CN106242953A - 一种从丹凤牡丹籽壳中制备白藜芦醇的方法 - Google Patents

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CN106242953A CN201610553870.0A CN201610553870A CN106242953A CN 106242953 A CN106242953 A CN 106242953A CN 201610553870 A CN201610553870 A CN 201610553870A CN 106242953 A CN106242953 A CN 106242953A
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张红玉
陈虹霞
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Abstract

本发明涉及一种从丹凤牡丹籽壳中制备白藜芦醇的方法，属于天然产物技术领域。以丹凤牡丹籽壳为原料、经过提取、萃取、大孔树脂纯化和硅胶柱层析分离得到丹凤牡丹籽壳白藜芦醇。通过本发明的技术条件制备牡丹籽壳白藜芦醇，具有制备过程简单、纯度高和原料价廉等特点。同时通过本发明制备的牡丹籽壳多酚提取物具有良好的抗氧化和抑菌活性，可以广泛应用于食品和护肤品领域，具有很好的商业前景。

Description

一种从丹凤牡丹籽壳中制备白藜芦醇的方法
技术领域
本发明涉及一种从丹凤牡丹籽壳中制备白藜芦醇的方法，属于天然产物技术领域。
背景技术
牡丹（Paeonia suffruticosa Andr.）属于芍药科（Paeoniaeeae）、芍药属（Paeonia）多年生木本植物。牡丹根皮具用很好药用价值，在两千年以前，就记载于《本草经》。直到隋唐时期，牡丹则成为了名贵的观赏植物。牡丹籽为牡丹花结的种子，色黑、皮硬、味苦，不规则圆型，比黄豆稍大。牡丹籽壳为牡丹籽外表的黑色坚硬的外壳。牡丹籽在民间可以治疗腰腿疼痛，具有消炎、抗氧化的作用。经中药化学和药理研究发现牡丹籽具有抗菌、消炎、镇静、降血糖、抗过敏及免疫调节等作用。白藜芦醇（C14H12O3）结构为3ˊ,4,5ˊ-三羟基-1，2-二苯乙烯（3ˊ,4,5ˊ-tri- hydroxylstillbene），无色针状晶体。白藜芦醇有顺式和反式两种结构，植物中主要以反式结构存在。白藜芦醇是一种天然的植物抗毒素，广泛存在于红葡萄皮、花生、桑葚以及其他一些药用的植物中，其中在种皮中含量极高。紫斑牡丹的叶、侧枝、茎以及根中均不含白藜芦醇，其籽和果荚中含有白藜芦醇，含量约为0.87%和0.26%。
近年来，随着牡丹籽油产业的兴起，产生了大量的油牡丹籽壳。油牡丹籽壳部分用作肥料，但是更多的是被丢弃，利用率极低。目前，国内外关于从油牡丹籽壳中提取高附加值白藜芦醇的学术报道极少，仅仅研究了其中芍药苷和丹皮酚检测方法。深度开发丰富并且廉价的油牡丹籽壳资源，获得高纯度的具有生物活性的物质——白藜芦醇，不仅能够变废为宝，也具有很好的社会和经济效益。
发明内容
为实现上述目的，发明了一种从丹凤牡丹籽壳中制备白藜芦醇的方法，其特征在于由以下步骤组成：
第一步 原料预处理
将丹凤牡丹籽壳干燥至水份8%以内粉碎，用10～60目的筛子进行筛分，得到丹凤牡丹籽壳细粉；
第二步 白藜芦醇粗提物制备
