CZ299652B6

CZ299652B6 - Zpusob prípravy extraktu z listu Ginkgo biloba vysoce obohaceného úcinnými látkami

Info

Publication number: CZ299652B6
Application number: CZ20033055A
Authority: CZ
Inventors: Teng@Beng-Poon
Original assignee: Société de Conseils de Recherches et D'Applications Scientifiques (S.C.R.A.S.)
Priority date: 2001-04-10
Filing date: 2002-04-09
Publication date: 2008-10-01
Also published as: AU2002307981B2; HUP0303797A3; DE60201525T8; FR2823116A1; KR100876233B1; ATE278411T1; ES2230512T3; JP4416404B2; HK1066164A1; FR2823116B1; CA2443302C; RU2003132470A; CA2443302A1; DE60201525T2; KR20030087068A; PT1379262E; EP1379262B1; PL366938A1; US7048954B2; EP1379262A1

Abstract

Rešení se týká zpusobu prípravy extraktu z listu Ginkgo biloba, který zahrnuje následující po sobe jdoucí kroky: i. extrakce suchých fragmentu listu Ginkgo biloba v ethanolu obsahujícím maximálne 20 % hmotn. vody; ii. koncentrace extraktu za sníženého tlaku v prítomnosti vodného roztoku chloridu sodného a odstranení tmavého oleje ze zbývajícího cirého roztoku; iii. promývání reziduálního vodného roztoku extrakcí kapalina-kapalina pomocí n-hexanu, n-heptanu nebo cyklohexanu; iv. extrakce kapalina-kapalina promyté vodné fáze ethylacetátem; v. promývání ethylacetátové fáze získané v kroku iv. roztokem chloridu sodného a potom odparení promyté ethyleacetátové fáze do sucha. Predmetem rešení je i farmaceutická kompozice obsahující uvedený extrakt, kterou lze použít k lécení mozkových a periferálních vaskulárních poruch a neurodenerativních onemocnení.

Description

Oblast techniky 5

Vynález se týká způsobu přípravy extraktu z listů Ginkgo biloba vysoce obohaceného účinnými látkami.

Dosavadní stav techniky

Jisté fytofarmaceutické standardizované přípravky na bázi extraktů z listů Ginkgo biloba jsou v současné době používány pro léčbu mozkových a periferálních vaskulárních poruch, zejména v Evropě, ve Spojených státech a na Dálném východě. Extrakt Ginkgo biloba, který je v současné době nejvíce používán (EGb 761®), obsahuje 24 % flakon-glykosidů, celkově 3 % ginkgolidů A, B, C a J a 3 % bilobalidu (víz K. Drieu, La Presse Médicale (1986), 15, 1455-1457). Doporučená denní dávka pro pacienta je 120 miligramů.

Patent US 5 399 348 například popisuje způsob přípravy extraktu Ginkgo biloba s průměrným obsahem 24 % flavonglykosidů, 3 % ginkgolidů A, B, C a J a 3 % bilobalidu. Tento způsob zahrnuje následující kroky

i. extrakce suchého prášku listů v acetonu obsahujícím 40 % hmotn. vody;

ii. odstranění lipidů koncentrací extraktu za sníženého tlaku až do získání koncentrátu, obsahujícího přibližně 30 % pevných látek pro odstranění acetonu a potom zředění vodou pro získání obsahu 15 % pevných látek, ochlazení získané suspenze na přibližně 10 °C po dobu jedné hodiny před odstraněním lipidických precipitátů filtrací;

iii. obohacení organické fáze přidáním roztoku síranu amonného 30 % do vodného filtrátu následované extrakci kapalina-kapalína směsí methy lethyl ketonu a acetonu (od 9: Ido 4: 6) a koncentraci organické fáze pro získání obsahu 50 až 70 % pevných látek;

i v. odstranění taninů zředěním koncentrátu ve směsi vody a ethanolu 50/50 hmotnostně pro získání obsahu 10 % pevných látek, přidání vodného roztoku olovnaté soli až do změny zabarvení z hnědé na jantarově žlutou a filtrace precipitátů olova a taninů pro získání čirého filtrátu;

v. odstranění olova ve formě nerozpustného síranu olovnatého koncentrací filtrátu pro udržení maximálního podílu 5 % ethanolu, přidání síranu amonného až do koncentrace přibližně 20 % s následnou extrakcí kapalina-kapalina směsí methylethylketonu a ethanolu (od.8 : 2 do 1 : 1); a vi. sušení výsledného produktu koncentrací organické fáze pro získání obsahu 50 až 70 % pevných látek a sušení za vakua v peci za teploty 60-80 °C pro izolaci výsledného produktu obsahujícího méně než 5 % vody.

Za posledních deset let bylo vynaloženo velké úsilí pro obohacení extraktů Ginkgo biloba o účinné sloučeniny za současného snížení obsahu alérgenogenních alkylfenolických sloučenin s dlouhým řetězcem, jako jsou gínkgolické kyseliny.

Je znám jistý počet přihlášek vynálezů a vynálezů, popisujících způsoby umožňující získání extraktů z listů Ginkgo biloba obohacených o flakon-glykosidy a terpen-laktony.

Například patent US 5 389 370 se týká způsobů přípravy koncentrovaných extraktů se zvýšeným obsahem účinných sloučenin. Strategie použitá v tomto případě je smíchat frakci obohacenou o flavon-glykosidy, získanou extrakcí kapalina-kapalina s bilobalidem a ginkgolidy, izolovaný50 mi pomocí chromatografické separace v koloně pro získání žádoucího složení obsahujícího typicky 50 % flavon-glykosidů a 6 % bilobalidu, 50 % flavon-glykosidů a 7 % ginkgolidů nebo 50% flavon-glykosidů, 6 % bilobalidu a 7 % ginkgolidů. Popsaný způsob přebírá dva první

-1CZ 299652 B6 kroky patentu US 5 399 348 uvedeného výše (které zde budou označeny jako kroky 1 a 2), ke kterým jsou přidány následující po sobě jdoucí kroky

3. obohacení organické fáze: extrakce kapalina-kapalina směsí ethylacetátu a hexanu (9: 1), vodná fáze se znovu extrahuje pomocí n-butanolu a získaná n-butanolová fáze se koncentruje do sucha pro získání frakce obohacené o flavon-glykosidy;

4. zpracování aktivním uhlím: promývání fáze ethylacetát-hexan vodou, promytá fáze ethylacetát-hexan se potom zpracovává pomocí aktivního uhlí, filtruje se a koncentruje do sucha;

5. rekrystalizace: rozpuštění pevného rezidua ve směsi 50/50 hmotnostně ethanolu a vody, ochlazení pro krystalizaci a filtrace pro získání ginkgolidů;

6. kolonová chromatografie: koncentrace do sucha supematantu kroku 5 a chromatografická separace v koloně sílikagelu pro získání frakcí obohacených o bilobalid a ginkgolidy; a

7. smíchání frakcí: smíchání frakce obohacené o flavon-glykosidy v kroku 3 s ginkgolidy získanými v kroku 5 nebo 6 a/nebo bilobalidem získaným v kroku 6.

