JP4416404B2 - 活性成分を高度に富化された、イチョウの葉の抽出物の製造方法 - Google Patents
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Description
i.葉の乾燥粉末を40重量%の水を含有するアセトン中で抽出する工程;
ii.抽出物を、約30%の固体を含有する濃縮物が得られるまで減圧下で濃縮してアセトンを除去しついで水で稀釈して固体の濃度を15%とし、得られた懸濁物を1時間で約10℃まで冷却し、ついで、脂質沈殿物をろ過により除去することにより脂質を除去する工程;
iii.水性ろ液に30%硫酸アンモニウム溶液を添加しついでメチルエチルケトンとアセトンの混合物(9:1〜4:6)を使用して液-液抽出を行い、ついで、有機相を濃縮して固体の濃度を50〜70%とすることにより有機相を富化する工程;
iv.濃縮物を、重量比で50/50の水とエタノールの混合物で稀釈して固体の濃度を10%とし、鉛塩の水溶液を色相が褐色からコハク色になるまで添加しついで鉛-タンニン沈殿物をろ過して透明なろ液を得ることによりタンニンを除去する工程;
v.ろ液を濃縮することによりエタノールを最大割合の5%に保持し、硫酸アンモニウムを約20%の濃度になるまで添加しついでメチルエチルケトンとエタノールの混合物(8:2〜1:1)を使用して液-液抽出を行うことにより、鉛を不溶性硫酸塩の形で除去する工程;及び
vi.有機相を濃縮して固体の濃度を50〜70%としついでオーブン中で、真空下、60〜80℃で乾燥させることにより、5%以下の水を含有する最終生成物を単離する工程。
3.有機相の富化:酢酸エチルとヘキサン(9:1)との混合物を使用する液-液抽出;水性相をn-ブタノールで再抽出し、得られたn-ブタノール相を濃縮、乾固させてフラボン-グリコシドに富むフラクションを得る工程;
4.活性炭による処理:アセテート-ヘキサン エチル相の水による洗浄、ついで、洗浄したアセテート-ヘキサン エチル相を活性炭で処理し、ろ過しついで濃縮、乾固させる;
5.再結晶:固体残渣を重量比で50/50のエタノールと水の混合物に溶解させた後、冷却して結晶化させついでろ過してギンゴライドを回収する工程;
6.カラムクロマトグラフィー:工程5の上澄み液を濃縮、乾固させついでシリカゲルカラム上でのクロマトグラフィーを行ってビロバライドとギンゴライドに富むフラクションを得る工程;
7.フラクションの混合:工程3で得られたフラボン-グリコシドに富むフラクションと、工程5叉は6で得られたギンゴライド及び/叉は工程6で得られたビロバライドとを混合する工程。
a) 葉の乾燥粉末を50重量%の水を含有するエタノールで抽出する工程;
b) 抽出物をエタノールが除去されるまで、減圧下で濃縮し、濃縮物を水で希釈し、混合物を48時間放置しついで脂質沈殿物をろ過することにより脂質を除去する工程;
c) 水性ろ液をXAD-4樹脂(多孔質重合体の混合物)とポリアミドの混合物からなる樹脂を通過させることにより活性化合物を捕捉する工程;
d) 30、60及び90重量%のエタノールを含有するエタノール-水混合物を順次使用して活性化合物を溶離する工程;及び
e) d)で得られた全てのフラクションを混合し、エタノールを蒸発させ、水性濃縮物をヘキサンで洗浄しついで洗浄した水性相を蒸発、乾固させることにより、47.2%のフラボン-グリコシドと6.3%のテルペン-ラクトンを含有する抽出物を得る工程。
i.イチョウの葉の乾燥断片を、最大で20重量%の水を含有するエタノール中で抽出する工程;
ii.抽出物を塩化ナトリウム水溶液の存在下、減圧下で濃縮しついで残留物の透明溶液から暗色油状物を除去する工程;
iii.残留水溶液をn-ヘキサン、n-ヘプタン叉はシクロヘキサンを使用して液-液抽出により洗浄する工程;
iv.洗浄した水性相を酢酸エチルを使用して液-液抽出する工程;
v.工程ivで得られた酢酸エチル相を塩化ナトリウム水溶液で洗浄しついで洗浄した酢酸エチル相を蒸発乾固させる工程;
