ES2230512T3 - Procedimiento de preparacion de un extracto de hojas de ginkgo biloba altamente enriquecido en principios activos. - Google Patents
Procedimiento de preparacion de un extracto de hojas de ginkgo biloba altamente enriquecido en principios activos.Info
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Abstract
Procedimiento de preparación de un extracto de hojas de Ginkgo biloba, que comprende las siguientes etapas sucesivas: vi. extracción de fragmentos secos de hojas de Ginkgo biloba en etanol que contiene como máximo 20% en peso de agua; vii. concentración del extracto a presión reducida en presencia de una disolución acuosa de cloruro de sodio y eliminación del aceite oscuro del resto de la disolución clara; viii. lavado de la disolución acuosa residual por extracción líquido-líquido con n-hexano, n-heptano o ciclohexano; ix. extracción líquido-líquido de la fase acuosa lavada con acetato de etilo; x. lavado de la fase acetato de etilo obtenida en la etapa iv con una disolución de cloruro de sodio y luego evaporación a sequedad de la fase acetato de etilo lavada.
Description
Procedimiento de preparación de un extracto de
hojas de Ginkgo biloba altamente enriquecido en principios
activos.
La invención se refiere a un procedimiento de
preparación de un extracto de hojas de Ginkgo biloba altamente
enriquecido en principios activos.
Algunas preparaciones fitofarmacéuticas
normalizadas a base de extractos de hojas de Ginkgo biloba se
utilizan actualmente para tratar trastornos vasculares cerebrales y
periféricos, principalmente en Europa, en Estados Unidos y en
Extremo Oriente.
El extracto de Ginkgo biloba utilizado con más
frecuencia en la actualidad (EGb 761®) contiene 24% de
flavonaglicósidos, 3% de ginkgólidos A, B, C y J en total y 3% de
bilobálido (cf. K. Drieu, La Presse Médicale (1986), 15,
1455-1457). La dosis diaria recomendada para un
paciente es de 120 miligramos.
La patente US 5.399.348 describe por ejemplo un
método para preparar un extracto de Ginkgo biloba, con una
composición media de 24% de glicósidos de flavona, 3% de
ginkgólidos A, B, C y J y 3% de bilobálido. Este método comprende
las siguiente etapas:
- i.
- extracción del polvo seco de hojas en acetona que contiene 40% en peso de agua;
- ii.
- eliminación de los lípidos por concentración del extracto a presión reducida hasta obtener un concentrado que contiene aproximadamente 30% de sólidos para eliminar así la acetona y luego dilución con agua para obtener una concentración de 15% en sólidos, enfriamiento de la suspensión obtenida a aproximadamente 10ºC durante una hora antes de eliminar por filtración los precipitados lipídicos;
- iii.
- enriquecimiento de la fase orgánica por adición de una disolución de sulfato de amonio al 30% al filtrado acuoso seguido por una extracción líquido-líquido con una mezcla de metiletilcetona y de acetona (entre 9:1 y 4:6) y concentración de la fase orgánica para obtener una concentración de 50 a 70% en sóli- dos;
- iv.
- eliminación de los taninos por dilución del concentrado en una mezcla de agua y de etanol 50/50 en peso para obtener una concentración de 10% en sólidos, adición de una disolución acuosa de una sal de plomo hasta que el color pase de pardo a ámbar y filtración del precipitado de plomo-taninos para obtener un filtrado claro;
- v.
- eliminación del plomo en forma de su sulfato insoluble por concentración del filtrado para guardar una proporción máxima de 5% en etanol, adición de sulfato de amonio hasta una concentración de aproximadamente 20% seguido de una extracción líquido-líquido con una mezcla de metiletilcetona y etanol (entre 8:2 y 1:1); y
- vi.
- secado del producto final por concentración de la fase orgánica para obtener una concentración de 50 a 70% en sólidos y secado a vacío en un horno a 60-80ºC para aislar el producto final que contiene menos de 5% de agua.
Durante estos diez últimos años, se han realizado
grandes esfuerzos para enriquecer la parte de los compuestos
activos de los extractos de ginkgo biloba reduciendo al mismo
tiempo la parte de los compuestos alergénicos alquilfenólicos de
cadena larga, tales como los ácidos ginkgólicos.
Existe un cierto número de solicitudes de
patentes y de patentes que describen procedimientos que permiten
obtener extractos de hojas de ginkgo biloba enriquecidos en
glicósidos de flavona y lactonas de terpeno.
Por ejemplo, la patente US 5.389.370 se refiere a
métodos de preparación de extractos concentrados en compuestos
activos. La estrategia empleada en este caso es mezclar la fracción
rica en glicósidos de flavona obtenida por extracción
líquido-líquido con bilobálido y ginkgólidos
aislados gracias a una separación cromatográfica en columna para
obtener las composiciones deseadas que contienen típicamente 50% de
glicósidos de flavona, 6% de bilobálido, 50% de glicósidos de
flavona y 7% de ginkgólidos o 50% de glicósidos de flavona, 6% de
bilobálido y 7% de ginkgólidos. El procedimiento descrito recoge las
dos primeras etapas de la patente US 5.399.348 citada anteriormente
(que se designarán aquí como las etapas 1 y 2) a las que se añaden
las siguientes etapas sucesivas:
3. enriquecimiento de las fases orgánicas:
extracción líquido-líquido con una mezcla de
acetato de etilo y de hexano (9:1), volviendo a extraer la fase
acuosa con n-butanol y concentrándose la fase
n-butanol obtenida a sequedad para obtener la
fracción rica en glicósidos de flavona;
4. tratamiento con carbono activo: lavado de la
fase acetato de etilo-hexano con agua, siendo, a
continuación, la fase acetato de etilo-hexano lavada
tratada con carbono activo, filtrada y concentrada en seco;
5. recristalización: disolución del residuo
sólido en una mezcla 50/50 en peso de etanol y agua, enfriamiento
para cristalizar y filtración para recuperar los ginkgólidos;
6. cromatografía en columna: concentración a
sequedad del sobrenadante de la etapa 5 y separación cromatográfica
sobre columna de gel de sílice para obtener fracciones ricas en
bilobálido y en ginkgólidos; y
7. mezcla de fracciones: mezcla de la fracción
rica en glicósidos de flavona de la etapa 3 con los ginkgólidos
obtenidos en la etapa 5 ó 6 y/o con el bilobálido obtenido en la
etapa 6.