* V jednom provedení výše uvedeného způsobu mohou být kroky 4 a 5 nahrazeny kolonovou chromatografií.

Kromě toho patent US 6 030 621 popisuje způsob získání extraktů Ginkgo biloba obohacených o flavon-glykosidy a terpen-laktony. Použitá strategie je analogií způsobu popsaného v patentu

US 5 389 370: frakce obohacená o flavon-glykosidy se smíchá s frakcemi obohacenými o terpen-laktony, které se získají kolonovou chromatografií. Typicky připravené extrakty zahrnují 47,2 % flavon-glykosidů a 6,3 % terpen-laktonů nebo 70 % flavon-glykosidů a 10 % terpenlaktonů. Tento způsob zahrnuje následující kroky:

a) extrakce suchého prášku listů v ethanolu obsahujícím 50 % hmotn. vody;

b) odstranění lipidů koncentrací extraktu za sníženého tlaku až do odstranění ethanolu, zředění koncentrátu vodou, ponechání směsi v klidu po dobu 48 hodin a filtrace lipidických precipitáťů;

c) zachycení účinné sloučeniny průchodem vodného filtrátu vrstvou pryskyřice, tvořené Směsi pryskyřice XAEW (směs porézních polymerů) a polyamidu;

d) vymývání účinné sloučeniny používajíce'směsi ethanol-voda postupně obsahující 30, 60 a

90 % hmotn. ethanolu; a

e) zkombinování všech frakcí získaných v kroku d), odpaření ethanolu, promývání vodného koncentrátu hexanem a odpaření do sucha vodné fáze získané promýváním pro získání extraktu obsahujícího 47,2 % flavon-glykosidů a 6,3 % terpen-laktonů.

V jednom provedení výše uvedeného způsobu se frakce získaná ze směsi ethanol-voda obsahující 30 % ethanolu podrobí mžikové chromatografií pro získání frakce obsahující alespoň 80 % terpen-laktonů. Stejným způsobem se frakce, získané vycházejíce ze směsí ethanol-voda obsahujících 60 a 90 % ethanolu zkombinují a podrobí mžikové chromatografii pro získání frakce obsahující alespoň 80 % flavon-glykosidů. Frakce obsahující alespoň 80 % flakon-glyko45 sidů a frakce obsahující alespoň 80 % terpen-laktonů se smíchají v různých poměrech, což umožní získání extraktů, obsahujících až 70 % flavon-glykosidů a 10 % terpen-laktonů.

Z důvodů navzájem si protiřečících požadavků v oblasti sanitární bezpečnosti se stává čím dále výhodnějším používat co nej čistší účinné látky. Tendence u extraktů Ginkgo biloba je tedy opustit časem extrakty jako je EGb 761® ve prospěch extraktů ještě více obohacených o účinné látky. Typicky je možno předvídat extrakty obsahující alespoň 50 % hmotn. flavon-glykosidů a 12 % hmotn. terpen-laktonů, nebo také extrakty obsahující alespoň 30 % hmotn. terpen-laktonů

-2CZ 299652 Bó a alespoň 15 % hmotn. flavon-glykosidů. Způsoby podle patentu US 5 389 370 nebo 6 030 621 umožňují získání takových extraktů, ale ukazuje se, že za cenu vysokých nákladů, protože se jedná o použití kroků zahrnujících separaci chromatografií při přípravě v průmyslovém měřítku.

Přihlašovatelé nalezli způsob, umožňující získání extraktů z listů Ginkgo biloba, které vyhovují výše uvedeným specifikacím, aniž by byl nutný krok chromatografické separace.

Předmět vynálezu

Předložený vynález se tedy týká způsobu přípravy extraktu z listů Ginkgo biloba, který zahrnuje následující po sobě jdoucí kroky:

i. extrakce suchých fragmentů listů Ginkgo biloba v ethanolu obsahujícím maximálně 20 % hmotn. vody;

ii. koncentrace extraktu za sníženého tlaku v přítomnosti vodného roztoku chloridu sodného a odstranění tmavého oleje ze zbývajícího čirého roztoku;

iii. promývání reziduálního vodného roztoku extrakcí kapalina-kapalina pomocí n-hexanu, n-heptanu nebo cyklohexanu;

iv. extrakce kapalina-kapalina promyté vodné fáze ethylacetátem;

v. promývání ethylacetátové fáze získané v kroku iv roztokem chloridu sodného a potom odpaření do sucha promyté ethylacetátové fáze.

Výrazem suché fragmenty listů Ginkgo biloba se rozumí v předložené přihlášce vynálezu suché fragmenty, jejichž velikost částic nepřekračuje 5 mm.

Výhodně jsou podle předloženého vynálezu suché fragmenty listů Ginkgo biloba ve formě suchého prášku. Výrazem prášek se v předložené přihlášce vynálezu rozumí prášek, jejichž velikost částic nepřekračuje 1 mm (a výhodně nepřekračuje 0,5 mm). Způsob podle předloženého vynálezu může být aplikován

- buď na lyofilizované fragmenty (a výhodně na prášek) listů Ginkgo biloba, v tomto případě se získají extrakty obsahující alespoň 50 % hmotn. flavon-glykosidů a 12 % hmotn, terpen-laktonů;

- nebo na sušené fragmenty (a výhodně na prášek) listů Ginkgo biloba, v tomto případě se získají extrakty - dále označované jako „základní extrakty“ - obsahující alespoň 30 % hmotn. terpenlaktonů a alespoň 15 % hmotn. flavon-glykosidů (uvedený způsob umožňuje v tomto případě kromě toho získání vedlejších produktů-extrakty dále označované jako „vedlejší extrakty“ analogických produktům popsaným v přihlášce vynálezu PCT WO 96/34 728, to jest extraktů obsahujících přibližně 30 až 35% hmotn. flavon-glykosidů a přibližně 1 % hmotn. terpenlaktonů).