在牡丹籽壳细粉中加入体积分数50%-95%的乙醇水溶液，两者的质量体积比为1:8～1:30(g:mL)，然后用超声波或微波辅助提取60～120min，提取温度40℃～90℃，提取1～3次，过滤，合并滤液，滤液于40～60℃下减压蒸发，回收溶剂，浓缩物经真空干燥或冷冻干燥，得到白藜芦醇粗提物；
第三步 白藜芦醇粗提物分级萃取
将白藜芦醇粗提物按质量体积比1:5～1:10(g:mL)加入蒸馏水，60℃搅拌溶解，过滤，滤液加入体积比1:1的石油醚萃取3～5次，合并石油醚萃取相，在40～60℃下减压浓缩得到石油醚萃取物；水层继续用乙酸乙酯等体积萃取3～5次，合并乙酸乙酯萃取相，在40～60℃下减压浓缩得到乙酸乙酯萃取物；
第四步 大孔脂脂选择性吸附筛选
从X-5、AB-8、NKA-Ⅱ、NKA-9、XDA-4、H103、D101和S-8大孔吸附树脂中筛选得到对白藜芦醇多酚吸附选择性好的X-5、AB-8和D101树脂，其吸附量高于2.5mg/g，吸附率和解附率大于90%；
第五步 大孔树脂吸附分离乙酸乙酯萃取物
将乙酸乙酯萃取物用蒸馏水溶解，乙酸乙酯萃取物与水质量体积比为0.8～3.0 mg/mL，调节溶液pH为1.0～4.0，大孔树脂与乙酸乙酯萃取物水溶液质量体积比为1:0.5～10（mg:mL），乙酸乙酯萃取物水溶液上柱吸附速度为1～6 mL/min，样品吸附结束后用50～90%乙醇洗脱大孔树脂柱，洗脱剂流速1～3mL/min，洗脱剂用量为大孔树脂体积1～4倍，收集白藜芦醇多酚部位，经HPLC分析，得到富含白藜芦醇、肉桂酸类、儿茶素、丹皮酚、芦丁和槲皮素类组成的白藜芦醇多酚提取物；
第六步 白藜芦醇分离
采用硅胶柱层析分离白藜芦醇，将白藜芦醇多酚提取物溶于少量乙酸乙酯溶液中搅拌成均匀膏状，干燥并用研钵研细为粉末，均匀加入硅胶层析柱中，以乙酸乙酯与石油醚体积比为5:100～40:100为洗脱剂进行梯度洗脱，每个梯度洗脱1～3倍柱体积，收集乙酸乙酯与石油醚体积比=7:3的洗脱液，经减压浓缩后获得95%以上白藜芦醇白色粉末。
本专利第五步中白藜芦醇多酚HPLC分析：HPLC色谱柱为Hypersil GOLD aQ C18Φ250×4.6mm，5μm，流动相：甲醇与0.5%冰醋酸水溶液体积比为4:6；紫外波长306nm；柱温：30℃；流速：1mL/min。
本专利第五步得到的白藜芦醇多酚提取物在240℃以下具有良好的热稳定性，在240～378℃之间有10-20%的质量损失，其分解速率为1.5～2.0%/min，在240～420℃下全程失重总计50～60%，失重速率2.0～3.0%/min。
本专利第五步得到的白藜芦醇多酚提取物具有抗氧化抗菌生物活性，总抗氧化能力为1200mg/g（BHT为200mg/g）以上，半数抑制浓度为50μg/mL以下，对表皮葡萄球菌的最低抑菌浓度为5.2mg/mL以下，对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为20.6mg/mL以下。
本发明的有益效果：
本发明所提供的一种从丹凤牡丹籽壳中制备白藜芦醇的方法，还具有以下特点：
（1）本发明采用超声辅助提取方法，可以有效地防止多酚提取物的分解，大大地提高提取得率；
（2）本发明采用超声波提取、分级萃取和大孔树脂纯化，可以有效地提高白藜芦醇的含量与纯度；
（3）本发明工艺操作简单，易实施，纯度高。
附图说明
图1 白藜芦醇多酚提取物的HPLC图；
图2丹凤牡丹籽壳白藜芦醇液相色谱图；
图3 丹凤牡丹籽壳白藜芦醇的红外谱图；
图4 丹凤牡丹籽壳白藜芦醇的1H NMR图；