からなることを特徴とする、イチョウの葉の抽出物の製造方法である。
―イチョウの葉の凍結乾燥断片(好ましくは粉末)―この場合には、少なくとも50重量%のフラボン-グリコシドと12重量%のテルペン-ラクトンを含有する抽出物が得られる―;叉は、
―イチョウの葉の乾燥断片(好ましくは粉末)―この場合には、少なくとも30重量%のテルペン-ラクトンと少なくとも15重量%のフラボン-グリコシドを含有する抽出物(以下においては“主抽出物”(“principle extract”)と称する)が得られる(この場合、前記方法によれば、更に、PCT特許出願WO 96/33728号明細書に記載されるものに類似する抽出物の関連生成物、即ち、約30〜35重量%のフラボン-グリコシドと約1重量%のテルペン-ラクトンを含有する抽出物(以下においては“関連抽出物”(“related extract”)と称する)を得ることが可能である)―;
に適用し得る。
a) 酢酸エチルとエタノールの約1:1の混合物を使用して液-液抽出を行う工程;
b) 工程a)の終了時に回収された有機相を蒸発、乾固させる工程;
c) 工程b) で得られた残渣を無水エタノールに溶解させて、固体の濃度をエタノール溶液の重量に基づいて約5〜10重量%とする工程;
d) 混合物を、好ましくは30分〜12時間の間に、好ましくは10℃に等しいか又はそれ以下の温度(例えば2〜8℃の温度)まで冷却する工程;
e) 回収されたろ液のエタノールをろ過しついで蒸発させて乾燥抽出物を生成させる工程。
vi.乾燥抽出物をエタノールに溶解させ、溶液を好ましくは10℃に等しいか又はそれ以下の温度(例えば2〜8℃の温度)まで冷却し、場合により沈殿した塩をろ過しついで得られた溶液を蒸発乾固させる工程。
3-(6’’’-trans-p-クマロイル)-グルコラムノシド)、O-ラムノピラノシル-4-O-D-(trans-p-クマロイル-6’’’)グルコピラノシルオキシ-3-トリヒドロキシ-4’,5,7-フラボノール(又は、ケンフェロール3-(6’’’-trans-p-クマロイル)-グルコラムノシド)に相当するピークが、一緒にクロマトグラムのピークの全表面の約39%を占めるようなものである。特に、本発明の主抽出物は、O-ラムノピラノシル-4-O-D-(trans-p-クマロイル-6’’’)グルコピラノシルオキシ-3-テトラヒドロキシ-3’,4’,5,7-フラボノール(又は、ケルセチン3-(6’’’-trans-p-クマロイル)-グルコラムノシド)に相当するピークが、クロマトグラムのピークの全表面の約20%を占めるようなものであることが好ましい。同様に、本発明の主抽出物は、O-ラムノピラノシル-4-O-D-(trans-p-クマロイル-6’’’)グルコピラノシルオキシ-3-トリヒドロキシ-4’,5,7-フラボノール(又は、ケンフェロール3-(6’’’-trans-p-クマロイル)-グルコラムノシド)に相当するピークが、クロマトグラムのピークの全表面の約19%を占めるようなものであることが好ましい。
(好ましくは0.40%以下、通常、0.15〜0.40%のプロデルフィニジン)を含有しているであろう。
実施例1
凍結乾燥し、粉砕したイチョウの葉(粒度4mm以下)100gを2回抽出した;1回目は88重量%のエタノールを含有するエタノール−水混合物を800ml、2回目は600mlを使用し、各回、60℃で1時間行った。2回の抽出工程からの抽出物をろ過し、葉の残渣を回収し、上記と同様の溶剤混合物200mlで洗浄した。一緒にした抽出物を蒸発により100mlの容量に減少させ、固体生成物含量を約35gとした。10重量%の塩化ナトリウム水溶液350mlをエタノール濃縮液に添加し、減圧下、50℃で蒸発を継続して残留エタノールを除去した。明るい橙赤色の透明な塩溶液を、ろ斗中の脱脂綿ボールを経てデカントしついで吸引しながらセライトを経てろ過することにより暗色油状物から分離した。塩水溶液中の抽出物を各回、150mlのn-ヘプタンを使用して2回洗浄しついで、各回、150mlの酢酸エチルを使用して2回抽出した。一緒にした酢酸エチル相を50mlの塩化ナトリウム飽和溶液で洗浄しついで減圧下で蒸発乾固させた。乾燥抽出物を60mlの無水エタノールに再溶解させ、冷蔵庫中に5℃で一夜放置し、ろ過して、場合により沈殿した塩を除去しついでろ液を蒸発乾固させて、51.7%のフラボン-グリコシドと13%のテルペン-ラクトン(6.55%のビロバライド)を含有する抽出物1.42gを製造した。
