PL204867B1

PL204867B1 - Ekstrakt z liści Ginkgo biloba, sposób jego wytwarzania, kompozycja farmaceutyczna zawierająca go i zastosowanie

Info

Publication number: PL204867B1
Application number: PL366938A
Authority: PL
Inventors: Beng-Poon Teng
Original assignee: Sod Conseils Rech Applic
Priority date: 2001-04-10
Filing date: 2002-04-09
Publication date: 2010-02-26
Also published as: AU2002307981B2; HUP0303797A3; DE60201525T8; FR2823116A1; KR100876233B1; ATE278411T1; ES2230512T3; JP4416404B2; HK1066164A1; FR2823116B1; CA2443302C; RU2003132470A; CA2443302A1; DE60201525T2; KR20030087068A; PT1379262E; EP1379262B1; PL366938A1; US7048954B2; CZ299652B6

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest ekstrakt z liści Ginkgo biloba o wysokiej zawartości składników aktywnych, sposób jego wytwarzania, kompozycja farmaceutyczna zawierająca ten ekstrakt i jego zastosowanie.

Pewne standaryzowane preparaty fitofarmaceutyczne oparte na ekstraktach z liści Ginkgo biloba stosuje się obecnie do leczenia chorób naczyń obwodowych i mózgowych, w szczególności w Europie, Stanach Zjednoczonych i na Dalekim Wschodzie.

Najpowszechniej stosowany obecnie ekstrakt z Ginkgo biloba (EGb 761^®) zawiera 24% flawonoglikozydów, w sumie 3% ginkgolidów A, B, C i J oraz 3% bilobalidu (por. K. Drieu, La Presse Medicale (1986), 15.1455-1457). Zalecana dla pacjenta dzienna dawka wynosi 120 miligramów.

W patencie USA nr 5,399,348 opisano na przykład sposób wytwarzania ekstraktu z Ginkgo biloba zawierającego przeciętnie 24% flawonoglikozydów, 3% ginkgolidów A, B, C i J oraz 3% bilobalidu. Sposób ten obejmuje następujące etapy:

i. ekstrakcja suchego proszku z liści w acetonie zawierającym 40% wagowych wody;

ii. eliminacja lipidów przez zatężanie ekstraktu pod zmniejszonym ciśnieniem, aż do uzyskania koncentratu zawierającego około 30% substancji stałej, w celu wyeliminowania w ten sposób acetonu, następnie rozcieńczenie wodą w celu uzyskania stężenia substancji stałej 15%, schłodzenie otrzymanej zawiesiny do temperatury około 10°C na 1 godzinę przed wyeliminowaniem osadu z lipidów przez przesączenie;

iii. wzbogacenie fazy organicznej przez dodanie do wodnego przesączu 30% roztworu siarczanu amonu, a następnie przeprowadzenie ekstrakcji ciecz-ciecz mieszaniną ketonu metylowo-etylowego i acetonu (w stosunku od 9:1 do 4:6) i zatężenie fazy organicznej w celu uzyskania stężenia substancji stałej w zakresie 50-70%;

iv. eliminacja garbników przez rozcieńczenie koncentratu mieszaniną wody i etanolu w stosunku wagowym 50/50 w celu uzyskania stężenia substancji stałej 10%, dodawanie wodnego roztworu soli ołowiu, aż do zmiany koloru z brązowego na bursztynowy i przesączenie osadu ołów-garbnik w celu wytworzenia czystego przesączu;

v. eliminacja ołowiu w postaci jego nierozpuszczalnego siarczanu przez zatężenie przesączu w celu uzyskania maksymalnie 5% stężenia etanolu, dodanie siarczanu amonu do stężenia około 20%, a następnie ekstrakcja ciecz-ciecz mieszaniną ketonu metylowo-etylowego i etanolu (w stosunku od 8:2 do 1:1); oraz vi. suszenie produktu końcowego przez zatężenie fazy organicznej w celu uzyskania stężenia substancji stałej w zakresie 50-70% i suszenie pod zmniejszonym ciśnieniem w piecu w temperaturze 60-80°C w celu wyizolowania produktu końcowego zawierającego mniej niż 5% wody.

W ciągu ostatnich 10 lat podjęto znaczne wysiłki w celu zwię kszenia części składników aktywnych ekstraktów z Ginkgo biloba, jednocześnie redukując tę część, którą stanowią alergogenne związki alkilofenolowe o długich łańcuchach alkilowych, takie jak kwasy ginkgolowe.

Istnieje pewna ilość zgłoszeń patentowych i patentów przedstawiających sposób umożliwiający otrzymywanie ekstraktów z liści Ginkgo biloba wzbogaconych we flawonoglikozydy i laktony terpenowe.

Na przykład patent USA nr 5,389,370 dotyczy sposobów wytwarzania ekstraktów o zwiększonej ilości składników aktywnych. Rozwiązanie zastosowane w tym przypadku polega na zmieszaniu frakcji bogatej we flawonoglikozydy, otrzymane w wyniku ekstrakcji ciecz-ciecz, z bilobalidem i ginkgolidami wyizolowanymi przy zastosowaniu rozdzielenia metodą chromatografii kolumnowej w celu uzyskania pożądanych kompozycji, które zwykle zawierają 50% flawonoglikozydów i 6% bilobalidu, 50% flawonoglikozydów i 7% ginkgolidów lub 50% flawonoglikozydów, 6% bilobalidu i 7% ginkgolidów. Przedstawiony proces obejmuje pierwsze dwa etapy ze wspomnianego patentu USA nr 5,399,348 (które są tutaj oznaczone jako etapy 1 i 2), do których dodano następujące kolejne etapy:

3. wzbogacenie faz organicznych: ekstrakcja ciecz-ciecz mieszaniną octan etylu-heksan (9:1), następnie reekstrakcja fazy wodnej n-butanolem i zatężenie do suchości otrzymanej fazy n-butanolu w celu uzyskania frakcji bogatej we flawonoglikozydy;

4. traktowanie węglem aktywnym: przemywanie wodą fazy octan etylu-heksan, następnie traktowanie węglem aktywnym przemytej fazy octan etylu-heksan, przesączenie i zatężenie do suchości;

5. rekrystalizacja: rozpuszczenie stałej pozostałości w mieszaninie etanolu i wody w stosunku wagowym 50/50, schłodzenie w celu krystalizacji i przesączenie w celu uzyskania ginkgolidów;

PL 204 867 B1

6. chromatografia kolumnowa: zatężenie do suchości supernatantu z etapu 5 i rozdzielenie chromatograficzne na kolumnie z żelem krzemionkowym w celu uzyskania frakcji bogatych w bilobalid i ginkgolidy; oraz

7. mieszanie frakcji: mieszanie frakcji bogatych we flawonoglikozydy z etapu 3 z ginkgolidami uzyskanymi w etapie 5 lub 6 i/lub z bilobalidem uzyskanym w etapie 6.

