CN113546112A - 一种从牡丹叶和根中分类提取酚类化合物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于物质提取技术领域，提供一种从牡丹叶和根中分类提取酚类化合物的方法。本发明的方法将牡丹样品和提取剂混合，进行超声提取和离心分离，得到上清液和滤渣；所述提取剂为甲醇、丙酮和水体积比为(7～9)：(7～9)：(3～5)的混合溶液；所述牡丹样品和提取剂的用量比为1g：(10～20)mL；所述牡丹样品包括牡丹叶和/或牡丹根。本发明的方法能够将酚类化合物从牡丹样品中充分提取出来，保证了提取液中酚类化合物的提取率；上清液经第一纯化分离，得到可溶性游离酚、可溶性酯化酚和可溶性糖基化酚；进一步地，对滤渣进行第二纯化分离，得到不溶性结合酚、不溶性酯化酚和不溶性糖基化酚；对牡丹的药用价值进行了深度挖掘。

Description

一种从牡丹叶和根中分类提取酚类化合物的方法
技术领域
本发明涉及物质提取技术领域，尤其涉及一种从牡丹叶和根中分类提取酚类化合物的方法。
背景技术
牡丹(Paeonia suffruticosa Andr.)为芍药科、芍药属植物，属多年生落叶灌木，是中国特有品种，有“花中之王”的美称。其根皮是重要的中药材，含有丹皮酚、牡丹酚苷、牡丹酚原苷和芍药苷等有效成分，其中丹皮酚具有抗癌、抗炎和预防心血管疾病等重要作用。牡丹花瓣中富含酚类、微量元素和维生素等物质，因其抗氧化活性而被应用于传统的功能性食品和医药中；另外，牡丹花提取物可以用于护肤品，有助于增强皮肤弹性、减少色素沉着和抑制斑点的形成，具有促进体内器官和皮肤的微循环功效。目前，中国牡丹品种有数千种，多数都为观赏型牡丹，少数为单花瓣为主的油用牡丹；而凤丹(Paeonia ostii)和“紫斑”(Paeonia rockii)是中国种植面积最大的两个油用牡丹品种。牡丹籽油中的不饱和脂肪酸含量高达90％，包括油酸、亚油酸、亚麻酸等，其中的α-亚麻酸含量高达40％，具有降血脂、预防心脑血管等疾病的重要生理功能；进而牡丹籽被用来榨油。
相比而言，牡丹叶和非根皮的普通牡丹根作为牡丹花和牡丹籽油生产研究过程中的主要副产物大部分被丢弃浪费，研究较少。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种从牡丹叶和根中分类提取酚类化合物的方法。本发明的方法能够将酚类化合物从牡丹叶和根中分类提取出来。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种从牡丹叶和根中分类提取酚类化合物的方法，包括以下步骤：
将牡丹样品和提取剂混合，进行超声提取和离心分离，得到提取液和滤渣；
将所述提取液进行第一纯化分离；所述第一纯化分离包括以下步骤：
将所述提取液中的有机溶剂去除，得到浓缩提取液；
调节所述浓缩提取液的pH值为酸性，进行第一固液分离，将所得上清液进行第一萃取，得到第一有机相和第一水相；将所述第一有机相依次进行除水、过滤和旋转蒸发，得到可溶性游离酚；
将所述第一水相和碱液混合，进行碱水解后调节pH值为酸性，再进行第二萃取，得到第二有机相和第二水相；所述第二有机相依次进行除水、过滤和旋转蒸发，得到可溶性酯化酚；
将所述第二水相和酸液混合，依次进行酸水解和第三萃取，得到第三有机相和第三水相；将所述第三有机相依次进行除水、过滤和旋转蒸发，得到可溶性糖基化酚；
所述提取剂为甲醇、丙酮和水体积比为(7～9)：(7～9)：(3～5)的混合溶液；
所述牡丹样品和提取剂的用量比为1g：(10～20)mL；
所述牡丹样品包括牡丹叶和/或牡丹根。
优选地，所述超声提取的温度为18～35℃；功率为160～200W，时间为20～40min。
优选地，所述超声提取的温度为20～30℃，功率为180W，时间为30min。
优选地，所述离心分离的温度为5～10℃，转速为6000～10000rpm，时间为4～6min。
优选地，还包括对所述滤渣进行第二纯化分离；所述第二纯化分离包括以下步骤：
将所述滤渣和碱液混合，进行碱水解后调节pH值为酸性，进行第二固液分离，将所得上清液进行第四萃取，得到第四有机相和第四水相；将所述第四有机相依次进行除水、过滤和旋转蒸发，得到不溶性结合酚；
将所述第四水相和碱液混合，进行碱水解后调节pH值为酸性，再进行第五萃取，得到第五有机相和第五水相；将所述第五有机相依次进行除水、过滤和旋转蒸发，得到不溶性酯化酚；
将所述第五水相和酸液混合，依次进行酸水解和第六萃取，得到第六有机相和第六水相；将所述第六有机相依次进行除水、过滤和旋转蒸发，得到不溶性糖基化酚。
优选地，所述酸液均为5mol/L的HCl溶液；所述酸水解的温度独立地为70～80℃，时间独立地为1～2h。
优选地，所述第一萃取和第四萃取的萃取剂为正己烷；所述第二萃取、第三萃取、第五萃取和第六萃取的萃取剂为乙酸乙酯。
优选地，所述碱液为NaOH浓度为4mol/L、EDTA浓度为10mmol/L、抗坏血酸质量浓度为1％的水溶液；所述碱水解的温度独立地为20～35℃，时间独立地为2～6h；所述碱水解在搅拌的条件下进行，所述搅拌的转速独立地为100～200rpm。
