CN113720943A - 一种快速测定尿液中邻苯二甲酸酯代谢物含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种快速测定尿液中邻苯二甲酸酯代谢物含量的方法，属于医疗检测技术领域。所述方法包括以下步骤：S1、取尿液样品涡旋混匀，加入50ng同位素内标，加入β‑葡萄糖醛酸酶、乙酸铵，充分振荡，于37℃水浴条件下水解100min，取出降至室温，乙腈定容，冷冻2h，取出恢复常温后，过0.22μm有机滤膜，得样品溶液；S2、采用LC‑MS/MS对样品溶液进行测试，S3、对照标准曲线进行对邻苯二甲酸酯代谢物进行定性或者定量分析。本发明提供的检测方法具有检测时间短、精密度高、回收率高的优点。
Description
技术领域
本发明涉及医疗检测技术领域，具体涉及一种快速测定尿液中邻苯二甲酸酯代谢物含量的方法。
背景技术
邻苯二甲酸酯(PAEs)是环境中普遍存在的污染物，常被用于生产日常生活用品，主要用作增塑剂。日常生活中的玩具、食品包装、乙烯地板、润滑剂、粘合剂、洗涤剂、化妆品、药物涂层和医疗器械等都含有一种或多种PAEs。PAEs可通过呼吸道、饮食摄入和皮肤吸收等途径进入人体。已有研究指出PAEs具有致癌性、生殖发育毒性和内分泌干扰作用。PAEs在人体内的半衰期较短，低于48h，经肝脏等器官代谢解毒，形成邻苯二甲酯代谢物(mPAEs)从尿液和粪便等途径排出体外。因此，可以通过检测人体尿液中的mPAEs的含量来评估人体PAEs的暴露水平和负荷。
目前，已有很多文献报道了不同的方法应用于尿液中mPAEs的分析，这些方法大多需要对尿液进行一定的前处理，比如最常见的利用离线固相萃取技术对尿液中mPAEs进行富集和净化，方法流程繁琐，溶剂用量大，费时低效，且不利于开展大规模的人体样品筛查。中国专利CN 112782295 A报道了一种在线测定尿液中邻苯二甲酸酯代谢物含量的方法，通过在线固相萃取技术对mPAEs进行富集和净化，再通过液相色谱分离，三级四重杆质谱检测，该法耗时较长，对仪器要求高。中国专利CN 111505144 A报道了一种简易监测人体尿样中多种增塑剂的分析方法，该法利用液液萃取技术对mPAEs进行富集和净化，再通过HPLC-MS/MS进行检测分析，还是存在前处理耗时长，对仪器要求高的缺陷。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中的缺陷，从而提供一种快速测定尿液中邻苯二甲酸酯代谢物含量的方法，用于大规模尿液样品的快速检测。
本发明提供的一种快速测定尿液中邻苯二甲酸酯代谢物含量的方法，包括以下步骤：
S1、取尿液样品涡旋混匀，加入50ng同位素内标，加入β-葡萄糖醛酸酶、乙酸铵，充分振荡，于37℃水浴条件下水解100min，取出降至室温，乙腈定容，冷冻2h，取出恢复常温后，过0.22μm有机滤膜，得样品溶液；
S2、采用液相色谱-串联质谱对样品溶液进行测试，
其中，液相色谱条件为：
色谱柱为Waters苯基柱，流速0.3mL/min，进样量为5μL，柱温流动相A为0.1％乙酸水溶液，流动相B为乙腈溶液，梯度洗脱程序为：0-4min时，流动相B体积分数为5％；4-6min时，流动相B体积分数为60％；6-8.5min时，流动相B体积分数为90％；8.5-10min时，流动相B体积分数为5％；
其中，质谱条件为：
离子化方式：ESI；电离方式：负电离模式；碰撞气类型：氩气；雾化气流量：3L/min；加热气流量：10L/min；干燥气流量：10L/min；接口温度：300℃；脱溶剂温度：526℃；DL温度：250℃；加热块温度：400℃；扫描模式：MRM；
S3、对照标准曲线进行对邻苯二甲酸酯代谢物进行定性或者定量分析。
优选地，步骤S1中，所述乙酸铵的浓度为1mol/L，所述尿液样品与乙酸铵的体积比为4:0.5-1.5。
优选地，步骤S1中，冷冻的温度为-25℃。
优选地，步骤S1中，所述尿液样品与乙腈的体积比为2:2.5-3.5。
优选地，步骤S1中，所述β-葡萄糖醛酸酶在尿液样品的浓度≥850U/mL。