W pewnym wariancie powyż szego procesu, etapy 4 i 5 moż na zastą pić chromatografią kolumnową.

Ponadto, w patencie USA nr 6,030,621 przedstawiono sposób uzyskiwania ekstraktów Ginkgo biloba wzbogaconych we flawonoglikozydy i laktony terpenowe. Sposób postępowania jest analogiczny do ujawnionego w patencie USA nr 5,389,370: frakcję bogatą we flawonoglikozydy miesza się z frakcjami bogatymi w laktony terpenowe, otrzymanymi metodą chromatografii kolumnowej. Zwykle, wytworzone ekstrakty zawierają 42,7% flawonoglikozydów i 6,3% laktonów terpenowych lub 70% flawonoglikozydów i 10% laktonów terpenowych. Sposób ten obejmuje następujące etapy:

a) ekstrakcja suchego proszku z liści etanolem zawierającym 50% wagowych wody;

b) eliminacja lipidów przez zatężanie ekstraktu pod zmniejszonym ciśnieniem, aż do wyeliminowania etanolu, rozcieńczenie koncentratu wodą, pozostawienie mieszaniny na 48 godzin i przesączenie osadu z lipidów;

c) stabilizacja aktywnych związków przez przepuszczenie wodnego przesączu przez żywicę składającą się z mieszaniny żywicy XAD-4 (mieszanina porowatych polimerów) i poliamidu;

d) elucja aktywnych związków przy kolejnym użyciu mieszanin etanol-woda zawierających kolejno 30, 60 i 90% wagowych etanolu; oraz

e) połączenie wszystkich frakcji uzyskanych w etapie d), odparowanie etanolu, przemycie wodnego koncentratu heksanem i odparowanie do suchości przemytej fazy wodnej w celu otrzymania ekstraktu zawierającego 47,2% flawonoglikozydów i 6,3% laktonów terpenowych.

W pewnym wariancie powyższego procesu frakcję uzyskaną przy użyciu mieszaniny etanolwoda zawierającej 30% etanolu poddaje się szybkiej chromatografii w celu otrzymania frakcji zawierającej co najmniej 80% laktonów terpenowych. W ten sam sposób, frakcje otrzymane przy użyciu mieszanin etanol-woda zawierających 60 i 90% etanolu łączy się i poddaje szybkiej chromatografii w celu otrzymania frakcji zawierającej co najmniej 80% flawonoglikozydów. Frakcję zawierającą co najmniej 80% flawonoglikozydów i frakcję zawierającą co najmniej 80% laktonów terpenowych miesza się w róż nych proporcjach, co umożliwia otrzymanie ekstraktów zawierających do 70% flawonoglikozydów i 10% laktonów terpenowych.

Z powodu coraz ostrzejszych wymagań dotyczących bezpieczeństwa dla zdrowia korzystne staje się stosowanie coraz to bardziej czystych składników aktywnych. Zatem, w przypadku ekstraktów z Ginkgo biloba tendencja ta spowoduje pewnego dnia zrezygnowanie z ekstraktów takich jak EGb 761^® na rzecz ekstraktów bogatszych w składniki aktywne. Zwykle możliwe byłoby dążyć do tego, aby ekstrakty zawierały co najmniej 50% wagowych flawonoglikozydów i 12% wagowych laktonów terpenowych lub co najmniej 30% wagowych laktonów terpenowych i co najmniej 15% flawonoglikozydów. Sposoby przedstawione w patentach USA nr 5,389,370 lub 6,030,621 umożliwiają otrzymanie takich ekstraktów, jednakże byłyby one trudne do zastosowania na skalę przemysłową, głównie z powodu obecności etapów rozdzielania metodą chromatografii.

Zgłaszający opracował sposób umożliwiający otrzymanie ekstraktów z liści Ginkgo biloba, który odpowiada wskazanym opisom patentowym, ale nie obejmuje żadnego etapu rozdzielenia metodą chromatografii.

Przedmiotem wynalazku jest zatem sposób wytwarzania ekstraktu z liści Ginkgo biloba, który obejmuje poniższe, kolejne etapy:

(i) ekstrakcja suchych fragmentów liści Ginkgo biloba etanolem zawierającym maksymalnie 20% wagowych wody;

(ii) zatężenie ekstraktu pod zmniejszonym ciśnieniem w obecności wodnego roztworu chlorku sodu i eliminacja ciemnego oleju z pozostałości przezroczystego roztworu;

(iii) przemycie pozostałego wodnego roztworu przez ekstrakcję ciecz-ciecz n-heksanem, n-heptanem lub cykloheksanem;

(iv) ekstrakcja ciecz-ciecz fazy wodnej przemytej octanem etylu;

(v) przemycie fazy octanu etylu otrzymanej w etapie iv chlorkiem sodu, następnie odparowanie do suchości przemytej fazy octanu etylu.

PL 204 867 B1

Suche fragmenty liści Ginkgo biloba oznaczają w niniejszym zgłoszeniu suche fragmenty, których rozmiar ziaren nie przekracza 5 mm.

Według wynalazku, suche fragmenty liści Ginkgo biloba korzystnie mają postać suchego proszku. Przez proszek, w niniejszym zgłoszeniu, rozumie się proszek, którego rozmiar ziaren nie przekracza 1 mm (a korzystnie nie przekracza 5 mm).

Sposób według niniejszego wynalazku można stosować:

- do liofilizowanych fragmentów (korzystnie proszku) liści Gingko biloba, w którym to przypadku otrzymuje się ekstrakty zawierające co najmniej 50% wagowych flawonoglikozydów i 12% wagowych laktonów terpenowych;

- lub do suchych fragmentów (korzystnie proszku) liś ci Gingko biloba, w którym to przypadku otrzymuje się ekstrakty - nazywane dalej „ekstraktami głównymi zawierające co najmniej 30% wagowych laktonów terpenowych i 15% wagowych flawonoglikozydów (w tym przypadku sposób według wynalazku umożliwia otrzymanie ponadto, jako produktu pokrewnego ekstraktom - nazywanego dalej „ekstraktami pokrewnymi - produktów analogicznych do przedstawionych w zgłoszeniu patentowym PCT WO 96/33728, mianowicie ekstraktów zawierających około 30 do 35% wagowych flawonoglikozydów i około 1% wagowych laktonów terpenowych).

