KR101550770B1 - 은이온 배위결합 이온분무 및 사중극자텐덤질량분석기를 이용하는 동화작용 스테로이드 검출 방법 - Google Patents

은이온 배위결합 이온분무 및 사중극자텐덤질량분석기를 이용하는 동화작용 스테로이드 검출 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 (a) 시료에 존재하는 동화작용 스테로이드와 그 대사체 및 유사한 약리작용을 가지는 물질들을 효소를 사용하여 가수분해하는 단계; (b) 가수분해된 시료를 염기화하고 유기용매로 추출하는 단계; (c) 추출된 물질을 액체크로마토그래피를 통해 분리시키는 단계; (d) 분리된 물질을 은이온 배위결합 이온분무를 이용하여 동시에 이온화시키는 단계; 및 (e) 이온화된 물질을 사중극자텐덤질량분석기를 이용하여 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 동화작용 스테로이드 검출 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 동시분석 방법은 시료 내 다양한 동화작용 스테로이드와 그 대사체 및 유사한 약리작용을 가지는 물질을 동시에 추출하고 동시 이온화시켜 검출할 수 있어 경제적인 측면과 시간적인 측면에서 탁월한 우수성을 가진다. 이는 도핑 분석 분야에서 효율적인 1차 스크리닝 방법으로 적용될 수 있을 뿐 아니라, 제약, 식품 및 환경 등의 다양한 분야에서 약물 또는 그 밖의 저분자 물질 및 기존의 전자분무 이온화법(electrospray ionization)에서 이온화되지 않는 물질들을 동시 분석 하는데 까지 그 응용범위를 확장할 수 있다.

Description

은이온 배위결합 이온분무 및 사중극자텐덤질량분석기를 이용하는 동화작용 스테로이드 검출 방법{Method for Analysis of anabolic androgenic steroid using silver coordination ion spray and triple-quadrupole mass spectrometry}
본 발명은 은이온 배위결합 이온분무 및 사중극자텐덤질량분석기를 이용하는 동화작용 스테로이드 검출 방법에 관한 것으로, 구체적으로 기존의 전기분무이온화법lectrospray ionization)으로 이온화가 어려웠던 동화작용 스테로이드 화합물을 은이온 배위결합 이온분무(Silver ion coordination ionspray, Ag+CIS)를 이용하여 이온화함으로써 모든 스테로이드 화합물을 동시에 이온화시킬 수 있으며, 이렇게 이온화된 분석물질을 사중극자텐덤질량분석기을 이용하여 분석함으로써, 모든 스테로이드 화합물을 동시에 분석할 수 있는 동화작용 스테로이드 검출 방법에 관한 것이다.
스포츠 분야에서 약물 복용을 통한 경기력 향상을 도모하려는 시도가 끊임없이 계속되고 있어 세계반도핑기구(World Anti-Doping Agency, WADA)는 매년 금지약물의 검사기준을 강화하고 있으며 규제 대상 금지약물의 항목 및 수를 증가시키고 있다(The World Anti-Doping Code, The 2014 Prohibited List International Standard, 2014).
분석대상은 WADA에서 지정한 동화작용 스테로이드에 속한 금지약물과 그 대사체 및 유사한 약리작용을 가지는 물질들을 포함한다.
한편 한국 등록특허 제10-1195049호 전기분무/사중극자텐덤질량분석기를 사용하는 금지약물 검출 방법은, WADA에서 지정하여 규제하는 금지 약물 중 흥분제류, 마약류, 이뇨제류, 부신피질호르몬류, 항에스트로겐류, 베타 2-작용제류, 산소이동촉진제류, 베타-차단제류, 근육강화제류 등의 금지 약물을 분석하는데 더욱 적합하다.
일반적으로 동화작용 스테로이드는 기체크로마토그래피-질량분석기(Gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)를 이용하여 분석하였으나, 최근에는 기존의 GC-MS로는 검출이 어려운 새로운 약물들이 출현하는 문제점 및 GC-MS 분석법의 감도와 선택성의 한계로 인하여 선택성과 감도가 뛰어난 액체크로마토그래피-텐덤질량분석기(Liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS)를 이용한 검출기술 개발이 시도되고 있다. LC-MS/MS를 이용한 동화작용 스테로이드들에 대한 분석기술의 개발은 전 세계 반도핑 분야의 매우 중요한 핵심 이슈로 대두되고 있으나 모든 스테로이드들을 동시에 액체상에서 이온화시킬 수 있는 이온화법이 없고 동화작용 스테로이드에 대한 동시 분석/검출법 개발이 매우 어려운 문제점이 있다.
그러므로 상기 문제점들을 극복하여 모든 스테로이드들을 동시에 이온화 시킬 수 있는 새로운 이온화 기술 및 이를 이용한 동시 분석/검출 방법의 개발이 요구되는 실정이다.
1: 한국 등록특허 제10-1195049호
이에 본 발명자들은 여러 스테로이드들을 동시에 이온화시킬 수 있는 새로운 이온화 기술 및 이를 이용한 동시 분석/검출 방법을 고안하던 중, 은이온 배위결합 이온분무(Silver ion coordination ionspray, Ag+CIS)를 이용하여 스테로이드를 이온화함으로써, 모든 스테로이드 화합물을 동시에 이온화시킬 수 있으며 이러한 이온들의 특정 시간을 모니터링하여 사중극자텐덤질량분석기에서의 체류시간(dwell time)을 향상시켜 분석하는 경우, 동시에 모든 스테로이드 화합물을 선택성과 감도를 향상시켜 분석할 수 있다는 것을 알게 되어 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
따라서, 본 발명은 (1) 운동선수의 소변시료로부터 추출된 동화작용 스테로이드들 및 그 대세체와 유사한 약리 작용을 가지는 물질들을 초고압 액체크로마토그래피를 이용하여 동시 분리분석하고, (2) 다양한 동화작용 스테로이드들 및 그 대사체와 유사한 약리 작용을 가지는 물질들을 동시에 이온화시킬 수 있는 방법을 제공하고, (3) 은이온 배위결합 이온분무/사중극자텐덤질량분석기를 이용하여 동시 검출하는 방법을 제공하는데 있다.