Según una variante del procedimiento anterior,
las etapas 4 y 5 se pueden reemplazar por una cromatografía en
columna.
Por otra parte, la patente US 6.030.621 describe
un método de obtención de extractos de Ginkgo biloba enriquecido en
glicósidos de flavona y en lactonas de terpeno. La estrategia
empleada es análoga a la de la patente US 5.89.370: la fracción
rica en glicósidos de flavona se mezcla con las fracciones ricas en
lactonas de terpeno, obteniéndose estas últimas por cromatografía en
columna. Típicamente, los extractos preparados comprenden 47,2% de
glicósidos de flavona y 6,3% de lactonas de terpeno o 70% de
glicósidos de flavona y 10% de lactonas de terpeno. Este método
comprende las siguientes etapas:
- a)
- extracción del polvo seco de hojas en etanol que contiene 50% en peso de agua;
- b)
- eliminación de los lípidos por concentración del extracto a presión reducida hasta eliminación del etanol, dilución del concentrado con agua, reposo de la mezcla durante 48 horas y filtración de los precipitados lipídicos;
- c)
- captura de los compuestos activos por paso del filtrado acuoso a través de una resina que consiste en una mezcla de resina XAD-4 (mezcla de polímeros porosos) y de poliamida;
- d)
- elución de los compuestos activos utilizando mezclas de etanol-agua sucesivas que contienen 30, 60 y 90% en peso de etanol; y
- e)
- combinación de todas las fracciones obtenidas en d), evaporación del etanol, lavado del concentrado acuoso con hexano y evaporación a sequedad de la fase acuosa lavada para obtener un extracto que contiene 47,2% de glicósidos de flavona y 6,3% de lactonas de terpeno.
En una variante del procedimiento anterior, la
fracción obtenida a partir de la mezcla etanol-agua
que contiene 30% de etanol se somete a una cromatografía por
desorción súbita para obtener una fracción que contiene al menos 80%
de lactonas de terpeno. De la misma forma, las fracciones obtenidas
a partir de las mezclas etanol-agua que contienen
60-90% de etanol se combinan y someten a una
cromatografía por desorción súbita para obtener una fracción que
contiene al menos 80% de glicósidos de flavona. La fracción que
contiene al menos 80% de glicósidos de flavona y la fracción que
contiene al menos 80% de terpeno-laconas se mezclan
en diferentes proporciones y permiten obtener extractos que
contienen hasta 70% de glicósidos de flavona y 10% de lactonas de
terpeno.
Debido a las crecientes exigencias en materia de
seguridad sanitaria, resulta preferible utilizar principios activos
cada vez más puros. La tendencia para los extractos de Ginkgo
biloba sería por lo tanto la de abandonar un día los extractos como
el EGb 761® en beneficio de extractos todavía más ricos en
principios activos. Típicamente, se podrían considerar extractos que
contengan al menos 50% en peso de glicósidos de flavona y 12% en
peso de lactonas de terpeno, o bien extractos que contengan al
menos 30% en peso de lactonas de terpeno y al menos 15% en peso de
glicósidos de flavona. Los procedimientos de las patentes US
5.389.370 ó 6.030.621 permitirían obtener dicho extracto pero se
comprueba sin embargo que son costosos cuando se trata de
utilizarlos a una escala industrial debido principalmente a la
presencia de etapas de separación por cromatografía.
La solicitante acaba de poner a punto un método
que permite obtener extractos de hojas de Ginkgo biloba que
responden a las especificaciones indicadas sin utilizar ninguna
etapa de separación por cromatografía.
La invención tiene por lo tanto como objetivo un
procedimiento de preparación de un extracto de hojas de Ginkgo
biloba, que comprende las siguientes etapas sucesivas:
- i.
- extracción de fragmentos secos de hojas de Ginkgo biloba en etanol que contiene como máximo 20% en peso de agua;
- ii.
- concentración del extracto a presión reducida en presencia de una disolución acuosa de cloruro de sodio y eliminación del aceite oscuro del resto de la disolución clara;
- iii.
- lavado de la disolución acuosa residual por extracción líquido-líquido con n-hexano, n-heptano o ciclohexano;
- iv.
- extracción líquido-líquido de la fase acuosa lavada con acetato de etilo;
- v.
- lavado de la fase acetato de etilo obtenida en la etapa iv con una disolución de cloruro de sodio y luego evaporación a sequedad de la fase acetato de etilo lavada.
Por fragmentos secos de hojas de Ginkgo biloba,
se entiende en la presente solicitud fragmentos secos cuyo tamaño
de partícula no excede de 5 mm.