Według jednego z wariantów niniejszego wynalazku, sposób przedstawiony powyżej stosuje się do liofilizowanych fragmentów (lub proszku) liści Gingko biloba, a otrzymany ekstrakt korzystnie zawiera około 52% wagowych flawonoglikozydów i około 13% wagowych laktonów terpenowych.

Według korzystnego wariantu niniejszego wynalazku, sposób przedstawiony powyżej stosuje się do suchych fragmentów (lub proszku) liści Ginkgo biloba, a otrzymany ekstrakt główny korzystnie zawiera 34 do 46% wagowych laktonów terpenowych i od 18 do 30% wagowych flawonoglikozydów. Bardziej korzystnie, sposób przedstawiony powyżej stosuje się do suchych fragmentów (lub proszku) liści Ginkgo biloba, otrzymany ekstrakt główny zawiera 36 do 44% wagowych laktonów terpenowych i od 18 do 3 0% wagowych flawonoglikozydów. W szczególności, sposób przedstawiony powyż ej stosuje się do suchych fragmentów (lub proszku) liści Ginkgo biloba, a otrzymany ekstrakt główny zawiera około 40% wagowych laktonów terpenowych (z czego około 24,5% wagowych ginkgolidów A, B i C oraz około 15,5% wagowych bilobalidu) i około 24% wagowych flawonoglikozydów.

Korzystnie, ekstrakcję w etapie (i) prowadzi się stosując etanol zawierający od 10 do 20% wagowych wody, bardziej korzystnie od 15% do 20% wagowych wody.

Również korzystnie, mieszaninę otrzymaną po zatężeniu ekstraktu pod zmniejszonym ciśnieniem w obecności wodnego roztworu chlorku sodu, w etapie (ii), schładza się, na przykład do temperatury około 10°C, korzystnie na 10 lub 15 minut do 1 lub 2 godzin przed przeprowadzeniem eliminacji ciemnego oleju z pozostałości przezroczystego roztworu. Jeszcze bardziej korzystnie, do mieszaniny otrzymanej po zatężeniu ekstraktu pod zmniejszonym ciśnieniem w obecności wodnego roztworu chlorku sodu podczas etapu (ii) dodaje się celit i cały etanol obecny w tej mieszaninie odparowuje się przed jej schłodzeniem.

Również korzystnie, przemycie w etapie (iii) prowadzi się n-heptanem.

Według szczególnie korzystnego wariantu sposobu według wynalazku, gdy sposób ten stosuje się do suchych fragmentów (lub proszku) liści Ginkgo biloba, objętość pozostałego wodnego roztworu przemytego w etapie (iii) oraz ilość chlorku sodu w roztworze dostosowuje się z góry, tak by z jednej strony zawartość wagowa rozpuszczalnych w wodzie substancji stałych wynosiła około 8% wagowych w stosunku do cał kowitego ciężaru roztworu, z drugiej strony zawartość wagowa chlorku sodu wynosiła około 16% w stosunku do całkowitego ciężaru roztworu. Zawartość rozpuszczalnych w wodzie substancji stałych wyznacza się pobierając próbkę roztworu etanolowego, który odparowuje się, w celu wyeliminowania etanolu, a następnie ekstrahuje się dichlorometanem, po czym pozostałą fazę wodną odparowuje się do suchości i waży; zawartość rozpuszczalnych w wodzie substancji stałych można wywnioskować na podstawie masy otrzymanej stałej pozostałości.

Odnośnie etapu (iv), octan etylu można ewentualnie zastąpić ketonem metylowo-etylowym zawierającym 2 do 10% objętościowych acetonu lub etanolu.

Odnośnie do wodnych roztworów chlorku sodu zastosowanych w etapach (ii) oraz (v), korzystnie zawierają one 10% wagowych chlorku sodu, jednocześnie, w etapie (v), korzystnie jest to nasycony roztwór chlorku sodu.

Według korzystnego wariantu powyższego sposobu stosowanego do suchych fragmentów (lub proszku) z liści Ginkgo biloba, solankową fazę wodną uzyskaną na końcu ekstrakcji ciecz-ciecz w etapie (iv) można ponownie poddać procesowi, składającemu się z następujących etapów:

PL 204 867 B1

a) ekstrakcja ciecz-ciecz przy zastosowaniu mieszaniny octan etylu-etanol (w stosunku około 1:1); i

b) odparowanie do suchości fazy organicznej uzyskanej na końcu etapu a);

c) rozpuszczenie pozostałości otrzymanej w etapie b) w absolutnym etanolu w celu uzyskania stężenia substancji stałych w zakresie około 5-10% wagowych w stosunku do ciężaru roztworu etanolowego;

d) schłodzenie mieszaniny do temperatury korzystnie niższej lub równej 10°C (na przykład do temperatury 2 do 8°C), korzystnie na 30 minut do 12 godzin;

e) przesączenie i odparowanie etanolu z otrzymanego przesączu w celu wytworzenia suchego ekstraktu.

Ten dodatkowy proces umożliwia uzyskanie dodatkowego ekstraktu, który na ogół zawiera około 30 do 35% wagowych flawonoglikozydów i około 1% wagowych laktonów terpenowych.

Ewentualnie, proces przedstawiony powyżej może zawierać, po etapach (i) do (v), poniższy etap (vi):

(vi) rozpuszczenie suchego ekstraktu w etanolu i schłodzenie roztworu do temperatury korzystnie niższej lub równej 10°C (na przykład do temperatury 2 do 8°C), przesączenie ewentualnie wytrąconej soli i odparowanie do suchości powstałego roztworu.

W tym przypadku, gdy sposób według wynalazku stosuje się na skalę przemysłową , korzystnie w etapie (v) tylko zatęża się fazę organiczną, aż do uzyskania stężenia substancji stałych w zakresie okoł o 50-70% wagowych (a nie odparowuje ją do suchoś ci) i dodaje etanol w celu otrzymania kompozycji zawierającej 5 do 20% wagowych wody, 5 do 20% wagowych substancji stałych i resztę etanolu, przed przeprowadzeniem etapu (vi). Postępując w ten sposób eliminuje się etap suszenia.

Ekstrakty główne otrzymane według wynalazku można stosować w farmacji lub w sektorze żywnościowym (na przykład jako składniki dodatków odżywczych), jako że, z jednej strony, zawierają mniej niż 5 ppm alkilofenoli (pomiary przeprowadzone metodą HPLC), a z drugiej strony zawierają mniej niż 0,3% prodelfinidyn (korzystnie mniej niż 0,25%, a na ogół od 0,05 do 0,25% prodelfinidyn). Ponadto, zawierają one również niewiele zanieczyszczeń lipofilowych oraz niewiele polisacharydów, proantocyjanidyn innych niż prodelfinidyny i białka o dużym ciężarze cząsteczkowym.