상기 과제를 해결하기 위해 본 발명에서는 (a) 시료에 존재하는 동화작용 스테로이드와 그 대사체 및 유사한 약리작용을 가지는 물질들을 효소를 사용하여 가수분해하는 단계; (b) 가수분해된 시료를 염기화하고 유기용매로 추출하는 단계; (c) 추출된 물질을 액체크로마토그래피를 통해 분리시키는 단계; (d) 분리된 물질을 은이온 배위결합 이온분무를 이용하여 동시에 이온화시키는 단계; 및 (e) 이온화된 물질을 사중극자텐덤질량분석기를 이용하여 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 동화작용 스테로이드 검출 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 동화작용 스테로이드 검출 방법은 은이온 배위결합 전지분무를 이용한 단일 이온화법으로 모든 스테로이드들을 동시에 이온화 시켜 검출할 수 있어 경제적인 측면과 시간적인 측면에서 탁월한 우수성을 가진다. 이는 도핑 분석 분야에서 효율적인 1차 스크리닝 방법으로 적용될 수 있을 뿐 아니라, 제약, 식품 및 환경 등의 다양한 분야에서 다양한 스테로이드들을 동시분석하는데 까지 그 응용범위를 확장할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 시료에서 금지약물의 검출여부를 확인하기 위한 방법을 나타낸 흐름도이다.
도 2 내지 도 7은 동화작용 스테로이드들에 대하여 액체크로마토그래피-은이온 배위결합 이온분무/사중극자텐덤질량분석기를 이용하여 분석한 이온크로마토그램이다.
본 발명은 (a) 시료에 존재하는 동화작용 스테로이드와 그 대사체 및 유사한 약리작용을 가지는 물질들을 효소를 사용하여 가수분해하는 단계; (b) 가수분해된 시료를 염기화하고 유기용매로 추출하는 단계; (c) 추출된 물질을 액체크로마토그래피를 통해 분리시키는 단계; (d) 분리된 물질을 은이온 배위결합 이온분무를 이용하여 동시에 이온화시키는 단계; 및 (e) 이온화된 물질을 사중극자텐덤질량분석기를 이용하여 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 동화작용 스테로이드 검출 방법에 관한 것이다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 시료에서 금지약물의 검출여부를 확인하기 위한 방법을 나타낸 흐름도로서, 이하 각 단계별 과정에 대하여 상세하게 설명하도록 한다.
상기 (a) 단계는, 시료에 존재하는 동화작용 스테로이드와 그 대사체 및 유사한 약리작용을 가지는 물질들을 효소(enzyme)를 사용하여 가수분해하는 단계로서, 대다수의 약물들은 체내에서 대사과정을 거치는데, 대사효소에 의해 구조가 변형된 대사체(metabolite)로 변환되거나, 모약물(parent drug) 또는 대사체가 생체 내 존재하는 글루쿠론산(glucuronic acid) 또는 설페이트(sulfate) 등과 결합하여 모약물 또는 대사체의 포합대사체 형태로 대사되기도 한다. 시료에 존재하는 포합대사체는 자유형태소로 전환하기 위한 가수분해 과정을 거쳐 분석대상물질인 모약물 또는 일반 대사체로 재변환될 수 있으며, 본 발명에서는 가수분해 시 효소는 베타-글루쿠로니데이즈(β-glucuronidase)가 사용될 수 있다. 상기 시료는 인간 또는 동물의 소변, 혈액 등이 될 수 있다.
상기 (b) 단계는 (a) 단계에서 가수분해된 시료를 염기화하고 유기용매로 추출하는 단계로서, 시료 내의 물리 화학적으로 성질이 다른 다양한 분석물질들을 동시에 추출하기 위한 것으로 시료 내의 분석물질이 액체상 추출에 사용하는 유기용매와 최적으로 상호작용하여 높은 추출 효율을 갖게 하기 위해서는 시료의 pH를 적절하게 조절하는 것이 필요하다. 따라서 본 발명에서는 가수분해된 시료를 pH 9 ~ 10의 범위로 조절할 수 있으며, 상기 유기 용매는 알칸, 에테르, 알데하이드, 케톤, 에스테르, 아미드 및 방향족 그에 속하는 유기 용매를 사용할 수 있으나, 바람직하게는 디에틸에테르, 헥산, 제3차부틸메틸에테르 및 에틸아세테이트로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 용액을 사용할 수 있다. 특히 디에틸에테르 용액을 사용하면 추출효율이 높아 더욱 바람직하다.
상기 (c) 단계는 (b) 단계에서 추출된 물질을 액체크로마토그래피를 이용하는 분리하는 단계로서, 먼저 추출물을 혼합하여 증발건조기를 이용하여 건조시킨 후, 이동상에 녹여 액체크로마토그래피에 주입하게 된다. 상기 액체크로마토그래페에서 사용되는 이동상으로는 증류수 및 메탄올 용액이 사용될 수 있다.
또한 상기 액체크로마토그래피는 증류수(A-이동상)과 메탄올(B-이동상)의 부피비가 55 : 45에서 2 : 98 기울기용리(gradient)를 갖는 것이 바람직하다. 상기 이동상은 액체크로마토그래피에 0.3 ~ 0.5 mL/min의 속도로 주입하여 1 ~ 46분 동안 분석될 수 있다. 상기 액체크로마토그래피에 사용되는 컬럼으로 옥타데실 실란(C18)으로 충진된 고압용 컬럼을 사용하는 것이 바람직하다.
상기 (d) 단계는 (c) 단계에서 분리된 물질을 은이온 배위결합 이온분무를(silver coordination ionspray)를 이용하여 동시에 이온화시키는 단계이다.
