CN110346497A - 一种高效液相色谱法检测阿魏酸的方法 - Google Patents

一种高效液相色谱法检测阿魏酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于分析技术领域，具体而言，通过利用一种高效液相色谱检测阿魏酸的方法，采用高效液相色谱法分别对阿魏酸供试品溶液及对照品溶液进行检测，记录两者的色谱图并获得所述阿魏酸供试品溶液中阿魏酸的峰面积及所述对照品溶液的峰面积并以标准曲线法对供试品中阿魏酸进行定量分析；所述对照品溶液为阿魏酸纯品溶液。该方法分离度高、保留时间适中即分析时间短、成本低。

Description

一种高效液相色谱法检测阿魏酸的方法
技术领域
本发明属于分析技术领域，具体而言，涉及一种高效液相色谱法检测阿魏酸的方法。
背景技术
阿魏酸，化学名为4羟基-3甲氧基-苯丙烯酸，其化学结构式如下所示：
阿魏酸是一种具有许多独特功能的生物活性物质，既是抗氧化剂又是抗炎症因子，能够清除过量ROS达到抗氧化损伤，或直接清除自由基或产生自由基的酶，抑制血小板聚集、血栓素样物质释放达到抗血栓，抑制肝脏胆固醇合成达到降血脂作用，防治冠心病、防止动脉粥样硬化，对部分病毒或细菌有抑制作用达到抗菌消炎的作用，还有抗辐射，免疫调节，提高精子活力，治疗男性不孕不育等作用。随着阿魏酸制品在药品、食品和化妆品行业的广泛使用，对其质量的鉴定及控制尤为重要。
目前，现有文章中已出现与高效液相色谱法检测阿魏酸相关的方法。吕光华研究HOLC测定川芎中游离阿魏酸和总阿魏酸的含量，采用乙腈和1%冰醋酸水溶液作为色谱条件中的流动相，梯度洗脱，流速为1.0mL·min- 1;柱温为30℃ ;测定波长为320nm，进样量10μl，阿魏酸出峰时间为接近15min，峰型尖锐且能与杂质峰完全分离开；吕乔采用流动相A为0.4%乙酸水溶液, 流动相B相为70%甲醇水溶液, 梯度洗脱, 流速为0.75 m L/min, DAD检测波长为290 nm, 柱温为35 ℃，在此条件下阿魏酸保留时间为6分左右，峰型尖锐，但不能与其他目标峰完全分离开。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高效液相色谱法检测阿魏酸的方法，以解决上述问题。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种高效液相色谱法检测阿魏酸的方法，包括：
采用高效液相色谱法分别对阿魏酸供试品溶液及对照品溶液进行检测，记录两者的色谱图并获得所述阿魏酸供试品溶液中阿魏酸的峰面积及所述对照品溶液的主峰面积并以外标法对供试品中阿魏酸进行定量分析。
所述对照品溶液为阿魏酸纯品溶液。
本发明采用外标法进行定量分析；就定量参比物而言，外标法是最为准确的方法，因为是同质组进行比较。
优选的，如上所述的高效液相色谱法检测阿魏酸的方法，所述阿魏酸供试品溶液浓度0.01~1.0mg/mL，更优选为0.03125~0.5mg/ml，还可以选择0.3mg/ml。
优选的，如上所述的高效液相色谱法检测阿魏酸的方法，所述阿魏酸对照品溶液浓度0.01~1.0mg/mL，更优选为0.03125~0.5mg/ml，还可以选择0.3mg/ml。
优选的，如上所述的高效液相色谱法检测阿魏酸的方法，在进行高效液相色谱检测时，所用色谱柱的固定相为十八烷基硅烷化学键合到多孔硅胶或陶瓷微粒上，流动相A为三氟乙酸水溶液，流动相B为甲醇。
优选的，如上所述的高效液相色谱法检测阿魏酸的方法，所述色谱柱的规格为：
内径为4.0~5.0mm，长度为200~300mm，填料粒径为2~6μm。更优选为内径为4.6mm，长度为250mm，填料粒径为5μm。
优选的，如上所述的高效液相色谱法检测阿魏酸的方法，所述色谱柱为AgilentC18色谱柱。
优选的，如上所述的高效液相色谱法检测阿魏酸的方法，所述流动相A为体积分数为0.01%~0.10%的三氟乙酸水溶液，优选的所述流动相A三氟乙酸的体积分数为0.03%~0.08%还可以选择0.05%；流动相B为色谱级纯甲醇。
优选的，如上所述的高效液相色谱法检测阿魏酸的方法，所述流动相的流速为0.8ml/min~1.5ml/min；更优选的，流速为1/min-1.2ml/min，还可以选择1.0ml/min。
流速的大小直接影响到流动相的用量问题，但从经济的角度来讲，应该设定较小流速；由于柱子的填充和仪器本身的关系也不能设定过大的流速。
优选的，如上所述的高效液相色谱法检测阿魏酸的方法，所述色谱柱的柱温为25℃~40℃，更优选为27℃~35℃，也可以是30℃。
柱温对洗脱时的保留时间影响较大，随着柱温的升高，保留时间一般会下降。
优选的，如上所述的高效液相色谱法检测阿魏酸的方法，在进行高效液相色谱检测时，检测波长为300nn-~350nm，更优选为310nm-330nm，还可以选择315nm；高效液相色谱一次进样量为2μl~7μl，可选择为1μl 或5μl。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
（1）与现有技术相比，本发明在流动相A为0.05%的三氟乙酸时，即可保证阿魏酸目标峰与主要杂质峰分离度大于3.0，目标峰理论塔板大于10000，且峰形尖锐、对称；且保留时间在15min以内，具备了分离度较高，分析时间较短等优点。