W szczególnoś ci, z powodu niskiej zawartoś ci prodelfinidyny, ekstrakty główne wedł ug wynalazku lepiej nadają się do podawania pacjentom dożylnie. Dla porównania, dostępne na rynku ekstrakty, takie jak EGb 761®, mogą zawierać do 1,5% prodelfinidyn.

Oprócz tego, ekstrakty główne według wynalazku korzystnie są takie, że piki odpowiadające O-ramnopiranozylo-4-O-D-(trans-p-kumaroilo-6')glukopiranozyloksy-3-tetrahydroksy-3',4',5,7-flawonolowi (lub 3-(6'-trans-p-kumaroilo)-glukoramnozydowi kwercetyny), O-ramnopiranozylo-4-O-D-(trans-p-kumaroilo-6')glukopiranozyloksy-3-trihydroksy-4',5,7-flawonolowi (lub 3-(6'-trans-p-kumaroilo)-glukoramnozydowi kemferolu) razem stanowią około 39% całkowitej powierzchni pików chromatogramu. W szczególnoś ci, ekstrakty gł ówne wedł ug wynalazku korzystnie są takie, ż e pik odpowiadający O-ramnopiranozylo-4-O-D-(trans-p-kumaroilo-6')glukopiranozyloksy-3-tetrahydroksy-3',4',5,7-flawonolowi (lub 3-(6'-trans-p-kumaroilo)-glukoramnozydowi kwercetyny) stanowi około 20% całkowitej powierzchni pików chromatogramu. Podobnie, ekstrakty główne według wynalazku korzystnie są takie, że pik odpowiadający O-ramnopiranozylo-4-O-D-(trans-p-kumaroilo-6')glukopiranozyloksy-3-trihydroksy-4',5,7-flawonolowi (lub 3-(6'-trans-p-kumaroilo)-glukoramnozydowi kemferolu) stanowi około 19% całkowitej powierzchni pików chromatogramu.

Ponadto, ekstrakty pokrewne uzyskane sposobem według wynalazku zawierają mniej niż 0,5% prodelfinidyn (korzystnie mniej niż 0,40%, a na ogół w zakresie od 0,15 do 0,40% prodelfinidyn).

Kolejnym przedmiotem wynalazku są ekstrakty główne, które można otrzymać sposobem według wynalazku. Przedmiotem wynalazku są również wspomniane ekstrakty główne jako leki, kompozycje farmaceutyczne zawierające te ekstrakty jako składniki aktywne i zastosowanie ekstraktów głównych do wytwarzania leków przeznaczonych do leczenia chorób/zaburzeń wybranych spośród następujących: choroby naczyń mózgowych i obwodowych (takie jak szum w uszach pochodzenia naczyniowego, miażdżyca tętnic, niedokrwienie, zakrzepica, symptomy związane z niewydolnością żył, ostre objawy zapalenia żył i symptomy związane z zespołem hemoroidalnym), choroby neurodegeneracyjne (takie jak, na przykład, choroba Alzheimera, choroba Parkinsona, pląsawica Huntingtona lub stwardnienie zanikowe boczne) oraz przewlekłe patologiczne zaburzenie funkcji neurosensorycznych i poznawczych związane z podeszłym wiekiem (w szczególności utrata pamięci obserwowana

PL 204 867 B1 u starszych pacjentów, którzy nie cierpią na chorobę Alzheimera lub na inną demencję ). Wreszcie przedmiotem wynalazku jest zastosowanie opisanych ekstraktów głównych do wytwarzania leków przeznaczonych do stosowania w terapii wspomagającej przy leczeniu chorób proliferacyjnych (w szczególności raka).

Kompozycje farmaceutyczne zawierające ekstrakt według wynalazku mogą mieć postać stałą, taką jak, na przykład, proszki, pigułki, granulki, tabletki, liposomy, kapsułki żelatynowe lub czopki. Pigułki, tabletki lub kapsułki żelatynowe mogą być powleczone substancją nadającą się do zabezpieczenia kompozycji przed działaniem kwasów żołądkowych lub enzymów w żołądku pacjenta wystarczająco długo, by kompozycja ta mogła przedostać się niestrawiona do jelita cienkiego. Ekstrakt można także podawać miejscowo, na przykład, w miejsce gdzie znajduje się nowotwór. Ekstrakt można również podawać metodą przedłużonego uwalniania (na przykład stosując kompozycję o przedłużonym uwalnianiu lub pompę perfuzyjną). Odpowiednimi nośnikami mogą być, na przykład, fosforan wapnia, stearynian magnezu, węglan magnezu, talk, cukry, laktoza, dekstryna, skrobia, żelatyna, celuloza, metyloceluloza, sól sodowa karboksymetylocelulozy, poliwinylopirolidyn i wosk.

Kompozycje farmaceutyczne zawierające ekstrakt według wynalazku mogą również mieć postać ciekłą, taką jak, na przykład, roztwory, emulsje, zawiesiny lub preparaty o przedłużonym uwalnianiu. Odpowiednimi ciekłymi nośnikami mogą być, na przykład, woda, rozpuszczalniki organiczne, takie jak glicerol lub glikole, takie jak glikol polietylenowy, podobnie ich mieszaniny, w różnych proporcjach, w wodzie.

Lek według wynalazku można podawać miejscowo, doustnie, pozajelitowo, przez wstrzyknięcie domięśniowe, itp.

Dawka ekstraktu według niniejszego wynalazku, ustalona do leczenia chorób lub zaburzeń wspomnianych powyżej, różni się zależnie od sposobu podawania, wieku i wagi ciała pacjenta oraz jego stanu i ostatecznie określa ją prowadzący lekarz lub weterynarz. Ta dawka określona przez prowadzącego lekarza lub weterynarza jest tutaj nazwana „terapeutycznie skuteczną ilością.

Nie podważając opinii lekarza prowadzącego, znając zawartość składników aktywnych w głównych ekstraktach według wynalazku, można przewidzieć, że dzienna dawka wspomnianych ekstraktów głównych przy podawaniu człowiekowi będzie wynosić, na przykład 5 do 150 mg, korzystnie 10 do 100 mg (szczególnie 40 do 80 mg, na przykład 50 do 70 mg).

W niniejszym zgł oszeniu, termin „okoł o oznacza pewien przedział wokół rozważ anej wartoś ci. W niniejszym zgł oszeniu, „okoł o X oznacza przedzia ł od X minus 10% X do X plus 10% X, korzystnie przedział od X minus 5% X do X plus 5% X.