Preferentemente según la invención, los
fragmentos secos de hojas de Ginkgo biloba estarán en forma de
polvo seco. Por polvo, se entiende en la presente solicitud un
polvo cuyo tamaño de partícula no excede de 1 mm (y preferentemente
de 0,5 mm).
El procedimiento según la invención se puede
aplicar:
- -
- bien a fragmentos (y preferentemente a un polvo) de hojas de Ginkgo biloba liofilizadas, en cuyo caso se obtendrán extractos que contienen al menos 50% en peso de glicósidos de flavona y 12% en peso de lactonas de terpeno;
- -
- bien a fragmentos (y preferentemente a un polvo) de hojas de Ginkgo biloba secadas, en cuyo caso se obtendrán extractos -denominados en adelante "extractos principales"- que contienen al menos 30% en peso de lactonas de terpeno y al menos 15% en peso de glicósidos de flavona (permitiendo dicho procedimiento en este caso obtener además como producto anexo de los extractos -en adelante denominados "extractos anexos"- análogos a los descritos en la solicitud de patente PCT WO 96/33.728, es decir extractos que contienen aproximadamente 30 a 35% en peso de glicósidos de flavona y aproximadamente 1% en peso de lactonas de terpeno).
Según una de las variantes de la invención, el
procedimiento descrito anteriormente se aplicará a fragmentos (o a
un polvo) de hojas de Ginkgo biloba liofilizados y el extracto
obtenido será preferentemente tal que contenga aproximadamente 52%
en peso de glicósidos de flavona y aproximadamente 13% en peso de
lactonas de terpeno.
Según la variante preferida de la invención, el
procedimiento descrito anteriormente se aplicará a fragmentos (o a
un polvo) de hojas de Ginkgo biloba secadas y el extracto principal
obtenido será preferentemente tal que contenga 34 a 46% en peso de
lactonas de terpeno y de 18 a 30% en peso de glicósidos de flavona.
Más preferentemente, el procedimiento descrito anteriormente se
aplicará a fragmentos (o a un polvo) de hojas de Ginkgo biloba
secadas y el extracto principal obtenido será tal que contenga de
36 a 44% en peso de lactonas de terpeno y de 20 a 28% en peso de
glicósidos de flavona. En particular, el procedimiento descrito
anteriormente se aplicará a fragmentos (o a un polvo) de hojas de
Gingko biloba secadas y el extracto principal obtenido contendrá
aproximadamente 40% en peso de lactonas de terpeno (de las que serán
aproximadamente 24,5% en peso de ginkgólidos A, B y C y
aproximadamente 15,5% en peso de bilobálido) y aproximadamente 24%
en peso de glicósidos de flavona.
Preferentemente, la extracción de la etapa i se
hará por medio de etanol que contenga entre 10 y 20% en peso de
agua, y más preferentemente entre 15 y 20% en peso de agua.
Preferentemente también, la mezcla obtenida
después de concentración del extracto a presión reducida en
presencia de una disolución acuosa de cloruro de sodio durante la
etapa ii se enfriará, por ejemplo a una temperatura de
aproximadamente 10ºC, preferentemente durante un tiempo de 10 ó 15
minutos a 1 ó 2 horas, antes de efectuar la eliminación del aceite
oscuro del resto de la disolución clara. Siempre preferentemente,
se añadirá celita a la mezcla obtenida después de la concentración
del extracto a presión reducida en presencia de una disolución
acuosa de cloruro de sodio durante la etapa ii y la totalidad del
etanol presente en dicha mezcla se evaporará antes de proceder al
enfriamiento de dicha mezcla.
De preferencia igualmente, el lavado de la etapa
iii se efectuará con n-heptano.
Según una variante particularmente preferida del
procedimiento de la invención cuando éste se aplica a fragmentos (o
a un polvo) de hojas de Ginkgo biloba secadas, el volumen de la
disolución acuosa residual de la etapa iii y la cantidad de cloruro
de sodio en la disolución se ajustarán previamente para que, por
una parte, el contenido en peso de sólidos hidrosolubles sea de
aproximadamente 8% en relación al peso total de la disolución, y por
otra parte, el contenido en peso de cloruro de sodio sea de 16% en
relación al peso total de la disolución. El contenido en sólidos
hidrosolubles se evalúa tomando una muestra de disolución etanólica
que se evapora para eliminar etanol y luego se extrae con
diclorometano, siendo la fase residual acuosa a continuación
evaporada a sequedad y pesada; el contenido en sólidos hidrosolubles
se puede entonces deducir de la masa de residuo sólido
obtenida.
En lo relativo a la etapa iv, la metiletilcetona
que contiene de 2 a 10% de acetona o de etanol en términos de
volumen podría eventualmente reemplazar al acetato de etilo.
En lo relativo a las disoluciones acuosas de
cloruro de sodio empleadas en las etapas ii y v, tendrán
preferentemente una concentración de al menos 10% en peso de
cloruro de sodio para la etapa ii mientras que estarán
preferentemente saturadas con cloruro de sodio para la etapa v.
Según una variante preferida del procedimiento
anterior aplicado a fragmentos (o a un polvo) de hojas de Ginkgo
biloba secadas, la fase acuosa salina recuperada después de la
extracción líquido-líquido de la etapa iv podría
retirarse mediante un procedimiento que comprende las siguientes
etapas:
- a)
- extracción líquido-líquido por medio de una mezcla de aproximadamente 1:1 de acetato de etilo y de etanol; y
- b)
- evaporación en seco de la fase orgánica recuperada después de la etapa a);
- c)
- disolución del residuo obtenido en la etapa b) en etanol absoluto para obtener una concentración de aproximadamente 5% a 10% en peso de sólidos en relación con la masa de la disolución etanólica;
- d)
- enfriamiento de la mezcla a una temperatura preferentemente inferior o igual a 10ºC (por ejemplo a una temperatura de 2 a 8ºC), preferentemente durante un tiempo de 30 minutos a 12 horas; y
- e)
- filtración y evaporación del etanol del filtrado recuperado para dar un extracto seco.