본 발명에 따른 일 구현예로서, 은이온 배위결합 이온분무는 질산은(silver nitrate) 또는 초산은(silver acetate) 용액을 분리단계 후 배출되는 이동상에 주입하여 동화작용 스테로이드들과 은이온 배위결합을 형성시킨다. 질산은 또는 초산은 용액은 액체크로마토그래피 또는 실린지 펌프(syringe pump)통해 주입하게 된다. 상기 은 용액은 0.5 ~ 2 mM의 농도로 0.005 ~ 0.010 mL/min의 속도로 주입하여 1 ~ 46분 동안 분석될 수 있다.
상기 (e) 단계는 (d) 단계의 이온화된 물질을 사중극자텐덤질량분석기(Triple-quadrupole mass spectrometry)를 이용하여 검출하는 단계이다. 상기 분석은 질량분석기의 다중반응탐색법(Multiple Reaction Monitoring 또는 Selected Reaction Monitoring)을 사용하여 수행될 수 있다.
본 발명에 따른 일 구현예로서, 사중극자텐덤질량분석기는 1차 이온화로 생성된 이온을 CID(collision-induced dissociation)에서 또 다시 이온화하기 때문에 방해물질 또는 다른 물질로부터 선택성을 증가시킬 수 있다.
또한 본 발명은 상기 분석단계에서 분석된 물질들은 양(positive) 이온 모드에서 [M+Ag]+ 값을 선구이온(precursor ion)으로 가지고, 각각 최적의 충돌에너지에서 생성이온(product ion)을 형성하게 된다. 90 여종 내·외인성 동화작용 스테로이드들을 동시에 효율적으로 분석하기 위해서 분석물질의 머무름 시간 전-후로 60초만 분석하여 체류시간(dwell time)을 높일 수 있는 Scheduled MRM(AB Sciex, Analyst 1.5 버전)를 사용할 수 있다.
본 발명의 방법으로 시료를 분석할시, 90 여종의 내·외인성 동화작용 스테로이드들을 한 번에 분석이 가능하며, 구체적으로, 1-안드로스텐다이온(1-androstenedione), 19-노르안드로스텐다이온(19-norandrostenedione),1-테스토스테론(1-testosterone), 1-테스토스테론 대사체(5α-androst-1-ene-3α-ol-17-one), 4-하이드록시테스토스테론(4-hydroxytestosterone), 4-하이드록시테스토스테론 대사체(4-hydroxyandrostenedione, formesterone), 6-옥소안드로스텐다이온(6-oxo-androstenedione), 6-옥소안드로스텐다이온 대사체(4-androstene-6a-ol-3,17-dione), 안드로스타트리엔다이온(androstatrienedione), 볼란다이올(bolandiol), 볼라스테론(bolasterone), 볼라스테론 대사체(7α-17α-dimethyl-5β-androstane-3α,17β-diol), 볼데논(boldenone), 볼데논 대사체(17β-hydroxy-5β-androst-1-en-3-one), 볼다이온(boldione), 칼루스테론(calusterone), 칼루스테론 대사체(7β-17α-dimethyl-5β-androstane-3α,17β-diol), 클로스테볼(clostebol), 클로스테볼 대사체(4-chloro-3α-hydroxyandrost-4-en-17-one), 다나졸(danazol), 다나졸 대사체(ethisterone), 디하이드로클로로메틸테스토스테론(dehydrochlormethyltestosterone), 디하이드로클로로메틸테스토스테론 대사체(6β-OH-4-chloro-dehydromehtyltestosterone), 드로스타놀론 대사체(3α-hydroxy-2α-methyl-5α-androstan-17-one), 에틸에스트레놀(ethylestrenol), 플루옥시메스테론(fluoxymesterone), 플루옥시메스테론 대사체 1(9α-fluoro-17α-methyl-4-androsten-3α,6β,11β,17β-tetra-ol), 플루옥시메스테론 대사체 2(9α-Fluoro-17,17-dimethyl-18-norandrosta-4,13-diene-11β-ol-3-one), 플루옥시메스테론 대사체 3(6β-OH-fluoxymesterone), 포메볼론 대사체(2-hydroxymethyl 17α-methyl-androstadiene-11α,17β-diol-3-one), 푸라자볼 대사체(16β-OH-furazabol), 게스트리논(gestrinone), 메스타놀론(mestanolone), 메스테롤론 대사체 1(1α-methyl-5α-androstan-3α-ol-17-one), 메스테롤론 대사체 2(1α-methyl-5α-androstane-3α,17β-diol), 메테놀론(metenolone), 메테놀론 대사체(1-methylene-5α-androstan-3α-ol-17-one), 메탄다이에논(methandienone), 메탄다이에논 대사체 1(epimetendiol), 메탄다이에논 대사체 2(6β-OH-methandienone), 메탄다이에논 대사체 3(17,17-dimethyl-18-norandrosta-1,4,13-triene-3-one), 메탄드리올(methandriol), 메타스테론(methasterone), 메틸-1-테스트스테론(methyl-1- testosterone), 메틸다이엔놀론(methyldienolone), 메틸테스토스테론 대사체 1(17α-methyl-5α-androstane-3α,17β-diol), 메틸테스토스테론 대사체 2(17α-methyl-5β-androstane-3α,17β-diol), 미볼레론(mibolerone), 난드롤론(nandrolone), 난드롤론 대사체 1(19-norandrosterone), 난드롤론 대사체 2(19-noretiocholanolone), 노르볼레톤 대사체 1(13β,17α-diethyl-5α-gonane-3α, 17β-diol), 노르볼레톤 대사체 2(13β,17α-diethyl-5β-gonane-3α, 17β-diol), 노르클로스테볼(norclostebol), 노르에탄드롤론(norethandrolone), 