O ile nie zaznaczono inaczej, wszystkie terminy techniczne i naukowe mają takie samo znaczenie jak przyjęte i funkcjonujące w dziedzinie, do której należy wynalazek.

Ilustrację powyższego sposobu stanowią następujące przykłady.

P R Z Y K Ł A D Y

Przykład 1

100 g liofilizowanych zmielonych liści Ginkgo biloba (wielkość ziaren mniejsza niż 4 mm) ekstrahuje się dwukrotnie, raz 800 ml, a za drugim razem 600 ml mieszaniny etanol-woda zawierającej 88% wagowych etanolu, za każdym razem w temperaturze 60°C, przez 1 godzinę. Ekstrakty z dwóch etapów ekstrahowania przesącza się i otrzymane pozostałości liści przemywa się 200 ml tej samej mieszaniny rozpuszczalników. Objętość połączonych ekstraktów zmniejsza się przez odparowanie do 100 ml, przy zawartości stałego produktu około 35 g. Do etanolowego koncentratu dodaje się 350 ml wodnego roztworu chlorku sodu o stężeniu 10% wagowych i kontynuuje się odparowywanie pod zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze 50°C w celu wyeliminowania pozostałego etanolu. Jasno pomarańczowy, klarowny roztwór soli oddziela się od ciemnego oleju metodą dekantacji przez kulkę z waty w lejku do sączenia, a następnie przez przesączenie przez celit z zasysaniem. Ekstrakt w wodnym roztworze solanki przemywa się dwoma porcjami 150 ml n-heptanu przed dwukrotną ekstrakcją każdorazowo 150 ml octanu etylu. Połączone fazy octanu etylu przemywa się 50 ml nasyconego roztworu chlorku sodu, następnie odparowuje do suchości pod zmniejszonym ciśnieniem. Suchy ekstrakt rozpuszcza się ponownie w 60 ml absolutnego etanolu, pozostawia na noc w chłodziarce w temperaturze 5°C, przesącza w celu wyeliminowania ewentualnie wytrąconej soli i przesącz odparowuje się do suchości z wytworzeniem 1,42 g ekstraktu zawierającego 51,7% flawonoglikozydów i 13% laktonów terpenowych (6,55% bilobalidu).

PL 204 867 B1

Przykład 2

100 g liści Ginkgo biloba otrzymanych po suszeniu w przemysłowym piecu obrotowym i zmielonych (wielkość ziaren mniejsza niż 4 mm; zawartość 1,8% wagowych flawonoglikozydów i 0,12% wagowych ginkgolidów) ekstrahuje się dwukrotnie, raz 800 ml, a za drugim razem 600 ml mieszaniny etanol-woda zawierającej 80% wagowych etanolu, za każdym razem w temperaturze 60°C przez 1 godzinę. Ekstrakty z dwóch etapów ekstrahowania przesącza się, a uzyskane pozostałości liści przemywa się 200 ml tej samej mieszaniny rozpuszczalników. Objętości połączonych ekstraktów zmniejsza się przez odparowanie do 800 ml, przy zawartości produktu w stanie stałym około 33 g. Do etanolowego koncentratu dodaje się 60 g chlorku sodu, 100 ml wody i 22 g celitu i kontynuuje się odparowywanie pod zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze 50°C w celu wyeliminowania pozostałego etanolu. Wodny koncentrat schładza się do temperatury 10°C na 1 godzinę i jasno pomarańczowy, klarowny roztwór soli oddziela się od ciemnego oleju metodą dekantacji przez kulkę z waty w lejku do sączenia, a następnie przez przesączenie przez celit z zasysaniem, na frycie wyłożonej warstwą celitu. Ekstrakt w wodnym roztworze solanki (około 300 ml) przemywa się dwoma porcjami 125 ml n-heptanu przed dwukrotnym ekstrahowaniem każdorazowo 125 ml octanu etylu. Połączone fazy octanu etylu przemywa się 50 ml nasyconego roztworu chlorku sodu, następnie odparowuje do suchości pod zmniejszonym ciśnieniem. Suchy ekstrakt rozpuszcza się ponownie w 23 ml absolutnego etanolu, pozostawia na noc w chłodziarce w temperaturze 4°C, przesącza w celu wyeliminowania ewentualnie wytrąconej soli i przesącz odparowuje się do suchości z wytworzeniem 1,06 g ekstraktu zawierającego 23,6% flawonoglikozydów, 32,9% laktonów terpenowych (w tym 24,6% ginkgolidów A, B i C oraz 14,5% bilobalidu) i około 0,14% prodelfinidyn.

Przykład 3

Zawierającą solankę fazę wodną, którą uzyskuje się po przeprowadzeniu kolejnych etapów procesu wytwarzania produktu z przykładu 2, to jest przemycia n-heptanem i ekstrakcji octanem etylu, ekstrahuje się dwoma porcjami po 125 ml mieszaniny octan etylu-etanol w stosunku 1:1. Otrzymaną fazę organiczną odparowuje się do suchości. Suchy ekstrakt umieszcza się w absolutnym etanolu w celu uzyskania stężenia wynoszącego 5% wagowych suchego ekstraktu w stosunku do całkowitego ciężaru roztworu. Mieszaninę pozostawia się na noc w chłodziarce, w temperaturze 4°C przed przesączeniem przez bibułę filtracyjną (substancje stałe przemywa się absolutnym etanolem w temperaturze 4°C). Po odparowaniu do suchości otrzymuje się ekstrakt zawierający 31,88% flawonoglikozydów, 0,67% terpenów (w tym 0,5% ginkgolidów A, B i C oraz 0,17% bilobalidu) i około 0,21% prodelfinidyn.

Charakterystyka ekstraktów według wynalazku

A) HPLC:

Ekstrakty według wynalazku można scharakteryzować stosując metodę HPLC z gradientem elucji określonym dalej.

Sprzęt

- chromatograf cieczowy i sprzęt przystosowany do przedstawionych dalej warunków

- laboratoryjne naczynia szklane

- waga z dokładnością do 0,1 mg.

Odczynniki

- czysta woda (jakość HPLC)

- acetonitryl (jakość HPLC)

- izopropanol (jakość HPLC)

- kwas cytrynowy (jakość HPLC)

- metanol R

- wzorzec porównawczy ekstraktu z Ginkgo biloba

Procedura

Roztwór testowanego ekstraktu przygotowuje się rozpuszczając 200 mg ekstraktu poddawanego analizie w 10 ml metanolu. Analogicznie, 200 mg wzorca porównawczego ekstraktu z Ginkgo biloba (EGb 761®) rozpuszcza się w 10 ml metanolu, wytwarzając roztwór porównawczy.