V jednom provedení předloženého vynálezu se výše uvedený způsob aplikuje na lyofilizované fragmenty (nebo prášek) listů Ginkgo biloba a získaný extrakt je výhodně takový, že obsahuje přibližně 52 % hmotn. flavon-glykosidů a přibližně 13 % hmotn. terpen-laktonů.

Ve výhodném provedení předloženého vynálezu se výše uvedený způsob aplikuje na sušené fragmenty (nebo prášek) listů Ginkgo biloba a získaný základní extrakt je výhodně takový, že obsahuje od 34 do 46 % hmotn. terpen-laktonů a od 18 do 30 % hmotn. flavon-glykosidů. Výhodněji se výše uvedený způsob aplikuje na sušené fragmenty (nebo prášek) listů Ginkgo biloba a získaný základní extrakt je takový, že obsahuje od 36 do 44 % hmotn. terpen-laktonů a od 20 do 28 % hmotn. flavon-glykosidů. Výše uvedený způsob se zejména aplikuje na sušené fragmenty (nebo prášek) listů Ginkgo biloba a získaný základní extrakt obsahuje přibližně 40 % hmotn. terpen-laktonů (a z nich přibližně 24,5 % hmotn. ginkgolidů A, B a C a přibližně 15,5 % hmotn. bilobalidu) a přibližně 24 % hmotn. flavon-glykosidů.

-3CZ 299652 B6

Extrakce v kroku i se výhodně provádí ethanolem obsahujícím mezi 10 a 20 % hmotn. vody a výhodněji mezi 15 a 20 % hmotn. vody. Výhodně se také směs získaná po koncentraci extraktu za sníženého tlaku v přítomnosti vodného roztoku chloridu sodného během kroku ii ochladí, například na teplotu přibližně 10 °C, výhodně po dobu od 10 nebo 15 minut do 1 nebo 2 hodin, před provedením odstranění tmavého oleje ze zbývajícího čirého roztoku. Také výhodně se do směsi získané po koncentraci extraktu za sníženého tlaku v přítomnosti vodného roztoku chloridu sodného v kroku ii přidá celit a veškerý ethanol, přítomný v uvedené směsi se odpaří před ochlazením uvedené směsi.

Výhodně se také promývání v kroku iii provádí pomocí n-heptanu.

V jednom obzvláště výhodném provedení způsobu podle předloženého vynálezu, pokud je tento aplikován na sušené fragmenty (nebo prášek) listů Ginkgo biloba, se objem reziduálního vodného roztoku v kroku iii a množství chloridu sodného v roztoku předem upraví tak, aby na jedné straně hmotnostní obsah pevných vodou rozpustných látek byl přibližně 8 % vzhledem k celkové hmotnosti roztoku a na druhé straně aby hmotnostní obsah chloridu sodného byl 16% vzhledem k celkové hmotnosti roztoku. Obsah pevných vodou rozpustných látek se určí odebráním vzorku ethanolového roztoku, který se odpaří pro odstranění ethanolu a potom extrahuje v dichlor20 methanu, zbytková vodná fáze se potom odpaří do sucha a zváží; obsah pevných vodou rozpustných látek může takto být odečten od hmotnosti získaného pevného rezidua.

Co se týče kroku iv, methylethylketon obsahující od 2 do 10 % obj. acetonu nebo ethanolu může popřípadě být nahrazen ethylacetátem. Co se týče vodných roztoků chloridu sodného použitých v krocích ii a v, mohou tyto roztoky mít výhodně koncentraci alespoň 10 % hmotn. chloridu sodného pro krok ii, zatímco jsou výhodně nasycené chloridem sodným pro krok v.

Ve výhodném provedení výše uvedeného způsobu, aplikovaného na sušené fragmenty (nebo prášek) listů Ginkgo biloba, slaná vodná fáze získaná extrakcí kapalina-kapalina v kroku iv může být odebrána způsobem zahrnuj ícím následuj ící kroky

a) extrakce kapalina-kapalina směsí přibližně 1 : l ethylacetátu a ethanolu; a f

b) odpaření do sucha organická fáze získané v kroku a);

c) rozpuštění rezidua získaného v kroku b) v absolutním ethanolu pro získání koncentrace přibližně 5 % až 10 % hmotn. pevných látek vzhledem hmotnosti ethanolového roztoku;

d) ochlazení směsi na teplotu výhodně nižší nebo rovnou 10 °C (například na teplotu od 2 do 8 °C), výhodně po dobu v rozmezí od 30 minut do 12 hodin;

e) filtrace a odpaření ethanolu ze získaného filtrátu pro získání suchého extraktu. Tento dodatečný způsob dovoluje získat dodatečný extrakt, který obecně obsahuje přibližně 30 až 35 % hmotn. flavon-glykosídů a přibližně 1 % hmotn, terpen-laktonů.

Výše uvedený způsob popřípadě může po krocích i až v zahrnovat ještě následující krok vi.

vi. rozpuštění suchého extraktu v ethanolu a ochlazení roztoku na teplotu výhodně nižší nebo rovnou 10 °C (například na teplotu od 2 do 8 °C), filtrace popřípadě precipitované soli a odpaření vzniklého roztoku do sucha.

V tomto případě, pokud se způsob podle předloženého vynálezu používá v průmyslovém měřítku, je výhodné v kroku v prostě koncentrovat organickou fázi až do získání koncentrace přibližně 50 až 70 % hmotn. pevných látek (a nikoli odpaření do sucha) a přidat ethanol pro získání směsi obsahující 5 až 20 % hmotn. vody, 5 až 20 % hmotn. pevných látek a nacházející se v ethanolu, dříve než se provede krok vi. Pokud se postupuje tímto způsobem, ušetří se jeden krok sušení.