노르에탄드롤론 대사체 1(17α-ethyl-5β-estrane-3α,17β-diol), 노르에탄드롤론 대사체 2(17α-hydroxyethyl-5β-estrane-3α,17β-diol ), 옥사볼론(oxabolone), 옥산드롤론(oxandrolone), 옥산드롤론 대사체(17-epioxandrolone), 옥시메스테론(oxymesterone), 3’-하이드록시프로스타노졸(3’-hydroxyprotanozol), 스타노졸롤(stanozolol), 스타노졸롤 대사체 1(3‘-hydoxystanozolol), 스타노졸롤 대사체 2(16β-hydroxystanzolol), 스타노졸롤 대사체 3(4β-hydroxystanzolol), 테트라하이드로게스트리논(tetrahydrogestrinone), 티볼론(tibolone), 티볼론 대사체 1(3β-hydroxytibolone), 티볼론 대사체 2(3α-OH-tibolone), 트렌볼론(trenbolone), 트렌볼론 대사체(17α-trenbolone), 제라놀(zeranol), 제라놀 대사체(β-zeranol) 등의 외인성 동화작용 스테로이드들과,
11β-하이드록시안드로스테론(11β-hydroxyandrosterone), 11β-하이드록시에티오콜라놀론(11β-hydroxyeiocholanolone), 11-케토-안드로스테론(11-keto-androsterone), 11-케토-에티오콜라놀론(11-keto-etiocholanolone), 17β-에스트라다이올(17β-estradiol, E2), 5α-안드로스탄-3α,17α-다이올(5α-androstane-3α,17α-diol), 5α-안드로스탄-3α,17β-다이올(5α-androstane-3α,17β-diol), 5α-안드로스탄-3β,17α-다이올(5α-androstane-3β,17α-diol), 5α-안드로스탄-3β,17β-다이올(5α-androstane-3β,17β-diol), 5β-안드로스탄-3α,17α-다이올(5β-androstane-3α,17α-diol), 5β-안드로스탄-3α,17β-다이올(5β-androstane-3α,17β-diol), 5β-안드로스탄-3β,17β-다이올(5β-androstane-3β,17β-diol), 안드로스테네다이올(androstenediol), 안드로스테네다이온(androstenedione), 안드로스테론(androsterone), 디하이드로에피안드로스테론(dehydroepiandrosterone, DHEA), 다이하이드로테스토스테론(dihydrotestosterone, DHT) 에피테스토스테론(epitestosterone), 에스트리올(estriol, E3), 에티오콜라놀론(etiocholanolone), 프레그나네다이올(prenanediol), 테스토스테론(testosterone) 등의 내인성 동화작용 스테로이드들을 동시에 검출 가능하다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 하나, 하기한 실시예는 본 발명을 예증하기 위한 것일 뿐, 본 발명을 제한하는 것은 아님을 이해하여만 할 것이다.
시료의 준비
분석물질을 포함하지 않는 공소변시료(blank urine) 2 mL에 동화작용 스테로이드들을 첨가하여 소변시료를 제조하였다. 제조된 소변 시료에서 동화작용 스테로이드들의 농도는 WADA에서 정한 최소요구농도(Minimum Required Performance Levels, MRPL) 수준이다.
실시예
(a) 가수분해단계
상기 준비된 시료 2 mL에 내부표준물질을 넣고, 활성화된 PAD-1 레진을 이용하여 고체상 추출한 후 용출된 메탄올 용액을 로터리 증발건조기를 이용하여 제거하였다. 건고된 시료에 0.2 M 포스페이트(phosphate) 완충용액(1 mL)을 이용하여 pH를 조절한 후 베타-글루쿠로니데이즈 효소(50 μL)를 첨가한 다음 55℃에서 1시간 동안 가수분해하였다.
(b) 추출단계
상기 (a)의 가수분해단계를 마친 시료를 상온에서 식히고, 0.5 mL의 5% K2CO3 용액으로 pH를 약 10으로 조절하고, 5 mL의 디에틸에테르 용매로 추출하였다. 위의 혼합용액을 원심분리 및 급속 냉동하여 유기층은 다른 튜브(tube)에 옮겼다.
(c) 분리단계
상기 (b)의 추출단계를 통해 추출된 유기층을 증발건조기를 이용하여 건조하였다. 건조된 시료를 증류수와 메탄올이 50:50로 혼합된 용매 50 μL에 녹인 후, 10 μL를 고성능 액체크로마토그래피(시마즈社, UFLC)에 주입하였다. 사용된 분석 컬럼은 길이 150 mm, 내경 2.1 mm 및 입자크기 2.7 μm인 시세이도사의 Capcell core C18 컬럼을 사용하였다. 주입된 용액에 대하여 이동상은 증류수(A-이동상)와 메탄올(B-이동상)을 이동상으로 한 기울기 용리를 사용하여 분리를 실시하였다. 분리과정에서 A-이동상과 B-이동상을 55:45의 비율로 시작하여 25분까지 일정한 속도로 30:70의 비율까지 B-이동상 비율을 올린 후, 34분 까지 10:90의 비율까지 B-이동상 비율을 올린 다음 4분 동안 유지시켰으며, 이후 38.1분까지 2:98의 비율까지 B-이동상 비율을 올린 후, 4분 동안 유지하였다. 그 후 시작조건인 55:45의 비율로 46분까지 안정화하였다. 이동상의 전체 유속은 0.4 mL/min을 사용하였고, 컬럼의 온도는 35℃로 유지하였다.
(d) 이온화단계
상기 (c)의 분리단계를 통해 분리된 분석물질은 은이온 배위결합 이온분무(silver coordination ionspray) 통해 동시에 이온화시켰다. 상기 은이온 배위결합 이온분무 이온화기의 조건은 이온스프레이 전압은 5400 V, 가열온도는 650℃, 이온소스(ion source) 가스 1과 2의 압력은 80 psi, 커튼(curtain) 가스는 30 psi 압력의 산소를 이용하여 분석하였다. 은이온 배위결합을 형성시키기 위하여 1 mM의 질산은 용액을 분리분석이 끝난 이동상에 혼합하였다. 상기 혼합을 위하여 질산은 용액은 액체크로마토그래피(시마즈社, HPLC)를 통해 주입하였고 유속은 0.010 mL/min을 사용하였다.
