CN105687367B - 一种红枣树叶标准化提取物及其制备和应用 - Google Patents

一种红枣树叶标准化提取物及其制备和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种红枣树叶标准化提取物及其制备方法和应用，该提取物包含以下组分：朦胧木酸‑3‑O‑反式‑对‑香豆酰酯134.96μg/g；朦胧木酸‑3‑O‑顺式‑对‑香豆酰酯5.27μg/g；苯甲酸6.75μg/g；2，4‑二羟基苯酚6.47μg/g；对羟基苯甲酸77.14μg/g；邻羟基苯甲酸2.24μg/g；芦丁25.13μg/g；对羟基苯甲醛10.25μg/g；山楂酸‑3‑O‑反式‑对‑香豆酰酯3.84μg/g；对羟基顺式桂皮酸1.71μg/g；对羟基反式桂皮酸9.38μg/g；3，4‑二羟基苯甲酸：1.85μg/g。经活性测试结果表明，此红枣树叶提取物具有保肝活性，可用作制成保肝药物。

Description

一种红枣树叶标准化提取物及其制备和应用
技术领域
本发明涉及一种药物技术领域的提取物及其提取方法、用途，具体是一种枣树枝叶提取物及其提取方法、定量分析方法和用途。
背景技术
枣树为鼠李科枣属落叶灌木或小乔木植物。高达十余米，树冠卵形，树皮灰褐色，有条形裂纹。枝有长枝、短枝和无芽小枝，长枝红褐色，光滑，呈之字形弯曲，具2个托叶刺；短枝在两年生以上的长枝上互生；脱落性小枝较纤细，绿色，无芽，簇生于短枝上，秋后同叶一起掉落。叶子呈卵形或卵状椭圆形，前端较短且尖，自基部生出三个主叶脉，叶两面无毛，有光泽，边缘有细齿。5-6月开花，聚伞花序腋生，花黄绿色，两性。果实长卵圆形，肉厚味甜，成熟时呈红色，后脱水变成紫红色，果核坚硬，两端较尖。其干燥成熟的果实名为大枣，是一种我国常用的传统中药，药性温和，有镇静安神，养血补气，缓和药性的功效，《本草纲目》和《神农本草经》中记载，大枣可治气血不足，胃虚厌食，心悸失眠，体倦乏力等症[1]。此外，大枣还是一种富合营养，甜美可口的水果，有我国古代五果之一的美誉。除果实可作药用外，枣树的果核、树皮、根及叶均可入药。近年来，随着经济的发展和人民生活水平的提高，人们更加注重养生，使得保健食品的市场需求迅速增加，给枣树资源的开发利用带来了广阔的前景。大枣不仅作药用具有显著的疗效与优良的保健作用，而且还是一种营养丰富的食品，以其特有的药食同源性，被人们誉为“天然的保健食品”，成为国内外研究的热点之一，有关大枣的基础研究已取得一定进展。
经对现有技术的文献检索发现，对于枣树果实红枣的研究很深入，但尚未见红枣枝叶提取物及其提取方法、用途有关的报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种红枣树叶标准化提取物及其制备和应用。本发明涉及的枣树枝叶提取物具有较好的保肝活性，可用于制备保肝类药物。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种红枣树叶标准化提取物，包含以下组分：
朦胧木酸-3-O-反式-对-香豆酰酯：134.96μg/g；
朦胧木酸-3-O-顺式-对-香豆酰酯：5.27μg/g；
苯甲酸：6.75μg/g；
2，4-二羟基苯酚：6.47μg/g；
对羟基苯甲酸：77.14μg/g；
邻羟基苯甲酸：2.24μg/g；
芦丁：25.13μg/g；
对羟基苯甲醛：10.25μg/g；
山楂酸-3-O-反式-对-香豆酰酯：3.84μg/g；
对羟基顺式桂皮酸：1.71μg/g；
对羟基反式桂皮酸：9.38μg/g；
3，4-二羟基苯甲酸：1.85μg/g。
一种红枣树叶标准化提取物的制备方法，包括以下步骤：
S1、取红枣树叶5kg，并粉碎；
S2、将粉碎的红枣树叶先用无水乙醇渗漉提取两次，每次24h，过滤，将两次乙醇提取液合并得到红枣树叶-EtOH提取液；滤渣再用水提取两次，每次24h，合并后得到红枣树叶-Water提取液；
S3、将上述两种提取液合并，并浓缩，即得到红枣树叶-EtOH-Water提取物。
本发明所述的枣树枝叶提取物可用于制备保肝药物。
本发明具有以下有益效果：所得的枣树枝叶提取物具有较好的保肝活性，可用于制备保肝类药物，并从红枣树叶中分离鉴定了13个天然化合物。
附图说明
图1为本发明实施例中枣树叶的提取流程图。
图2为本发明实施例中枣树叶中部分化合物的分离流程图。
图3为本发明实施例中枣树叶中部分化合物的分离流程图。
图4为本发明实施例中红枣树叶标准化EtOH-Water提取物的高效液相色谱图。
图5为本发明实施例中分离的13个天然化合物的结构式。
具体实施方式
为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
如图1所示，本发明实施例提供了一种红枣树叶标准化提取物的制备方法，包括以下步骤：
步骤1、取红枣树叶5kg，并粉碎；
步骤2、将粉碎的红枣树叶先用无水乙醇渗漉提取两次，每次24h，过滤，将两次乙醇提取液合并得到红枣树叶-EtOH提取液；滤渣再用水提取两次，每次24h，合并后得到红枣树叶-Water提取液；
步骤3、将上述两种提取液合并，并浓缩，即得到红枣树叶-EtOH-Water提取物。
本发明实施例还提供了一种红枣树叶标准化提取物的定量分析方法，包括以下步骤：
步骤一：用电子天平准确称取各对照品化合物1.0mg，用适宜的溶剂溶解并用甲醇稀释定容到1mL，摇匀，配制成1mg/mL的对照品溶液，放入4℃冰箱中保存。分别精密吸取上述各化合物对照品溶液10μL、40μL、80μL、150μL、200μL，并用甲醇定容至1mL，摇匀，配制成浓度为10mg/L、40mg/L、80mg/L、150mg/L、200mg/L的系列标准溶液，4℃冰箱中保存待用。
