CN108845071A - 三种法定基源黄精的鉴别方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及三种法定基源黄精的鉴别方法。利用超声法提取收集到的药材，提取液经PS/AL固相萃取小柱净化后，采用超高效液相色谱串联静电场轨道阱高分辨质谱(UPLC‑Orbitrap MS)技术分别对其化学成分进行表征，并用多元统计分析处理数据，包括主成分分析(PCA)、偏最小二乘法判别分析(PLS‑DA)、正交校正的偏最小二乘分析(OPLS‑DA)及聚类分析(HCA)。我们发现三种基源黄精药材的化学成分存在明显差异，所建分析方法可用于区分三种法定基源黄精，研究结果将为黄精药材的深入研究及质量标准的科学制定提供依据。

Description

三种法定基源黄精的鉴别方法
技术领域
本发明涉及中药鉴定领域，尤其是对于黄精化学成分的鉴定。
背景技术
黄精始载于晋代《名医别录》，具补肾益精、滋阴润燥之功，用于滋补强身和治疗肾虚精亏，肺虚燥咳以及脾胃虚弱之证[1]，是中医临床常用药物之一。现代药理学研究证明，黄精具有增强免疫、降低血脂、血糖、延缓衰老等多种药理作用[2]，是重要的药食两用资源，誉有“血气双补之王”之称[3]。
2015版《中国药典》规定，黄精来源于百合科植物滇黄精Polygonatum kingianumColl.et Hemsl.、黄精Polygonatum sibiricum Red.或多花黄精Polygonatum cyrtonemaHua的干燥根茎。根据形状不同，分别习称“大黄精”、“鸡头黄精”、“姜形黄精”[1]。3种法定基源黄精在中国分布较广，蕴藏量较大，其中黄精分布于东北、华北、西北、华东以及河南、湖北、四川、贵州；多花黄精分布于华东、中南、四川、贵州等地；滇黄精主产云南，四川、贵州、广西等省区也有分布[4]。
黄精主要含有多糖、甾体皂苷、三萜皂苷、黄酮、蒽醌、生物碱、木脂素、氨基酸等成分[5]，其中甾体皂苷、三萜皂苷、黄酮为黄精属植物的特征性成分，甾体皂苷和多糖在黄精中含量较高且通常认为是其主要活性成分。尽管当前已建立了黄精植物这一个品种[6]的HPLC指纹图谱及浙江产黄精药材酸水解物的HPLC指纹图谱[7]，且报道了不同产地的黄精植物中薯蓣皂苷元含量差异较大[6]，然而，药典收载的三种法定基源黄精的化学成分是否存在差异目前仍未见报道。另外，在药材市场上，市售黄精类药材多为片状，难以采用性状鉴别、显微等方法区分、鉴别不同品种药材。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本文采用超高效液相色谱串联四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱技术对收集的不同基源的黄精药材的化学成分进行表征分析，并利用主成分分析(PCA)、偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)、正交校正的偏最小二乘分析(OPLS-DA)及聚类分析(HCA)4种多元统计分析方法对数据进行比较分析，首次探讨不同基源黄精化学成分的差异性。
本研究所建立方法可用于区分三种基源的黄精药材，研究结果将为黄精药材质量标准科学制定提供依据，并为进一步黄精药效评价、资源开发利用奠定基础。
具体的，本发明采用如下方法进行鉴别不同批次的法定基源黄精。
三种法定基源黄精的鉴别方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)供试品溶液制备；
2)UHPLC/MS分析；
3)数据统计分析。
进一步的，三种法定基源黄精的鉴别方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)供试品溶液制备：将黄精粉碎、提取，浸膏用固相萃取小柱萃取后用甲醇复溶得供试品溶液；