Este procedimiento adicional permite recuperar un
extracto suplementario, que contiene generalmente aproximadamente
30 a 35% en peso de glicósidos de flavona y aproximadamente 1% en
peso de lactonas de terpeno.
Opcionalmente, el procedimiento descrito
anteriormente podrá comprender, después de las etapas i a v, la
etapa vi siguiente:
iv. disolución del extracto seco en etanol y
enfriamiento de la disolución a una temperatura preferentemente
inferior o igual a 10ºC (por ejemplo a una temperatura de 2 a 8ºC),
filtración de la sal eventualmente precipitada y evaporación a
sequedad de la disolución resultante.
En este caso, cuando el procedimiento de la
invención se utilice a escala industrial, se preferirá para la
etapa v simplemente concentrar la fase orgánica hasta obtener una
concentración de aproximadamente 50 a 70% en peso de sólidos (y no
evaporarlo a sequedad) y añadir etanol para obtener una composición
que contenga 5 a 20% en peso de agua, 5 a 20% en peso de sólidos y
el resto de etanol antes de efectuar la etapa vi. Procediendo así,
se economizará una etapa de secado.
Los extractos principales obtenidos según la
invención son utilizadas en farmacia o en el campo de la
alimentación (por ejemplo como ingredientes de suplementos
nutricionales) ya que, por una parte, contienen menos de 5 ppm de
alquilfenoles (medida efectuada por dosificación HPLC) y, por otra
parte, contienen menos de 0,3% de prodelfinidinas (preferentemente
menos de 0,25% y generalmente entre 0,05 y 0,25% de
prodelfinidinas). Por otra parte, también tienen pocas impurezas
lipófilas y pocos polisacáridos, proantocianidinas diferentes a las
prodelfinidinas y proteínas de peso molecular elevado.
En particular, debido a su bajo contenido en
prodelfinidinas, los extractos principales según la invención se
adaptarán mejor a una administración a los pacientes por vía
intravenosa. Como comparación, un extracto comercial tal como el
EGb 761® puede contener hasta 1,5% de prodelfinidinas.
Además, los extractos principales de la invención
serán preferentemente tales que los picos correspondientes al
O-ramnopiranosil-4-O-D-(trans-p-cumaroil-6''')glucopiranosiloxi-3-tetrahidroxi-
3',4',5,7-flavonol (ó
3-(6'''-trans-p-cumaroil)-glucoramnósido
de
quercetina)O-ramnopiranosil-4-O-
D-(trans-p-cumaroil-6''')glucopiranosiloxi-3-trihidroxi-4',5,7-flavonol
(ó
3-(6''''-trans-p-cumaroil)-glucoramnósido
de kampferol) representarán juntos aproximadamente 39% de la
superficie total de los picos del cromatograma. En particular, los
extractos principales de la invención serán preferentemente tales
como el pico correspondiente al
O-ramnopiranosil-4-O-D-(trans-p-cumaroil-6''')glucopiranosiloxi-3-tetrahidroxi-
3',4',5,7-flavonol (ó
3-(6'''-trans-p-cumaroil)-glucoramnósido
de quercetina) representará aproximadamente 20% de la superficie
total de los picos del cromatograma. Incluso, los extractos
principales de la invención serán preferentemente tales que el pico
correspondiente al
O-ramnopiranosil-4-O-D-(trans-p-cumaroil-6''')glucopiranosiloxi-3-trihidroxi-
4',5,7-flavonol (ó
3-(6'''-trans-p-cumaroil)glucoramnósido
de kampferol) representará aproximadamente 19% de la superficie
total de los picos del cromatograma.
Por otra parte, los extractos anexos obtenidos
por medio del procedimiento según la invención contendrán menos de
0,5% de prodelfinidinas (preferentemente menos de 0,40% y
generalmente entre 0,15 y 0,40% de prodelfinidinas).
La invención tiene además como objetivo los
extractos principales susceptibles de obtenerse por un
procedimiento según la invención. Tiene también por objetivo dichos
extractos principales como de medicamentos, comprendiendo las
composiciones farmacéuticas, como principio activo, dichos extractos
principales y la utilización de dichos extractos principales para
preparar medicamentos destinados a tratar enfermedades/trastornos
elegidos entre las enfermedades/trastornos siguientes: trastornos
vasculares cerebrales y periféricos (como los acúfenos de origen
vascular, aterosclerosis, isquemias, trombosis, síntomas en
relación con insuficiencia venosa, manifestaciones venosas
inflamatorias agudas y síntomas en relación con una crisis
hemorroide), enfermedades neurodegenerativas (como por ejemplo la
enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de
Huntington o la esclerosis lateral amiotrófica) y el déficit
patológico cognitivo y neurosensorial crónico del anciano
(especialmente la pérdida de memoria observada en los ancianos no
afectados por la enfermedad de Alzheimer u otra demencia). Tiene
finalmente como objetivo la utilización de dichos extractos
principales para preparar medicamentos destinados a ofrecer una
terapia coadyuvante para tratar las enfermedades proliferativas
(especialmente el cáncer).