图5 丹凤牡丹籽壳白藜芦醇的13C NMR图。
具体实施方式
以下实施例为本发明的一些举例，不应被看做是对本发明的限定。
实施例1
将丹凤牡丹籽壳干燥至水份8%以内粉碎，用10～60目的筛子进行筛分，得到丹凤牡丹籽壳细粉；在牡丹籽壳细粉中加入体积分数50%-95%的乙醇水溶液，两者的质量体积比为1:8～1:30(g:mL)，然后用超声波提取60～120min，提取温度40℃～90℃，提取1～3次，过滤，合并滤液，滤液于40～60℃下减压蒸发，回收溶剂，浓缩物经真空干燥或冷冻干燥，得到白藜芦醇粗提物；将白藜芦醇粗提物按质量体积比1:5～1:10(g:mL)加入蒸馏水，60℃搅拌溶解，过滤，滤液加入体积比1:1的石油醚萃取3～5次，合并石油醚萃取相，在40～60℃下减压浓缩得到石油醚萃取物；水层继续用乙酸乙酯等体积萃取3～5次，合并乙酸乙酯萃取相，在40～60℃下减压浓缩得到乙酸乙酯萃取物；从X-5、AB-8、NKA-Ⅱ、NKA-9、XDA-4、H103、D101和S-8大孔吸附树脂中筛选得到对白藜芦醇多酚吸附和解吸附性较好的树脂，结果见表1。
表1 8种大孔树脂对油牡丹籽壳多酚静态吸附及解吸的结果
8种大孔吸附树脂对油牡丹籽壳多酚的吸附与解吸性能见表4-2。这几种大孔树脂对油牡丹籽壳多酚吸附性能差异不大，应该是因为树脂过量。但是，大孔吸附树脂的解吸量和解吸率有较大差别。其中，X-5和AB-8的解吸性能最好，解析率分别达到94.51%和97.91%。8种树脂中S-8对油牡丹籽壳多酚的解析率最低，可能是因为S-8树脂对油牡丹籽壳中的多酚类物质有较强的亲和力，因而多酚类物质很难被洗脱，所以S-8大孔吸附树脂不被用来纯化油牡丹籽壳多酚。
实施例2
将乙酸乙酯萃取物用蒸馏水溶解，乙酸乙酯萃取物与水质量体积比为0.8～3.0 mg/mL，调节溶液pH为1.0～4.0，大孔树脂X-5与乙酸乙酯萃取物水溶液质量体积比为1:0.5～10（mg:mL），乙酸乙酯萃取物水溶液上柱吸附速度为1～6 mL/min，样品吸附结束后用50～90%乙醇洗脱大孔树脂柱，洗脱剂流速1～3mL/min，洗脱剂用量为大孔树脂体积1～4倍，收集白藜芦醇多酚部位，经HPLC分析，得到富含白藜芦醇、肉桂酸类、儿茶素、丹皮酚、芦丁和槲皮素类组成的白藜芦醇多酚提取物。
HPLC分析条件：HPLC色谱柱为Hypersil GOLD aQ C18Φ250×4.6mm，5μm，流动相：甲醇与0.5%冰醋酸水溶液体积比为4:6；紫外波长306nm；柱温：30℃；流速：1mL/min。白藜芦醇、肉桂酸类、儿茶素、丹皮酚、芦丁和槲皮素的混合物标准品的出峰时间见表2，白藜芦醇多酚提取物的HPLC图如附图1所示。
表2 标准品的出峰时间表
实施例3
将丹凤牡丹籽壳干燥至水份8%以内粉碎，用10～60目的筛子进行筛分，得到丹凤牡丹籽壳细粉；在牡丹籽壳细粉中加入体积分数50%-95%的乙醇水溶液，两者的质量体积比为1:8～1:30(g:mL)，然后用微波提取60～120min，提取温度40℃～90℃，提取1～3次，过滤，合并滤液，滤液于40～60℃下减压蒸发，回收溶剂，浓缩物经真空干燥或冷冻干燥，得到白藜芦醇粗提物；将白藜芦醇粗提物按质量体积比1:5～1:10(g:mL)加入蒸馏水，60℃搅拌溶解，过滤，滤液加入体积比1:1的石油醚萃取3～5次，合并石油醚萃取相，在40～60℃下减压浓缩得到石油醚萃取物；水层继续用乙酸乙酯等体积萃取3～5次，合并乙酸乙酯萃取相，在40～60℃下减压浓缩得到乙酸乙酯萃取物；将乙酸乙酯萃取物用蒸馏水溶解，乙酸乙酯萃取物与水质量体积比为0.8～3.0 