CN109164178A - 一种栀子及其炮制品的质量检测及鉴别方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种栀子及其炮制品的质量检测及鉴别方法，它是采用高效液相色谱法进行检测和鉴别，包括如下步骤：(1)取待检样品，加乙醇超声提取，过滤，取续滤液作为供试品溶液；(2)取栀子苷、西红花苷I、绿原酸、京尼平‑1‑β‑D‑龙单双糖苷对照品适量，加甲醇溶解配制对照品溶液；(3)取待测供试品，采用高效液相色谱法检测，建立对照指纹图谱，供试品指纹图谱中至少含有6个特征峰，其中4个峰分别与相应的对照品峰保留时间相同，西红花苷I相应的峰与峰5的峰面积比值不得大于0.7。本方法操作简单，快速，重复性好，可用于栀子及其炮制品的检测和鉴别。

Description

一种栀子及其炮制品的质量检测及鉴别方法

技术领域

本发明涉及一种栀子及其炮制品的质量检测及鉴别方法。

背景技术

栀子(Gradenia jasminoides Ellis)系茜草科栀子属植物的干燥成熟果实，属卫生部颁布的第一批药食两用资源，是一种传统中药，具有护肝、利胆、降压、镇静、止血、消肿等作用，在中医临床常用于治疗黄疸型肝炎、扭挫伤、高血压、糖尿病等症。在食品上常用其提取以藏红花素、藏花酸为主体的栀子黄色素。栀子含有11种环烯醚萜苷类化合物，包括栀子苷(Geniposide)、羟异栀子苷(Gardenoside)、京尼平1-β-龙胆双糖苷(Genipin1-β-gentiobioside)、栀子苷酸(Geniposidic acid)、京尼平(Genipin)等。而栀子苷是主要的环烯醚萜苷化合物，它是栀子作为中药的有效成分。此外，栀子中还含有有机酸类化合物如绿原酸，二萜类化合物如西红花苷等。

栀子的鉴别及分析测定方法较多，有纸色谱、薄层色谱、紫外分光光度法、薄层扫描法及HPLC法等，但均存在不同程度的缺点和不足之处。栀子、炒栀子、焦栀子饮片在性状上存在明显的差异，通过性状即可简单快速地对其进行鉴别。但是栀子、炒栀子、焦栀子通过水提取、浓缩、干燥、制粒等工艺制成配方颗粒之后，失去了性状上的差异，很难直观地对其进行辨别。因此建立一种能快速鉴别检测栀子及其炮制品的方法很有意义。

邵坚等人利用HPLC/DAD对栀子全果、果仁、果皮生品及其炮制品中京尼平苷酸、去乙酰车叶草酸甲酯、京尼平龙胆二糖苷、栀子苷、绿原酸、西红花苷I和西红花苷II进行过定量分析(邵坚，罗光明，朱继孝，张忠立，张兰，董艳凯，魏春华.栀子炮制前后 7种成分的比较研究[J].中草药，2015，46(11):1629-1633.)。杜伟锋等人采用HPLC-DAD 比较了不同产地的栀子及其炮制品中绿原酸、栀子苷和西红花苷-I的量(杜伟锋，梁小娟，吴晶宇，丛晓东，张云，蔡宝昌.栀子炮制前后绿原酸、栀子苷和西红花苷-Ⅰ的比较[J].中草药，2011，42(10):2008-2010.)。但关于栀子及其炮制品的质量检测方法及采用指纹图谱法鉴别栀子炮制品如炒栀子、焦栀子或含炒栀子、焦栀子为原料的药物的方法尚未见文献报道。

发明内容

本发明提供了一种栀子及其炮制品的质量检测方法，还提供了一种鉴别炒栀、焦栀子或含炒栀子、焦栀子为原料的药物的方法。

本发明提供了一种栀子及其炮制品的质量检测方法，它是采用高效液相色谱法进行检测，其操作步骤如下：

(1)供试品溶液的制备：取待检样品，加乙醇提取，滤过，即得；

(2)对照品溶液的制备：取栀子苷、西红花苷I、绿原酸、京尼平-1-β-D-龙单双糖苷对照品，加甲醇制成每1ml分别含30μg、148μg、40μg、100μg的溶液，即得；