2)UHPLC/MS分析；
3)数据统计分析：采用HCA、PCA、PLS和/或OPLS-DA中的一种或多种进行多元统计分析。
进一步的，三种法定基源黄精的鉴别方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)供试品溶液制备：
将黄精药材烘干，粉碎；称取粉末超声提取，收集滤液；浸膏用有机溶剂复溶；用活化后的PS/AL固相萃取小柱洗脱复溶后的浸膏；收集洗脱液，用有机溶剂复溶；滤过后得供试品溶液；
2)UHPLC/MS分析：
UHPLC条件为反相色谱柱；流动相：乙腈和水梯度洗脱；
质谱条件为采用全扫描和数据相关二级质谱模式检测；离子源为ESI。
3)数据统计分析：
采用HCA、PCA、PLS和/或OPLS-DA中的一种或多种进行多元统计分析。
进一步的，三种法定基源黄精的鉴别方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)供试品溶液制备：
将黄精药材放入烘箱烘干至恒重，粉碎，过20-60目筛；精密称取粉末至锥形瓶中，加入60-80％乙醇，摇匀，超声提取1-3次，每次20-60min，合并滤液，减压回收溶剂，浸膏用60-80％甲醇复溶；取PS/AL固相萃取小柱，用甲醇活化，水洗涤，再将样品溶液倒入固相萃取小柱中，依次用纯水淋洗和甲醇洗脱；收集洗脱液，减压回收溶剂，用60-80％甲醇复溶并定容；0.22μm滤膜滤过后得供试品溶液，保存备用；
2)UHPLC/MS分析：
UHPLC条件为色谱柱：C18色谱柱；流动相：乙腈和水梯度洗脱；
质谱条件为采用全扫描和数据相关二级质谱模式检测；离子源为ESI；毛细管温度320℃；喷雾气流速1.5L/min；加热模块250℃；
3)数据统计分析：
采用HCA、PCA、PLS和/或OPLS-DA中的一种或多种进行多元统计分析。
进一步的，三种法定基源黄精的鉴别方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)供试品溶液制备：
将黄精药材放入50℃烘箱烘干至恒重，粉碎，过40目筛；精密称取粉末5g至锥形瓶中，加入70％乙醇40mL，摇匀，500W，40KHz超声提取30min，放冷，抽滤，收集滤液；滤渣及滤纸一并转移至锥形瓶中，加70％乙醇40mL，超声30min提取第二次，放冷，抽滤，收集滤液；合并两次滤液，减压回收溶剂，浸膏用5mL 70％甲醇复溶；取PS/AL固相萃取小柱，用20mL甲醇活化，20mL水洗涤，再将5mL样品溶液倒入固相萃取小柱中，依次用20mL的纯水淋洗和25mL的甲醇洗脱；收集洗脱液，减压回收溶剂，用70％甲醇复溶并定容至5mL；0.22μm滤膜滤过后得供试品溶液，4℃冰箱保存备用。
2)UHPLC/MS分析：
UHPLC条件为色谱柱：Agilent Zorbax SB-C18；流动相：乙腈A和水B梯度洗脱：0min，10％A；20min，25％A；30min，35％A；40min，50％A；50min，65％A；60min，85％A；70min，100％A；75min，100％A；流速1.0mL/min；柱温30℃；进样体积10μL；
质谱条件为采用全扫描和数据相关二级质谱模式检测；离子源为ESI；毛细管温度320℃；喷雾气流速1.5L/min；加热模块250℃；全扫描正、负离子同时检测，分辨率70 000；接口电压：(+)3.5kV，(-)2.8kV；质量范围m/z：100～1000Da；最长注入时间：200msec；二级质谱正、负离子同时检测，数据相关二级质谱对最高的5个峰进行二级质谱裂解：分辨率17500，质量范围m/z：50～1000Da；最长注入时间：50msec；CID能量：30％；使用动态排除，动态排除时间:10s；工作站：Xcalibar 3.0.63；
