CN111505144A - 一种简易监测人体尿样中多种增塑剂的分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医疗检测技术领域,具体为一种简易监测人体尿样中多种增塑剂的分析方法。本方法建立了一种以液‑液萃取为主体样本前处理方法,配合以同位素稀释法,使用高效液相色谱‑双质谱联用仪对多种增塑剂,包括新型增塑剂在人体尿液中的内暴露水平进行快速定量,有利于准确评估人体对该类污染物的暴露水平和查找污染来源。该分析方法具有操作简单,耗时短,回收率结果较好等优点,可推广大范围使用。
Description
技术领域
本发明涉及医疗检测材料技术领域,具体为一种简易监测人体尿样中多种增塑剂的分析方法。
背景技术
典型的内分泌干扰物包括双酚A,其过去常常被用作儿童奶瓶、食品和饮料(奶粉)罐内涂层,欧盟曾报道含双酚A的奶瓶会诱发性早熟的生殖发育疾病。此外,邻苯二甲酸酯作为一类增塑剂可以增加塑料制品的柔韧性,其是一种类雌激素的内分泌干扰物,当加热或分解各种塑料产品时可释放出该物质,易通过饮食和环境接触进入人体,从而引发危害。此外,重金属铅、汞和镉等重金属由于具有高稳定性、难降解性和可积累性等特点,也会对生物体内分泌系统造成影响。
邻苯二甲酸酯类增塑剂属于典型内分泌干扰物。增塑剂通过各种暴露途径摄入机体后可导致人体或动物体内分泌系统紊乱,从而引发生殖障碍、行为异常等疾病。为了调查增塑剂对人体暴露产生的影响,常常采用内暴露评估的方式,即通过监测人体介质(如尿样、血样、头发)等中其母体或代谢物的迁移、转化、代谢等规律,由内而外的反映暴露产生的危害,目前的技术方案在检测时,操作复杂,耗时长,在前处理时,样品的损耗率较高。本方法建立了一种以液-液萃取为主体样本前处理方法,配合以同位素稀释法,使用高效液相色谱-双质谱联用仪对多种增塑剂,包括新型增塑剂在人体尿液中的内暴露水平进行快速定量,有利于准确评估人体对该类污染物的暴露水平和查找污染来源。该分析方法具有操作简单,耗时短,回收率结果较好等优点,可推广大范围使用。
发明内容
本发明的目的是提供一种简易监测人体尿样中多种增塑剂的分析方法,以获得的操作简单,耗时短,回收率结果较好的分析方法。
本发明解决其技术问题采用以下技术方案来实现:
本发明提供了一种简易监测人体尿样中多种增塑剂的分析方法,包括以下步骤:
步骤1、将-20℃冷冻的尿液从冰箱中取出,室温下解冻,尿样用涡旋处理30s,取0.5mL尿样样品,于12mL甲醇润洗过的螺口玻璃离心管中,加入50μL浓度为200ng/mL对应目标物的混合内标,空白加标和基质加标中均加入50μL浓度为200ng/mL各种目标物的混合标准物质;
步骤2、加入300μL酶解缓冲液;
步骤3、向上述溶液中加入0.5mL超纯水,然后将处理过的尿液置于恒温摇床内以37℃、110转/分的条件平衡12h;
步骤4、向酶解后的样品中加入3mL乙酸乙酯,涡旋混匀10s,超声萃取20min,震荡1h;以4000转/秒的速度离心10min;取上清液至12mL甲醇润洗过的螺口玻璃离心管中;
步骤5、重复步骤4两次,合并上清液,在重复步骤3时不需要超声处理;
步骤6、往上层清液中加入1mLMilli-Q一级超纯水,涡旋混匀20s,4000rpm离心10min,取上清液至12mL甲醇润洗过的试管中;利用高纯N2浓缩上清液至近干,加入500μL色谱级甲醇,涡旋20s;
步骤7、过膜:将步骤6得到的甲醇溶解的样品过0.22um的有机滤膜,然后转移至2mL的进样瓶内;
步骤8、利用同位素标记步骤7制取的样品,再使用高效液相色谱-双质谱联用仪对多种增塑剂,包括新型增塑剂在人体尿液中的内暴露水平进行快速定量。
优选的,在步骤2中,所述酶解缓冲液中β-葡萄糖苷酸酶浓度为200units/mL;乙酸-乙酸铵缓冲液浓度为1mol/L,pH=4.5;
优选的,所述酶解缓冲液的配制方法包括以下步骤:
步骤201、称取0.77g乙酸铵固体,溶于9.38mL超纯水中;