优选地，所述酸性的pH值为2。
本发明提供了一种从牡丹叶和根中分类提取酚类化合物的方法，包括以下步骤：将牡丹样品和提取剂混合，进行超声提取和离心分离，得到提取液和滤渣；将所述提取液进行第一纯化分离；所述第一纯化分离包括以下步骤：将所述提取液中的有机溶剂去除，得到浓缩提取液；调节所述浓缩提取液的pH值为酸性，进行第一固液分离，将所得上清液进行第一萃取，得到第一有机相和第一水相；将所述第一有机相依次进行除水、过滤和旋转蒸发，得到可溶性游离酚；将所述第一水相和碱液混合，进行碱水解后调节pH值为酸性，再进行第二萃取，得到第二有机相和第二水相；所述第二有机相依次进行除水、过滤和旋转蒸发，得到可溶性酯化酚；将所述第二水相和酸液混合，依次进行酸水解和第三萃取，得到第三有机相和第三水相；将所述第三有机相依次进行除水、过滤和旋转蒸发，得到可溶性糖基化酚；所述提取剂为甲醇、丙酮和水体积比为(7～9)：(7～9)：(3～5)的混合溶液；所述牡丹样品和提取剂的用量比为1g：(10～20)mL；所述牡丹样品包括牡丹叶和/或牡丹根。本发明的方法能够将酚类化合物从牡丹样品中充分且分类提取出来，保证了提取液中酚类化合物的提取率。
进一步地，本发明通过对滤渣进行第二纯化分离，将不溶性结合酚、不溶性酯化酚和不溶性糖基化酚纯化分离出来。
附图说明
图1为丹凤叶和丹凤根所得六个酚中总酚的含量图；
图2为丹凤叶和丹凤根所得六个酚中DPPH法抗氧化活性；
图3为丹凤叶和丹凤根所得六个酚中ABTS法抗氧化活性；
图4为丹凤叶和丹凤根所得六个酚中FRAP法抗氧化活性。
具体实施方式
本发明提供了一种从牡丹叶和根中分类提取酚类化合物的方法，包括以下步骤：
将牡丹样品和提取剂混合，进行超声提取和离心分离，得到提取液和滤渣；
将所述提取液进行第一纯化分离。
在本发明中，如无特殊说明，本发明所用原料均优选为市售产品。
本发明将牡丹样品和提取剂混合，进行超声提取和离心分离，得到提取液和滤渣。
在本发明中，所述牡丹样品包括牡丹叶和/或牡丹根，优选为牡丹叶或牡丹根，进一步优选为丹凤牡丹叶或丹凤牡丹根。在本发明中，所述牡丹样品的尺寸优选≤50mm。在本发明中，所述牡丹样品和提取剂混合前，优选进行预处理；所述预处理优选包括以下步骤：将牡丹原料依次进行洗涤、干燥、粉碎和过筛，得到牡丹样品。在本发明中，所述洗涤的试剂优选为去离子水；所述洗涤的次数优选为1～3次。在本发明中，所述干燥的温度优选为60℃，本发明对所述干燥的时间不做具体限定，只要能够将洗涤的试剂完全去除即可。在本发明中，所述粉碎的设备优选为型粉碎机。在本发明中，所述过筛的筛具的筛孔优选为50mm。
在本发明中，所述提取剂为甲醇、丙酮和水体积比为(7～9)：(7～9)：(3～5)的混合溶液，进一步优选为甲醇、丙酮和水体积比为8：8：4的混合溶液。
在本发明中，所述牡丹样品和提取剂的用量比为1g：(10～20)mL，优选为1g：15mL。
在本发明中，所述超声提取的温度优选为18～35℃，进一步优选为20～30℃；所述超声提取的功率优选为160～200W，进一步优选为170～190W，更优选为180W；所述超声提取的时间优选为20～40min，进一步优选为25～35min，更优选为30min。
在本发明中，所述离心分离的温度优选为5～10℃，具体优选为5℃；所述离心分离的转速优选为6000～10000rpm，进一步优选为7000～9000rpm，更优选为8000rpm；所述离心分离的时间优选为4～6min，进一步优选为5min。
在本发明中，所述超声提取的次数优选为2～4次，进一步优选为3次；进行3次超声提取的操作具体优选为：将第一次超声提取的料液进行第一离心分离，得到第一滤液和第一滤渣；将所述第一滤渣和提取剂混合，进行第二超声提取和第二离心分离，得到第二滤液和第二滤渣；将所述第二滤渣和提取剂混合，进行第三超声提取和第三离心分离，得到第三滤液和第三滤渣，合并第一滤液、第二滤液和第三滤液作为提取液。
得到提取液后，本发明将所述提取液进行第一纯化分离。在本发明中，所述第一纯化分离包括以下步骤：
将所述提取液中的有机溶剂去除，得到浓缩提取液；
调节所述浓缩提取液的pH值为酸性，进行第一固液分离，将所得上清液进行第一萃取，得到第一有机相和第一水相；将所述第一有机相依次进行除水、过滤和旋转蒸发，得到可溶性游离酚(F)；
将所述第一水相和碱液混合，进行碱水解后调节pH值为酸性，再进行第二萃取，得到第二有机相和第二水相；所述第二有机相依次进行除水、过滤和旋转蒸发，得到可溶性酯化酚(E)；
将所述第二水相与酸液混合，依次进行酸水解和第三萃取，得到第三有机相和第三水相；将所述第三有机相依次进行除水、过滤和旋转蒸发，得到可溶性糖基化酚(G)。
本发明将所述提取液中的有机溶剂去除，得到浓缩提取液。
在本发明中，所述有机溶剂去除的方式优选为旋转蒸发，本发明对所述旋转蒸发的操作不做具体限定，只要能够将有机溶剂去除完全即可。
得到浓缩提取液后，本发明调节所述浓缩提取液的pH值为酸性，进行第一固液分离，将所得上清液进行第一萃取，得到第一有机相和第一水相；将所述第一有机相依次进行除水、过滤和旋转蒸发，得到可溶性游离酚(F)。