工業用回転炉中で乾燥し、粉砕して得られたイチョウの葉(粒度4mm以下、1.8重量%のフラボン-グリコシドと0.12重量%のギンゴライド含有)100gを2回抽出した;1回目は80重量%のエタノールを含有するエタノール−水混合物を800ml、2回目は600mlを使用し、各々、60℃で1時間行った。2回の抽出工程からの抽出物をろ過し、葉の残渣を回収し、上記と同様の溶剤混合物200mlで洗浄した。一緒にした抽出物を蒸発により800mlの容量に減少させ、固体生成物含量を約33gとした。60gの塩化ナトリウム、100mlの水及び22gのセライトをエタノール濃縮液に添加し、減圧下、50℃で蒸発を継続して残留エタノールを除去した。水性濃縮液を1時間で10℃に冷却し、明るい橙赤色の透明な塩溶液を、ろ斗中の脱脂綿ボールを経てデカントしついでセライトの床で覆われたフリット上で吸引しながらろ過することのより暗色油状物から分離した。塩水溶液(〜300ml)中の抽出物を各回125mlのn-ヘプタンを使用して2回洗浄しついで各回125mlの酢酸エチルを使用して2回抽出した。一緒にした酢酸エチル相を50mlの塩化ナトリウム飽和水溶液で洗浄しついで減圧下で蒸発乾固させた。乾燥抽出物を23mlの無水エタノールに再溶解させ、冷蔵庫中に4℃で一夜放置し、ろ過して、場合により沈殿した塩を除去しついでろ液を蒸発乾固させて、23.6%のフラボン-グリコシド、39.2%のテルペン-ラクトン(24.6%のギンゴライドA、B及びC及び14.5%のビロバライドを含有)及び約0.14%のプロデルフィニジンを含有する抽出物1.06gを生成させた。
実施例2の抽出物の製造方法におけるn-ヘプタンによる洗浄と酢酸エチルによる抽出からなる連続工程を行って回収された塩の水性相について、酢酸エチル-エタノール1:1混合物125mlの2部分を使用して液−液抽出を行った。回収された橙赤色の相を蒸発、乾固させた。乾燥抽出物を無水エタノールに溶解して、無水抽出物の濃度を全溶液の重量に対して5重量%とした。混合物を冷蔵庫中に4℃で一夜放置し、ついでろ紙上でろ過した(固体を4℃で無水エタノールで洗浄した)。蒸発乾固させて、31.88%のフラボン-グリコシド及び0.67%のテルペン類(0.50%のギンゴライドA、B及びC及び0.17%のビロバライドを含有)及び約0.21%のプロデルフィニジンを含有する抽出物を生成させた。
A)HPLC:
本発明の抽出物の特性決定は後記する溶離勾配(eluent gradient)を用いる高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)を使用して行い得る。
−後記で規定する条件に適合する液相クロマトグラフ及び装置
−実験室用ガラス器具
薬剤
−純水(HPLC品質)
−アセトニトリル(HPLC品質)
−イソプロパノール(HPLC品質)
−クエン酸(HPLC品質)
−メタノールR
−参照標準イチョウ抽出物
手順
分析すべき抽出物200mgを10mlのメタノールに溶解することにより、試験すべき抽出物の溶液を調製する。これと並行して、参照標準イチョウ抽出物(EGb 761)200mgを10mlのメタノールに溶解して参照溶液を調製する。
−勾配の形式: 0〜100%の二次移動相の線状、15分間、ついで二次
移動相を用いて5分間。以後の注入を行う前に一次移
動相を用いて10分間カラムを再平衡化
−一次移動相 精製水 1000ml
アセトニトリル 200ml
イソプロパノール 30ml
クエン酸 4.92g
−二次移動相 精製水 1000ml
アセトニトリル 470ml