PL 204 867 B1

Stosuje się następujące warunki chromatografii:

- typ gradientu:

liniowy od 0% do 100% następczej fazy ruchomej przez 15 minut, następnie przez 5 minut z nastę pczą fazą ruchomą. Ponownie zrównoważyć kolumnę przez 10 minut początkową fazą ruchomą przed nastrzykiem.

- początkowa faza ruchoma: oczyszczona woda 1000 ml acetonitryl 200 ml izopropanol 30 ml kwas cytrynowy 4,92 g

- nastę pcza faza ruchoma: oczyszczona woda 1000 ml acetonitryl 470 ml izopropanol 50 ml kwas cytrynowy 6,08 g

- szybkość przepł ywu: 1,5 ml/minuta

- detekcja: UV 360 nm

- kolumna:

Stal nierdzewna, 15 cm, średnica 4,6 mm; wypełniona żelem krzemionkowym do chromatografii Macherey-Nagel R Nucleosil 5C18 lub jego ekwiwalentem (5 μ m).

- objętość nastrzyku: 5 μΐ

Wyniki

Chromatogram otrzymany dla ekstraktu uzyskanego w przykładzie 2 jest przedstawiony na Fig. 1, a dla ekstraktu uzyskanego w przykładzie 3 na Fig. 2.

Całkowanie określone dla różnych pików przedstawione jest w tabeli I ekstrakt z przykładu 2) i tabeli II (ekstrakt z przykładu 3). Główne piki odpowiadające kolejno O-ramnopiranozylo-4-O-D-(trans-p-kumaroilo-6')glukopiranozyloksy-3-tetrahydroksy-3',4',5,7-flawonolowi (lub 3-(6'-trans-p-kumaroilo)-glukoramnozydowi kwercetyny) O-ramnopiranozylo-4-O-D-(trans-p-kumaroilo-6') glukopiranozyloksy-3-trihydroksy-4',5,7-flawonolowi (lub 3-(6'-trans-p-kumaroilo)-glukoramnozydowi kemferolu) mają czas retencji około 13 do 15 minut w warunkach przedstawionych powyżej.

T a b e l a I

pik nr	czas retencji (minuty)	Typ całkowania	powierzchnia	% powierzchni
1	2	3	4	5
1	5,66	BV	323169,34	1,63
2	6,09	VV	40920,21	0,21
3	7,12	VV	69832,25	0,35
4	5,53	VV	335574,32	1,69
5	7,86	VV	119797,71	0,60
6	8,42	VV	2633527,95	13,25
7	9,38	VV	272916,32	1,37
8	9,76	VV	1226466,81	6,17
9	10,04	VV	72124,84	0,36
10	10,29	Vv	97259,69	0,49
11	10,61	vv	2967432,21	14,93
12	10,88	vV	343065,16	1,73
13	11,25	VV	61980,66	0,31

PL 204 867 B1 cd. tabeli I

1	2	3	4	5
14	11,58	VV	405705,79	2,04
15	12,02	VV	193158,96	0,97
16	12,32	VV	295426,85	1,49
17	12,66	VV	139571,25	0,70
18	13,25	VV	39600621,99	19,93
19	13,79	Vv	145778,77	0,73
20	13,99	vV	38952,25	0,20
21	14,26	VV	39634,91	0,20
22	14,67	VV	119350,40	0,60
23	14,87	VV	85122,51	0,43
24	15,18	VV	3789171,34	19,07
25	15,67	VV	60575,37	0,30
26	15,94	VV	118616,10	0,60
27	16,51	VV	208977,01	1,05
28	16,69	VV	345205,90	1,74
29	17,13	VV	206765,44	1,04
30	17,32	VV	241246,27	1,21
31	17,68	Vv	95087,16	0,48
32	17,80	vV	311413,97	1,57
33	18,08	VV	108167,40	0,54
34	18,40	VV	103158,38	0,52
35	18,88	VV	19884,37	0,10
36	19,15	VV	9701,13	0,05
37	19,35	VV	18389,23	0,09
38	19,75	VV	109237,26	0,55
39	20,42	VV	21754,52	0,11
40	20,82	VV	13348,93	0,07
41	21,35	VV	26491,23	0,13
42	21,82	VV	55867,45	0,28
43	22,18	VV	14634,07	0,07
44	22,58	VB	7095,01	0,04
SUMA			19872178,50

T a b e l a II

pik nr	czas retencji (minuty)	typ całkowania	powierzchnia	% powierzchni
1	2	3	4	5
1	4,25	BV	1082912,49	3,74

PL 204 867 B1 cd. tabeli II

1	2	3	4	5
2	4,84	VV	853793,45	2,95
3	5,52	VV	767098,18	2,65
4	6,06	VV	1634400,29	5,68
5	6,59	VV	53647,35	0,19
6	6,91	VV	127266,30	0,44
7	7,37	VV	5275614,83	18,22
8	7,69	VV	1062334,77	3,67
9	8,28	VV	1918663,93	6,63
10	8,95	Vv	103523,93	0,36
11	9,23	vV	1390204,37	4,80
12	9,63	VV	3866788,04	13,35
13	9,87	VV	2102182,30	7,26
14	10,48	VV	968935,87	3,35
15	10,97	VV	314304,16	1,0
16	11,46	VV	1167341,28	4,03
17	11,86	VV	143179,61	0,49
18	12,20	VV	193515,76	0,67
19	12,56	VV	91823,91	0,32
20	13,13	vV	1197144,99	4,13
21	13,62	VV	94540,18	0,33
22	13,99	VV	33698,24	0, 2
23	14,34	VV	78763,83	0,27
24	14,59	VV	334542,58	1,16
25	15,19	VV	944041,64	3,26
26	15,45	VV	244838,93	0,85
27	15,84	VV	473019,80	1,51
28	16,39	VV	569694,64	1,97
29	16,55	Vv	323620,29	1,12
30	16,72	vV	255311,37	0,88
31	17,02	VV	370249,91	1,28
32	17,55	Vv	106207,91	0,37
33	17,69	vV	338307,55	1,17
34	17,97	VV	134115,60	0,46
35	18,33	VV	148609,32	0,51
36	18,78	Vv	31564,17	0,11
37	18,91	vV	17047,61	0,06

PL 204 867 B1 cd. tabeli II

1	2	3	4	5
38	19,20	VV	25147,79	0,09
39	19,64	VV	67214,23	0,23
40	20,06	VV	16329,48	0,06
41	20,65	VV	11266,06	0,04
42	21,23	VV	10502,29	0,04
43	21,62	VV	40624,23	0,14
SUMA			28956906,57

B) Określenie zawartości prodelfinidyny:

W dalszej części oceniono i podano zawartość prodelfinidyny w ekstraktach wedł ug niniejszego wynalazku.