3)数据统计分析：
采用HCA、PCA、PLS和/或OPLS-DA同时进行多元统计分析。
附图说明
图1：17批黄精样品的总离子流图(A-正离子模式；B-负离子模式)
图2：17批黄精样品的PCA散点图(A-正离子模式；B-负离子模式)
I-多花黄精；II-滇黄精；III-黄精
图3：17批黄精样品的PLS-DA散点图(A-正离子模式；B-负离子模式)
I-多花黄精；II-滇黄精；III-黄精
图4：17批黄精药材的OPLS-DA散点图(A-正离子模式；B-负离子模式)
I-多花黄精；II-滇黄精；III-黄精
图5：PCA模式下的HCA树状图(A-正离子模式；B-负离子模式)
图6：PLS-DA模式下的HCA树状图(A-正离子模式；B-负离子模式)
图7：PLS-DA模式下的HCA树状图(A-正离子模式；B-负离子模式)
具体实施方式
下面结合具体实施方式，对本发明作进一步说明。
实施例1 17批黄精药材的鉴定
1仪器与试药
1.1仪器
Ultimate 3000超高效液相色谱串联Q Exactive四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱(赛默飞世尔科技，美国)，配有CBM-20A系统控制器，LC-20AD四元泵，SIL-20A自动进样器，CTO-20A柱温箱及SPD-M20A PDA检测器；超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；DK-S24电热恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司)；N-11000-WD旋转蒸发器(上海爱朗仪器有限公司)；万分之一电子分析天平(德国Sartorius公司)；HR/16M高速冷冻离心机(湖南赫西仪器装备有限公司)；MILLI-Q超纯水系统(美国Millipore公司)。
1.2试剂与样品来源
PS/AL固相萃取小柱(天津博纳艾杰尔科技公司)；色谱级乙腈、色谱级甲醇(德国Merk公司)；超纯水由MILLI-Q超纯水系统制备；其余试剂均为分析纯。本研究收集到黄精药材共17批(表1)，其中1～8批经云南中医学院俞捷副教授鉴定为百合科黄精属(Polygonatum)植物滇黄精Polygonatum kingianum Coll.et Hemsl.，9～11批与12～17批经赣南医学院胡海波老师分别鉴定为百合科黄精属(Polygonatum)植物多花黄精Polygonatum cyrtonema Hua.和百合科黄精属(Polygonatum)植物黄精Polygonatumsibiricum.Red.，凭证标本均保存于昆明市代谢性疾病中医药防治重点实验室。
表1黄精样品信息及其PCA结果
2方法
2.1供试品溶液制备
将黄精药材放入50℃烘箱烘干至恒重，粉碎，过40目筛。精密称取粉末5g至锥形瓶中，加入70％乙醇40mL，摇匀，超声提取(500W，40KHz)30min，放冷，抽滤，收集滤液；滤渣及滤纸一并转移至锥形瓶中，加70％乙醇40mL，超声30min提取第二次，放冷，抽滤，收集滤液；合并两次滤液，减压回收溶剂(50℃)，浸膏用5mL70％甲醇复溶。取PS/AL固相萃取小柱，用20mL甲醇活化，20mL水洗涤，再将5mL样品溶液倒入固相萃取小柱中，依次用20mL的纯水淋洗和25mL的甲醇洗脱；收集洗脱液，减压回收溶剂(50℃)，用70％甲醇复溶并定容至5mL。0.22μm滤膜滤过后得供试品溶液，4℃冰箱保存备用。
2.2UHPLC/MS分析条件
UHPLC条件色谱柱：Agilent Zorbax SB-C18(250mm×4.6mm,5μm)；流动相：乙腈(A)和水(B)梯度洗脱(0min，10％A；20min，25％A；30min，35％A；40min，50％A；50min，65％A；60min，85％A；70min，100％A；75min，100％A)；流速1.0mL/min；柱温30℃；进样体积10μL。