(e) 검출단계
상기 (d)의 이온화단계를 통해 동시에 이온화된 분석물질은 API4000 질량분석기(AB Sciex, Toronto, Canada)의 사중극자텐덤질량분석기(Triple-quadrupole tandem mass spectrometry)를 통해 분석을 실시하였다.
분석된 시료의 정성은 질량분석기의 MRM(Multiple Reaction Monitoring) 모드를 사용하여 분석하였다. 분석된 물질 [M+Ag]+값 선구이온으로 가지며, 각각 최적의 충돌 에너지에서 생성이온(product ion)을 형성한다. 상기와 같이 얻어진 각 분석물질의 선구이온 및 생성이온 값과 최적 충돌에너지 그리고 머무름시간 등은 하기 표1에 나타내었다. 본 분석방법에서는 많은 분석물질을 효율적으로 분석할 수 있도록 분석물질의 머무름 시간 전-후로 60초만 분석하도록 Scheduled MRM를 사용하여 충분한 체류시간(dwell time)을 확보함으로써 90 여종의 내·외인성 동화작용 스테로이드들을 동시 분석이 가능하도록 하였다.
Anabolic Androgenic Steroids ( AAS ) Abbreviation Q1 (m/z) Q3 (m/z) DP
(V) 		CE
(V) 		R.T ( min )
Group I Conjugated keto
Exogenous AAS
1-Androstendione 1AND 393 107 111 39 18.82
1-Testosterone 1T 395 107 130 45 21.07
19-Norandrostenedione 19NOR 379 107 116 39 13.75
4-OH-testosterone 4HT 411 107 130 52 18.41
4-OH-androstenedione 4HT-M 409 107 121 47 17.31
6-Oxo-androstenedione 6-OXO 407 107 121 43 8.04
4-Androstene-6α-ol-3,17-dione 6-OXO-M 409 107 136 43 6.81
Androstatrienedione ATD 389 171 116 41 12.34
Bolasterone BOLAS 423 405 121 37 22.53
Boldenone BOLD 393 121 126 49 15.07
17β-Hydroxy-5β-androst-1-en-3-one BOLD-M 395 109 126 43 21.84
Boldione BODI 391 107 136 45 12.61
Calusterone CALUS 423 405 126 35 24.40
Clostebol CLOS 431 413 151 15 31.18
Ethisterone DANA-M 419 393 101 27 19.15
Dehydrochormethyltestosterone DHMT 441 147 116 41 22.21
6β-OH-4-chloro-dehydromehtyl testosterone DHMT-M 457 421 121 27 11.97
Fluoxymesterone FLUO 443 423 116 27 15.40
9α-Fluoro-17,17-dimethyl-18-norandrosta -4,13-diene-11β-ol-3-one FLUO-M2 425 405 106 25 26.44
6β-OH-fluoxymesterone FLUO-M3 459 439 126 25 7.15
2-Hydroxymethyl-17α-methyl-androstadiene-11α,17β-diol-3-one FOR-M 453 423 126 35 8.81
Gestrinone GES 415 107 96 53 18.08
Tetrahydrogestrinone THG 419 265 111 35 23.91
Metenolone METE 409 107 131 47 21.33
Methandienone METH 407 121 131 49 16.87
6β-OH-methandienone METH-M2 423 107 141 55 7.73
17,17-Dimethyl-18-norandrosta-1,4,13-triene-3-one METH-M3 389 173 106 33 33.74
Methyl-1-testosterone M-1-T 409 391 131 31 23.71
Methyldienolone MEYDI 393 375 126 33 16.32
Mibolerone MIBO 409 391 131 33 20.60
Nandrolone NAND 381 107 126 45 15.86
Norclostebol NORC 415 107 111 49 20.79
Norethandrolone NORE 409 391 116 31 24.11
Oxabolone OXAB 397 107 101 45 15.78
Oxymesterone OXYMES 425 107 121 55 20.79
Trebolone TREN 377 107 101 39 13.79
17α-Trenbolone ETREN 377 107 130 45 15.77
Endogenous AAS
Androstenedione ANDDI 393 107 121 43 16.44
Testosterone T 395 107 121 47 18.39
Epitestosterone ET 395 107 126 47 22.56
Group II Unconjugated keto with double bond
Exogenous AAS
5α-Androst-1-ene-3α-ol-17-one 1T-M 395 151 111 33 24.07
4-Chloro-4-androsten-3α-ol-17-one CLOS-M 429 123 101 37 26.24
1-Methylene-5α-androstan-3α-ol-17-one METE-M 409 107 106 53 25.92
Tibolone TIBO 419 107 116 37 18.57
Endogenous AAS
Dehydroepiandrosterone DHEA 395 107 116 45 20.22
Group III Unconjugated keto without double bond
Exogenous AAS
2α-Methyl-5α-androstan-3α-ol-17-one DROS-M 411 107 116 47 30.35
Mestanolone MESTA 411 393 121 29 25.62
1α-Methyl-5α-androstan-3α-ol-17-one MESTE-M1 411 107 126 31 28.65
Methasterone METHA 425 125 121 33 29.65
19-Norandrosterone 19-NA 383 107 126 39 24.58
19-Noretiocholanolone 19-NE 383 107 111 41 23.81
Oxandrolone OXAN 415 351 121 35 16.03
17-Epioxandrolone EOXAN 413 351 126 33 23.32
Endogenous AAS
11β-OH-androsterone 11β-OH-A 413 377 116 39 16.17