Las composiciones farmacéuticas que contienen un
extracto según la invención pueden estar en forma sólida como, por
ejemplo, polvos, píldoras, gránulos, comprimidos, liposomas,
cápsulas o supositorios. Las píldoras, comprimidos o cápsulas
pueden estar revestidos por una sustancia capaz de proteger la
composición de la acción del ácido gástrico o de las enzimas en el
estómago del sujeto durante un periodo de tiempo suficiente para
permitir que esta composición pase no digerida al intestino delgado
de este último. El extracto también se puede administrar
localmente, por ejemplo en la misma ubicación de un tumor. El
extracto también se puede administrar según un proceso de liberación
prolongado (por ejemplo utilizando una composición de liberación
prolongada o una bomba de infusión). Los soportes sólidos
apropiados pueden ser, por ejemplo, el fosfato de calcio, estearato
de magnesio, carbonato de magnesio, talco, azúcares, lactosa,
dextrina, almidón, gelatina, celulosa, celulosa de metilo, celulosa
de carboximetilo de sodio, polivinilpirrolidina y cera.
Las composiciones farmacéuticas que contienen un
extracto de la invención pueden igualmente presentarse en forma
líquida como, por ejemplo, disoluciones, emulsiones, suspensiones o
una formulación de liberación prolongada. Los soportes líquidos
apropiados pueden ser, por ejemplo, agua, disolventes orgánicos
tales como glicerol o glicoles tal como el polietilen glicol,
incluso sus mezclas, en proporciones variadas en el agua.
La administración de un medicamento según la
invención podrá hacerse por vía tópica, oral, parenteral, por
inyección intramuscular, etc.
La dosis de un extracto según la presente
invención, a prever para el tratamiento de las enfermedades o
trastornos mencionados anteriormente, varía según el modo de
administración, la edad y el peso corporal del sujeto que se va a
tratar así como del estado de este último, y lo decidirá en
definitiva el médico o el veterinario de cabecera. Dicha cantidad
determinada por el médico o el veterinario de cabecera se denomina
aquí "cantidad terapéuticamente eficaz".
Sin prejuzgar la opinión del médico de cabecera,
y teniendo en cuenta el contenido en principios activos de los
extractos principales según la invención podrá por ejemplo ser
considerada, la administración a un ser humano de una dosis diaria
de 5 a 150 mg, y preferentemente de una dosis de 10 a 100 mg (en
particular una dosis de 40 a 80 mg, por ejemplo de 50 a 70 mg) de
dichos extractos principales.
En la presente solicitud, el término
"aproximadamente" hace referencia a un intervalo alrededor del
valor considerado. Tal como se utiliza en la presente solicitud,
"aproximadamente X" significa un intervalo de X menos 10% de X
a X más 10% de X, y preferentemente un intervalo de X menos 5% de X
a X más 5% de X.
A menos de que no estén definidos de otra manera,
todos los términos técnicos y científicos utilizados aquí tienen el
mismo significado que el habitualmente comprendido por un
especialista normal del campo al que pertenece esta invención.
Los ejemplos que siguen se presentan para
ilustrar los procedimientos anteriores.
100 g de hojas liofilizadas de Ginkgo biloba
trituradas (tamaño de partícula inferior a 4 mm) se extraen dos
veces, una vez con 800 ml y una segunda vez con 600 ml de una
mezcla de etanol-agua que contiene 88% de peso de
etanol, cada vez a 60ºC y durante 1 hora. Los extractos de las dos
etapas de extracción se filtran y los restos de hojas recuperadas
se lavan con 200 ml de la misma mezcla de disolventes. Los
extractos combinados se reducen por evaporación a un volumen de 100
ml con un contenido en productos sólidos de aproximadamente 35 g. Se
añaden 350 ml de una disolución acuosa de cloruro de sodio al 10%
en peso al concentrado etanólico y la evaporación se continúa a
presión reducida a 50ºC para eliminar el resto de etanol. La
disolución salina límpida naranja clara se separa del aceite oscuro
por decantación a través de un tampón de algodón sobre un embudo
filtrante y luego por filtración sobre celita con succión. El
extracto en disolución acuosa salina se lava con dos porciones de
150 ml de n-heptano antes de ser extraído dos veces
con 150 ml de acetato de etilo en cada vez. Las fases acetato de
etilo combinadas se lavan con 50 ml de una disolución saturada de
cloruro de sodio y luego se evaporan a sequedad a presión reducida.
El extracto seco se vuelve a disolver en 60 ml de etanol absoluto,
se deja durante la noche en un refrigerador a 5ºC, se filtra para
eliminar la sal eventualmente precipitada y el filtrado se evapora
a sequedad para dar 1,42 g de extracto que contiene 51,7% de
glicósidos de flavona y 13% de lactonas de terpeno (6,55% de
bilobalido).