-4CZ 299652 B6

Základní extrakty získané podle předloženého vynálezu jsou použitelné ve farmakologii nebo v potravinářství (například jako příměsi výživných doplňků), protože na jedné straně obsahují méně než 5 ppm alkylfenolů (měření prováděné chromatografíí HPLC) a na druhé straně obsahu5 jí méně než 0,3 % prodelfinidinů (výhodně méně než 0,25 % a obecně mezi 0,05 až 0,25 % prodelfinidinů). Mimo jiné také obsahují velmi málo 1 ipofilních nečistot a velmi málo polysacharidů, proanthokyanidinů jiných než prodelfbinidiny a proteinů o vysoké molekulové hmotnosti.

Základní extrakty podle předloženého vynálezu jsou zejména v důsledku jejich nízkého obsahu io prodelfinidinů lépe snášeny při podávání pacientům cestou intravenózní. Pro srovnání může komerční extrakt jako je EGb 761® obsahovat až 1,5 % prodelfinidinů.

Mimo to jsou základní extrakty podle předloženého vynálezu výhodně takové, že maxima, odpovídaj ící O-rhamnopyranosyM-O-D-{trans-p-kumaroy 1-6'' ')glukopyranosyloxy-3-tetra15 hydroxy-3',4',5,7-flavonolu (nebo 3-(6Mrans-p-kumaroyl)-glukorhamnosidu kercetinu) O-rhamnopyranosyM-O-D-(trans-p-kumaroyl-6 ^f)glukopyranosyloxy-3-trihydroxy-4 ',5,7flavonolu (nebo 3-(6'-trans-p-kumaroyl)-glukorhamnosidu kamferolu) představují dohromady přibližně 39 % celkové plochy maxim chromatogramu. Základní extrakty podle předloženého vynálezu jsou zejména výhodně takové, že maximum odpovídající O-rhamnopyranosyM-O-D20 (trans-p-kumaróyl~6')glukopyranosyloxy-3-tetrahydroxy-3',4',5,7-fIavonolu (nebo 3-(6”'trans-p-kumaroyl)-glukorhamnosidu kercetinu) představuje přibližně 20 % celkové plochy maxim chromatogramu. Kromě toho základní extrakty podle předloženého vynálezu jsou výhodně takové, že maximum odpovídající Q-rhamnopyranosyM-0-D~(trans-p-kumaroyf-6^r'^r)*· glukopyranosyloxy-3-trÍhydroxy-4',5,7-flavonolu (nebo 3-(ó' -trans-p-kumaroyl)-glukor25 hamnosidu kamferolu) představuje přibližně 19 % celkové píochy maxim chromatogramu.

Mimo jiné obsahují vedlejší extrakty, získané způsobem podle předloženého vynálezům méně než 0,5%. prodelfinidinů (výhodně méně než 0,40 % a obecně mezi 0,15 a 0,40% prodelfintdinů).

Předložený vynález se dále týká základních extraktů, které mohou být získány způsobem podle předloženého vynálezu. Předložený vynález se také týká těchto základních extraktů jako léčiv, farmaceutických kompozic, které obsahují jako účinnou látku uvedené základní extrakty a dále se týká použití uvedených základních extraktů pro přípravu léčiv určených pro léčbu onemoc35 nění/poruch, zvolených ze souboru, zahrnujícího následující onemocnění/poruchy; mozkové a periferální vaskulámí poruchy (jako jsou poruchy vaskulámího původu, ateroskleróza, íschemie, trombózy, symptomy související s. cévní nedostatečností, cévní manifestace akutních zánětů a symptomy související s krvácivými příhodami), neurodegeneratívní onemocnění (jako je například Alzheimerova nemoc, Parkínsonova nemoc, Huntingtonova chorea nebo laterální amyo40 trofní skleróza) a patologický kognitivní a neurosenzitivní chronický deficit stárnoucího subjektu (zejména ztráta pamětí stárnoucího subjektu, který není postižen Alzheimerovou nemocí nebo jinou demencí). Předložený vynález se nakonec týká použití uvedených základních extraktů pro přípravu léčiv určených pro dodatkovou terapii proliferativních onemocnění (zejména rakoviny).

Farmaceutické kompozice obsahující extrakt podle předloženého vynálezu mohou být v pevné formě jako například prášky, pilulky, granule, tablety, liposomy, želé nebo čípky. Pilulky, tablety nebo želé mohou být povlečeny látkou schopnou chránit kompozici před působením žaludeční kyseliny nebo enzymů v žaludku subjektu po dobu dostatečnou pro přechod kompozice v nenatrávené formě do tenkého střeva subjektu. Extrakt může také být podáván lokálně, například přímo do místa nádoru. Extrakt může také být podáván způsobem $ prodlouženým uvolňováním (například používajíce kompozici s prodlouženým uvolňováním nebo perfuzní pumpu). Vhodné pevné nosiče mohou být například fosforečnan vápenatý, stearan horečnatý, uhličitan horečnatý, mastek, cukry, laktóza, dextrin, škrob, želatina, celulóza, methylcelulóza, sodná sůl karboxymethylcelulózy, póly viny lpyrrolidin a vosk.

-5CZ 299652 B6

Farmaceutické kompozice obsahující extrakt podle předloženého vynálezu mohou také být vytvořeny v kapalné formě jako například roztoky, emulze, suspenze nebo přípravky s prodlouženým uvolňováním. Vhodné kapalné nosiče mohou být například voda, organická rozpouštědla jako je glycerol nebo glykoly jako je polyethylenglykol, stejně tak jako jejich směsi v různých množstvích s vodou.

Podávání léčiva podle předloženého vynálezu se může provádět cestou topickou, orální, parenterální, intramuskulámí injekcí a podobně.

ío Dávkování extraktu podle předloženého vynálezu pro léčbu onemocnění nebo poruch uvedených výše závisí na způsobu podávání, věku a tělesné hmotnosti léčeného subjektu stejně tak jako na jeho stavu a bude nakonec určeno ošetřujícím lékařem nebo veterinářem. Takové množství, určené ošetřujícím lékařem nebo veterinářem, je dále označováno jako „terapeuticky účinné množství“. Aniž by bylo předcházeno názoru ošetřujícího lékaře, a s uvážením obsahu účinných látek v základních extraktech podle předloženého vynálezu, je možno předpokládat například podávání lidskému pacientovi v denní dávce od 5 do 150 mg, výhodně v dávce od 10 do 100 mg (zejména v dávce od 40 do 80 mg, například od 50 do 70 mg) uvedených základních extraktů.