质谱条件采用全扫描(Full Mass)和数据相关二级质谱(DD-MS2)模式检测；离子源为ESI；毛细管温度320℃；喷雾气流速1.5L/min；加热模块250℃；全扫描正、负离子同时检测，分辨率70 000；接口电压：(+)3.5kV，(-)2.8kV；质量范围m/z：100～1000Da；最长注入时间(Maximun IT)：200msec。二级质谱正、负离子同时检测，数据相关二级质谱对最高的5个峰进行二级质谱裂解：分辨率17 500，质量范围m/z：50～1000Da；最长注入时间(MaximunIT)：50msec；CID能量：30％；使用动态排除，动态排除时间:10s。工作站：Xcalibar 3.0.63，用于LC/MS数据处理、分子式预测和精确分子量计算。
2.3数据统计分析
实验所得原始数据先导入XCMS-online软件处理转换为Excel格式，再将Excel表中数据导入Simca 14.1软件进行多元统计分析(HCA、PCA、PLS、OPLS-DA)。
3结果与讨论
3.1LC/MS分析
已采用黄精药材中含有较多量的多糖、鞣质等水溶性成分[5]，会严重降低药材中甾体皂苷、三萜皂苷及黄酮等特征成分的检测灵敏度及分离度。目前已有研究[6]采用液-液萃取法(正丁醇为萃取剂)净化黄精样品以建立其HPLC指纹图谱，对黄精皂苷类等成分进行了较好分离和检测，与液-液萃取法相比，固相萃取法具有回收率高，分离速度快，不产生乳化，溶剂用量少等特点[8]，而大孔吸附树脂常用于去除中药中的多糖、鞣质等水溶性成分。为此，本研究采用以大孔吸附树脂为主要填料的PS/AL固相萃取小柱对黄精药材提取液进行净化处理，除去样品中强极性水溶性成分后，再采用LC/MS对其中的皂苷、黄酮等特征成分进行表征，结果见图1。
从图中可看出，17批黄精样品中的大量成分已被表征出，且主要色谱峰均得到较好分离。通过对比发现，不同产地的同基源黄精的化学成分仍存在差异(如，1～8批滇黄精中，样品2与其余7种样品差异较大；9～11批多花黄精中，样品9与样品10和11差异较大；12～17批黄精区别亦较大)，这很可能是因为这些样品生长在不同地区(环境)，其生长条件、种植方式或(和)管理方式不同而致使这些同基源样品的化学成分存在明显差异；另外，一些采自同一行政区的同基源黄精样品(如1～3批均采自文山平坝镇，7～8批采自文山大坪镇)的成分也存在一定差异，这可能亦是不同的种植和管理方式导致的。这些结果充分体现了不同产地的同一品种药材的化学成分可能存在明显差异，在开展中药指纹图谱建立、中药制剂及临床应用等工作中应给予充分考虑。更值得注意的是，不同基源黄精的化学成分差异更明显，为了更好地比较三种黄精化学成分差异，本文将对获取的LC/MS数据进行多元统计分析。
3.2多元统计分析
3.2.1 PCA已普遍被用于中药质量标准研究数据的统计分析中[9]，通过对数据降维、变量提取与压缩、确定中药资源的分类和聚类，并从中获取能用于区分、鉴别等有用信息。PCA测定结果见表1与图2。从图中可看出，除2批黄精品种(12和15)与滇黄精品种有些交叉外，其余15批黄精药材明显聚为三类，1～8批滇黄精聚为一类，9～11批多花黄精聚为一类，13～17批黄精(除15批以外)聚为另一类。结果表明，多花黄精、滇黄精和黄精的化学成分存在差异(图2)。
3.2.2 PLS-DA为多变量数据分析技术中的判别分析法，基本思想是根据己知样品集特征，选定适合的判别准则，建立定性分析模型，最后用于判定未知样品。PLS-DA结果如图3，其中+p的R2X为0.476，R2Y为0.999；-p的R2X为0.409，R2Y为0.999，17批黄精药材明显聚成三类，1～8批滇黄精聚为一类，9～11批多花黄精聚为一类，12～17批黄精聚为另一类。结果表明，滇黄精、多花黄精和黄精的化学成分存在明显差异(图3)。