11β-OH-etiocholanolone 11β-OH-E 413 377 116 39 15.91
11-Keto-androsterone 11-keto-A 411 393 116 33 16.40
11-Keto-etiocholanolone 11-keto-E 411 107 126 45 16.24
Androsterone ANDRO 397 107 131 47 27.10
Dihydrotestosterone DHT 397 107 126 43 23.07
Etiocholanolone ETCH 397 107 136 49 26.61
Group IV Double bond and hydroxyl function
Exogenous AAS
Bolandiol BOLAN 385 365 101 27 16.49
Ethylestrenol ETHES 395 377 101 25 38.91
9α-Fluoro-17α-methyl-4-androsten-3α,6β,11β,17β-tetra-ol FLUO-M1 463 443 96 23 1.98
Epimetendiol METH-M1 411 149 86 41 32.90
Methandriol METDR 411 375 106 37 22.13
3β-OH-tibolone TIBO-M1 421 133 101 39 24.64
3α-OH-tibolone TIBO-M2 421 133 130 43 20.58
Endogenous AAS
Androstenediol ANDDL 399 145 116 49 19.07
Group V Only hydroxyl function
Exogenous AAS
7α-17α-Dimethyl-5β-androstane-3α,17β-diol BOLAS-M 427 409 121 29 28.18
7β-17α-Dimethyl-5β-androstane-3α,17β-diol CALUS-M 427 391 131 33 29.47
1α-Methyl-5α-androstane-3α,17β-diol MESTE-M2 413 305 106 29 27.63
17α-Methyl-5α-androstane-3α,17β-diol MT-M1 413 395 126 27 26.82
17α-Methyl-5β-androstane-3α,17β-diol MT-M2 413 377 121 33 27.01
13β,17α-Diethyl-5α-gonane-3α,17β-diol NORB-M1 429 411 111 23 30.62
13β,17α-Diethyl-5β-gonane-3α, 17β-diol NORB-M2 429 393 111 29 30.19
17α-Ethyl-5β-estrane-3α,17β-diol NORE-M1 415 379 111 39 27.02
17α-Hydroxyethyl-5β-estrane-3α,17β-diol NORE-M2 429 411 106 33 22.37
Endogenous AAS
5α-Androstane-3α,17α-diol ααα 399 107 106 49 31.43
5α-Androstane-3α,17β-diol ααβ 399 107 111 49 26.43
5α-Androstane-3β,17α-diol αβα 399 107 106 45 25.25
5α-Androstane-3β,17β-diol αββ 399 107 116 45 21.25
5β-Androstane-3α,17α-diol βαα 399 107 121 58 31.43
5β-Androstane-3α,17β-diol βαβ 399 107 116 47 26.90
5β-Androstane-3β,17β-diol βββ 399 107 116 47 21.50
Pregnanediol PREGDL 427 407 126 35 31.69
Group VI Nitrogen and / or other functions
Exogenous AAS
Danazol DANA 446 420 131 31 27.72
16β-OH-furazabol FURA-M 453 107 141 61 24.38
3'-OH-prostanozol 3'-OH-PROS 435 107 131 61 15.46
Stanozolol STANO 435 417 151 37 26.81
3'-OH-stanzolol STANO-M1 451 107 131 61 18.67
16β-OH-stanzolol STANO-M2 451 107 146 61 18.99
4β-OH-stanzolol STANO-M3 451 415 131 43 19.03
α-Zeranol ZERA 429 393 96 35 17.76
β-Zeranol EZERA 431 395 96 33 13.30
Endogenous AAS
17β-Estradiol E2 381 157 106 37 17.41
Estriol E3 395 287 101 23 5.99
그 결과는 도 2 내지 도 7에서 나타낸 데이터와 같으며, 90 여종의 내·외인성 동화작용 스테로이드들을 검출한 결과를 확인할 수 있었다. 또한 반복성을 5개의 소변 시료를 분석하여 분석물질과 내부표준물질의 면적 값 비에 대한 변동계수(% CV)로, 재현성을 5일간 5개의 소변 시료를 분석하여 분석물질과 내부표준물질의 면적 값 비에 대한 변동계수(% CV)로, 매질효과를 순수한 용매(추출용매)에 분석물질을 첨가한 시료와 공소변시료(blank urine)를 추출 후에 분석물질을 첨가한 시료에서의 분석물질 면적 값의 비교 방법으로 측정하여 하기 표 2 에 나타내었다. 표 2에서 볼 수 있듯이 반복성, 재현성, 매질효과 등이 우수함을 확인할 수 있었다.
Anabolic Androgenic Steroids ( AAS ) 반복성( CV %) 재현성( CV %) 매질효과(%)
RRT Area Ratio RRT Area Ratio Mean ± SD CV %
Group I Conjugated keto
Exogenous AAS
1-Androstendione 0.05 8.09 0.09 12.01 90.2 ± 4.4 4.92
1-Testosterone 0.03 6.56 0.29 8.43 71.8 ± 3.3 4.59
19-Norandrostenedione 0.05 4.92 0.58 5.72 88.4 ± 4.0 4.57
4-OH-testosterone 0.05 6.82 0.10 11.40 76.9 ± 5.6 7.31
4-OH-androstenedione 0.07 7.03 0.14 11.15 99.0 ± 6.0 6.10
6-Oxo-androstenedione 0.06 5.77 1.41 12.26 89.6 ± 3.9 4.35
4-Androstene-6α-ol-3,17-dione 0.07 4.90 1.26 8.97 91.4 ± 5.0 5.52
Androstatrienedione 0.10 2.02 0.91 4.81 92.5 ± 4.5 4.83
Bolasterone 0.05 3.48 0.34 3.54 93.2 ± 4.9 5.25
Boldenone 0.03 2.75 0.35 7.04 84.0 ± 4.5 5.38
17β-Hydroxy-5β-androst-1-en-3-one 0.04 3.78 0.40 6.72 77.5 ± 6.2 8.00