V předložené přihlášce vynálezu, výraz „přibližně“ znamená interval okolo uvažované hodnoty.

Tak, jak je používán v předložené přihlášce vynálezu, výraz „přibližně X“ znamená interval od X mínus 10 % X do X plus 10 % X a výhodně interval od X minus 5 % X do X plus 5 % X.

Pokud nejsou definovány jiným způsobem, všechny technické a vědecké termíny, které jsou zde používány, mají stejný význam jako je ten, který je znám běžnému odborníkovi v oboru, do kterého spadá předložený vynález. Mimo to všechny publikace, přihlášky vynálezů, všechny vynálezy a všechny další reference, které jsou zde uvedeny, jsou zahrnuty jako reference.

Příklady provedení vynálezu

Následující, příklady jsou uvedeny pro ilustraci způsobů výše uvedených a nemohou být v žádném případě považovány za omezení rozsahu předloženého vynálezu.

Příklad 1

100 g rozdrcených lyofilizovaných listů Ginkgo biloba (velikost částic menší než 4 mm) se dvakrát extrahují, jednou pomocí 800 ml a podruhé pomocí 600 ml směsi ethanol-voda, obsahující 88 % hmotn. ethanolu, po.každé za teploty 60 °C a po. dobu 1 hodiny. Extrakty ze dvou kroků extrakce se filtrují a zbytky listů se propíachují 200 ml stejné směsi rozpouštědel. Zkombinované extrakty se zahustí.odpařením na objem 100 ml s obsahem pevných produktů přibližně 35 g. 350 ml vodného roztoku chloridu sodného o koncentraci 10 % hmotn. se přidá do ethano40 lového koncentrátu a odpaření se provádí za sníženého tlaku a za teploty 50 °C pro odstranění zbytku ethanolu. Čirý oranžový solný roztok se oddělí od tmavého oleje dekantací přes bavlněný polštář ve filtrační nálevce a potom podtlakovou filtrací přes celit. Extrakt ve vodném solném roztoku se promývá dvěma dávkami 150 ml n--heptánu před extrakcí dvakrát 150 ml ethylacetátu. Zkombinované ethylacetátové fáze se promývají 50 ml nasyceného roztoku chloridu sodného a potom se odpaří do suchá za sníženého tlaku. Suchý extrakt se znovu rozpustí v 60 ml absolutního ethanolu, ponechá jednu noc v ledničce za teploty 5 °C, filtruje se pro odstranění soli popřípadě precipitované a filtrát se odpaří do sucha pro získání 1,42 g extraktu obsahujícího 51,7 % flavon-glykosidů a 13 % terpen-laktonů (6,55 % bilobalidu).

Příklad 2

100 g listů Ginkgo biloba získaných po sušení v průmyslové rotační peci a rozdrcených (velikost částic menší než 4 mm; obsah 1,8 % hmotn. flavon-glykosidů a 0,12 % hmotn. ginkgolidů) se

-6CZ 299652 B6 dvakrát extrahují, jednou 800 ml a podruhé 600 ml směsi ethanol-voda obsahující 80 % hmotn, ethanolu, pokaždé za teploty 60 °C a po dobu 1 hodiny. Extrakty dvou kroků extrakce se filtrují a zbytky listů se promývají 200 ml stejné směsi rozpouštědel. Zkombinované extrakty se zahustí odpařením na objem 800 ml s obsahem pevných produktů přibližně 33 g, 60 g chloridu sodného,

100 ml vody a 22 g celitu se přidá k ethanolovému koncentrátu a odpaření se provádí za sníženého tlaku a za teploty 50 °C pro odstranění zbytků ethanolu. Vodný koncentrát se ochladí na teplotu 10 °C po dobu jedné hodiny a čirý oranžový solný roztok se oddělí od tmavého oleje dekantací přes polštář bavlny ve filtrační nálevce a potom podtlakovou filtrací přes fritu pokrytou ložem celitu. Extrakt ve vodném solném roztoku (přibližně 300 ml) se promývá dvěma dávkami ío 125 ml n-heptanu před extrakcí dvakrát 125 ml ethylacetátu. Zkombinované ethylacetátové fáze se promývají 50 ml nasyceného roztoku chloridu sodného a potom se odpaří do sucha za sníženého tlaku. Suchý extrakt se znovu rozpustí v 23 ml absolutního ethanolu, ponechá jednu noc v ledničce za teploty 4 °C, filtruje se pro odstranění popřípadě precipitované soli a filtrát se odpaří do sucha pro získání 1,06 g extraktu obsahujícího 23,6 % flavon-glykosidů, 39,2 % terpen15 laktonů (z toho 24,6 % ginkgolidů A, B a C a 14,5 % bilobalidu) a přibližně 0,14 % prodelfinidinů.

Příklad 3

Vodná solná fáze, která se získá po sobě následujících krocích promývání pomocí n-heptanu a extrakci ethylacetátem způsobu přípravy extraktu podle příkladu 2 se podrobí extrakci kapalinakapalina použitím dvou dávek 125 ml směsi ethylaeetát-ethanol 1:1. Získaná organická fáze se odpaří do sucha. Suchý extrakt se vyjme v absolutním ethanolu tak, aby měl obsah 5 % hmotn. suchého extraktu vzhledem k celkové hmotnosti roztoku. Směs se ponechá jednu noc v ledničce za teploty 4 °C před filtrací přes papír (pevné látky se promývají absolutním ethánolem o teplotě

4 °C). Po odpaření do sucha se získá extrakt obsahující 31,88% flavon-glykosidů a 0,67% terpenů (z toho 0,50% ginkgolidů A, B a C a 0,17 % bilobalidu) a přibližně 0,21 % prodetfinidinů.

Charakterizace extraktů podle předloženého vynálezu .

A) HPLC

Extrakty podle předloženého vynálezu mohou být charakterizovány pomocí vysokovýkonné kapalinové chromatografie (HPLC) vymýváním gradientem popsaným dále.