步骤二：用高效液相色谱仪分别对浓度为80mg/L的12种标准品溶液进行检测，选择不同的流动相梯度洗脱方法，根据检测结构不断调整色谱条件，确定最佳色谱条件和吸收波长，最佳色谱条件为：色谱柱：Prodigy 5μ ODS 100A(250×4.60mm 5micron)，流动相：甲醇-水(含0.2％磷酸)系统，流速：1mL/min，柱温：30℃，进样量：40μL，检测波长：254nm和320nm。
用高效液相色谱仪分析上述配制的各化合物的系列标准溶液，进样量40μL，分别记录各化合物的峰面积，以标准溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，各化合物标准曲线及其参数见表1。结果表明，各化合物浓度在10-200mg/L范围内时峰面积与浓度呈良好的线性关系，R2值均大于0.999。
表1 各化合物标准曲线
步骤三：精密称取已粉碎好的枣树叶10.0g，放入100mL带塞锥形瓶中，加入90％的乙醇溶液40mL，称重。放置过夜后，超声提取1h，待提取液冷却至室温后，补重，摇匀。上清夜经0.45μm微孔滤膜过滤，取1mL注入HPLC样品瓶中，4℃下保存待用。
分别精密吸取40μL各对照品溶液和供试品溶液，用高效液相色谱仪进行检测，根据检测结果，找出各对照品化合物对应的峰，记录其峰面积并用标准曲线法计算各化合物的含量，测定结果见表2。
表2 枣树枝叶标准化EtOH-Water提取物中各化合物含量
本发明实施例还提供了一种红枣树叶的提取分离过程，包括以下步骤：
步骤一，取枣树枝叶，乙醇渗透提取，得提取液；
步骤二，浓缩提取液，得浸膏，加水稀释，依次用二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇进行萃取，减压回收各萃取部分，得浸膏，
步骤三，硅胶柱色谱洗脱，得枣树枝叶提取物。
步骤一中，所述乙醇的体积分数为90％。
步骤二中，所述二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇萃取的次数均为3次。
步骤二中，所述减压回收具体为45℃、0.09Mpa条件下进行回收。
步骤三中，所述色谱洗脱使用的硅胶柱的目数为200～300目。
步骤三中，所述洗脱具体为：以二氯甲烷与甲醇的体积比为(200～1)∶1的梯度进行洗脱。
运用硅胶、CHP-20P、大孔树脂、Sephadex LH-20等柱层析技术从红枣枝叶中分离得到13个化合物，通过核磁共振技术(1H NMR、13C NMR、1H-1H COSY、DEPT、HMBC、HMQC)，紫外光谱技术(UV)，质谱技术(MS)等现代波谱技术确定了其结构。包括6个三萜类化合物，3个黄酮类化合物，2个酚酸类化合物，1个苯丙素苷类化合物，1个甾体类化合物；分别为：3β-羟基-齐墩果-5(6)-烯(化合物1)、5(6)，20(29)-羽扇二烯-3β醇(化合物2)、豆甾醇(化合物3)、白桦酸(化合物4)、3-氧代齐墩果酸(化合物5)、齐墩果酸(化合物6)、二氢查尔酮-4′-β-D-葡萄糖苷(化合物7)、槲皮素-3-O-芸香糖苷(化合物8)、丁香酚-β-D-葡萄糖苷(化合物9)、儿茶素(化合物10)、朦胧木酸-3-O-反式-对-香豆酰酯(化合物11)、对羟基苯甲酸(化合物12)、2，4-二羟基-苯酚(化合物13)，已鉴定化合物的结构如图5所示。
实施效果：枣树枝叶提取物的保肝活性药效学研究
(1)试验材料：
受试物为上述提取物，实验动物为雄性昆明种小白鼠，体重18-22克。取小白鼠60只，随机分5组，每组12只，第1、2组为正常对照组和模型组，灌胃蒸馏水20g/kg体重，第3组为阳性对照组(水飞蓟素)，灌胃0.08克g/kg体重；第4、5组为实验组，分别灌胃枣树叶提取物4g/kg体重和8g/kg体重，在实验第42天，正常灌胃后2小时，对照组腹腔注射花生油0.1mL/10g体重，模型组、阳性对照组和实验组腹腔注射0.1％四氯化碳花生油溶液0.1mL/10g体重。所有动物断粮不断水，16小时后摘眼球采血，颈部脱臼处死，取肝脏测定。血清中谷丙、谷草转氨酶的测定：采集全血，3000转每分钟离心，分离血清，用试剂盒测定谷丙(ALT)、谷草转氨酶(AST)。肝脏中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的测定：取右叶肝脏制备10％肝匀浆，4℃3000转离心20分钟，上清液用于测定丙二醛、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶。
(2)结果
表3 枣树叶提取物对四氯化碳致小鼠肝脏损伤血液生化指标的影响(X±SD)
具有不同小写字母表示有显著性差异(p＜0.05)。
表4 枣树叶提取物对四氯化碳致小鼠肝脏损伤肝脏生化指标的影响(X±SD)
具有不同小写字母表示有显著性差异(p＜0.05)。
表3和表4可知，与模型对照组相比，枣树叶提取物能够显著降低小鼠血清
ALT和AST的活性，同时能够提高肝脏GSH-Px和SOD的活性，降低小鼠肝脏氧化产物MDA的含量，本发明的枣树叶标准化提取物为预防四氯化碳肝脏损伤的有效部位。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，对发明而言仅仅是说明性的，而非限制性的。本专业技术人员理解，在发明权利要求所限定的范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效，但都将落入本发明的保护范围内。另外，本发明对于化合物活性研究部分，主要研究的是保肝活性和抗肿瘤活性，但是对于枣树枝叶所具有的其他广泛生物活性，例如改善心血管作用，免疫作用等活性，也将落入本发明的保护范围内。