优选地，步骤S2中，所述同位素内标包括：13C2-MMP、13C2-MEP、13C2-MCHP、13C2-MBZP、D4-MIBP、13C4-MEOHP、13C4-MEHHP、13C2-MEHP、13C2-MOP、13C2-MNP、D4-MDP和13C2-MNBP中的任意一种或多种的混合。
优选地，步骤S3中，与所述同位素内标对应的邻苯二甲酸酯代谢物包括：MMP、MEP、MCHP、MBZP、MIBP、MEOHP、MEHHP、MEHP、MOP、MNP、MDP和MNBP中的任意一种或多种的混合。
本发明技术方案，具有如下优点：
本发明提供的方法，通过液质联用，能快速测定尿液中邻苯二甲酸酯代谢物的含量，可用于定性和定量分析。检测时间短，只需15-20min即可检测出代谢物含量；检测限范围为0.05-1.88μg/L；在5～100μg/L的加标范围内，回收率在80％～125％，精密度小于10％。
具体实施方式
实施例1
1.样品的保存
可在-20℃下保存2个月，在-70℃以下可保存1年。
2.标准配制
2.1标准储备液：准确称取各标准品0.0010g，分别用甲醇定容至10.0mL，配制成100mg/L标准储备液，4℃保存。或直接使用符合要求的标准溶液或混合标准溶液。
2.2混合标准工作液：分别取MMP、MEP、MCHP、MBZP、MEOHP、MEHHP、MEHP、MOP、MNP、MDP标准储备液1.0mL，MiBP标准储备液2.0mL，MNBP标准储备液3.0mL，配制成12种PAEs代谢物混合标准储备液，于4℃保存待用。
2.3同位素内标储备液：称取各同位素内标0.0010g，分别用甲醇定容至10.0mL，配制成100mg/L内标储备液。
2.4混合内标工作液：分别取MMP、MEP、MCHP、MBZP、MIBP、MEOHP、MEHHP、MEHP、MOP、MNP、MDP和MNBP内标储备液各1mL，用甲醇定容至25.0mL，配制成0.5mg/L的12种PAEs代谢物内标使用液，于4℃保存待用。
2.5标准工作曲线配制：取2mL人工尿液到5mL离心管。依次加入200ng、100ng、50ng、20ng、10ng、5ng和1ng PAEs混合标准以及50ng混合内标。之后，向各离心管中加入不低于850U/mL的β-葡萄糖醛酸酶，0.5mL乙酸铵溶液。上述混合样品同尿液样品一同处理，以配置标准曲线。
表1标准工作曲线
| 化和物 | 标准工作曲线方程 | 相关系数(R) |
| MMP | f(x)＝0.0738261*x+0.0136181 | 0.9991406 |
| MEP | f(x)＝0.0792814*x-0.00101121 | 0.9925800 |
| MIBP | f(x)＝0.548677*x+0.651246 | 0.9980763 |
| MEHHP | f(x)＝0.114904*x+0.00767205 | 0.9988483 |
| MNBP | f(x)＝0.472822*x+0.680363 | 0.9926703 |
| MEOHP | f(x)＝0.0691936*x-0.00400428 | 0.9995567 |
| MBZP | f(x)＝0.164753*x-0.00817728 | 0.9992574 |
| MCHP | f(x)＝0.0988395*x-0.00993492 | 0.9989187 |
| MEHP | f(x)＝0.0440574*x+0.00579469 | 0.9992858 |
| MOP | f(x)＝0.131726*x-0.0110772 | 0.9986310 |
| MNP | f(x)＝0.0879621*x-0.00464429 | 0.9991943 |
| MDP | f(x)＝0.147727*x+0.0245079 | 0.9996374 |
3.试样的制备
在涡旋混匀器上混匀样品。取2mL尿液于5mL聚乙烯管中，加入50ng同位素内标，加入不低于850U/mL的β-葡萄糖醛酸酶，加入0.5mL乙酸铵，充分振荡。于37℃水浴条件下水解100min，取出降至室温，加入乙腈定容至5mL，放冷冻室冷冻2hr，取出恢复常温后，过0.22μm有机滤膜上机测试。