(3)分别吸取对照品溶液与供试品溶液注入液相色谱仪，色谱条件为：

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以水为流动相A，以乙腈为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为1.0ml/min；柱温：30℃；

进一步优选地，所述的栀子炮制品为焦栀子、炒栀子。

其中，步骤(1)所述的乙醇浓度为50％；所述的提取方法为超声提取，提取功率600W；提取时间为20min。其中，步骤(3)所述的十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm；检测波长：0～23min为238nm,23～40min为440nm。

本发明还提供了一种鉴别栀子炮制品的方法，它包括如下步骤：

1)取待检栀子炮制样品；

2)按所述的高效液相色谱法进行检测；

3)分析检测结果。

其中，所述的栀子炮制品包括炒栀子、焦栀子或以炒栀子、焦栀子为原料的药物，高效液相色谱法检测的指纹图谱中至少含有6个特征峰，其中4个峰分别与相应的对照品峰保留时间相同，与栀子苷对照品相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±5％之内，相对保留时间分别为：0.410(峰1)、0.806(峰 2)、0.881(峰3)、1.000(峰4/S)、1.455(峰5)。

其中，西红花苷I相应的峰与峰5的峰面积比值不得大于0.7。

本发明以栀子配方颗粒、炒栀子配方颗粒、焦栀子配方颗粒特征峰的相对峰面积差异为甄别关键点，建立高效液相色谱法快速对焦栀子配方颗粒进行鉴别，防止临床上将焦栀子配方颗粒和栀子配方颗粒、炒栀子配方颗粒进行混用，保证用药的安全。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其他多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1：对照品特征图谱峰2：京尼平-1-β-D-龙单双糖苷，峰3：绿原酸；峰4(S)：栀子苷，峰6：西红花苷I

图2：栀子苷紫外吸收光谱图

图3：西红花苷I紫外吸收光谱图

图4：西红花苷II紫外吸收光谱图

图5：绿原酸紫外吸收光谱图

图6：焦栀子配方颗粒不同波长色谱图

图7：不同温度考察下的焦栀子配方颗粒色谱图

图8：不同流速考察下的焦栀子配方颗粒色谱图

图9：焦栀子配方颗粒色谱峰指认色图谱

图10：焦栀子配方颗粒在不同仪器上的色谱图

图11：焦栀子配方颗粒在不同色谱柱上的色谱图

图12 ：9批栀子配方颗粒特征图谱

图13 ：12批炒栀子配方颗粒特征图谱

图14： 8批焦栀子配方颗粒特征图谱

具体实施方式

1、材料、试剂与仪器

(1)实验仪器及材料高效液相色谱仪：安捷伦1200型高效液相色谱仪、安捷伦1260型高效液相色谱仪、Waters2695-2996型高效液相色谱仪；电子天平：ME204E/02(梅特勒-托利多仪器有限公司)；超纯水机：细胞型1810A(上海摩勒科学仪器有限公司)；超声波清洗器：KQ5200DB型(600W，40kHz；昆山市超声仪器有限公司)；色谱柱： Agilent 5HC-C18(4.6×250mm，5μm)、Agilent 5TC-C18(4.6×250mm，5μm)、Phenomenex Luna C18(2)(250×4.60mm，5μm)。

(2)试剂及试药乙腈、乙酸、磷酸为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。栀子苷(中国食品药品检定研究院，批号：110749-201718，含量以97.6％计)，绿原酸(中国食品药品检定研究院，批号：110749-201316，含量以97.5％计)，西红花苷I(中国食品药品检定研究院，批号：111588-201303，含量以92.6％计)，西红花苷II(中国食品药品检定研究院，批号：111589-201304，含量以92.4％计)，京尼平-1-β-D-龙单双糖苷(四川省维克奇生物科技有限公司，CAS号：29307-60-6，含量以99.32％计)。炒栀子配方颗粒(1502016、1504005、1507122、15090012、1510002、1601041、1603083、1610073、 1801041、SY1802001、SY1802002、SY1802003)；焦栀子(16030118、16110036、16110037、 17110166、17110167、SY1803004、SY1803005、SY1803006)；栀子配方颗粒(1504087、 1506132、1512052、1612031、1707013、1712010、SY1804001、SY1804002、SY1804003)，均由四川新绿色药业科技发展有限公司提供。