Około 50 mg ekstraktu rozpuszcza się w 25 ml mieszaniny izopropanolu i 3N roztworu kwasu chlorowodorowego (5/1 obj./obj.). 5 ml otrzymanej mieszaniny przelewa się do 10 ml kolby uszczelnionej wodoszczelnym korkiem, następnie kolbę zanurza się we wrzącej wodzie na 45 minut. Po schłodzeniu do 20°C, objętość zwiększa się do 10 ml przez dodanie mieszaniny izopropanolu i 3N roztworu kwasu chlorowodorowego. Absorbancję mierzy się przy 556 nm i zawartość procentową prodelfinidyn otrzymuje się przeprowadzając następujące obliczenie:

% prodelfinidyn = A x 86,206897/B

A: absorbancja przy 556 nm

B: mg próbki

W celu zredukowania niepewności pomiaru eksperyment powtarza się 3 razy i na podstawie uzyskanych wyników oblicza się średnią.

Farmakologiczne właściwości ekstraktów według wynalazku

W celu wykazania farmakologicznych wł a ś ciwoś ci ekstraktów wedł ug wynalazku moż na przeprowadzić następujące testy.

1) Proliferacja komórek

Linie komórkowe

Linie komórek raka sutka MDA-231 uzyskano z Lombardi Cancer Center (Georgetown University Medical Center). Te linie komórkowe hodowano w polistyrenowych naczynkach do hodowli (Corning) i namnażano w pożywce Eagle zmodyfikowanej przez Dulbecco uzupełnionej 10% bydlęcą surowicą płodową (FBS).

Testy na wiązanie

Linie komórek raka sutka MDA-231 dysperguje się przez roztarcie na proszek w 5 ml roztworu solanki buforowanego fosforanem, następnie wiruje się przy 500 g przez 15 minut. Odwirowane komórki powtórnie zawiesza się w PBSS i testuje w celu pomiaru zawartości białka. Testy [³H]PK11195 można prowadzić tak jak przedstawiono w Papadopoulos i in., J. Biol. Chem. (1990), 265, 3772-3779 i Hardwick i in., Cancer Res. (1999), 59, 831-842. [N-metylo³H] PK 11195 lub (1-(2-chlorofenylo)-N-metylo-N-(1-metylo-propylo)-3-izochinolinokarboksyamid uzyskuje się z Du Pont-New England Nuclear (Wilmington, DE, USA), a PK 11195 z Research Biochemicals Incorporated (Natick, MA, USA). Otrzymane wyniki analizuje się stosując program LIGAND (Munson and Robard, Anal. Biochem. (1976), 72, 248-254.

Analiza RNA typu Northern

Wyrażanie mRNA obwodowych receptorów benzodiazepiny (PBR) w komórkach MDA-231 potraktowanych ekstraktem z przykładu 1 lub z przykładu 2 lub EGb 761^® (ekstrakt porównawczy) można ocenić stosując metodę Northern, jak opisana w Hardwick i in., Cancer Res. (1999), 59, 831-842.

Cały RNA komórkowy wyizolowano stosując odczynnik RNAzol B (TEL-TEST, Inc., Friendswood, TX,

USA) i chloroform. 20 μg całego RNA przepuszcza się przez 1% żel agarozowy i przez noc przenosi się na nylonowe membrany (S&S Nytran, Scheicher & Schuell, Keene, NH, USA). Fragment ludzkiego cDNA z PBR o długości 0,2 kb (pochodzący z wektora plazmidowego pCMV5-PBR zawierającego

PL 204 867 B1 kompletną sekwencję ludzkiego PBR) znakuje się przy użyciu [a-³²P]dCTP, stosując układ do identyfikacji losowej starterów DNA (Live Technologies, Gaithersburg, MD, USA). Zastosowane warunki hybrydyzacji są przedstawione we wspomnianym uprzednio odnośniku. Autoradiografię prowadzi się przenosząc bloty na film X-OMAT AR (Kodak, Rochester, NY, USA) w temperaturze -70°C przez 4-48 godzin. Oznaczenie ilościowe mRNA PBR prowadzi się stosując oprogramowanie SigmaGel (Jandel Scientific, San Rafel, CA, USA).

Proliferacja komórek

Komórki MDA-231 umieszcza się na 96-studzienkowych płytkach (Corning, NJ, USA) w stężeniu około 10000 (inkubacja przez 24 godziny) lub 5000 komórek na studzienkę (inkubacja przez 48 godzin) w DMEM z dodatkiem 0,1% FBS. Następnie komórki inkubuje się w 10% FBS przy różnych stężeniach związku z przykładu lub porównawczego związku (EGb 761^®) przez czas wskazany powyżej. Różnice w odniesieniu do proliferacji komórek analizuje się mierząc ilość włączonej 5-bromo-2'-deoksyurydyny (BrdU), którą określa się stosując sprzęt do testu ELISA BrdU (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN, USA). Włączenie BrdU mierzy się przy długości fali 450 nm (odnośnik: 690 nm).

2) Neurotoksyczność wywołana glutaminianem

Ekstrakt według wynalazku można przetestować w następujący sposób: neurony z mózgu szczura traktuje się, lub nie, wzrastającymi stężeniami ekstraktu z powyższego przykładu 1 lub przykładu 2, a następnie, 30 minut później, poddaje się je działaniu glutaminianu w stężeniu 250 μM. Dawkę hamującą 50% toksyczności glutaminianu (oznaczoną IC50) można następnie ocenić i porównać do otrzymanej dla ekstraktu takiego jak EGb 761^®, uboższego we flawonoglikozydy i laktony terpenowe (mianowicie 100 μg EGb 761® na ml).

3) Toksyczność komórek

Wpływ ekstraktu według wynalazku na żywotność komórek można badać na linii komórek HT 22 (komórki hipokampu myszy). Żywotność tych komórek określa się wyznaczając ilość LDH wydzielonej przez komórki potraktowane wzrastającymi dawkami ekstraktu z przykładu 1 lub z przykładu 2, powyżej, oraz w teście wykluczenia z błękitem trypanowym.

Linie komórkowe

Linia komórek HT-22 pochodzi z Salk Institute for Biological Research (La Jolla, CA, USA). Tę linię komórek utrzymuje się w temperaturze 37°C w pożywce Eagle zmodyfikowanej przez Dulbecco, uzupełnionej 10% bydlęcą surowicą płodową, nazywanej dalej „środowiskiem kompletnym.