4.分析条件
液相色谱：岛津LCMS-8060
液相色谱柱：Waters苯基柱，100mm(柱长)×2.1mm(内径)，1.7μm(粒径)，
流速：0.3ml/min
进样量：5μL。
柱温：40℃
流动相：A:0.1％乙酸水溶液，B：乙腈溶液。梯度洗脱程序参加表1。
表2梯度洗脱程序表
| 时间/min | A(V％) | B(V％) |
| 0.0 | 95％ | 5％ |
| 2.0 | 95％ | 5％ |
| 4.0 | 40％ | 60％ |
| 6.0 | 10％ | 90％ |
| 8.0 | 10％ | 90％ |
| 8.5 | 95％ | 5％ |
| 10.0 | 95％ | 5％ |
5.质谱参考条件
质谱参考条件如下：
离子化方式：ESI。
电离方式：负电离模式。
碰撞气类型：氩气。
雾化气流量：3L/min。
加热气流量：10L/min。
干燥气流量：10L/min。
接口温度：300℃。
脱溶剂温度：526℃。
DL温度：250℃。
加热块温度：400℃。
扫描模式：MRM，12种邻苯二甲酸酯代谢物及其内标的质谱参数见表2。
表3 12种邻苯二甲酸酯代谢物及其内标的质谱参数
注：*为定量离子
6.空白试验
样品前处理时，除不加样品外，均按以上操作步骤进行。
7.定性测定
在相同条件下，按照液相色谱-串联质谱条件测定尿中12种邻苯二甲酸酯代谢物，同时测定标准溶液。定性时样尿液样品中待测物质的保留时间与标准溶液中的保留时间偏差在±2.5％之内。尿液样品中各组分定性离子的相对丰度与标准工作溶液中相应的定性离子的相对丰度比进行比较，偏差不超过表4规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物。
表4液相色谱-串联质谱法定性离子相对丰度的最大允许偏差
| 相对离子丰度(％) | ＞50 | 20～50 | 10～20 | ≤10 |
| 允许的相对偏差(％) | ±20 | ±25 | ±30 | ±50 |
8.结果计算
处理后的样品在与标准曲线相同的条件下进样分析。样品中被测组分的测定
结果可由数据处理系统内标法自动计算(见式1和式2)。
Ai/Ais＝ai+bi×Ci………………………(1)
Ci＝(Ai/Ais-ai)/bi………………………(2)
式中：Ci：标准曲线计算的样品测定液中目标物的浓度，ng/mL
Ai：各组分定量离子峰面积；
Ais：内标物定量离子峰面积；
ai：标准曲线i组分截距；
bi：标准曲线i组分斜率。
用式(3)计算尿中被测组分的浓度
ρi＝(Ci×Cis2/Cis1)×V1/V…………(3)
式中：ρi：实际样品中目标物的浓度，ng/mL；
Ci:标准曲线计算的样品测定液中被测组分的浓度，ng/mL；
Cis 1：标准系列内标物浓度，ng/mL；
Cis 2：样品中内标物的浓度，ng/mL；
V1：定容体积，mL；
V：样品体积，mL。
9.检出限
12种邻苯二甲酸酯的方法检出限范围是0.05-1.88μg/L，具体检出限见表4。
表5 12种PAEs代谢物的检出限
| MMP | MEP | MIBP | MNBP | MCHP | MBZP | |
| 检出限(μg/L) | 1.88 | 1.38 | 0.10 | 0.15 | 0.08 | 0.05 |
| MEHHP | MEOHP | MEHP | MOP | MNP | MDP | |
| 检出限(μg/L) | 0.15 | 0.62 | 0.35 | 0.05 | 0.62 | 0.13 |
10.回收率与精密度
MMP、MEP、MEOHP、MEHHP、MEHP、MCHP、MBZP、MOP、MNP、MDP、MIBP、MNBP等12种物质在5～100μg/L的加标范围内，回收率在80％～125％，精密度小于10％。
表6样品加标回收试验
表7精密度(n＝6)
11.基质效应考察
采用提取后添加法评价基质效应。Set 1：将被测物溶于非生物基质的空白溶液(甲醇)配制标准溶液。Set 2：提取空白生物基质，将被测物加入此溶液中。将上述Set1和Set2样品引入LC-MS/MS系统进行分析，获得12种增塑剂代谢物和相应内标的信号强度，计算待测物和相应内标的基质效应因子(matrix factor，MF)。结果见表7和表8：