实施例1焦栀子配方颗粒特征图谱

色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm)；以水为流动相A，以乙腈为流动相B，按1表中的规定进行梯度洗脱；流速为1.0m/minl；检测波长：0～23min为238nm,23～40min为440nm。

表1梯度洗脱程序

对照品溶液的制备取栀子苷、西红花苷I、绿原酸、京尼平-1-β-D-龙单双糖苷对照品，加甲醇制成每1ml分别含30μg、148μg、40μg、100μg的溶液，即得。

供试品溶液的制备取本品颗粒0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入50％乙醇50ml，称定重量，超声处理20min(超声提取功率：600W)，放冷，再称定重量，用50％乙醇补足减失的重量，摇匀，即得。

测定法分别吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

供试品特征图谱中应呈现6个特征峰，其中4个峰应分别与相应的参照物峰保留时间相同，与栀子苷参照物相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±5％之内。规定值为：0.410(峰1)、0.806(峰2)、0.881(峰3)、 1.000(峰4/S)、1.455(峰5)。与西红花苷I参照物相应的峰与峰5的峰面积比值不得大于0.7。特征图谱如附图1所示。

实施例2栀子及其炮制品的质量检测的色谱条件考察

1、检测波长的选择在拟定的试验条件基础上，利用二极管阵列检测器分别对栀子苷、西红花苷I、绿原酸、京尼平-1-β-D-龙单双糖苷对照品溶液进行分析，并分别提取供试品溶液在238nm、270nm、327nm、440nm波长下的色谱图。色谱图见附图2-6。

结果表明，栀子苷出峰时间在14min附近，紫外最大吸收波长为238nm。西红花苷I、西红花苷II出峰时间分别在26min和28min附近，紫外最大吸收波长为440nm。为确保色谱峰信息量较大，故焦栀子配方颗粒特征图谱检测波长确定为：0～23min检测波长为 238nm，23～40min检测波长为440nm。

2、柱温的考察分别对柱温为20℃、30℃、40℃时进行考察。色谱图见附图7，结果见表2-6。

表2柱温考察—特征峰保留时间

表3柱温考察—特征峰相对保留时间比值

表4柱温考察—特征峰峰面积

表5柱温考察—特征峰相对峰面积比值

表6特征峰峰6与峰5的峰面积比值

结果表明，柱温在20-30℃时，色谱图峰形均较为对称，分离度均好，且峰相对保留时间均小于5％，方法耐用性较好。但柱温在40℃时对峰3影响较大，故确定柱温为30℃进行后续考察。峰6(西红花苷I)与峰5的比值小于0.7。

3、流速考察

在以上拟定的实验条件基础上，分别对流速为0.8ml/min、1.0ml/min、1.2ml/min时进行了考察。见附图8，表7-11。

表7流速考察—特征峰保留时间

表8流速考察—特征峰相对保留时间

表9流速考察—特征峰峰面积

表10流速考察—特征峰相对峰面积

表11特征峰峰6与峰5的峰面积比值

结果表明，流速分别为0.8ml/min、1.0ml/min、1.2ml/min时，各特征峰的相对保留时间RSD为1.40％～7.29％，在流速为0.8ml/min时，峰5消失，在流速为1.0ml/min时，色谱图峰形较好，分离度适中。故流速确定为1.0ml/min。峰6(西红花苷I)与峰5的比值小于0.7。

实施例3栀子及其炮制品的质量检测方法学考察

1、色谱峰指认

供试品溶液的制备：按拟定的实验条件，制备焦栀子配方颗粒供试品溶液。

参照物溶液的制备：取栀子苷、西红花苷I、西红花苷II、绿原酸、京尼平-1-β-D-龙单双糖苷对照品，加甲醇制成每1ml分别含30μg、148μg、276μg、40μg、100μg的溶液，即得。

栀子对照药材溶液的制备：取栀子对照药材0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入 50％乙醇50ml，称定重量，超声20min(提取功率：600W)，放冷，再称定重量，用50％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