イソプロパノール 50ml
クエン酸 6.08g
−流率 1.5ml/分
−検出 UV 360nm
−カラム ステンレススチール、15cm、直径4.6mm;クロマトグ
ラフィー マチェリー-ナゲル Rヌクレオシル5C18
(Macherey-Nagel R Nucleosil 5C18)又は均等物
(5μm)
−注入された容量 5μl
実施例2で得られた抽出物について得られたクロマトグラムは図1に示されており、実施例3で得られた抽出物について得られたクロマトグラムは図2に示されている。
本発明の抽出物のプロデルフィニジン含量を下記のごとくして測定した。
プロデルフィニジンの%=Ax86.206897/B
A:556nmでの吸光度
B:サンプルの重量
本発明の抽出物の薬理学的特性を測定するために下記の試験を行った。
細胞系
MDA-231乳癌細胞系をロンバルディ キャンサー センター(Lombardi Cancer Center)(ジョージタウン大学メヂカルセンター)から入手した。この細胞系をポリスチレン培養皿
(Corning)中で培養し、10%のウシ胎児血清(FBS)を補充したダルベッコ変性イーグル培地(DMEM)中で増殖させた。
MDA-231細胞を磨砕(trituration)により5mlのリン酸塩緩衝塩溶液(PBSS)中に分散させついで500gで15分間遠心分離した。遠心分離された細胞をPBSS中に再懸濁させ、そのタンパク質含量を測定するために試験した。[3H]PK11195試験はPapadopoulos et al,J.Biol.Chem.(1990),265,3772-3779及びHardwick et al,Cancer Res.(1999),59,831-842に記載されるごとくして行い得る。[N-メチル-3H]PK 11195又は(1-(2-クロロフェニル)-N-メチル-N-(1-メチル-プロピル)-3-イソキノリンカルボキシアミドはDu Pont-New England Nuclear社(米国、DE、ウイルミングトン)から、PK 11195はResearch Biochemicals社(米国、MA、ナチック)から入手される。得られた結果をプログラムLIGAND(Manson and Robard,Anal.Biochem.(1976),72,248-254)を使用して分析した。
実施例1又は実施例2の抽出物又はEGb 761(登録商標)(参照)で処理したMAD-231細胞中の周辺型(peripheral type)ベンゾジアゼピンレセプター(PBR)のmRNAの発現は、Hardwick et al,Cancer Res.(1999),59,831-842に記載されるごときノーザン分析法を使用して評価し得る。全細胞RNAは試薬RNAzolB(米国、TX、フレンドウッド、TEL-TEST社製)とクロロホルムを使用して単離した。20μgの全RNAを1%アガロースゲル上に通送しついで一夜でナイロン膜(S&S Nytran、米国、NH、キイーネ、Schleicher & Schuell社製)中に移行させた。長さ0.2kbのPBRのヒトcDNAフラグメント(ヒトPBRの完全配列を含有するpCMV5-PBRプラスミドベクターから誘導)を、DNAプライマーのランダム同定システム(Life Technologies、米国、MD、ゲイセルスバーグ)を使用する[α-32P]dCTPを使用して標識した。使用したハイブリダイズ条件は前記した参照文献に記載されている。オートラジオグラフィーはブロットを、-70℃で4〜48時間、X-OMAT ARフィルム(米国、NY、ロチェスター、Kodak社製)に暴露することにより行った。PBR mRNAの定量はシグマゲルソフトウエア(SigmaGel software)(米国、CA、サンレーフェル、Jandel scientific社製)を使用して行った。