表8标准的基质效应
表9内标的基质效应
12.质量控制
(1)按批进行未知样品测定时，每批试验包括不少于6个标准浓度点，1个过程空白。
(2)分析实验结果时，需确定目标化合物及其内标的保留时间，其相对保留时间(即化合物的保留时间÷相应内标的保留时间)应在0.9～1.1范围内，若超过其范围，需要进行确认分析该物质是否为目标化合物。
(3)每次分析前，需评估标准品或内标的质谱响应信号，当标准品或内标的质谱响应信号低于正常值50％时，表明仪器需要维护，清洗或校准。
(4)试剂空白应尽量低于三倍检出限，若不能低于三倍检出限，需评估试剂空白是否稳定及空白的来源。空白稳定性评价中，需进行不低于6批次的试剂空白实验，计算含空白目标化合物质谱响应峰面积，计算RSD，若低于20％，表示试剂空白稳定。
(5)如样品中待测物浓度超过线性范围时，需对样品进行复测。复测时可采用减少取样体积或稀释样品。
(6)待测物在样品中未检出时，需确定样品是否正常进样。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (7)
1.一种快速测定尿液中邻苯二甲酸酯代谢物含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、取尿液样品涡旋混匀，加入50ng同位素内标，加入β-葡萄糖醛酸酶、乙酸铵，充分振荡，于37℃水浴条件下水解100min，取出降至室温，乙腈定容，冷冻2h，取出恢复常温后，过0.22μm有机滤膜，得样品溶液；
S2、采用液相色谱-串联质谱对样品溶液进行测试，
其中，液相色谱条件为：
色谱柱为Waters苯基柱，流速0.3mL/min，进样量为5μL，柱温流动相A为0.1％乙酸水溶液，流动相B为乙腈溶液，梯度洗脱程序为：0-4min时，流动相B体积分数为5％；4-6min时，流动相B体积分数为60％；6-8.5min时，流动相B体积分数为90％；8.5-10min时，流动相B体积分数为5％；
其中，质谱条件为：
离子化方式：ESI；电离方式：负电离模式；碰撞气类型：氩气；雾化气流量：3L/min；加热气流量：10L/min；干燥气流量：10L/min；接口温度：300℃；脱溶剂温度：526℃；DL温度：250℃；加热块温度：400℃；扫描模式：MRM；
S3、对照标准曲线进行对邻苯二甲酸酯代谢物进行定性或者定量分析。
2.根据权利要求1所述的一种快速测定尿液中邻苯二甲酸酯代谢物含量的方法，其特征在于，步骤S1中，所述乙酸铵的浓度为1mol/L，所述乙酸铵与尿液样品的体积比为4:0.5-1.5。
3.根据权利要求1所述的一种快速测定尿液中邻苯二甲酸酯代谢物含量的方法，其特征在于，步骤S1中，冷冻的温度为-25℃。
4.根据权利要求1所述的一种快速测定尿液中邻苯二甲酸酯代谢物含量的方法，其特征在于，步骤S1中，所述尿液样品与乙腈的体积比为2:2.5-3.5。
5.根据权利要求1所述的一种快速测定尿液中邻苯二甲酸酯代谢物含量的方法，其特征在于，步骤S1中，所述β-葡萄糖醛酸酶在尿液样品的浓度≥850U/mL。
6.根据权利要求1所述的一种快速测定尿液中邻苯二甲酸酯代谢物含量的方法，其特征在于，步骤S1中，所述同位素内标包括：13C2-MMP、13C2-MEP、13C2-MCHP、13C2-MBZP、D4-MIBP、13C4-MEOHP、13C4-MEHHP、13C2-MEHP、13C2-MOP、13C2-MNP、D4-MDP和13C2-MNBP中的任意一种或多种的混合。
7.根据权利要求1所述的一种快速测定尿液中邻苯二甲酸酯代谢物含量的方法，其特征在于，步骤S3中，所述邻苯二甲酸酯代谢物包括：MMP、MEP、MCHP、MBZP、MIBP、MEOHP、MEHHP、MEHP、MOP、MNP、MDP和MNBP中的任意一种或多种的混合。
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