在本发明中，所述酸性的pH值优选为2。在本发明中，所述调节浓缩提取液的pH值为酸性的试剂优选为盐酸，本发明对所述盐酸的浓度和用量不做具体限定，只要能够将浓缩提取液的pH值调节为酸性即可。
在本发明中，所述第一固液分离的方式优选为离心分离，所述离心分离的参数优选与上述技术方案一致，在此不再赘述。
在本发明中，所述第一萃取的萃取剂优选为正己烷，所述第一萃取的次数优选为3次。
在本发明中，所述除水的试剂优选为无水硫酸钠；本发明对所述过滤的操作不做具体限定，只要能够实现固液分离即可；本发明对所述旋转蒸发的参数不做具体限定，只要能够将有机溶剂去除即可。
得到第一水相后，本发明将所述第一水相和碱液混合，进行碱水解后调节pH值为酸性，再进行第二萃取，得到第二有机相和第二水相；所述第二有机相依次进行除水、过滤和旋转蒸发，得到可溶性酯化酚(E)。
在本发明中，所述碱液优选为NaOH浓度为4mol/L、EDTA浓度为10mmol/L、抗坏血酸质量浓度为1％的水溶液。在本发明中，所述第一水相和碱液混合中，所述第一水相和碱液的体积比优选为1：(1～3)，进一步优选为1：1。在本发明中，所述碱水解的温度优选为20～35℃；所述碱水解的时间优选为2～6h，进一步优选为4h；所述碱水解优选在搅拌的条件下进行，所述搅拌的转速优选为100～200rpm，进一步优选为150rpm。
在本发明中，所述酸性的pH值优选为2。在本发明中，所述调节pH值为酸性的试剂优选为盐酸，本发明对所述盐酸的浓度和用量不做具体限定，只要能够将碱水解后的体系的pH值调节为酸性即可。
在本发明中，所述第二萃取的萃取剂优选为乙酸乙酯，所述第二萃取的次数优选为3次。
在本发明中，所述除水的试剂优选为无水硫酸钠；本发明对所述过滤的操作不做具体限定，只要能够使固液分离即可；本发明对所述旋转蒸发的参数不做具体限定，只要能够将有机溶剂去除即可。
得到第二水相后，本发明将所述第二水相和酸液混合，依次进行酸水解和第三萃取，得到第三有机相和第三水相；将所述第三有机相依次进行除水、过滤和旋转蒸发，得到可溶性糖基化酚(G)。
在本发明中，所述酸液优选为5mol/L的盐酸。在本发明中，所述第二水相和酸液混合中，所述第二水相和酸液的体积比优选为6：1。在本发明中，所述酸水解的温度优选为70～80℃，进一步优选为75℃；所述酸水解优选在搅拌的条件下进行，所述搅拌的转速优选为100～200rpm，进一步优选为150rpm；所述酸水解的时间优选为1～2h，进一步优选为1h。
在本发明中，所述第三萃取的萃取剂和次数优选与第二萃取的萃取剂和次数一致，在此不再赘述。
在本发明中，所述除水的试剂优选为无水硫酸钠；本发明对所述过滤的操作不做具体限定，只要能够使固液分离即可；本发明对所述旋转蒸发的参数不做具体限定，只要能够将有机溶剂去除即可。
本发明优选还包括对所述滤渣进行第二纯化分离。在本发明中，所述第二纯化分离优选包括以下步骤：
将所述滤渣和碱液混合，进行碱水解后调节pH值为酸性，进行第二固液分离，将所得上清液进行第四萃取，得到第四有机相和第四水相；将所述第四有机相依次进行除水、过滤和旋转蒸发，得到不溶性结合酚(IB)；
将所述第四水相和碱液混合，进行碱水解后调节pH值为酸性，再进行第五萃取，得到第五有机相和第五水相；将所述第五有机相依次进行除水、过滤和旋转蒸发，得到不溶性酯化酚(IE)；
将所述第五水相和酸液混合，依次进行酸水解和第六萃取，得到第六有机相和第六水相；将所述第六有机相依次进行除水、过滤和旋转蒸发，得到不溶性糖基化酚(IG)。
本发明将所述滤渣和碱液混合，进行碱水解后调节pH值为酸性，进行第二固液分离，将所得上清液进行第四萃取，得到第四有机相和第四水相；将所述第四有机相依次进行除水、过滤和旋转蒸发，得到不溶性结合酚(IB)。
在本发明中，所述碱液优选为NaOH浓度为4mol/L、EDTA浓度为10mmol/L、抗坏血酸质量浓度为1％的水溶液。在本发明中，所述滤渣和碱液混合中，所述滤渣和碱液的用量比优选为1g：(10～15)mL，进一步优选为1g：15mL。在本发明中，所述碱水解的温度优选为20～35℃；时间优选为2～6h，进一步优选为4h；所述碱水解优选在搅拌的条件下进行，所述搅拌的转速优选为100～200rpm，进一步优选为150rpm。
在本发明中，所述酸性的pH值优选为2。在本发明中，所述调节pH值为酸性的试剂优选为盐酸，本发明对所述盐酸的操作不做具体限定，只要能够将碱水解后的体系的pH值调节为酸性即可。
在本发明中，所述第二固液分离的方式优选为离心分离，所述离心分离的参数优选与上述技术方案一致，在此不再赘述。
在本发明中，所述第四萃取的萃取剂和次数优选与第一萃取的萃取剂和次数一致，在此不再赘述。
在本发明中，所述除水的试剂优选为无水硫酸钠；本发明对所述过滤的操作不做具体限定，只要能够使固液分离即可；本发明对所述旋转蒸发的参数不做具体限定，只要能够将有机溶剂去除即可。