阴性对照溶液的制备：按以上拟定的实验条件，制备缺焦栀子配方颗粒阴性对照溶液。对焦栀子配方颗粒特征图谱峰进行定位。见附图9。

2、精密度试验取焦栀子配方颗粒(批号：SY1803004)供试品溶液，按拟定实验方法连续进样6次，每次10μl，计算各特征峰的相对保留时间及相对峰面积。见表12-14。

表12精密度考察-保留时间

表13精密度考察-峰面积

表14特征峰峰6与峰5的峰面积比值

结果表明，该仪器精密度良好。

3、重复性考察称取栀子配方颗粒(批号：SY1804001)6份，按拟定实验方法进行制备及测定。见表15-17。

表15重复性考察-相对保留时间比值

表16重复性考察-相对峰面积比值

表17特征峰峰6与峰5的峰面积比值

结果表明，该方法重复性好。

4、中间精密度考察

(1)不同仪器考察在以上拟定的实验条件基础上，分别精密称取焦栀子配方颗粒(批号：SY1802001)两份，制备供试品溶液，分别在安捷伦1200、waters、安捷伦1260 型高效液相色谱仪上进行测定。见图10、表18-20。

表18仪器耐用性考察-相对保留时间比值

表19仪器耐用性考察-相对峰面积比值

表20特征峰峰6与峰5的峰面积比值

结果表明，用上述3种仪器对供试品进行检测时，各特征峰相对保留时间的RSD小于5％。

(2)不同人员和时间考察在以上拟定的实验条件基础上，由不同人员(A、B) 在不同时间(T1、T2)分别精密称取栀子配方颗粒(批号：SY1804001)各两份，制备供试品，进行测定。见表21-23。

表21人员和时间考察-相对保留时间比值

表22人员和时间考察-相对峰面积比值

表23特征峰峰6与峰5的峰面积比值

结果表明，由不同的人员在不同的时间对同一个样品进行测定，方法稳定性较好。

5、耐用性考察在以上拟定的实验条件基础上，分别对色谱柱为Agilent 5HC-C18(250×4.6mm，5μm)；Agilent 5TC-C18(4.6×250mm，5μm)；菲罗门Luna C18(2) (250×4.6mm，5μm)进行考察。见附图11，表24-26。

表24色谱柱耐用性考察-相对保留时间比值

表25色谱柱耐用性考察-相对峰面积比值

表26特征峰峰6与峰5的峰面积比值

结果表明，用上述3种色谱柱对样品进行检测，特征峰相对保留时间的RSD在0.71％～ 2.59％，特征峰相对峰面积的RSD在4.78％～24.19％。

6、稳定性考察在以上拟定的实验条件基础上，取同一供试品溶液，分别于0h， 3h，6h，9h，12h，24h时测定。见表27-29。

表27稳定性考察-保留时间

表28稳定性考察-峰面积

表28特征峰峰6与峰5的峰面积比值

结果表明，其相对应的特征峰保留时间的RSD在0.03％～0.55％，样品溶液在24h内较稳定。

综上所述，各特征峰相对保留时间的RSD在以上各项考察中均符合要求，该方法良好。将上述5个特征峰纳入后续考察。

实施例4焦栀子或含焦栀子为原料制备的药物的鉴别方法

1、焦栀子或含焦栀子为原料制备的药物特征峰的确定及对照图谱的建立按照拟定特征图谱色谱条件对历年9批栀子配方颗粒、12批炒栀子配方颗粒、8批焦栀子配方颗粒、进行特征图谱检验，结果见表30-33，附图12-14。

表30栀子、炒栀子、焦栀子配方颗粒特征图谱结果汇总--保留时间

表31栀子、炒栀子、焦栀子配方颗粒特征图谱结果汇总—相对保留时间

表32栀子、炒栀子、焦栀子配方颗粒特征图谱结果汇总—峰面积

表33栀子、炒栀子、焦栀子配方颗粒特征图谱结果汇总—相对峰面积

根据相对保留时间稳定及各批次样品均能检出且峰相对较高的原则，共选择了6个重复性较好的峰作为特征峰。结果表明，当峰4作为S峰时，各批次栀子、炒栀子、焦栀子配方颗粒特征峰相对保留时间RSD在0.00％～0.00％。