Boldione 0.05 2.69 0.62 4.12 92.0 ± 4.9 5.33
Calusterone 0.05 2.38 0.45 4.29 91.7 ± 4.3 4.66
Clostebol 0.05 10.81 1.24 12.17 72.6 ± 5.3 7.25
Ethisterone 0.06 2.71 0.09 7.35 93.0 ± 4.7 5.08
Dehydrochormethyltestosterone 0.03 3.32 0.30 6.45 85.9 ± 6.0 7.02
6β-OH-4-chloro-dehydromehtyl testosterone 0.05 0.84 0.66 4.60 94.1 ± 5.4 5.77
Fluoxymesterone 0.05 2.39 0.29 3.99 89.2 ± 5.3 5.94
9α-Fluoro-17,17-dimethyl-18-norandrosta -4,13-diene-11β-ol-3-one 0.05 1.81 0.61 5.41 85.0 ± 5.8 6.83
6β-OH-fluoxymesterone 0.06 2.37 1.26 8.95 89.8 ± 5.3 5.90
2-Hydroxymethyl-17α-methyl-androstadiene-11α,17β-diol-3-one 0.05 2.31 1.08 8.73 90.1 ± 3.2 3.56
Gestrinone 0.05 4.26 0.07 4.45 95.7 ± 4.2 4.38
Tetrahydrogestrinone 0.03 2.92 0.42 5.62 92.8 ± 6.5 6.99
Metenolone 0.02 3.57 0.24 4.64 85.1 ± 5.0 5.85
Methandienone 0.05 3.30 0.15 5.39 89.3 ± 4.3 4.86
6β-OH-methandienone 0.06 2.55 1.14 4.07 85.8 ± 3.8 4.41
17,17-Dimethyl-18-norandrosta-1,4,13-triene-3-one 0.07 9.16 1.41 10.63 85.1 ± 5.3 6.27
Methyl-1-testosterone 0.04 4.50 0.62 7.74 91.3 ± 5.3 5.80
Methyldienolone 0.03 3.16 0.21 6.93 80.8 ± 3.7 4.53
Mibolerone 0.07 2.54 0.20 3.80 90.9 ± 4.0 4.37
Nandrolone 0.06 2.98 0.27 4.43 85.0 ± 4.7 5.49
Norclostebol 0.04 3.64 0.21 3.74 93.6 ± 4.2 4.45
Norethandrolone 0.06 2.54 0.45 3.96 85.8 ± 4.3 5.01
Oxabolone 0.06 3.54 0.27 11.94 100.8 ± 5.0 5.01
Oxymesterone 0.05 5.46 0.33 11.91 88.5 ± 11.0 12.46
Trebolone 0.13 2.12 0.56 5.23 91.7 ± 3.4 3.67
17α-Trenbolone 0.03 4.12 0.26 6.89 96.7 ± 4.7 4.81
Endogenous AAS
Androstenedione 0.03 0.66 0.22 4.11 - -
Testosterone 0.18 0.68 1.95 2.48 - -
Epitestosterone 0.03 1.99 0.04 3.21 - -
Group II Unconjugated keto with double bond
Exogenous AAS
5α-Androst-1-ene-3α-ol-17-one 0.17 3.43 1.73 6.21 88.8 ± 4.7 5.29
4-Chloro-4-androsten-3α-ol-17-one 0.18 5.89 0.47 9.43 96.0 ± 2.2 2.25
1-Methylene-5α-androstan-3α-ol-17-one 0.03 3.35 0.57 4.84 91.9 ± 3.9 4.27
Tibolone 0.05 3.05 0.06 7.84 100.3 ± 6.7 6.64
Endogenous AAS
Dehydroepiandrosterone 0.08 12.28 0.24 14.53 - -
Group III Unconjugated keto without double bond
Exogenous AAS
2α-Methyl-5α-androstan-3α-ol-17-one 0.07 4.08 1.59 11.55 81.9 ± 5.9 7.19
Mestanolone 0.07 7.40 0.71 9.58 84.0 ± 5.4 6.40
1α-Methyl-5α-androstan-3α-ol-17-one 0.05 5.22 1.28 10.98 87.3 ± 7.6 8.71
Methasterone 0.04 4.95 1.46 13.57 80.4 ± 5.6 6.94
19-Norandrosterone 0.02 6.05 0.66 12.08 88.1 ± 5.7 6.52
19-Noretiocholanolone 0.04 5.51 0.60 9.86 96.0 ± 5.3 5.56
Oxandrolone 0.04 5.20 0.16 14.49 77.0 ± 4.8 6.23
17-Epioxandrolone 0.03 5.52 0.31 14.90 86.6 ± 4.9 5.70
Endogenous AAS
11β-OH-androsterone 0.15 12.19 1.70 14.38 - -
11β-OH-etiocholanolone 0.21 13.34 1.80 14.39 - -
11-Keto-androsterone 0.04 5.20 0.26 6.52 - -
11-Keto-etiocholanolone 0.28 7.05 2.79 11.34 - -
Androsterone 0.17 7.38 1.08 11.50 - -
Dihydrotestosterone 0.13 10.28 0.53 13.27 - -
Etiocholanolone 0.16 1.29 0.92 7.60 - -
Group IV Double bond and hydroxyl function
Exogenous AAS
Bolandiol 0.05 4.55 0.18 9.19 83.5 ± 4.5 5.39
Ethylestrenol 0.03 2.57 1.93 14.20 82.8 ± 10.0 12.09
9α-Fluoro-17α-methyl-4-androsten-3α,6β,11β,17β-tetra-ol 0.28 2.08 0.55 8.99 96.3 ± 2.7 2.80
Epimetendiol 0.07 4.20 1.37 10.44 87.8 ± 5.2 5.91
Methandriol 0.05 6.02 0.40 12.07 95.6 ± 6.5 6.82
3β-OH-tibolone 0.04 2.65 0.50 5.76 93.4 ± 5.1 6.05
3α-OH-tibolone 0.02 3.83 0.31 6.97 98.2 ± 5.9 5.47
Endogenous AAS
Androstenediol 0.06 7.99 0.09 14.75 - -
Group V Only hydroxyl function