得到第四水相后，本发明将所述第四水相和碱液混合，进行碱水解后调节pH值为酸性，再进行第五萃取，得到第五有机相和第五水相；将所述第五有机相依次进行除水、过滤和旋转蒸发，得到不溶性酯化酚(IE)。
在本发明中，所述碱液优选与上述技术方案一致，在此不再赘述。在本发明中，所述第四水相和碱液混合中，所述第四水相和碱液的体积比优选为1：(1～3)，进一步优选为1：1。在本发明中，所述碱水解的参数优选与上述技术方案一致，在此不再赘述。本发明中，所述调节pH值为酸性的试剂优选与上述技术方案一致，在此不再赘述。在本发明中，所述第五萃取的萃取剂和次数优选与第二萃取的萃取剂和次数一致，在此不再赘述。
在本发明中，所述除水、过滤和旋转蒸发的操作优选与上述技术方案一致，在此不再赘述。
得到第五水相后，本发明将所述第五水相和酸液混合，依次进行酸水解和第六萃取，得到第六有机相和第六水相；将所述第六有机相依次进行除水、过滤和旋转蒸发，得到不溶性糖基化酚。
在本发明中，所述酸液优选为5mol/L的盐酸；所述第五水相和酸液的体积比优选为6：1。在本发明中，所述第五水相和酸液混合中，所述第五水相和酸液的体积比优选为6：1。在本发明中，所述酸水解的温度和时间优选与上述技术方案所述的酸水解的温度和时间一致，在此不再赘述。
在本发明中，所述第六萃取的萃取剂和次数优选与第二萃取的萃取剂和次数一致，在此不再赘述。
在本发明中，所述除水的试剂优选为无水硫酸钠；本发明对所述过滤的操作不做具体限定，只要能够使固液分离即可；本发明对所述旋转蒸发的参数不做具体限定，只要能够将有机溶剂去除即可。
本发明优选采用高分辨液质联用对上述技术方案所得的六个酚组分(以下统称样品溶液)：可溶性游离酚(F)、可溶性酯化酚(E)、可溶性糖基化酚(G)、不溶性结合酚(IB)、不溶性酯化酚(IE)和不溶性糖基化酚(IG)进行定性定量分析。在本发明中，所述高分辨液质联用的参数优选包括色谱条件和质谱条件。
在本发明中，所述色谱条件包括：高分辨液质联用仪优选为美国Thermo Fisher的高分辨质谱仪；色谱柱优选为C18反向色谱柱，100mm×2.1mm，3μm；流动相包括流动相A和流动相B；所述流动相A为甲酸体积浓度为0.1％的水溶液；流动相B为乙腈；流速优选为0.3mL/min；梯度洗脱程序包括：0～1.5min：10％B；1.5～2.0min：10％→5％B；2.0～3.5min：15％B；3.5～4.0min：15％→20％B；4.0～6.0min，20％→25％B；6.0～8.0min：25％B；8.0～9.0min：25％→70％B；9.0～10.5min，70％→10％B；10.5～12.0min：10％B。
在本发明中，所述质谱条件包括：采用电喷雾电离离子源(ESI)，负离子扫描模式；毛细管温度优选为320℃；鞘气流速优选为40arb；辅助气流速优选为10arb；喷雾电压优选为2500V；全扫描的扫描范围优选为100～1000m/z。
得到六个酚组分后，本发明优选还包括对所得六个酚组分(以下统称样品溶液)进行总酚含量(TPC)、抗氧化活性和抗酪氨酸酶活性测定。
在本发明中，所述总酚含量(TPC)的测定方法优选参照Folin酚法，原理为：碱性条件下利用多酚的还原性，多酚可以将磷钨钼酸还原成蓝色，蓝色的深浅与多酚含量成正比，用分光光度计进行测定；以没食子酸(50～200mg/mL)为标准品，以没食子酸质量浓度(X)对吸光度(Y)进行回归，得到回归方程：Y＝1.809X+0.006，R2＝0.998。各取样品溶液0.1mL，依次加入福林酚试剂、质量百分含量为7％碳酸钠溶液和蒸馏水，以蒸馏水作为空白，在波长760nm处对样品溶液进行测定后计算总酚含量，总酚含量单位(TPC)，单位为mg GAE/g dw。
在本发明中，所述抗氧化活性测定的方法包括DPPH法、ABTS法和FRAP法。
在本发明中，所述DPPH法优选参照(Yang J.,Cui J.,WuY.,Han H.,Chen J.,YaoJ.,Liu Y.,2019.Comparisons of the active components in four unripe raspberryextracts and their activites.Food Science and Technology,39,632-639.)测定抗氧化活性的步骤优选包括：各取2.0mL样品溶液与2.0mL的DPPH溶液混合，避光40min后在517nm处测吸光度值A样品；相同方法测2.0mL DPPH溶液和2.0mL提取剂混合后的吸光度A对照和2.0mL样品溶液的甲醇溶液和2.0mL 95％乙醇混合后的吸光度A空白；按照公式1计算DPPH自由基清除率：
Figure BDA0003179162380000101
在本发明中，所述ABTS法测定抗氧化活性的步骤优选包括：将配制好的ABTS母液，用体积浓度为70％的乙醇稀释到吸光度为0.7±0.02，得到ABTS反应液。各取1mL样品溶液与3mL ABTS反应液，避光反应6min，在734nm测定吸光度值A样品；取用70％乙醇调零，按照公式2计算ABTS自由基清除率：
Figure BDA0003179162380000102