Protokół testu

Komórki HT-22 umieszcza się na 96-studzienkowej płytce w stężeniu 5x10³ komórek na studzienkę w środowisku kompletnym. Po 24 godzinach ekstrakt z przykładu rozpuszcza się w DMEM i dodaje w stężeniu 10, 25, 50, 100, 250, 500 i 1000 μg/ml; następnie ekstrakt pozostawia się w kontakcie przez 24 lub 48 godzin. Pomiar LDH prowadzi się stosując zestaw testowy Promega, zgodnie z instrukcjami dostarczonymi przez wytwórcę. Absorbancje odczytuje się przy 470 nm. Po całkowitej lizie komórek przy zastosowaniu Triton X-100 uzyskuje się maksymalne wydzielenie LDH.

W celu pomiaru żywotności w teście wykluczania z zastosowaniem błękitu trypanowego komórki umieszcza się na płytkach 6-studzienkowych i w ciągu 24 godzin dodaje się ekstrakt z przykładu 1 lub z przykładu 2 w stężeniu 100 μg/ml.

Następnie komórki przemywa się roztworem buforu fosforanowego wolnym od wapnia i magnezu i poddaje się działaniu trypsyny przez 5 minut w temperaturze 37°C. Reakcję zatrzymuje się stosując środowisko kompletne i do zawiesiny komórek dodaje się 0,04% błękitu trypanowego. Ilość komórek, które nie zostaną zabarwione (to jest żywych komórek) określa się stosując hematocytometr. Procent żywotności komórek oblicza się w następujący sposób: ilość żywych komórek (niezabarwionych)/całkowita ilość komórek (zabarwianych i niezabarwionych) x 100.

PL 204 867 B1

Claims

1. Sposób wytwarzania ekstraktu z liś ci Ginkgo biloba, znamienny tym, ż e obejmuje kolejno następujące etapy:

(iv) ekstrakcja ciecz-ciecz fazy wodnej przemytej octanem etylu;

(v) przemycie fazy octanu etylu otrzymanej w etapie (iv) chlorkiem sodu, a następnie odparowanie do suchości przemytej fazy octanu etylu.

2. Sposób wedł ug zastrz. 1, znamienny tym, ż e nie obejmuje etapu chromatografii.

3. Sposób według zastrz. 1 lub 2, znamienny tym, że suche fragmenty liści Ginkgo biloba w etapie i zastępuje się suchym proszkiem z liści Ginkgo biloba.

4. Sposób według jednego z zastrz. 1 do 3, znamienny tym, że ekstrakcję w etapie (i) prowadzi się przy użyciu etanolu zawierającego od 10 do 20% wagowych wody.

5. Sposób według jednego z zastrz. 1 do 4, znamienny tym, że przemycie w etapie (iii) prowadzi się n-heptanem.

6. Sposób według jednego z zastrz. 1 do 5, znamienny tym, że w etapach (ii) oraz (v) stosuje się wodne roztwory chlorku sodu o stężeniu chlorku sodu co najmniej 10% wagowych.

7. Sposób według jednego z zastrz. 1 do 6, znamienny tym, ż e obejmuje ponadto, po etapach (i) do (v), poniższy etap (vi):

(vi) rozpuszczenie suchego ekstraktu w etanolu i schłodzenie roztworu, przesączenie ewentualnie wytrąconej soli i odparowanie do suchości powstałego roztworu.

8. Ekstrakt z liści Ginkgo biloba, znamienny tym, że można go otrzymać sposobem wytwarzania określonym w jednym z zastrz. 1 do 7.

9. Ekstrakt z liści Ginkgo biloba, według zastrz. 8, znamienny tym, że proces prowadzi się wychodząc z suchych fragmentów suchych liści Ginkgo biloba.

10. Ekstrakt z liści Ginkgo biloba, według zastrz. 9, znamienny tym, że zawiera od 34 do 46% wagowych laktonów terpenowych i 18 do 30% wagowych flawonoglikozydów.

11. Ekstrakt z liści Ginkgo biloba, według zastrz. 8, znamienny tym, że proces prowadzi się wychodząc z suchych fragmentów liofilizowanych liści Ginkgo biloba.

12. Ekstrakt z liści Ginkgo biloba, według zastrz. 11, znamienny tym, że zawiera 52% wagowych flawonoglikozydów i 13% wagowych laktonów terpenowych.

13. Ekstrakt określony w jednym z zastrz. 8 do 12, do stosowania jako lek.

14. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera, jako składnik aktywny, ekstrakt określony w jednym z zastrz. 8 do 12.

15. Zastosowanie ekstraktu określonego w jednym z zastrz. 8 do 12 do wytwarzania leku przeznaczonego do leczenia chorób/zaburzeń wybranych spośród następujących: choroby naczyń mózgowych i obwodowych oraz choroby neurodegeneracyjne.

16. Zastosowanie ekstraktu określonego w jednym z zastrz. 8 do 12 do wytwarzania leków przeznaczonych do stosowania w terapii wspomagającej przy leczeniu chorób proliferacyjnych.

PL 204 867 B1

Rysunki

-1—Ι~η'.....Γ|.....I TTl I.......> ι I I......... (1,1)1, >.....| ι ι I I I

10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00

Ο.Ο(Ρ l-r-r-/·! , , ,-ρτ·) π-ι ι—I ·τ—[-'|·-|·· ! | , ,, η γΤΓί fi' ΙΤ| ι I |-γ-Γ·ΓΙ

0.00 2.00 4.00 8.00 Β.ΟΟ 10.00 12.00 14.00 18.00 18.00 20.00 22.00 24.00 28.00 28.00 30.00

Minuty

FIG. 1

0.30

0.280.25·

0.240.22

0,20

0.1Sfctt* 0,14^

0.12

G.1O0.080.050.040.02·

0-.ι\Χ0.0

8,00

0.00

2.00

4.00

8,00

Minuty

0.05

PL 204 867 B1

4.00 8.00 8.00 10.00 12.00 14.00 18.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30 00

Minuty

8.00 20.00 22.00 24.00 26.00 2Β.00 30.00

FIG. 2

0.30

0.2B0.260.240.22-J

0.20O.iB0.160.140.12

0.160.080.080.040.02OJ

O.OO-J

2.00

0.05

0.040.030.02

0.016.00

2.00

4.00

3.00 10.00 12.00 14.00

e.oo

Minuty

PL 204 867 B1

Departament Wydawnictw UP RP