Exogenous AAS
7α-17α-Dimethyl-5β-androstane-3α,17β-diol 0.04 4.48 1.18 10.36 81.9 ± 4.9 6.02
7β-17α-Dimethyl-5β-androstane-3α,17β-diol 0.07 6.76 1.44 8.87 89.8 ± 5.4 5.98
1α-Methyl-5α-androstane-3α,17β-diol 0.05 7.80 1.08 8.15 92.3 ± 4.8 5.16
17α-Methyl-5α-androstane-3α,17β-diol 0.06 7.87 0.77 12.80 94.8 ± 8.0 8.44
17α-Methyl-5β-androstane-3α,17β-diol 0.07 4.47 0.95 8.86 72.5 ± 8.3 11.43
13β,17α-Diethyl-5α-gonane-3α,17β-diol 0.07 5.56 1.62 11.15 85.3 ± 6.7 7.84
13β,17α-Diethyl-5β-gonane-3α, 17β-diol 0.07 6.07 1.57 8.49 78.0 ± 4.3 6.75
17α-Ethyl-5β-estrane-3α,17β-diol 0.07 6.33 0.93 8.72 85.2 ± 4.1 4.80
17α-Hydroxyethyl-5β-estrane-3α,17β-diol 0.04 4.39 0.43 4.47 87.3 ± 5.1 5.87
Endogenous AAS
5α-Androstane-3α,17α-diol 0.21 8.64 1.93 11.17 - -
5α-Androstane-3α,17β-diol 0.13 7.91 0.89 11.30 - -
5α-Androstane-3β,17α-diol 0.06 9.47 0.77 11.04 - -
5α-Androstane-3β,17β-diol 0.21 7.60 2.21 9.92 - -
5β-Androstane-3α,17α-diol 0.21 5.55 1.93 11.17 - -
5β-Androstane-3α,17β-diol 0.18 7.37 0.99 11.76 - -
5β-Androstane-3β,17β-diol 0.11 6.56 0.40 8.35 - -
Pregnanediol 0.23 4.81 1.90 9.17 - -
Group VI Nitrogen and / or other functions
Exogenous AAS
Danazol 0.05 3.27 0.81 7.04 93.9 ± 5.0 5.33
16β-OH-furazabol 0.05 3.52 0.61 8.66 91.6 ± 6.0 6.53
3'-OH-prostanozol 0.02 5.76 0.33 10.34 97.8 ± 5.6 5.76
Stanozolol 0.03 3.99 0.61 8.17 75.0 ± 9.3 12.38
3'-OH-stanzolol 0.05 4.25 0.10 12.61 69.7 ± 14.8 14.43
16β-OH-stanzolol 0.04 2.22 0.08 7.08 86.2 ± 9.0 10.45
4β-OH-stanzolol 0.04 3.89 0.06 6.13 92.2 ± 7.0 7.65
α-Zeranol 0.05 4.34 0.13 6.41 97.5 ± 5.2 5.28
β-Zeranol 0.04 3.57 0.73 5.87 94.5 ± 5.1 5.36
Endogenous AAS
17β-Estradiol 0.05 13.10 0.21 14.84 - -
Estriol 0.16 12.17 1.98 14.44 - -

Claims (11)

  1. (a) 시료에 존재하는 동화작용 스테로이드와 그 대사체 및 유사한 약리작용을 가지는 물질(이하 '동화작용 스테로이드'라 한다)을 효소를 사용하여 가수분해하는 단계;
    (b) 가수분해된 시료를 염기화하고 유기용매로 추출하는 단계;
    (c) 추출된 물질을 액체크로마토그래피를 통해 분리시키는 단계;
    (d) 분리된 물질의 이동상에 0.5 ~ 2 mM 농도의 질산은 또는 초산은 용액을 0.005 ~ 0.010 mL/min의 속도로 주입하여 동화작용 스테로이드와 은이온 배위결합시키는 은이온 배위결합 이온분무를 통해, 복수의 동화작용 스테로이드를 동시에 이온화하는 단계; 및
    (e) 이온화된 물질을 사중극자텐덤질량분석기를 이용하여 검출하는 단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 동화작용 스테로이드 검출 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 (a) 단계의 효소는 베타-글루쿠로니데이즈 효소인 것을 특징으로 하는 동화작용 스테로이드 검출 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 (b) 단계의 염기화는 pH 9 ~ 10의 범위로 염기화되는 것을 특징으로 하는 동화작용 스테로이드 검출 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 (b) 단계의 유기용매는 디에틸에테르, 헥산, 제3차부틸메틸에테르 및 에틸아세테이트로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 용매인 것을 특징으로 하는 동화작용 스테로이드 검출 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 (c) 단계의 액체크로마토그래피는 이동상 용액으로 증류수 및 메탄올 용액을 사용하는 것을 특징으로 하는 동화작용 스테로이드 검출 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 (c) 단계의 액체크로마토그래피는 증류수와 메탄올 용액의 부피비가 55:45에서 2:98의 기울기용리(gradient)를 가지는 것을 특징으로 하는 동화작용 스테로이드 검출 방법.
  7. 제 5 항에 있어서, 상기 이동상은 액체크로마토그래피에 0.3 ~ 0.5 mL/min의 속도로 주입하여 1 ~ 46분 동안 분석되는 것을 특징으로 하는 동화작용 스테로이드 검출 방법.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 (c) 단계의 액체크로마토그래피는 컬럼으로 옥타데실 실란(C18)으로 충진된 고압용 컬럼을 사용하는 것을 특징으로 하는 동화작용 스테로이드 검출 방법.
  9. 삭제
  10. 제 1 항에 있어서, 상기 (d) 단계의 은이온 배위결합 이온분무는 이온스프레이 전압이 5400V, 가열온도가 650℃, 이온소스(ion source) 가스 1과 2의 압력은 80 psi, 커튼(curtain) 가스가 30 psi 압력의 산소인 조건에서 수행되는 동화작용 스테로이드 검출 방법.
  11. 제 1 항에 있어서, 상기 질산은 또는 초산은 용액은 액체크로마토그래피 또는 실린지 펌프를 통해 주입되는 것을 특징으로 하는 동화 작용 스테로이드 검출 방법.
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