在本发明中，所述FRAP法测定抗氧化活性的步骤优选包括：以硫酸亚铁作为标准品，以硫酸亚铁摩尔浓度X为横坐标，吸光度Y为纵坐标绘制标准曲线；标准曲线方程为：Y＝5.114X+0.1402，R2＝0.999。
将醋酸缓冲液、TPTZ溶液、氯化铁溶液按照体积比10：1：1混合，制成FRAP工作液。各取样品溶液0.5mL，加入4mL FRAP工作液，在593nm处测吸光度值，单位：μmol。
在本发明中，所述抑制酪氨酸酶活性的测定方法包括以下步骤：使用修饰的多巴色素法以L-DOPA作为底物测量；将样品溶液(25μL，100μg/mL)与酪氨酸酶溶液(40μL；127U/mL)和磷酸盐缓冲液(100μL，pH值为6.8)在96孔微孔板中混合，并在25℃下温育15分钟。然后加入L-DOPA(40μL；2.5mM)引发反应。类似地，通过将样品溶液加入到无酶液的反应液中来制备A对照。在25℃温育15分钟后，在475nm处读取A样品和A对照吸光度。从样品的吸光度中减去空白的吸光度。将结果报告为抑制百分比并根据公式3计算：
Figure BDA0003179162380000111
下面结合实施例对本发明提供的一种从牡丹叶和根中分类提取酚类化合物的方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
凤丹叶(PL)、凤丹根(PR)均于2020年9月采自山西省长治市，将收集到的材料进行简单的清洗后60℃干燥，并用小型粉碎机粉碎，过50mm筛，收集粉末，-4℃保存备用。
将凤丹叶和凤丹根分别与提取剂(甲醇、丙酮和水的体积比为8：8：4的混合溶剂)以料液比1g：15mL、功率180W、室温下超声辅助提取30min，后在5℃条件下以8000r/min离心5min，收集上清液并将以上步骤重复两次。合并后的上清液作为提取液。
第一纯化分离：
所述提取液在真空条件下将有机溶剂旋转蒸发掉，剩余溶液用盐酸调节pH值为2，再次以上述条件离心，上清液用正己烷萃取3次，得到第一有机相和第一水相，第一有机相用无水硫酸钠除水、过滤、旋转蒸发即得到可溶性游离酚F，对于从丹凤叶(PL)中提取的可溶性游离酚简称为PL-F，对于从丹凤根(PR)中提取的可溶性游离酚简称为PR-F。
第一水相和NaOH浓度为4mol/L、EDTA浓度为10mmol/L和抗坏血酸质量百分含量为1％的水溶液按体积比为1：1混合调节pH值为13，在室温下以150rpm碱水解4h后用盐酸调节pH值为2，最后用乙酸乙酯萃取3次得到第二有机相和第二水相，按照第一有机相的处理步骤处理第二有机相得到可溶性酯化酚E，对于从丹凤叶(PL)中提取的可溶性酯化酚简称为PL-E，从丹凤根(PR)中提取的可溶性酯化酚简称为PR-E；
第二水相和5mol/L的HCl按照体积比为6：1混合，在75℃，150rpm条件下酸水解60min，将所得酸水解体系用乙酸乙酯萃取3次，得到第三有机相和第三水相；对所述第三有机相重复第一有机相的处理操作，得到可溶性糖基化酚G，对于从丹凤叶(PL)中提取的可溶性糖基化酚简称为PL-G，对于从丹凤根(PR)中提取的可溶性糖基化酚简称为PR-G。
第二纯化分离：
提取3次后的滤渣和NaOH浓度为4mol/L、EDTA浓度为10mmol/L和抗坏血酸质量百分含量为1％的水溶液按照用量比为1g：15mL混合调节pH值为13，在室温下以150rpm碱水解4h后用盐酸调节pH值为2，以上述离心条件进行第二离心分离，上清液用正己烷萃取，得到第四有机相和第四水相；按照第一有机相的处理步骤处理第四有机相，得到不溶性结合酚IB，对于从丹凤叶(PL)中提取的不溶性结合酚简称为PL-IB，对于从丹凤根(PR)中提取的不溶性结合酚简称为PR-IB；
将所述第四水相和NaOH浓度为4mol/L、EDTA浓度为10mmol/L和抗坏血酸质量百分含量为1％的水溶液按照体积比1：1混合，调节pH值为2，在室温下以150rpm碱水解4h后用盐酸调节pH值为2，最后用乙酸乙酯萃取3次，得到第五有机相和第五水相，按照第一有机相的处理步骤处理第五有机相得到不溶性酯化酚IE，对于从丹凤叶(PL)中提取的不溶性酯化酚简称为PL-IE，对于从丹凤根(PR)中提取的不溶性酯化酚简称为PR-IE；
第五水相和6mol/L的HCl按照体积比6：1混合，在75℃，150rpm条件下酸水解60min，用乙酸乙酯萃取3次，得到第六有机相和第六水相；对所述第六有机相重复第一有机相的处理操作，得到不溶性糖基化酚IG，对于从丹凤叶(PL)中提取的不溶性糖基化酚简称为PL-IG，对于从丹凤根(PR)中提取的不溶性糖基化酚简称为PR-IG。
测定丹凤叶和丹凤根所得各酚组分之一中的总酚含量(TPC)：TPC的测定方法优选参照Folin酚法，原理为：碱性条件下利用多酚的还原性，多酚可以将磷钨钼酸还原成蓝色，蓝色的深浅与多酚含量成正比，用分光光度计进行测定；以没食子酸(50～200mg/mL)为标准品，以没食子酸质量浓度(X)对吸光度(Y)进行回归，得到回归方程：Y＝1.809X+0.006，R2＝0.998。各取六个酚0.1mL，依次加入福林酚试剂、7％碳酸钠和蒸馏水，以蒸馏水作为空白，在波长760nm处对样品溶液进行测定后计算总酚含量，总酚含量单位(TPC)，单位为mgGAE/g dw。结果如图1所示。