（2）本发明采用流动相B溶解阿魏酸，其溶解度更高、溶解速度更快，可以有效的避免检测过程中固体而导致色谱柱以及色谱系统的堵塞，使得检测结果准确可靠，其操作也更为方便。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
附图1为实施例1条件下对阿魏酸的液相检测色谱图；
附图2为实施例2条件下对阿魏酸的液相检测色谱图；
附图3为实施例3条件下对阿魏酸的液相检测色谱图。
附图4为阿魏酸对照品溶液的高效液相色谱图。
附图5为阿魏酸对照品溶液的标准曲线图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购买获得的常规产品。
本发明具体实施方式中使用的供试品、对照品、设备均为已知产品，其中对照品在索莱宝公司购买高效液相色谱仪：Angi1ent1260高效液相色谱仪，DAD检测器参照说明书附图以具体实施例对本发明的测定阿魏酸含量的方法作以下详细说明。
实施例1
阿魏酸高效液相色谱检测方法：
（1）制备供试品溶液：精密称取青麦仁麸皮阿魏酸10mg，置10ml容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
制备对照品溶液：取阿魏酸5mg，置于10ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液；
制备系统适用性试验溶液：称取青麦仁麸皮阿魏酸10mg，置10ml容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；取对照品储备液0.2ml，置于10ml容量瓶中，用流动相B甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，作为系统适用性试验溶液；
（2）高效液相色谱的检测条件为：
色谱柱：AgilentC18色谱柱(4.6mm×250mm 5μm)
流动相：A为体积分数的0.05%的三氟乙酸，B为纯甲醇
流速：1.0ml/min
检测波长：315nm
柱温：30℃
按照上述检测条件，自动取系统适用性试验溶液5μl注入液相色谱仪，记录色谱图；自动取对照品5μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使目标色谱峰峰高约为满量程的10%左右；精密量取供试品溶液和对照品溶液各1μ1，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算供试品种阿魏酸的含量平均值约为14.435mg/g。
标准曲线：y=25029x+141.5，R2=0.9995，检测范围为0.03125~0.5mg/ml
计算公式：
阿魏酸A=C×V/M0
式中：
A：指供试品溶液中阿魏酸的含量（单位：mg/g）；
C：指供试品溶液中阿魏酸的浓度（单位：mg/ml）；
V：指供试品溶液的体积（单位：mg/ml)；
M0：指制成供试品溶液的供试品质量（单位：g)。
结果表明，本发明检测方法阿魏酸目标峰与主要杂质峰分离度大于3.0，理论塔板大于50000，有效的避免了干扰峰影响检测结果的准确性;同时，本发明检测方法阿魏酸对照品的保留时间在13.273min且供试品中阿魏酸保留时间在13.277min（图4），可初步鉴定为是同一种物质——阿魏酸，而且出峰时间在15min以内，具有分析时间短、成本低等优点。
实施例2
检测条件中流动相A改为0.03%的三氟乙酸水溶液，其他步骤及实施条件同实施例1。
按照上述检测条件，自动取系统适用性试验溶液5μl注入液相色谱仪，记录色谱图；自动取对照品5μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使目标色谱峰峰高约为满量程的10%左右；精密量取供试品溶液和对照品溶液各1μ1，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算供试品种阿魏酸的含量平均值约为14.435mg/g。
计算方法均同实施例1相同
结果表明，本发明检测方法阿魏酸目标峰与主要杂质峰分离度为3.3，理论塔板大于43000，有效的避免了干扰峰影响检测结果的准确性;同时,本发明检测方法阿魏酸对照品的保留时间在13.160min，且供试品中阿魏酸保留时间在13.277min（图4）,可初步鉴定为是同一种物质——阿魏酸，而且出峰时间在15min以内，具有分析时间较短、成本低等优点。
实施例3
检测条件中流速变为1.1ml/min，其他步骤及实施条件同实施例1。
按照上述检测条件，自动取系统适用性试验溶液5μl注入液相色谱仪，记录色谱图；自动取对照品5μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使目标色谱峰峰高约为满量程的10%左右；精密量取供试品溶液和对照品溶液各1μ1，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算供试品种阿魏酸的含量平均值约为14.435mg/g。
计算方法均同实施例1相同
结果表明，本发明检测方法阿魏酸目标峰与主要杂质峰分离度为3.5，理论塔板大于46000，有效的避免了干扰峰影响检测结果的准确性;同时,本发明检测方法阿魏酸对照品的保留时间在13.085min，且供试品中阿魏酸保留时间在13.277min（图4）,可初步鉴定为是同一种物质——阿魏酸，而且出峰时间在15min以内，具有分析时间较短、成本低等优点。