Materiály

- Chromatograf v kapalné fázi a vybavení upravené pro podmínky popsané dále

- Laboratorní sklo.

- Váhy s přesností na 10^e mg

Činidla

- Čistá voda (kvalita HPLC)

- Acetonitril (kvalita HPLC)

- Izopropanol (kvalita HPLC)

- Kyselina citrónová (kvalita HPLC)

- Methanol R

- Standardní referenční extrakt Ginkgo biloba

-7CZ 299652 B6

Procedura

Roztok testovaného extraktu se připraví rozpuštěním 200 mg extraktu určeného k analýze v 10 ml methanolu. Současně se 200 mg standardního referenčního extraktu Ginkgo biloba (EGb 761®) rozpustí v 10 ml methanolu a představuje referenční roztok.

Použity jsou následující chromatografické podmínky

- Typ gradientu: lineární od 0 % do 100 % sekundární mobilní fáze za 15 minut a potom 5 minut se sekundární mobilní fází. Reekvilibrace kolony po dobu 10 minut primární mobilní fází před následující injekcí.

- Primární mobilní fáze:

purifikovaná voda 1000 ml acetonitril 200 ml izopropanol 30 ml kyselina citrónová 4,92 g

- Sekundární mobilní fáze;

purifikovaná voda 1000 ml acetonitril 470 ml izopropanol 50 ml kyselina citrónová 6,08 g

- Průtok: 1,5 ml/min

- Detekce: UV 360 nm

- Kolona: Nerezová ocel, 15 cm, průměr 4,6 mm; naplněná silikagelem pro chromatografii R Nucleosil 5C18 Macherey-Nagel nebo ekvivalent (5 pm).

- Injektovaný objem: 5 μΐ

- Teplota kolony: 20 ± 2 °C

Výsledky

Chromatogram získaný pro extrakt získaný v příkladu 2 je znázorněn na obr. 1 a chromatogram pro extrakt získaný v příkladu 3 na obr. 2.

Integrály určené pro různá maxima jsou uvedeny v tabulce I (extrakt z příkladu 2) a II (extrakt z příkladu 3). Hlavní maxima odpovídající retenční době přibližně 13 a 15 minut za podmínek popsaných výše odpovídají 0-rhamnopyranosyM-0-D-(trans-p-kumaroyI-6')gliikopyranosvloxy-3-tetrahydroxy-3\4\5,7-flavonolu (nebo 3-(6'-trans-p-kumaroyl)-glukorhamnosid kvercetínu) a 0-rhamnopyranosyM--0-D-(trans-p~kiirnaroyl-ó')gIukopyranosyloxy-3trihydroxy-4',5,7-flavonolu (nebo 3-(6'-trans-p-kumaroyl)- glukorhamnosidu kamferolu).

Tabulka 1

Č.maxima	Ret.doba (min)	Typ integrace	Plocha	% plochy
1	5,66	BV	323169,34	1,6.3
2	6,09	VV	40920,, 21	0,21
. 3	7,12	W	6.9832,25	0,35
4·	7,53	VV	335574,32	1, 69
5	7,86	VV	119797,71	0, 60
6	8,42	VV	2633527,95	13,25

-8CZ 299652 B6

7	9,38	w	272916,32	1,37
8	9,76	w	1226466,81	6,17
9	10,04	w	72124,84	0,36
10	10,29	vv	97259,69	0,49
11	10,61	w	2967432,21	14,93
12	10,88	w	343065,16	1,73
13	11,25	vv	61980,66	0,31
14	11,58	vv	405705,79	2,04
15	12,02	vv	19-3158, 96	0,97
16	12,32	vv	295426,85	1,49
17	12, 66	vv	139571,25	o, 70:
18	1.3,25	vv	39600621,99	19,93 .
19	13,.79	vv	145778,77	0,73
20	13,99	' vv	38952,25	0,20
21	14,26	vv	39634,91	0,20
22	14,67	vv	'119350,40	0,60'
23	14', 87	vv	85122,51	0,43
24	15,18	w	3789171,34	19,0.7
25	15,67	vv	60575,37	0,30
26	15,94	w	118616,10	0,60
27	16,51'	vv	208977,01	1,05
28	16,69	vv	345205,90	1,74
29	17,13	vv	206765,44	1,04
30	. 17,32	. . -w	241246-,-27	1,21
31	17,68	vv	95087,16	0,48
32	17,80	w	311413,97	1,57
33	18,08	w	108167,40	0,54
34	18,40	vv	103158,38	0,52
35	18,8.8	w	19884,37	0,10
36	19,15	w	9701,13	0,05
37	19,35	vv	18389,23	0,09
38	19,75.	vv	109237,26	0,55
39.	20,42	w	21754,5-2	0,11

-QCZ 299652 B6

40	20,82	W	13348,93	0,07
41	21, 35	w	26491,23	0,13
42'	21,82	vv	55867,45	0,28
43	22,18	vv	14634,07	0,07
44	22,58	VB	7095,01	0,04
Celkově			19872178,50

Tabulka 2

Č.maxima	Ret.doba (.min)	Typ integrace	Plocha	% plochy
1	4,25	BV	1082912,49	3,74
2	4,84	VV	853793,45	2,95
3	5,52	VV	767098,18	2,65
4	6,06	VV	1634400’, 29	. 5,68
5	6,59	W	53647,35	0,19
6	6,91	VV	127266,30	0,44
7	7,37	VV	5275614,83	18,22
8	7,69	VV	1062334,77	3, 67
9	8,28	vv	1918663,93	6, 63
10	8,95	vv	103523,93	0,36
11	9,23	vv	1390204,37	4,80
12	9,63	vv	3866788,04	13,35
13	9,87	w	2102182,30	7,2 6
14	10,48	vv	968.935,87	3,35
15	10,97	vv	314304,16	1/0
16	11,46	vv	1167341,28	4,03
17	11/86	vv	143179,61	0,49
18	12,20	w	193515,76	0,67
19	12,56	vv	91823,99	0,32
20	13,13	vv	1197144,99	4,13
21	13,62	vv	94540,18	0,33
22	13,99	w	33698,24	0,12
23	14,34	vv	78763,83	0,27
24	14,59	vv	334542,58	1,16
25	15,19	w	9440č+,64	3,26