从图1可以看出：牡丹不同部位TPC含量差异较大，范围为2.01～193.56mg GAE/gdw。其中，PL-F含量最高，达到193.56mg GAE/g dw，其次为PR-F和PL-IB。另外，六个酚组分之和超过了只超声提取不酸碱处理的总酚量(陈金祥等，多种植物总酚含量和抗氧化能力的测定和比较分析，山西大学学报，2020，43(1)：150-157)，如PR中125.48>94.88mg GAE/gdw，PL为280.38>162.10mg GAE/g dw，其他研究表明，乙醇提取芍药叶的TPC含量高于根，且与本发明的结果一致(Pan,Y.,Gao,Z.,Huang,X.Y.,Chen,J.J.,Geng,C.-A.,2020.Chemical and biological comparison of different parts of Paeoniasuffruticosa(Mudan)based on LCMS-IT-TOF and multi-evaluation invitro.Industrial Crop&Products,144.112028.)。
为评价PL和PR六个酚组分中的主要化合物，采用HPLC-MS对21个典型化合物进行了鉴定和定量，分为5组，包括6个单萜类化合物、5个苯乙酮类化合物、5个黄酮类化合物、4个酚酸组分和1,2,3,4,6-邻五苯三酚葡萄糖(PGG)，结果如表1所示。
所述HPLC-MS的参数优选包括色谱条件和质谱条件。
所述色谱条件包括：所述高分辨液质联用仪优选为美国Thermo Fisher的高分辨质谱仪；色谱柱优选为C18反向色谱柱，100mm×2.1mm，3μm；流动相包括流动相A和流动相B；所述流动相A为甲酸体积浓度为0.1％的水溶液；流动相B为乙腈；流速优选为0.3mL/min；梯度洗脱程序包括：0～1.5min：10％B；1.5～2.0min：10％→5％B；2.0～3.5min：15％B；3.5～4.0min：15％→20％B；4.0～6.0min，20％→25％B；6.0～8.0min：25％B；8.0～9.0min：25％→70％B；9.0～10.5min，70％→10％B；10.5～12.0min：10％B。
所述质谱条件包括：采用电喷雾电离离子源(ESI)，负离子扫描模式；毛细管温度优选为320℃；鞘气流速优选为40arb；辅助气流速优选为10arb；喷雾电压优选为2500V；全扫描的扫描范围优选为100～1000m/z。
表1丹凤根(PR)和丹凤叶(PL)6个酚组分中的各物质含量
Figure BDA0003179162380000141
Figure BDA0003179162380000151
Figure BDA0003179162380000161
从表1可以看出：PL中总化合物含量为52.00±0.12mg/g dw低于PR 58.59±0.19mg/g dw)。丹凤叶片和丹凤根中植物成分的分布和含量不同，但游离酚的比例最大，PR为85.7％，PL为83.3％。
首先，芍药属的代表物质为单萜类糖苷，包括芍药苷、氧芍药苷、苯甲酰芍药苷，其中6种单萜苷是丹凤根(30.0mg/g dw)和丹凤叶中(28.4mg/g dw)的主要化合物。以PL-F和PR-F为例，以∑单萜苷类化合物在PR-F(29.5mg/g dw)和PL-F(26.7mg/g dw)中最高，芍药苷含量最高，分别为92.8％和89.8％。芍药苷已被证明具有一定的抗炎活性(ChangY.,Zhang L.,Wang C.,Jia X.Y.,Wei W.,2011.Paeoniflorin inhibits functionofsynoviocytes pretreated by rIL-1alpha and regulates EP4 receptorexpression.Journal of Ethnopharmacology,137,1275-1282.)，并有效地治疗免疫过度反应。其次，酚酸组含有没食子酸及其衍生物，其根(15.4mg/g dw)和叶片(13.2mg/g dw)含量差异不大，具有很高的黄酮抗氧化活性。值得注意的是，PGG(1,2,3,4,6-五邻没食子酸-β-D-葡萄糖)是牡丹中的重要化合物，是一种可水解单宁，丹凤根中含量为7.7mg/g dw，占酚酸基团的50％，是丹凤叶片的3倍。有报道说，PGG能够通过上调转录因子EGR3来改善皮肤屏障基因的表达。黄酮类化合物组叶片中青蒿素含量最高(70.8％)，儿茶素含量最高，丹凤根中儿茶素含量最高(53.7％)。它们是一种抗氧化剂，能中和过氧化物自由基，并具有一定的抗寄生虫作用和其他生物活性。最后，苯乙酮组丹皮酚是丹凤根中最有价值的活性成分，具有多种生理活性。结果表明，丹凤根中丹皮酚的总含量为2.9mg/g dw，89％的丹皮酚在PR-G组分中。该含量已超过中国药典的要求1.2％和9种牡丹种。丹皮酚的异构体香草乙酮可上调COL17A1的表达，它的含量在丹凤根中为79.97μg/g和丹凤叶片中为277.31μg/g。COL17A1是一种维持皮肤稳态和防止衰老的原始蛋白质，它可以促进干细胞竞争，有效地“驱逐”较弱的细胞，并加速细胞增殖以保持皮肤年轻。结果表明：除丹凤根外，丹凤叶和叶提取物，在化妆品原料中也具有较高的利用价值。