Claims (2)

1.一种红枣树叶标准化提取物，其特征在于，包含以下组分：
朦胧木酸-3-O-反式-对-香豆酰酯：134.96μg/g；
朦胧木酸-3-O-顺式-对-香豆酰酯：5.27μg/g；
苯甲酸：6.75μg/g；
2，4-二羟基苯酚：6.47μg/g；
对羟基苯甲酸：77.14μg/g；
邻羟基苯甲酸：2.24μg/g；
芦丁：25.13μg/g；
对羟基苯甲醛：10.25μg/g；
山楂酸-3-O-反式-对-香豆酰酯：3.84μg/g；
对羟基顺式桂皮酸：1.71μg/g；
对羟基反式桂皮酸：9.38μg/g；
3，4-二羟基苯甲酸：1.85μg/g；
所述红枣树叶标准化提取物按照以下方法提取得到：
S1、取红枣树叶5kg，并粉碎；
S2、将粉碎的红枣树叶先用无水乙醇渗漉提取两次，无水乙醇的体积分数为90％，每次24h，过滤，将两次乙醇提取液合并得到红枣树叶-EtOH提取液；滤渣再用水提取两次，每次24h，合并后得到红枣树叶-Water提取液；
S3、将上述两种提取液合并，并浓缩，即得到红枣树叶-EtOH-Water提取物。
S4、浓缩红枣树叶-EtOH-Water提取物，加水稀释，依次用二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇进行萃取，二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇萃取的次数均为3次，在45℃、0.09Mpa的条件下减压回收各萃取部分，得浸膏；
S5、硅胶柱色谱洗脱，得枣树枝叶提取物，色谱洗脱使用的硅胶柱的目数为200～300目，洗脱具体条件为：二氯甲烷与甲醇的体积比为200～1∶1的梯度进行洗脱；
S6、运用硅胶、CHP-20P、大孔树脂、Sephadex LH-20柱层析技术从红枣枝叶中分离得到13个化合物。
2.如权利要求1所述的一种红枣树叶标准化提取物的应用，其特征在于，所述提取物用作制备保肝药物。
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