100 g de hojas de Ginkgo biloba obtenidas después
de secado en una estufa rotativa industrial y trituradas (tamaño de
partícula inferior a 4 mm; contenido de 1,8% en peso de glicósidos
de flavona y de 0,12% en peso de ginkgólidos) se extraen dos veces,
una vez con 800 ml y una segunda vez con 600 ml de una mezcla de
etanol-agua que contiene 80% en peso de etanol, cada
vez a 60ºC y durante 1 hora. Los extractos de las dos etapas de
extracción se filtran y los restos de hojas recuperadas se lavan
con 200 ml de la misma mezcla de disolventes. Los extractos
combinados se reducen por evaporación a un volumen de 800 ml con un
contenido en productos sólidos de aproximadamente 33 g. Se añaden 60
g de cloruro de sodio, 100 ml de agua y 22 g de celita al
concentrado etanólico y la evaporación se continúa a presión
reducida a 50ºC para eliminar el resto de etanol. El concentrado
acuoso se enfría a 10ºC durante una hora y la disolución salida
límpida naranja clara se separa del aceite oscuro por decantación a
través de un tampón de algodón sobre un embudo filtrante y luego por
filtración con succión sobre material sinterizado recubierto de un
lecho de celita. El extracto en disolución acuosa salina (-300 ml)
se lava con dos porciones de 125 ml de n-heptano
antes de ser extraído dos veces con 125 ml de acetato de etilo cada
vez. Las fases acetato de etilo combinadas se lavan con 50 ml de una
disolución saturada en cloruro de sodio y luego se evaporan a
sequedad a presión reducida. El extracto seco se vuelve a disolver
en 23 ml de etanol absoluto, se deja durante la noche en un
refrigerador a 4ºC, se filtra para eliminar la sal eventualmente
precipitada y el filtrado se evapora a sequedad para dar 1,06 g de
extracto que contiene 23,6% de glicósidos de flavona, 39,2% de
lactonas de terpeno (de ellos 24,6% ginkgólidos de A, B y C y 14,5%
de bilobálido) y aproximadamente 0,14% de prodelfinidinas.
La fase acuosa salina que se recupera después de
las etapas sucesivas de lavado con n-heptano y de
la extracción con acetato de etilo del procedimiento de preparación
del extracto del ejemplo 2 se somete a una extracción
líquido-líquido por medio de dos porciones de 125 ml
de una mezcla de acetato de etilo-etanol 1:1. La
fase orgánica recuperada se evapora a sequedad. El extracto seco se
recoge en etanol absoluto de forma que se tenga una concentración de
5% en peso de extracto seco en relación al peso total de la
disolución. La mezcla se deja durante la noche en un refrigerador a
4ºC antes de ser filtrada sobre papel (se lavan los sólidos con
etanol absoluto a 4ºC). Después de evaporación a sequedad, se
obtiene un extracto que contiene 31,88% de glicósidos de flavona y
0,67% de terpenos (de ellos 0,50% de ginkgólidos A, B y C y 0,17% de
bilobálido) y aproximadamente 0,21% de prodelfinidinas.
Los extractos según la invención se pueden
caracterizar por medio del método de Cromatografía Líquida de Alta
Eficacia (HPLC) con elución por gradientes descrito a
continuación.
- -
- Cromatógrafo en fase líquida y equipo adaptado a las condiciones especificadas a continuación.
- -
- Artículos de vidrio para laboratorio.
- -
- Balanza de precisión a décimas de mg.
- -
- Agua pura (calidad HPLC).
- -
- Acetonitrilo (calidad HPLC).
- -
- Isopropanol (calidad HPLC).
- -
- Ácido cítrico (calidad HPLC).
- -
- Metanol R.
- -
- Extracto de Ginkgo biloba patrón de referencia.
Se prepara una disolución del extracto que se va
ensayar por disolución de 200 mg de extracto que se quiere analizar
en 10 ml de metanol. Paralelamente, se disuelven 200 mg de extracto
de Ginkgo biloba patrón de referencia (EGb 761®) en 10 ml de
metanol y constituyen la disolución de referencia.
Se emplean las siguientes condiciones de
cromatografía:
- -
- Tipo de gradiente: lineal de 0% a 100% de fase móvil secundaria en 15 minutos y luego 5 minutos con la fase móvil secundaria. Reequilibrar la columna durante 10 minutos con la fase móvil primaria antes de la inyección siguiente.
\newpage
- -
- Fase móvil primaria:
Agua purificada | 1.000 ml | |
Acetonitrilo | 200 ml | |
Isopropanol | 30 ml | |
Ácido cítrico | 4,92 g |
- -
- Fase móvil secundaria:
Agua purificada | 1.000 ml | |
Acetonitrilo | 470 ml | |
Isopropanol | 50 ml | |
Ácido cítrico | 6,08 g |
- -
- Caudal: 1,5 ml/min
- -
- Detección: UV 360 nm
- -
- Columna: Acero inoxidable, 15 cm, diámetro 4,6 mm; rellena de gel de sílice para cromatografía R Nucleosil 5C18 Macherey-Nagel o equivalente (5 \mum)
- -
- Volumen inyectado: 5\mul
- -
- Temperatura de columna: 20 \pm 2ºC
El cromatograma obtenido para el extracto
obtenido en el ejemplo 2 se reproduce en Figura 1 y aquel para el
extracto obtenido en el ejemplo 3 en Figura 2.
Las integraciones determinadas para los
diferentes picos se reproducen en las tablas I (extracto del
ejemplo 2) y II (extracto del ejemplo 3) a continuación. Los picos
mayores que tienen tiempos de retención de aproximadamente 13 y 15
minutos en las condiciones descritas anteriormente corresponden
respectivamente al
O-ramnopiranosil-4-O-D-(trans-p-cumaroil-6''')glucopiranosiloxi-3-tetrahidroxi-
3',4',5,7-flavonol (ó
3-(6'''-trans-p-cumaroil)-glucoramnósido
de quercetina) y al
O-ramnopiranosil-4-O-D-(trans-p-cumaroil-6''')glucopiranosiloxi-3-trihidroxi-
4',5,7-flavonol (ó
3-(6'''-trans-p-cumaroil)-glucoramnósido
de kampferol).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
El contenido en prodelfinidinas de los extractos
de la invención se evalúa como se expone a continuación.