分别利用DPPH法、ABTS法和FRAP法测定丹凤叶和丹凤根所得六个酚组分的抗氧化活性，其中：所述DPPH法测定抗氧化活性的步骤优选包括：根据(Yang J.,Cui J.,Wu Y.,Han H.,Chen J.,Yao J.,Liu Y.,2019.Comparisons of the active components infour unripe raspberry extracts and their activites.Food Science andTechnology,39,632-639.)，取2.0mL六个酚组分之一与2.0mL的DPPH溶液混合，避光40min后在517nm处测吸光度值A样品；相同方法测2.0mL DPPH溶液和2.0mL提取剂混合后的吸光度A空白和2.0mL六个酚组分之一和2.0mL95％乙醇混合后的吸光度；按照公式1计算DPPH自由基清除率，结果如图2所示。
所述ABTS法测定抗氧化活性的步骤优选包括：将配制好的ABTS母液，用70％乙醇稀释到吸光度为0.7±0.02，得到ABTS反应液。取1mL各酚组分与3mL ABTS反应液，避光反应6min，在734nm测定吸光度值，以70％乙醇为空白，按照公式2计算ABTS自由基清除率，结果如图3所示。
在本发明中，所述FRAP法测定抗氧化活性的步骤优选包括：以硫酸亚铁作为标准品，以硫酸亚铁摩尔浓度X为横坐标，吸光度Y为纵坐标绘制标准曲线；标准曲线方程为：Y＝5.114X+0.1402，R2＝0.999。将醋酸缓冲液、TPTZ溶液、氯化铁溶液按照体积比10：1：1混合，制成FRAP工作液。取各酚组分之一0.5mL，加入4mL FRAP工作液，在593nm处测吸光度值，单位：μmol。结果如图4所示。
从图2～图4可以看出：各样品均表现出不同程度的抗氧化活性，其抗氧化活性与提取物的TPC具有良好的相关性，相关系数分别为RFRAP＝0.9923、RDPPH＝0.9063和RABTS＝0.8069。丹凤根的抗氧化活性弱于丹凤叶。丹凤根和丹凤叶中酚类成分的抗氧化活性最高的是F，这也与HPLC-MS或比色法测定的总酚含量一致，如PL-F(IC50/DPPH＝0.79)μmo/L，IC50/ABTS＝1.058nmo/L)和PR-F(IC50/DPPH＝1.016μmo/L，IC50/ABTS＝2.01nmo/L)。这个剂量甚至高于未成熟树莓提取物的抗氧化活性。一方面，抗氧化活性取决于酚类化合物的含量、酚类化合物的结构，如羟基的数目、特定位置、羟基化程度以及分子间的相互作用、协同作用或拮抗作用。因此，有效地测定植物提取物的体外抗氧化活性是初步筛选和评价植物提取物的必要条件，以发现其在预防疾病和促进人体健康方面潜在的积极作用。
测定凤丹叶(PL)和凤丹根(PR)所得六个酚组分和21种化合物标准品的抗酪氨酸酶活性，结果如表2和表3所示。
表2 PR和PL中六个酚组分的酪氨酸酶抑制活性
Figure BDA0003179162380000181
Figure BDA0003179162380000191
表3 21种标准化合物的酪氨酸酶抑制活性
Figure BDA0003179162380000192
从表2和3可以看出：根据对化合物的抑制作用，将其分为3组，Ⅰ组>50％，Ⅱ组20-50％，Ⅲ组<20％。PL-F和PR-F的抗酪氨酸酶活性最高，约为60％，属于Ⅰ组。丹凤叶中其他组分的抗酪氨酸酶活性在29.64％～38.65％之间，属于Ⅱ组，高于丹凤根中相应组分的抗酪氨酸酶活性。分为Ⅲ组，占6.15％～14.78％。其中单萜苷包括芍药苷、氧化芍药苷、苯甲酰芍药苷、牡丹皮苷C、没食子酸芍药苷、苯甲酰芍药苷等，具有较高的抗酪氨酸酶活性，超过50％。从它们的分子结构来看，这种活性可能与其单萜环有关。据报道，番红花中的一种单萜(番红花素-K)显示出与曲酸相同的抑制活性。这也可能是叶片组抑制活性高于根组的主要原因，因为丹凤叶片组中PL-E、G、IB、IE、IG的含量高于根组∑Mono在丹凤根中的相对分数较高。虽然PR-F中的单萜苷和总酚含量都高于PL-F，但是前者中的儿茶素约为后者的88倍。在以往的研究中，儿茶素和表儿茶素具有明显的背景效应，对抗酪氨酸酶活性的检测有负面影响。在这里，儿茶素的抗酪氨酸酶活性为-30％，意味着负作用。因此，PR和PL的抑制活性分别为61.36％和57.70％。没食子酸的抑制活性低于其衍生物，这与本发明中II组的结果相似。槲皮素黄酮的抑制活性存在争议。一些研究发现槲皮素具有很高的抗酪氨酸酶活性，甚至比曲酸还要高，而最活跃的槲皮素仅显示出曲酸20％的抑制强度。在这里，一些类黄酮和丹皮酚，分类为第二组有抑制活性，但活性较弱(<35％)。此外，apocynin对酪氨酸酶的抑制作用不明显。