mg/mL，调节溶液pH为1.0～4.0，大孔树脂AB-8与乙酸乙酯萃取物水溶液质量体积比为1:0.5～10（mg:mL），乙酸乙酯萃取物水溶液上柱吸附速度为1～6 mL/min，样品吸附结束后用50～90%乙醇洗脱大孔树脂柱，洗脱剂流速1～3mL/min，洗脱剂用量为大孔树脂体积1～4倍，收集白藜芦醇多酚部位，经HPLC分析，得到富含白藜芦醇、肉桂酸类、儿茶素、丹皮酚、芦丁和槲皮素类组成的白藜芦醇多酚提取物。
实施例4
将丹凤牡丹籽壳干燥至水份8%以内粉碎，用10～60目的筛子进行筛分，得到丹凤牡丹籽壳细粉；在牡丹籽壳细粉中加入体积分数50%-95%的乙醇水溶液，两者的质量体积比为1:8～1:30(g:mL)，然后用微波提取60～120min，提取温度40℃～90℃，提取1～3次，过滤，合并滤液，滤液于40～60℃下减压蒸发，回收溶剂，浓缩物经真空干燥或冷冻干燥，得到白藜芦醇粗提物；将白藜芦醇粗提物按质量比1:5～1:10(g:mL)加入蒸馏水，60℃搅拌溶解，过滤，滤液加入体积比1:1的石油醚萃取3～5次，合并石油醚萃取相，在40～60℃下减压浓缩得到石油醚萃取物；水层继续用乙酸乙酯等体积萃取3～5次，合并乙酸乙酯萃取相，在40～60℃下减压浓缩得到乙酸乙酯萃取物；将乙酸乙酯萃取物用蒸馏水溶解，乙酸乙酯萃取物与水质量体积比为0.8～3.0 mg/mL，调节溶液pH为1.0～4.0，大孔树脂D101与乙酸乙酯萃取物水溶液质量体积比为1:0.5～10（mg:mL），乙酸乙酯萃取物水溶液上柱吸附速度为1～6mL/min，样品吸附结束后用50～90%乙醇洗脱大孔树脂柱，洗脱剂流速1～3mL/min，洗脱剂用量为大孔树脂体积1～4倍，收集白藜芦醇多酚部位，经HPLC分析，得到富含白藜芦醇、肉桂酸类、儿茶素、丹皮酚、芦丁和槲皮素类组成的白藜芦醇多酚提取物。
实施例5
采用硅胶柱层析分离白藜芦醇，将白藜芦醇多酚提取物溶于少量乙酸乙酯溶液中搅拌成均匀膏状，干燥并用研钵研细为粉末，均匀加入硅胶层析柱中，以乙酸乙酯与石油醚体积比为5:100～40:100为洗脱剂进行梯度洗脱，每个梯度洗脱1～3倍柱体积，收集乙酸乙酯与石油醚体积比=7:3的洗脱液，经减压浓缩后获得95%以上白藜芦醇白色粉末。
白色粉末样品的HPLC色谱图中只有一个能识别的色谱峰，其保留时间为19.388min，见附图2。在波长范围200-800nm内扫描，其中在最大吸收波长仅为219和304nm。经结构鉴定该化合物为白藜芦醇。其波谱特征如下：
红外光谱：3 300.00，1 609.91和964.55cm-1均为白藜芦醇化学结构的特征吸收峰，并且具有1 441.84、1 462.83、1 511.84、1 580cm-1等苯环的特征吸收峰。并与相关文献对照，符合白藜芦醇的红外色谱图。油牡丹籽壳白藜芦醇样品的红外谱图见附图3。
1H NMR（δ）：9.38（1H，s，OH-4´），9.18（2H，s，OH-3，5），7.35（2H，d，H-2´，6´），6.84（1H，d，J=16.3Hz，α-H），6.78（1H，d，J=16.3Hz，β-H），6.73（2H，d，H-3´，5´），6.34（2H，d，H-3´，5´），6.07（1H，t，H-4），见附图4。以及在化学位移为6.84和6.78处的双键偶合常数与报道文献中数据一致。