Se disuelven aproximadamente 50 mg de extracto se
disuelven en 25 ml de una mezcla de isopropanol y de disolución de
ácido clorhídrico 3N (5/1 v/v). Se transfieren 5 ml de la mezcla
obtenida a un matraz de 10 ml cerrado con un tapón estanco y el
matraz se sumerge a continuación en agua hirviendo durante 45
minutos. Después de enfriamiento a 20ºC, se lleva el volumen a 10 ml
añadiendo mezcla de isopropanol y de disolución de ácido
clorhídrico 3N. La absorbancia se mide a 556 nm y el porcentaje de
prodelfinidinas se obtiene efectuando el siguiente cálculo:
% prodelfinidinas = A x 86,206897 /
B
A: Absorbancia a 556
nm
B: mg de
muestra
Para disminuir la incertidumbre en cuanto al
resultado, la experiencia se repite 3 veces y se hace una media con
los resultados obtenidos.
Para demostrar las propiedades farmacológicas de
los extractos según la invención, se pueden llevar a cabo los
siguientes ensayos.
El linaje de células de cáncer de seno
MDA-231 se han adquirido a Lombardi Cancer Center
(Georgetown University Medical Center). Estas líneas de células se
cultivan en recipientes de cultivo en poliestireno (Corning) y se
multiplican en el medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM)
complementado con 10% de suero fetal bovino (FBS).
Las células MDA-231 se dispersan
por trituración en 5 ml de disolución salina de tampón fosfato
(SSTP) y luego se centrifugan a 500 g durante 15 minutos. Las
células centrifugadas se vuelven a poner en suspensión en una SSTP y
se ensayan para medir su contenido en proteínas. Los ensayos
[^{3}H]PK 11195 se pueden efectuar como se describe en
Papadopoulos et coll., J. Biol.. Chem. (1990), 265,
3772-3779 y Hardwick et coll., Cancer Res.
(1999), 59, 831-842. El
[N-metil-^{3}H]PK 11195 ó
(1-(2-clorofenil)-N-metil-N-(1-metil-propil)-3-isoquinolinocarboxamida
se obtiene en Du Pont-New England Nuclear
(Wilmington, DE, Estados Unidos) y el PK 11195 dirigiéndose a
Research Biochemicals Incorporated (Natick, MA, Estados Unidos).
Los resultados obtenidos se analizan por medio del programa LIGAND
(Munson et Robard, Anal. Biochem. (1976), 72,
248-254.
La expresión del ARNm de los receptores de
benzodiacepina de tipo periférico (PBR) en células MDA 231 tratadas
con el extracto del ejemplo 1 o del ejemplo 2 o del EGb 761®
(referencia) se puede evaluar por medio de un análisis de Northern
como se describe en Hardwick et coll., Cancer Res. (1999),
59, 831-842. El ARN celular total se ha
aislado por medio de un reactivo RNAzol B
(TEL-TEST, Inc., Friendswood, TX, Estados Unidos) y
cloroformo. Se pasan 20 \mug de ARN total sobre gel de 1% de
agarosa y se transfiere durante la noche sobre membranas de nilón
(S&S Nytran, Scheicher & Schuell, Keene, NH, Estados
Unidos). Un fragmento de ADNc humano de PBR de una longitud de 0,2
kb (derivado del vector plásmido pCMV5-PBR que
contiene la secuencia completa del PBR humano) se marca por medio
de [\alpha^{-32p}] dCTP por medio de un sistema aleatorio de
identificación de iniciadores ADN (Life Technologies,
Gaithersburg, MD, Estados Unidos). Las condiciones de hibridación
utilizadas se describen en la referencia citada anteriormente. La
auto-radiografía se efectúa exponiendo los borrones
a una película X-OMAT AR (Kodak, Rochester, NY,
Estados Unidos) a -70ºC durante 4-48 horas. La
cuantificación del ARNm de PBR se hace por medio del programa
SigmaGel (Jandel Scientific, San Rafel, CA, Estados Unidos).
Se colocan células MDA-231 sobre
placas de 96 pozos (Corning, NJ, Estados Unidos) a una
concentración de aproximadamente 10.000 células por pozo (24 h de
incubación) ó 5.000 células por pozo (48 h de incubación) en DMEM
complementado con 0,1% de FBS. Las células se incuban a
continuación en FBS a 10% con concentraciones variadas en compuesto
del ejemplo o del compuesto de referencia (EGb 761®) durante los
periodos indicados anteriormente. Las diferencias en término de
proliferación celular se analizan por medida de la cantidad de
5-bromo-2'-desoxiuridina
(BrdU) incorporado, que se determina utilizando el material BrdU
ELISA (Boehringer Mannheim, Indianápolis, IN, Estados Unidos). La
incorporación del BrdU se mide a la longitud de onda de 450 nm
(referencia: 690 nm).
Un extracto según la invención se puede ensayar
como sigue: neuronas de cerebro de rata, se tratan o no con
concentraciones crecientes de extracto del ejemplo 1 o del ejemplo
2 anteriores y luego, 30 minutos después, se exponen a glutamato a
una concentración de 250 \mum. La dosis inhibidora del 50% de la
toxicidad del glutamato (designada como IC_{50}) se puede
entonces evaluar y luego se compara con la obtenida por un extracto
como el EGb 761®, menos rico en glicósidos de flavona y lactonas de
terpeno (es decir 100 \mug de EGb 761® por ml).