因此，II组和III组化合物和组分不适用于美白产品的应用。结果表明，PGG具有很高的抗酪氨酸酶活性，达到曲酸水平60％以上。令人惊讶的是，PGG对弹性蛋白酶活性具有抑制作用，对人角质形成细胞具有保护作用。此外，通过高速逆流色谱从白芍中提取高纯度PGG，抑制脂肪生成和TNF-α-3T3-L1细胞中的介导炎症(Peng J.,Li K.,ZhuW.,Nie R.,Wang R.,Li C.,2019.Penta-O-galloyl-beta-d-glucose,a hydrolysabletannin from Radix Paeoniae Alba,inhibits adipogenesis and TNF-alpha-mediatedinflammation in 3T3-L1 cells.Chemico-Biological Interactions,302,156-163.)。因此，I组化合物和PL-F、PR-F具有潜在的应用价值。
在本发明中，所述抑制酪氨酸酶活性的测定方法包括以下步骤：使用修饰的多巴色素法以L-DOPA作为底物测量；将六个酚组分(25μL，100μg/mL)与酪氨酸酶溶液(40μL；127U/mL)和磷酸盐缓冲液(100μL，pH值为6.8)在96孔微孔板中混合，并在25℃下温育15分钟。然后加入L-DOPA(40μL；2.5mM)引发反应。类似地，通过将六个酚加入到无酶液的反应液中来制备A对照。在25℃温育15分钟后，在475nm处读取A样品和A对照吸光度。从样品的吸光度中减去空白的吸光度。将结果报告为抑制百分比并根据公式3计算。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种从牡丹叶和根中分类提取酚类化合物的方法，包括以下步骤：
将牡丹样品和提取剂混合，进行超声提取和离心分离，得到提取液和滤渣；
将所述提取液进行第一纯化分离；所述第一纯化分离包括以下步骤：
将所述提取液中的有机溶剂去除，得到浓缩提取液；
调节所述浓缩提取液的pH值为酸性，进行第一固液分离，将所得上清液进行第一萃取，得到第一有机相和第一水相；将所述第一有机相依次进行除水、过滤和旋转蒸发，得到可溶性游离酚；
将所述第一水相和碱液混合，进行碱水解后调节pH值为酸性，再进行第二萃取，得到第二有机相和第二水相；所述第二有机相依次进行除水、过滤和旋转蒸发，得到可溶性酯化酚；
将所述第二水相和酸液混合，依次进行酸水解和第三萃取，得到第三有机相和第三水相；将所述第三有机相依次进行除水、过滤和旋转蒸发，得到可溶性糖基化酚；
所述提取剂为甲醇、丙酮和水体积比为(7～9)：(7～9)：(3～5)的混合溶液；
所述牡丹样品和提取剂的用量比为1g：(10～20)mL；
所述牡丹样品包括牡丹叶和/或牡丹根。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述超声提取的温度为18～35℃；功率为160～200W，时间为20～40min。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述超声提取的温度为20～30℃，功率为180W，时间为30min。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述离心分离的温度为5～10℃，转速为6000～10000rpm，时间为4～6min。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括对所述滤渣进行第二纯化分离；所述第二纯化分离包括以下步骤：
将所述滤渣和碱液混合，进行碱水解后调节pH值为酸性，进行第二固液分离，将所得上清液进行第四萃取，得到第四有机相和第四水相；将所述第四有机相依次进行除水、过滤和旋转蒸发，得到不溶性结合酚；
将所述第四水相和碱液混合，进行碱水解后调节pH值为酸性，再进行第五萃取，得到第五有机相和第五水相；将所述第五有机相依次进行除水、过滤和旋转蒸发，得到不溶性酯化酚；
将所述第五水相和酸液混合，依次进行酸水解和第六萃取，得到第六有机相和第六水相；将所述第六有机相依次进行除水、过滤和旋转蒸发，得到不溶性糖基化酚。
6.根据权利要求1或5所述的方法，其特征在于，所述酸液均为5mol/L的HCl溶液；所述酸水解的温度独立地为70～80℃，时间独立地为1～2h。
7.根据权利要求1或5所述的方法，其特征在于，所述第一萃取和第四萃取的萃取剂为正己烷；所述第二萃取、第三萃取、第五萃取和第六萃取的萃取剂为乙酸乙酯。
8.根据权利要求1或5所述的方法，其特征在于，所述碱液为NaOH浓度为4mol/L、EDTA浓度为10mmol/L、抗坏血酸质量浓度为1％的水溶液；所述碱水解的温度独立地为20～35℃，时间独立地为2～6h；所述碱水解在搅拌的条件下进行，所述搅拌的转速独立地为100～200rpm。
9.根据权利要求1或5所述的方法，其特征在于，所述酸性的pH值为2。
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