Claims (10)

1.一种高效液相色谱法检测阿魏酸的方法，其特征在于，包括：
采用高效液相色谱法分别对阿魏酸供试品溶液及对照品溶液进行检测，记录两者的色谱图并获得所述阿魏酸供试品溶液中阿魏酸的峰面积及所述对照品溶液的峰面积并以标准曲线法对供试品中阿魏酸进行定量分析；
所述对照品溶液为阿魏酸纯品溶液。
2.根据权利要求1所述的高效液相色谱法检测阿魏酸的方法，其特征在于，所述阿魏酸供试品溶液浓度0.01~1.0mg/mL mg/mL。
3.根据权利要求1所述的高效液相色谱法检测阿魏酸的方法，其特征在于，所述阿魏酸对照品溶液浓度0.01~1.0mg/mL mg/mL。
4.根据权利要求1所述的高效液相色谱法检测阿魏酸的方法，其特征在于，在进行高效液相色谱检测时，所用色谱柱的固定相为十八烷基硅烷化学键合到多孔硅胶或陶瓷微粒上，流动相A为三氟乙酸水溶液，流动相B为甲醇。
5.根据权利要求4所述的高效液相色谱法检测阿魏酸的方法，其特征在于，所述色谱柱的规格为：
内径为4.0~5.0mm，长度为200~300mm，填料粒径为2~6μm。
6.根据权利要求4所述的高效液相色谱法检测阿魏酸的方法，其特征在于，所述色谱柱为AgilentC18色谱柱。
7.根据权利要求4所述的高效液相色谱法检测阿魏酸的方法，其特征在于，所述流动相A为体积分数为0.01%~0.10%的三氟乙酸水溶液，流动相B为色谱级纯甲醇。
8.根据权利要求4所述的高效液相色谱法检测阿魏酸的方法，其特征在于，所述流动相的流速为0.8~1.5ml/min；所述色谱柱的柱温为25~40℃。
9.根据权利要求1所述的高效液相色谱法检测阿魏酸的方法，其特征在于，在进行高效液相色谱检测时，检测波长为300~350nm；高效液相色谱一次进样量为2μl~7μl。
10.根据权利要求1所述的高效液相色谱法检测阿魏酸的方法，其特征在于，在进行高效液相色谱检测时，0~1min，梯度洗脱，流动相A为100%~70%；1min~20min，等度洗脱，流动相A为70%。
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