Los efectos de un extracto según la invención
sobre la viabilidad de las células se pueden estudiar sobre una
línea de células HT 22 (células hipocampales de ratón). La
viabilidad de las células se calcula por determinación de la
cantidad de LDH liberada por células tratadas por dosis crecientes
del extracto del ejemplo 1 ó del ejemplo 2 anterior y por el ensayo
de exclusión en el azul de tripano.
La línea de células HT-22
proviene del Salk Institute for Biological Research (La Jolla, CA,
Estados Unidos). Esta línea de células se mantiene a 37ºC en el
medio Eagle modificado de Dulbecco (DNEM) complementado con 10% de
suero fetal bovino (FBS), en adelante llamado medio completo.
Se colocan células HT-22 sobre
una placa de 96 pozos a una concentración de 5.10^{3} células por
pozo en el medio completo. 24 horas después, el extracto del
ejemplo se solubiliza en DMEM y se añade a la concentración de 10,
25, 50, 100, 500 y 1.000 \mug/ml; el extracto se deja entonces en
contacto durante 24 ó 48 horas. La medida de LDH se hace por medio
de un equipo de dosificación Promega según las instrucciones dadas
por el fabricante. Las absorbancias se leen a 470 nm. La liberación
máxima de LDH se obtiene después de lisis completa de las células
por medio de Triton X-100.
Para las medidas de viabilidad calculada por el
ensayo de exclusión con azul de tripano, las células se colocan en
placas de 6 pozos y el extracto del ejemplo 1 o del ejemplo 2 se
añade a la concentración de 100 \mug/ml durante 24 horas.
Las células se lavan a continuación con una
disolución tampón de fosfato exenta de calcio y de magnesio y
expuestas a tripsina durante 5 minutos a 37ºC. La reacción se para
con el medio completo y se añade 0,04% de azul de tripano a la
suspensión celular. El número de células que excluyen el colorante
(es decir, las células vivas) se determina por medio de un
hematocitómetro. El porcentaje de viabilidad de células se calcula
como sigue: número de células viables (no coloreadas)/número total
de células (coloreadas y no coloreadas) x 100.
Claims (16)
1. Procedimiento de preparación de un extracto de
hojas de Ginkgo biloba, que comprende las siguientes etapas
sucesivas:
- vi.
- extracción de fragmentos secos de hojas de Ginkgo biloba en etanol que contiene como máximo 20% en peso de agua;
- vii.
- concentración del extracto a presión reducida en presencia de una disolución acuosa de cloruro de sodio y eliminación del aceite oscuro del resto de la disolución clara;
- viii.
- lavado de la disolución acuosa residual por extracción líquido-líquido con n-hexano, n-heptano o ciclohexano;
- ix.
- extracción líquido-líquido de la fase acuosa lavada con acetato de etilo;
- x.
- lavado de la fase acetato de etilo obtenida en la etapa iv con una disolución de cloruro de sodio y luego evaporación a sequedad de la fase acetato de etilo lavada.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque no comprende ninguna etapa
cromatográfica.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2,
en el que los fragmentos secos de hojas de Ginkgo biloba de la
etapa i se reemplazan por un polvo seco de hojas de Ginkgo
biloba.
4. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la extracción
de la etapa i se efectúa por medio de etanol que contiene de 10 a
20% en peso de agua.
5. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el lavado de la
etapa iii se efectúa con n-heptano.
6. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque las
disoluciones acuosas de cloruro de sodio empleadas en las etapas ii
y v tienen una concentración de al menos 10% en peso de cloruro de
sodio.
7. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 6 que comprende además, después de las etapas
i a v, la siguiente etapa vi:
iv. disolución del extracto seco en etanol y
enfriamiento de la disolución, filtración de la sal eventualmente
precipitada y evaporación a sequedad de la disolución
resultante.
8. Extracto de hojas de Gingko biloba susceptible
de obtenerse por un procedimiento de preparación según una de las
reivindicaciones 1 a 7.
9. Extracto de hojas de Gingko biloba según la
reivindicación 8, caracterizado porque el procedimiento se
efectúa a partir de fragmentos secos de hojas secadas de Ginkgo
biloba.
10. Extracto de hojas de Ginkgo biloba según la
reivindicación 9, caracterizado porque contiene de 34 a 46%
en peso de lactonas de terpeno y de 18 a 30% en peso de glicósidos
de flavona.
11. Extracto de hojas de Gingko biloba según la
reivindicación 8, caracterizado porque el procedimiento se
efectúa a partir de fragmentos secos de hojas liofilizadas de
Ginkgo biloba.
12. Extracto de hojas de Ginkgo biloba según la
reivindicación 11, caracterizado porque contiene
aproximadamente 52% en peso de glicósidos de flavona y
aproximadamente 13% en peso de lactonas de terpeno.
13. Como medicamento, un extracto según una de
las reivindicaciones 8 a 12.
14. Composición farmacéutica que comprende, como
principio activo, un extracto según una de las reivindicaciones 8 a
12.
15. Utilización de un extracto según una de las
reivindicaciones 8 a 12 para preparar un medicamento destinado a
tratar enfermedades/ trastornos elegidos entre las siguientes
enfermedades/ trastornos: trastornos vasculares cerebrales y
periféricos y enfermedades neurodegenerativas.
16. Utilización de un extracto según una de las
reivindicaciones 8 a 12, para preparar medicamentos destinados a
ofrecer una terapia coadyuvante para tratar enfermedades
proliferativas.
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