26	15,4.5	VV	244838,93	0,85
27	15,84	W	473019,80	1,51
28	16,39	W	569694,64	1,97
29	16,55	w	323620,29	1,12
30	16,72	w	255311,37	0,88
31	17,02	w	.370249,91	1,28
32	17,55	w	106207,91	0,37
33	17,69	w	338307,55	1,17
34	17,97	vv	134115,60	0,46
35	18,33	vy	148609,32	0,51
36	18,78	vv	' 31564,17	0,11
37	18,91	vv	17047,61	0,06
38	19,20	vv.	25147,79	0,09
39	19,64	vv	67214,23	0,23
4-0	' 20,06	¹ vv	16329,48	0,06
.41	20,65	vv	11266,06	0,04
42	21,23	vv	10502,29	0,04
43	21,62	, vv	40624,23	0,14
• Celkově			28956906,57

B) Určení obsahu prodelfinidinů

Obsah prodelfinidinů u extraktů podle předloženého vynálezu se určí způsobem popsaným dále.

Přibližně 50 mg extraktu se rozpustí ve 25 ml směsi izopropanolu a roztoku 3N kyseliny chlorovodíkové (5/1 -obj.) 5 ml získané-směsi se přenese do 10 ml zazátkované baňky a baňka se potom ponoří do vroucí vody po dobu 45 minut. Po ochlazení na teplotu 20 °C se objem upraví na 10 ml io přidáním směsi izopropanolu a roztoku 3N kyseliny chlorovodíkové. Absorpce se měří na vlnové délce 556 nm a procentní obsah prodelfinidinů se získá následujícím způsobem:

% prodelfinidinů = A x 86,206897/B, kde

A je absorpce na vlnové délce 556 nm,

B je hmotnost vzorku v mg.

Pro snížení nepřesnosti výsledku se měření opakuje třikrát, jako konečný výsledek se uvažuje průměrná hodnota.

Farmakologické vlastnosti extraktů podle předloženého vynálezu

Pro prokázání farmako logických vlastností extraktů podle předloženého vynálezu mohou být provedeny následující testy.

-11 CZ 299652 B6

1) Buněčná proliferace

Linie buněk

Buněčné linie buněk rakoviny prsu MDA-231 byly získány z Lombardi Cancer Center (Georgetown University Medical Center). Tyto linie buněk se kultivují v polystyrénových kultivačních nádobkách (Corning) v médiu Eagle, modifikace Dulbecco (DMEM), s přídavkem 10 % fetálního hovězího séra (FBS).

Testy vazby ío Buňky MDA-231 se dispergují rozetřením v 5 ml fosfátem pufrovaného solného roztoku (SSTP) a potom centrifugují při 500 g po dobu 15 minut. Centr ifugované buňky se reSuspendují v SSTP a testují pro určení jejich obsahu proteinů. Testy [³H]PK 11195 mohou být provedeny jak je popsáno v Papadopoulos a kol., T. Bíol. Chem. (1990), 265, 3772-3779 a Hardwick a kol., Cancer Res. (1999), 59, 831— 842. [n-methyl ³H]PK 11195 nebo (l-(2-chlorfenyl)-n-methyl-n15 (l-methyl-propyl)-3-izochÍnolinkarboxamid byl získán od společnosti Du Pont-New Éngland Nuclear (Wilmirígton, DE, USA) a PK 11195 u společnosti Research Biochemicals Incorporated (Natick, MA, Spojené státy). Získané výsledky se analyzují programem LÍGAND (Munson a Robard, Anal. Biochem. (1976),72,248-254.

Northern analýza RNA

Exprese mRNA receptorů benzodiazepinu periferního typu (PBR) v buňkách NMA-231 zpracovávaných extraktem z příkladu 1 nebo příkladu 2 nebo EGb 761® (reference) může být ohodnocena na základě analýzy Northern přenosem, jak je popsáno v Hardwick a kol., Cancer Res. (1999), 59, 831-842. Celková buněčná RNA byla izolována pomocí činidla RNAzol B (TEL-TEST, lne., Friendswood, TX, Spojené státy) a chloroformu. 20 pg celkové RNA se nanese na gel 1 % agarózy a přenáší po jednu noc na nylonové membrány (S&S Nytran, Scheicher & Schuell, Keene, NH, Spojené státy). Fragment lidské cDNA PBR o délce 0,2 kb (derivát plazmídového vektoru pCMV5-PBR obsahující úplnou sekvenci lidského PBR) se označí pomocí [a ³²P]dCTP pomocí náhodného systému identifikace primerů DNA (Life Techno30 logies, Gaithersburg, MD, Spojené státy). Použité hybridizační podmínky jsou popsány v referenci uvedené výše. Autoradiografie se provádí vystavením blotů filmu X-OMAT AR (Kodak, Rochester, NY, Spojené státy) za teploty -70 °C po dobu 4—48 hodin. Kvantifíkativní určení mRNA v PBR se provádí pomocí programu SigmaGel (Jandel Scientific, San Rafel, CA, Spojené státy).

. ' '

Buněčná proliferace . ..... ,

Buňky NMA-231 se vloží na destičky o 96 jamkách (Corning, NJ, Spojené státy) v koncentraci přibližně 10 000 buněk na jamku (24. hodin inkubace) nebo 5000 buněk na jamku (48 hodin inkubace) v DMEM doplněném 0,1 % FBS. Buňky se potom inkubují v FBS 10 % s různými koncentracemi sloučeniny podle příkladu nebo referenční sloučeniny (EGb 761®) po výše uvedené doby. Rozdíly buněčné proliferace se analyzují měřením množství zabudovaného

5-brom-2'-deoxyuridinu (BrdU), které se určí používajíce materiál BrdU ELISA (Boehringer Mannheim, índianapolis, IN, Spojené státy). Zabudování BrdU se měří na vlnové délce 450 nm (reference : 690 nm). ,

2) Neurotoxicita indukovaná gluťamátem

Extrakt podle předloženého vynálezu může být testován následujícím způsobem: neurony krysího mozku se ošetřují nebo neošetřují rostoucími koncentracemi extraktu podle příkladu 1 nebo příkladu 2 uvedených výše a potom, po 30 minutách, se vystaví glutamátu s koncentrací 250 μΜ. Dávka inhibující na 50 % toxicitu glutamátu (označená jako IC50) může být potom určena a porovnávána s dávkou získanou pro extrakt jako je EGb 761®, které obsahuje menší množství flavon-glykosidů a terpen-laktonů (konkrétně 100 pg EGb 761® najeden ml).