13C NMR（δ）：159.05（C-3，5)，157.78（C-4´），139.81（C-1´），128.58（C-1），128.46（C-α），128.40(C-2´，6´)，126.18（C-β），116.05(C-10，14)，104.82（C-2，6），102.28（C-4），见附图5。
综合1H NMR和13C NMR与已报道文献比较，鉴定为白藜芦醇。
实施例6
对白藜芦醇多酚提取物的热稳定性进行研究，结果表明白藜芦醇多酚提取物在240℃以下具有良好的热稳定性，在240～378℃之间有10-20%的质量损失，其分解速率为1.5～2.0%/min，在240～420℃下全程失重总计50～60%，失重速率2.0～3.0%/min。
白藜芦醇多酚提取物的微商热重曲线，对应热解过程有四次较大的失重阶段。第一阶段在30℃至 173℃温度范围内热解失外部水和物质中的结合水，失重峰出现在130.8℃，失重为4.63%，这阶段的失重及失重速率都较小。第二阶段173-240℃，失重峰出现在219.0℃，此时的失重速率为0.98%/min，失重较轻微，损失率为5.86%。表明白藜芦醇多酚提取物在240℃以下具有良好的热稳定性。第三阶段温度为240-378℃，失重峰出现在303.8℃，此时的失重速率为105-2.0%/min，分解速率达到最高，损失率约为10-20%。在240～420℃下全程失重总计50～60%，失重速率2.0～3.0%/min。
实施例7
以体外试验研究了白藜芦醇多酚提取物的抗氧化活性和抑菌活性。采用总抗氧化能力评价白藜芦醇多酚提取物的抗氧化活性。研究了白藜芦醇多酚提取物抑制大肠杆菌CMCC44102（Escherichia coli，E. coli）、金黄色葡 萄球菌CMCC 26003（Staphylococcus aureus，S. aureus）、产气肠杆菌ATCC 13048（Escherichia aerogenes，E. aerogenes）、表皮葡萄球菌CMCC 26069（Staphylococcus epidermidis，S. epidermidis）、肺炎克雷伯氏菌CMCC 46117（Klebsiella pneumoniae，K. pneumoniae）的能力。
VC与BHT的FRAP值分别为1 814.88和226.00mmol/L，白藜芦醇多酚提取物的FRAP值为1250.08mg/g，虽然低于VC的总抗氧化能力但远高于BHT。FRAP值越大，说明具有的还原能力越强，即总抗氧化能力越强。
抗氧化能力越高对DPPH自由基的清除能力就越强，因而半数抑制浓度IC50值越小。白藜芦醇多酚提取物对DPPH自由基均具有不同程度的清除能力。BHT 的半数抑制浓度IC50值为34.30mg/L。白藜芦醇多酚提取物的半数抑制浓度IC50为45μg/mL。
白藜芦醇多酚提取物对所测试菌种均有一定的抑制作用，具体结果见表3。白藜芦醇多酚提取物对这5种菌，均有一定的抑制作用。白藜芦醇多酚提取物对这5种菌均有抑制作用，对表皮葡萄球菌的抑制作用最好，最低抑菌浓度分别为5.2g/L。
表3 白藜芦醇多酚提取物对菌种的抑制作用
菌种 抑菌圈值（mm） 最低抑菌浓度（g/L）
肺炎克雷伯氏球菌 17.3 10.38
产气肠杆菌 12.4 20.8
表皮葡萄球菌 36.7 5.15
金黄色葡萄球菌 11.6 19.8
大肠杆菌 12.1 20.8

Claims (4)

1.一种从丹凤牡丹籽壳中制备白藜芦醇的方法，其特征在于由以下步骤组成：
第一步 原料预处理