步骤202、再加入600μL乙酸溶液,混匀;
步骤203、最后加入20μL浓度为>10000unites/mL的β-葡萄糖醛酸酶,即可制得酶解缓冲液。
优选的,在步骤8中,所述的同位素标记包括:
1)常规的邻苯二甲酸酯代谢物:12种目标物以及对应的10种碳标记的同位素内标化合物,分别是mMP、mEP、mBP、miBP、mBzP、mCHP)、mECPP、mEHHP、mEOHP、mEHP、mOP、mNP;与目标物相对应10种内标物质及简写为13C2-mMP(C-mMP)、13C2-mEP(C-mEP)、13C2-mBP(C-mBP)、13C4-mECPP(C-mECPP)、13C4-MEOHP(C-mEOHP)、13C4-mEHHP(C-mEHHP)、13C2-mCHP(C-mCHP)、13C2-MBzP(C-mBZP))、13C2-mEHP(C-mEHP)和d4-miBP(D-miBP);
2)新型的邻苯二甲酸酯代谢物:7种目标物以及对应的6种碳标记的同位素内标物质,分别是mDOP、mTEHP、mHPHP、mCPHP、mOPHP、mCNP、mCOP;与目标物相对应6种内标物质及简写为13C2-mTEHP(C-mTEHP))、13C2-mHPHP(C-mHPHP)、13C2-mCPHP(C-mCPHP)、13C2-mCNP(C-mCNP))、13C2-mCOP(C-mCOP)、13C2-mOPHP(C-mOPHP)。
与现有技术相比,本发明的有益效果是:本发明所述的一种简易监测人体尿样中多种增塑剂的分析方法,建立了一种以液-液萃取为主体样本前处理方法,配合以同位素稀释法,使用高效液相色谱-双质谱联用仪对多种增塑剂,包括新型增塑剂在人体尿液中的内暴露水平进行快速定量,有利于准确评估人体对该类污染物的暴露水平和查找污染来源。该分析方法具有操作简单,耗时短,回收率结果较好等优点,可推广大范围使用。
具体实施例
下面将结合本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例1
1.化学试剂及实验材料
(1)甲醇:Thermo Fisher Scientific,色谱纯
(2)纯水:Thermo Fisher Scientific,色谱纯
(3)乙腈:Thermo Fisher Scientific,色谱纯
(4)乙酸乙酯:Thermo Fisher Scientific,色谱纯
(5)乙酸铵:Sigma-Aldrich,纯度>98%
(6)乙酸溶液:Fluka,纯度>98%
(7)β-葡萄糖苷酸酶(浓度>100,000unit/mL):Sigma-Aldrich,纯度>98%
(8)螺口离心管:12mL,可重复利用
(9)广口瓶:200mL,用于盛装实验过程中所用溶剂
(10)有机滤膜:孔径为0.22μm
(11)一次性无菌注射器:1mL
(12)安捷伦2mL色谱进样瓶,带聚四氟乙烯膜衬片瓶盖
(13)胶头和滴管
(14)锡箔纸,手套,口罩
2.待测目标物及同位素内标
本实验的主要目标物为邻苯二甲酸酯代谢物,按该物质的研究背景和文献报导的情况可将其分为常规代谢物和新型代谢物两大类。
1)常规的邻苯二甲酸酯代谢物:12种目标物以及对应的10种碳标记的同位素内标化合物,分别是mMP、mEP、mBP、miBP、mBzP、mCHP)、mECPP、mEHHP、mEOHP、mEHP、mOP、mNP;与目标物相对应10种内标物质及简写为13C2-mMP(C-mMP)、13C2-mEP(C-mEP)、13C2-mBP(C-mBP)、13C4-mECPP(C-mECPP)、13C4-MEOHP(C-mEOHP)、13C4-mEHHP(C-mEHHP)、13C2-mCHP(C-mCHP)、13C2-MBzP(C-mBZP))、13C2-mEHP(C-mEHP)和d4-miBP(D-miBP);