-1? _ .3

3) Buněčná toxicita

Účinky extraktu podle předloženého vynálezu na životaschopnost buněk mohou být studovány na buněčných liniích HT 22 (buňky hippocampu myši). Životaschopnost buněk se odhaduje určením množství LDH uvolňovaného buňkami ošetřovanými rostoucími dávkami extraktu z příkladu 1 nebo příkladu 2 uvedených výše a testem exkluze v modři Trypan.

Buněčné linie

W Buněčná linie HT-22 byla získána ze Salk Institute for Biological Research (La Jolla, CA, Spojené státy). Tato buněčná linie se udržuje při teplotě 37 °C v médiu Eagle, modifikace Dulbecco (DMEM) s přídavkem 10 % fetálního hovězího séra (FBS), dále označovaném jako úplné médium.

Protokol testu

Buňky HT-22 se vloží na destičky s 96 jamkami v koncentraci 5.10³ buněk na jamku v úplném médiu. Po 24 hodinách se extrakt z příkladu rozpustí v DMEM a přidá se v koncentraci 10, 25, 50, 100, 250, 500 a 1000 pg/ml; extrakt se potom ponechá v kontaktu po dobu 24 nebo 48 hodin. Měření LDH se provádí dávkovači soupravou Promega podle instrukcí výrobce. Absorpce se odečítají na vlnové délce 470 nm. Maximální uvolňování LDH se získá po úplné lýze buněk pomocí Triton X-l 00.

Pro měření životaschopnosti určované testem exkluze v modři Trypan se buňky umístí na destičky s 6 jamkami a přidá se extrakt z příkladu 1 nebo z příkladu 2 v koncentraci 100 gg/ml po dobu 24 hodin.

Buňky se potom promývají roztokem pufrovaným fosforečnanem bez vápníku a hořčíku a vystaví se trypsinu po dobu 5 minut za teploty 37 °C. Reakce se zastaví pomocí úplného média a do buněčné suspenze se přidá 0,04 % trypanové modři. Počet buněk v exkluzi s barvivém (to znamená živých buněk) se určí hematocytometrem. Procento životaschopných buněk se vypočte následujícím způsobem: počet živých buněk (neobarvených) / celkový počet buněk (neobarvených a obarvených) x 100.

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

40 1. Způsob přípravy extraktu z listů Ginkgo biloba, vyznačující se tím, že zahrnuje následující po sobě jdoucí kroky

i. extrakce suchých fragmentů listů Ginkgo biloba v ethanolu obsahujícím maximálně 20% hmotn. vody; í ii. koncentrace extraktu za sníženého tlaku v přítomnosti vodného roztoku chloridu sodného a j

45 odstranění tmavého oleje ze zbývajícího čirého roztoku;

iii. promývání reziduálního vodného roztoku extrakcí kapalina-kapatina pomocí n-hexanu, n-heptanu nebo cyklohexanu;

iv. extrakce kapalina-kapalína promyté vodné fáze ethylacetátem;

v. promývání ethyl acetátové fáze získané v kroku i v roztokem chloridu sodného a potom 50 odpaření promyté ethylacetátové fáze do sucha.

-13CZ 299652 B6
2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že nezahrnuje žádný krok chromatografie.
3. Způsob podle nároku 1 nebo2, vyznačující se tím, že suché fragmenty listů 5 Ginkgo biloba v kroku i jsou nahrazeny suchým práškem listů Ginkgo biloba.
4. Způsob podle jednoho z nároků 1 až 3, vyznač uj ící se t í m , že extrakce v kroku i se provádí pomocí ethanolu obsahujícího od 10 do 20 % hmotn. vody.

10
5. Způsob podle jednoho z nároků 1 až4, vyznačující se tím, že promývání v kroku iii se provádí pomocí n-heptanu.
6. Způsob podle jednoho z nároků 1 až5, vyznačující se tím, že vodné roztoky chloridu sodného použité v krocích ii a v mají koncentraci alespoň 10 % hmotn. chloridu

15 sodného.
7. Způsob podle jednoho z nároků 1 až 6, vyznačující se tím, že zahrnuje kromě kroků i až v ještě následující krok vi:

ví. rozpuštění suchého extraktu v ethanolu a ochlazení roztoku, filtrace popřípadě precipitované 20 soli a odpaření vzniklého roztoku do sucha.
8. Extrakt z listů Ginkgo biloba, který je možno získat způsobem přípravy podle jednoho z nároků 1 až 7.

25
9. Extrakt z listů Ginkgo biloba podle nároku 8, vyznačující se tím, že způsob se provádí vycházejíce z suchých fragmentů listů Ginkgo biloba.
10. Extrakt z listů Ginkgo biloba podle nároku 9, vyznačující se tím, že obsahuje od 34 do 46 % hmotn. terpen-laktonů a od 18 do 30 % hmotn. flavon-glykosidů.
11. Extrakt z listů Ginkgo biloba podle nároku 8, vyznačující se tím, že způsob se provádí vycházejíce ze suchých lyofilizovaných fragmentů listů Ginkgo biloba.
12. Extrakt z listů Ginkgo biloba podle nároku 11, vyznačující se tím, že obsahuje 35 přibližně 52 % hmotn. flavon-glykosidů a přibližně 13 % hmotn. terpen-laktonů.
13. Extrakt podle jednoho.z nároků 8 až .12 jako léčivo. - .
14. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že, jako účinnou látku obsahuje 40 extrakt podle jednoho z nároků 8 až 12.
15. Použití extraktu podle jednoho z nároků 8 až 12 pro přípravu léčiva, určeného pro léčbu onemocnění/poruch, zvolených ze. souboru, zahrnujícího následující onemocněn í/poruchy: mozkové a períferální vaskulární poruchy a neurodegenerativní onemocnění.
16. Použití extraktu podle jednoho z nároků 8 až 12 pro přípravu léčiv určených jako doplňková terapie pro léčbu proliferativních onemocnění.