3.2.3 OPLS-DA是一种多因变量对多自变量的回归建模方法，其最大特点是可以去除自变量X中与分类变量Y无关的数据变异，使分类信息主要集中在一个主成分中，模型变得简单和易于解释，其判别效果及主成分得分图的可视化效果更加明显[10]。OPLS-DA分析结果见图4，其中+p的R2X为0.673，R2Y为1；-p的R2X为0.585，R2Y为1，17批黄精药材也明显聚成三类，1～8批滇黄精聚为一类，9～11批多花黄精聚为一类，12～17批黄精聚为另一类。结果表明，滇黄精、多花黄精和黄精的化学成分存在明显差异(图4)。
HCA是根据研究对象特征对研究对象进行分类的一种方法，把性质相近的个体归为一类，使得同一类中的个体都具有高度的同质性，不同类之间的个体具有高度的异质性[11]。本文分别在PCA、PLS-DA、OPLS-DA模式下进行HCA分析，结果见图5～7。从图可看出，在黄精药材的HCA图中，三种黄精均明显聚为了三类(除图5A中12和15批黄精样品与滇黄精样品聚为一类外)。
尽管不同产地的同基源黄精的化学成分存在明显差异，但三种不同基源黄精样品却明显聚为了三类，且四种统计方法(PCA、PLS-DA、OPLS-DA及HCA)的分析结果一致，充分说明了三种法定基源黄精药材(多花黄精、滇黄精、黄精)的化学成分存在明显差异，但它们的药理作用是否存在差异值得深入研究。此外，研究结果也证明本文所建立的PS/AL固相萃取-LC/MS分析方法可用于快速、有效区分三种法定基源黄精(同基源黄精的化学成分有明显差异情况下亦可用于区分不同基源)。
4结论
采用超声法提取所收集的17批不同品种的黄精药材，提取液经PS/AL固相萃取小柱净化，除去大部分水溶性成分后，采用LC/MS表征分析样品的化学成分，并利用PCA、PLS-DA、OPLS-DA、HCA对数据进行了统计分析。结果表明，三种法定基源黄精药材的化学成分存在明显差异，且所建方法可用于区分三种法定基源黄精。研究结果将为黄精药材基源鉴定及质量标准科学制定提供依据，并为深入比较不同基源黄精的药理作用及黄精药材资源的开发利用奠定基础。
实施例2 60批黄精药材的鉴定
为了进一步证实实验结果的可靠性，加大带测样品数量，并采用以上同样的方法进行检测，结果如下：
待测样品：滇黄精20份；黄精20份；多花黄精20份。
将其分别进行编号后打乱并粉碎，实验人员未知不同编号的样品所对应之基源。
采用本文所述方法对各样品进行测定，结果如下：
表2 PCA分析结果
表3 PLS-DA分析结果
表4 OPLS-DA分析结果
表5 HCA分析结果
在此基础上，综合上述四种分析结果综合分析，可以准确或者每一种编号的样品基源，结果如下表：
表6四种方法分析结果
参考文献：
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综上所述，以上仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.三种法定基源黄精的鉴别方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)供试品溶液制备；
2)UHPLC/MS分析；
3)数据统计分析。
2.权利要求1所述的三种法定基源黄精的鉴别方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)供试品溶液制备：将黄精粉碎、提取，浸膏用固相萃取小柱萃取后用甲醇复溶得供试品溶液；
2)UHPLC/MS分析；
3)数据统计分析：采用HCA、PCA、PLS和/或OPLS-DA中的一种或多种进行多元统计分析。
3.权利要求1或2三种法定基源黄精的鉴别方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)供试品溶液制备：