2、相对保留时间规定值限度的制定方法学各考察项目及验证结果汇总见表34、35：

表34方法学各项目结果RSD％汇总标准—相对保留时间

表35方法学各项目结果RSD％汇总标准—相对峰面积

由上表可知柱温、流速对相对保留时间的影响较大，柱温和流速对峰3和峰5的影响最大，故将流速定为1.0ml/min，柱温定为30℃，为了增加方法的重现性和适用性，故将各峰的相对保留时间规定值暂定为5％。

采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)对8批焦栀子配方颗粒进行合成，建立了焦栀子配方颗粒特征图谱的对照图谱。见附图1。

同时发现栀子、炒栀子、焦栀子配方颗粒的峰6(西红花苷I)和峰5的峰面积比值存在规律可以用以鉴别焦栀子配方颗粒，结果见表36。

表36峰6(西红花苷I)与峰5的峰面积比值结果

故规定峰6(西红花苷I)和峰5的峰面积比值不得大于0.7。用以甄别焦栀子配方颗粒。

最终规定：供试品特征图谱中应呈现6个特征峰，其中4个峰应分别与相应的参照物峰保留时间相同，与栀子苷参照物相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±5％之内。规定值为：0.410(峰1)、0.806(峰2)、0.881 (峰3)、1.000(峰4/S)、1.455(峰5)。与西红花苷I参照物相应的峰与峰5的峰面积比值不得大于0.7。

综上，本发明的栀子及其炮制品的质量检测及鉴别方法，能用于检测和鉴别焦栀子、炒栀子及以焦栀子或炒栀子为原料的药物，本法操作简单，快速，重复性好，可快速有效甄别栀子及其炮制品，防止临床上将焦栀子配方颗粒和栀子配方颗粒、炒栀子配方颗粒进行混用，保证临床用药的安全。

Claims (10)

1.一种栀子及其炮制品的质量检测方法，其特征在于：它是采用高效液相色谱法检测，其操作步骤如下：

(1)供试品溶液的制备：取待检样品，加乙醇提取，过滤，取续滤液，过滤，即得；

(2)对照品溶液的制备：取栀子苷、西红花苷I、绿原酸、京尼平-1-β-D-龙单双糖苷对照品，加甲醇溶解，稀释，制成对照品溶液；

(3)分别吸取对照品溶液与供试品溶液注入液相色谱仪，色谱条件如下：

色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：以水为流动相A，以乙腈为流动相B梯度洗脱；流速为0.8-1.2m/minl；柱温：20℃～40℃；梯度洗脱程序如下：

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述的栀子炮制品为焦栀子、炒栀子。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤(1)所述的乙醇浓度为50％；所述的提取方法为超声提取，提取功率为600W；提取时间为20min。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤(2)所述的栀子苷、西红花苷I、绿原酸、京尼平-1-β-D-龙单双糖苷的浓度为每1ml分别含30μg、148μg、40μg、100μg的溶液。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤(3)所述的十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm；柱温为30℃；流速为1.0ml/min。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤(3)中的检测波长：0～23min为238nm,23～40min为440nm。

7.一种栀子炮制品的鉴别方法，其特征在于：它包括如下步骤：

(1)取待检栀子炮制品制备供试品溶液；

(2)按权利要求1-6项所述的高效液相色谱法检测；

(3)分析检测结果。

8.根据权利要求7所述的鉴别方法，其特征在于：所述的栀子炮制品是指炒栀子、焦栀子或以炒栀子、焦栀子为原料制备的药物。

9.根据权利要求7所述的鉴别方法，其特征在于：所述的高效液相色谱法检测的指纹图谱中至少含有6个特征峰，其中4个峰分别与相应的对照品峰保留时间相同，与栀子苷对照品相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±5％之内，相对保留时间分别为：0.410(峰1)、0.806(峰2)、0.881(峰3)、1.000(峰4/S)、1.455(峰5)。

10.根据权利要求7所述的鉴别方法，其特征在于：西红花苷I相应的峰与峰5的峰面积比值不得大于0.7。