将丹凤牡丹籽壳干燥至水份8%以内粉碎，用10～60目的筛子进行筛分，得到丹凤牡丹籽壳细粉；
第二步 白藜芦醇粗提物制备
在牡丹籽壳细粉中加入体积分数50%-95%的乙醇水溶液，两者的质量体积比为1:8～1:30(g:mL)，然后用超声波或微波辅助提取60～120min，提取温度40℃～90℃，提取1～3次，过滤，合并滤液，滤液于40～60℃下减压蒸发，回收溶剂，浓缩物经真空干燥或冷冻干燥，得到白藜芦醇粗提物；
第三步 白藜芦醇粗提物分级萃取
将白藜芦醇粗提物按质量体积比1:5～1:10(g:mL)加入蒸馏水，60℃搅拌溶解，过滤，滤液加入体积比1:1的石油醚萃取3～5次，合并石油醚萃取相，在40～60℃下减压浓缩得到石油醚萃取物；水层继续用乙酸乙酯等体积萃取3～5次，合并乙酸乙酯萃取相，在40～60℃下减压浓缩得到乙酸乙酯萃取物；
第四步 大孔脂脂选择性吸附筛选
从X-5、AB-8、NKA-Ⅱ、NKA-9、XDA-4、H103、D101和S-8大孔吸附树脂中筛选得到对白藜芦醇多酚吸附选择性好的X-5、AB-8和D101树脂，其吸附量高于2.5mg/g，吸附率和解附率大于90%；
第五步 大孔树脂吸附分离乙酸乙酯萃取物
将乙酸乙酯萃取物用蒸馏水溶解，乙酸乙酯萃取物与水质量体积比为0.8～3.0 mg/mL，调节溶液pH为1.0～4.0，大孔树脂与乙酸乙酯萃取物水溶液质量体积比为1:0.5～10（mg:mL），乙酸乙酯萃取物水溶液上柱吸附速度为1～6 mL/min，样品吸附结束后用50～90%乙醇洗脱大孔树脂柱，洗脱剂流速1～3mL/min，洗脱剂用量为大孔树脂体积1～4倍，收集白藜芦醇多酚部位，经HPLC分析，得到富含白藜芦醇、肉桂酸类、儿茶素、丹皮酚、芦丁和槲皮素类组成的白藜芦醇多酚提取物；
第六步 白藜芦醇分离
采用硅胶柱层析分离白藜芦醇，将白藜芦醇多酚提取物溶于少量乙酸乙酯溶液中搅拌成均匀膏状，干燥并用研钵研细为粉末，均匀加入硅胶层析柱中，以乙酸乙酯与石油醚体积比为5:100～40:100为洗脱剂进行梯度洗脱，每个梯度洗脱1～3倍柱体积，收集乙酸乙酯与石油醚体积比=7:3的洗脱液，经减压浓缩后获得95%以上白藜芦醇白色粉末。
2.根据权利要求1所述一一种从丹凤牡丹籽壳中制备白藜芦醇的方法，其特征在于第五步中白藜芦醇多酚HPLC分析：HPLC色谱柱为Hypersil GOLD aQ C18Φ250×4.6mm，5μm，流动相：甲醇与0.5%冰醋酸水溶液体积比为4:6；紫外波长306nm；柱温：30℃；流速：1mL/min。
3.根据权利要求1所述一种从丹凤牡丹籽壳中制备白藜芦醇的方法，其特征在于第五步得到的白藜芦醇多酚提取物在240℃以下具有良好的热稳定性，在240～378℃之间有10-20%的质量损失，其分解速率为1.5～2.0%/min，在240～420℃下全程失重总计50～60%，失重速率2.0～3.0%/min。
4.根据权利要求1所述一种从丹凤牡丹籽壳中制备白藜芦醇的方法，其特征在于第五步得到的白藜芦醇多酚提取物具有抗氧化抗菌生物活性，总抗氧化能力为1200mg/g（BHT为200mg/g）以上，半数抑制浓度为50μg/mL以下，对表皮葡萄球菌的最低抑菌浓度为5.2mg/mL以下，对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为20.6mg/mL以下。
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