将黄精药材烘干，粉碎；称取粉末超声提取，收集滤液；浸膏用有机溶剂复溶；用活化后的PS/AL固相萃取小柱洗脱复溶后的浸膏；收集洗脱液，用有机溶剂复溶；滤过后得供试品溶液；
2)UHPLC/MS分析：
UHPLC条件为反相色谱柱；流动相：乙腈和水梯度洗脱；
质谱条件为采用全扫描和数据相关二级质谱模式检测；离子源为ESI。
3)数据统计分析：
采用HCA、PCA、PLS和/或OPLS-DA中的一种或多种进行多元统计分析。
4.权利要求1或2所述的三种法定基源黄精的鉴别方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)供试品溶液制备：
将黄精药材放入烘箱烘干至恒重，粉碎，过20-60目筛；精密称取粉末至锥形瓶中，加入60-80％乙醇，摇匀，超声提取1-3次，每次20-60min，合并滤液，减压回收溶剂，浸膏用60-80％甲醇复溶；取PS/AL固相萃取小柱，用甲醇活化，水洗涤，再将样品溶液倒入固相萃取小柱中，依次用纯水淋洗和甲醇洗脱；收集洗脱液，减压回收溶剂，用60-80％甲醇复溶并定容；0.22μm滤膜滤过后得供试品溶液，保存备用；
2)UHPLC/MS分析：
UHPLC条件为色谱柱：C18色谱柱；流动相：乙腈和水梯度洗脱；
质谱条件为采用全扫描和数据相关二级质谱模式检测；离子源为ESI；毛细管温度320℃；喷雾气流速1.5L/min；加热模块250℃；
3)数据统计分析：
采用HCA、PCA、PLS和/或OPLS-DA中的一种或多种进行多元统计分析。
5.权利要求1或2所述的三种法定基源黄精的鉴别方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)供试品溶液制备：
将黄精药材放入50℃烘箱烘干至恒重，粉碎，过40目筛；精密称取粉末5g至锥形瓶中，加入70％乙醇40mL，摇匀，500W，40KHz超声提取30min，放冷，抽滤，收集滤液；滤渣及滤纸一并转移至锥形瓶中，加70％乙醇40mL，超声30min提取第二次，放冷，抽滤，收集滤液；合并两次滤液，减压回收溶剂，浸膏用5mL 70％甲醇复溶；取PS/AL固相萃取小柱，用20mL甲醇活化，20mL水洗涤，再将5mL样品溶液倒入固相萃取小柱中，依次用20mL的纯水淋洗和25mL的甲醇洗脱；收集洗脱液，减压回收溶剂，用70％甲醇复溶并定容至5mL；0.22μm滤膜滤过后得供试品溶液，4℃冰箱保存备用。
2)UHPLC/MS分析：
UHPLC条件为色谱柱：Agilent Zorbax SB-C18；流动相：乙腈A和水B梯度洗脱：0min，10％A；20min，25％A；30min，35％A；40min，50％A；50min，65％A；60min，85％A；70min，100％A；75min，100％A；流速1.0mL/min；柱温30℃；进样体积10μL；
质谱条件为采用全扫描和数据相关二级质谱模式检测；离子源为ESI；毛细管温度320℃；喷雾气流速1.5L/min；加热模块250℃；全扫描正、负离子同时检测，分辨率70 000；接口电压：(+)3.5kV，(-)2.8kV；质量范围m/z：100～1000Da；最长注入时间：200msec；二级质谱正、负离子同时检测，数据相关二级质谱对最高的5个峰进行二级质谱裂解：分辨率17 500，质量范围m/z：50～1000Da；最长注入时间：50msec；CID能量：30％；使用动态排除，动态排除时间:10s；工作站：Xcalibar 3.0.63；
3)数据统计分析：
采用HCA、PCA、PLS和/或OPLS-DA同时进行多元统计分析。
6.权利要求1或2所述的三种法定基源黄精的鉴别方法所鉴定的黄精。
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