MDA-231細胞を、0.1%のFBSを補充したDMEM中の細胞数が、ウエル1個当り、約10,000個(インキュベーション24時間)又はウエル1個当り、5,000個(インキュベーション48時間)の濃度で、96-ウェルプレート(米国、NZ、Corning社製)上に載せた。ついで、細胞を、種々の濃度の実施例の化合物及び参照化合物(EGb 761)と共に、上記した時間、10%FBS中でインキュベートした。細胞増殖の差異は、結合した(incorporated) 5-ブロモ-2’-デオキシウリジン(BrdU)の量を測定することにより分析した;この量の測定はELISA BrdU装置(米国、IN、インディアナポリス、Boehringer Mannheim社製)を使用して行った。BrdUの結合は450nm(参照:690nm)で測定した。
本発明の抽出物は下記のごとく試験し得る:ラットの脳ノイロンを、濃度を次第に増大させた実施例1又は実施例2の抽出物で処理した(又は処理しなかった);30分後、脳ノイロンを250μMの濃度のグルタメートに暴露した。グルタメートの毒性の50%を抑制する投与量(IC50と称する)を測定し、これをフラボン-グリコシド及びテルペン-ラクトンのより少ない、EGb 761のごとき抽出物について得られた値(即ち、1ml当り、EGb 761 100μg)と比較した。
本発明の抽出物の細胞の生存能力に対する影響を、HT 22細胞系(マウス海馬細胞)について検討した。細胞の生存能力は、実施例1又は実施例2の抽出物の投与量を増大させて処理した細胞によって放出されたLDHの量を測定することにより及びトリパンブルー排除試験により評価した。
HT 22細胞系はSalk Institute for Biological Research(米国、CA、ラジョラ)から得られる。この細胞株を10%のウシ胎児血清(FBS)を補填したダブレッコ変性イーグル培地
(以下においては、完全培地と称する)中に37℃で保持した。
HT 22細胞株を、完全培地中の細胞数が、ウエル1個当り、5.103個となる濃度で96-ウエルプレート上に載せた。24時間後、前記実施例の抽出物をDMEMに溶解し、10、25、50、100、250、500及び1000μg/mlの濃度で添加した;ついで、抽出物を24時間又は48時間接触させた。LDHの測定は製造業者の取扱説明書に従ってプロメガ(Promega)試験キットを使用して行った。吸光度は470nmで読んだ。最大LDH放出はトリトン(Triton) X-100を使用する細胞の完全な溶解の後に得られた。
生存細胞(染色されなかった細胞)の数/細胞の全数(染色された細胞及び染色されなかった細胞)x100。
Claims (6)
- 下記の連続工程、即ち、
i.イチョウの葉の乾燥断片を、最大で20重量%の水を含有するエタノール中で抽出する工程;
ii.抽出物を塩化ナトリウム水溶液の存在下、減圧下で濃縮しついで残留物の透明溶液から暗色油状物を除去する工程;
iii.残留水溶液をn-ヘキサン、n-ヘプタン叉はシクロヘキサンを使用して液-液抽出により洗浄する工程;
iv.洗浄した水性相を酢酸エチルを使用して液-液抽出する工程;
v.工程ivで得られた酢酸エチル相を塩化ナトリウム水溶液で洗浄しついで洗浄した酢酸エチル相を蒸発乾固させる工程;
からなり、クロマトグラフィー工程を含まないことを特徴とする、イチョウの葉の抽出物の製造方法。 - 工程iのイチョウの葉の乾燥断片をイチョウの葉の乾燥粉末で置換する、請求項1に記載の方法。
- 工程iの抽出を10〜20重量%の水を含有するエタノールを使用して行う、請求項2に記載の方法。
- 工程iiiの洗浄をn-ヘプタンを使用して行う、請求項1〜3の一つに記載の方法。
- 工程ii及びvで使用される塩化ナトリウム水溶液は少なくとも10重量%の塩化ナトリウム濃度を有する、請求項1〜4の一つに記載の方法。
- 工程i〜vの後に、下記の工程vi、即ち、
vi乾燥抽出物をエタノールに溶解させ、溶液を冷却し、場合により沈殿した塩をろ過しついで得られた溶液を蒸発乾固させる工程;
を更に行う、請求項1〜5の一つに記載の方法。
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