2)新型的邻苯二甲酸酯代谢物:7种目标物以及对应的6种碳标记的同位素内标物质,分别是mDOP、mTEHP、mHPHP、mCPHP、mOPHP、mCNP、mCOP;与目标物相对应6种内标物质及简写为13C2-mTEHP(C-mTEHP))、13C2-mHPHP(C-mHPHP)、13C2-mCPHP(C-mCPHP)、13C2-mCNP(C-mCNP))、13C2-mCOP(C-mCOP)、13C2-mOPHP(C-mOPHP)。本研究中所有目标化合物均购自于美国AccuStandard公司(NewHaven,CT,USA),对应的内标化合物购自于Cambridge IsotopeLaboratories(Andover,MA,USA),另外,所有的标准物质的纯度均大于99%。
3.调查对象和样品采集
通常情况下,代谢物主要是通过尿液排泄,采集也比较方便,无需伤害目标受试者。所以在人体健康和人体暴露课题中常常作为样品来研究。本研究是围绕孕妇对环境内分泌干扰物的暴露特征、来源解析及其健康风险评估这一科研课题来展开的,目的在于评估敏感人群孕妇在不同孕期内对邻苯二甲酸酯代谢物的暴露特征。研究的目标人群是做例行检查的孕妇,通过志愿者招募方式,一共招募了364名孕妇,收集其尿液,用于分析。
样本采集之前的准备工作:准备好干净的尿杯(容积为50mL),干净的尿管(容积为15mL,聚四氟乙烯材质),手套,口罩,记号笔,自封袋和书面问卷
具体尿样采集方式:将采集到的孕妇尿液收集于事先准备好的尿管之中,并做好标记,同时对孕妇进行简单的问卷调查,问卷内容涉及孕妇的年龄、身高、体重以及是否空腹、是否抽烟等基本信息,问卷信息和样本一一对应,收集完之后将尿样及时转移至-20℃低温冰箱保存,以待备用。
前处理方法
尿样样品前处理过程分为样品酶解、液液萃取两部分。
1、样品酶解
(1)将-20℃冷冻的尿液从冰箱中取出,室温下解冻。
(2)尿样取用前需涡旋30s,取0.5mL尿样样品,于12mL甲醇润洗过的螺口玻璃离心管中;
(3)加入50μL浓度为200ng/mL对应目标物的混合内标,空白加标和基质加标中均加入50μL浓度为200ng/mL各种目标物的混合标准物质;
(4)加入300μL酶解缓冲液,β-葡萄糖苷酸酶浓度为200units/mL;乙酸-乙酸铵缓冲液浓度为1mol/L,pH=4.5;
酶解缓冲液具体配制方法:首先,称取0.77g乙酸铵固体,溶于9.38mL超纯水中,然后加入600μL乙酸溶液,最后加入20μL浓度为>10,000unites/mL的β-葡萄糖醛酸酶。
(5)向上述溶液中加入0.5mL超纯水,然后将处理过的尿液置于恒温摇床内以37℃、110转/分的条件平衡12h。
2、液液萃取
(1)向酶解后的样品中加入3mL乙酸乙酯,涡旋混匀10s;
(2)超声萃取20min,震荡1h;
(3)以4000转/秒的速度离心10min;
(4)取上清液至12mL甲醇润洗过的螺口玻璃离心管中;
(5)重复步骤(1)-(4)两次,合并上清液,重复步骤中不需超声20min,但需涡旋混匀10s;
(6)往上层清液中加入1mLMilli-Q一级超纯水,涡旋混匀20s,4000rpm离心10min,取上清液至12mL甲醇润洗过的试管中;
(7)高纯N2浓缩步骤(6)得到的上清液至近干,加入500μL色谱级甲醇,涡旋20s。
(8)过膜:将步骤7得到的甲醇溶解的样品过0.22um的有机滤膜,然后转移至2mL的进样瓶内。
质量保证与质量控制(QA/QC)
质量控制和质量保证是科研实验中必不可少的环节。为了保证实验的准确性、操作稳定性以及实验方法是否可行,每批实验设置2个程序空白样本(加入超纯水),2个空白加标样本(往超纯水中加入已知浓度的目标化合物),2个基质平行样本(随机选取某几个尿液混合均匀作为基质),2个基质加标样本(往基质中加入已知浓度的目标化合物)。这8个QA/QC样本和实际样品经过完全一致的前处理过程,因此可以用来反映实验操作过程中的人为误差情况和验证前处理方法的可行性。
虽然在上文中已经参考实施例对本发明进行了描述,然而在不脱离本发明的范围的情况下,可以对其进行各种改进并且可以用等效物替换其中的部件。尤其是,只要不存在结构冲突,本发明所披露的实施例中的各项特征均可通过任意方式相互结合起来使用,在本说明书中未对这些组合的情况进行穷举性的描述仅仅是出于省略篇幅和节约资源的考虑。因此,本发明并不局限于文中公开的特定实施例,而是包括落入权利要求的范围内的所有技术方案。
Claims (4)
1.一种简易监测人体尿样中多种增塑剂的分析方法,其特征在于,包括以下步骤:
步骤1、将-20℃冷冻的尿液从冰箱中取出,室温下解冻,尿样用涡旋处理30s,取0.5mL尿样样品,于12mL甲醇润洗过的螺口玻璃离心管中,加入50μL浓度为200ng/mL对应目标物的混合内标,空白加标和基质加标中均加入50μL浓度为200ng/mL各种目标物的混合标准物质;
步骤2、加入300μL酶解缓冲液;
步骤3、向上述溶液中加入0.5mL超纯水,然后将处理过的尿液置于恒温摇床内以37℃、110转/分的条件平衡12h;
步骤4、向酶解后的样品中加入3mL乙酸乙酯,涡旋混匀10s,超声萃取20min,震荡1h;以4000转/秒的速度离心10min;取上清液至12mL甲醇润洗过的螺口玻璃离心管中;
步骤5、重复步骤4两次,合并上清液,在重复步骤3时不需要超声处理;
步骤6、往上层清液中加入1mLMilli-Q一级超纯水,涡旋混匀20s,4000rpm离心10min,取上清液至12mL甲醇润洗过的试管中;利用高纯N2浓缩上清液至近干,加入500μL色谱级甲醇,涡旋20s;
步骤7、过膜:将步骤6得到的甲醇溶解的样品过0.22um的有机滤膜,然后转移至2mL的进样瓶内;
步骤8、利用同位素标记步骤7制取的样品,再使用高效液相色谱-双质谱联用仪对多种增塑剂,包括新型增塑剂在人体尿液中的内暴露水平进行快速定量。
2.根据权利要求1所述的一种简易监测人体尿样中多种增塑剂的分析方法,其特征在于:在步骤2中,所述酶解缓冲液中β-葡萄糖苷酸酶浓度为200units/mL;乙酸-乙酸铵缓冲液浓度为1mol/L,pH=4.5。
3.根据权利要求2所述的一种简易监测人体尿样中多种增塑剂的分析方法,其特征在于,所述酶解缓冲液的配制方法包括以下步骤:
步骤201、称取0.77g乙酸铵固体,溶于9.38mL超纯水中;
步骤202、再加入600μL乙酸溶液,混匀;
步骤203、最后加入20μL浓度为>10000unites/mL的β-葡萄糖醛酸酶,即可制得酶解缓冲液。
4.根据权利要求1所述的一种简易监测人体尿样中多种增塑剂的分析方法,其特征在于,在步骤8中,所述的同位素标记包括:
1)常规的邻苯二甲酸酯代谢物:12种目标物以及对应的10种碳标记的同位素内标化合物,分别是mMP、mEP、mBP、miBP、mBzP、mCHP)、mECPP、mEHHP、mEOHP、mEHP、mOP、mNP;与目标物相对应10种内标物质及简写为13C2-mMP(C-mMP)、13C2-mEP(C-mEP)、13C2-mBP(C-mBP)、13C4-mECPP(C-mECPP)、13C4-MEOHP(C-mEOHP)、13C4-mEHHP(C-mEHHP)、13C2-mCHP(C-mCHP)、13C2-MBzP(C-mBZP))、13C2-mEHP(C-mEHP)和d4-miBP(D-miBP);
2)新型的邻苯二甲酸酯代谢物:7种目标物以及对应的6种碳标记的同位素内标物质,分别是mDOP、mTEHP、mHPHP、mCPHP、mOPHP、mCNP、mCOP;与目标物相对应6种内标物质及简写为13C2-mTEHP(C-mTEHP))、13C2-mHPHP(C-mHPHP)、13C2-mCPHP(C-mCPHP)、13C2-mCNP(C-mCNP))、13C2-mCOP(C-mCOP)、13C2-mOPHP(C-mOPHP)。
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