KR100876233B1

KR100876233B1 - 유효 성분이 풍부한 은행나무 잎 추출물의 제조 방법

Info

Publication number: KR100876233B1
Application number: KR1020037013205A
Authority: KR
Inventors: 벵푼 텡
Original assignee: 소시에떼 드 꽁세이으 드 르세르세 에 따블리까시옹 시앙띠피끄 (에스.세.에르.아.에스.)
Priority date: 2001-04-10
Filing date: 2002-04-09
Publication date: 2008-12-26
Also published as: FR2823116A1; CN1501806A; ATE278411T1; US7048954B2; ES2230512T3; WO2002083158A1; HUP0303797A3; DE60201525D1; KR20030087068A; US20040109907A1; DE60201525T8; PL366938A1; RU2297235C2; CN1245167C; NZ528571A; EP1379262B1; PT1379262E; AU2002307981B2; CA2443302A1; CZ299652B6

Abstract

본 발명은 i) 은행나무 잎의 건조 분획을 최대 20중량%의 물을 포함하는 에탄올 중에서 추출하고; ii) 추출물을 감압하에서 적어도 소듐 클로라이드 수용액 존재하에 농축하고 진한색 오일을 나머지 투명한 용액으로부터 제거하고; iii) 잔류 수용액을 n-헥산, n-헵탄 또는 시클로헥산으로의 액체-액체 추출에 의해 세척하고; iv) 세척된 수성 상을 에틸 아세테이트로 액체-액체 추출하고; v) 단계 iv)에서 얻은 에틸 아세테이트 상을 소듐 클로라이드 용액으로 세척한 다음 세척된 에틸 아세테이트 상을 건조 방법에 의해 증발시키는 연속 단계를 포함하는 은행나무 잎 추출물의 제조 방법에 관한 것이다.

은행나무 잎 추출물

Description

유효 성분이 풍부한 은행나무 잎 추출물의 제조 방법{METHOD FOR PREPARING AN EXTRACT OF GINKGO BILOBA LEAVES HIGHLY ENRICHED IN ACTIVE PRINCIPLES}

본 발명은 유효 성분이 매우 풍부한 은행나무 잎 추출물의 제조 방법에 관한 것이다.

은행나무 잎 추출물을 기재로 하는 특정한 표준 식물제약학적 제제가 현재 뇌 및 말초 혈관 질병 치료를 위해, 특히 유럽, 미국 및 극동 지역에서 사용되고 있다.

현재 가장 일반적으로 사용되고 있는 은행나무 추출물(EGb 761(등록상표))은 24%의 플라본-글리코시드, 총 3%의 징콜라이드 A, B, C 및 J와 3%의 빌로발라이드를 포함한다(케이, 드리오(K. Drieu)의 문헌[La Presse Medicale(1986), 15. 1455-1457] 참고). 환자에게 권장되는 일일 투여량은 120mg이다.

예를 들어 미국 특허 제 5,399,348 호는 24%의 플라본-글리코시드, 3%의 징콜라이드 A, B, C 및 J와 3%의 빌로발라이드의 평균 조성을 갖는 은행나무 추출물 을 제조하는 방법을 기술한다. 이 방법은 하기 단계를 포함한다:

i. 잎의 건조 분말을 40중량%의 물을 포함하는 아세톤 중에서 추출하고;

ii. 대략 30%의 고체를 포함하는 농축물이 얻어질 때까지 추출물을 감압하에서 농축하여 아세톤을 제거한 다음, 물로 희석하여 15% 고체의 농도를 얻고, 수득 된 현탁액을 대략 10℃로 1시간 동안 냉각한 다음 지질 침전물을 여과에 의해 제거하는 것에 의해, 지질을 제거하고;

iii. 30% 암모늄 술페이트 용액을 수성 여액에 첨가한 후에 메틸에틸케톤 및 아세톤(9:1 내지 4:6) 혼합물로 액체-액체 추출하고 유기 상을 농축하여 50 내지 70% 고체의 농도를 얻는 것에 의해, 유기 상을 풍부하게 하고;

iv. 농축물을 물 및 에탄올의 중량 50/50 혼합물로 희석하여 10% 고체의 농도를 얻고 납 염의 수용액을 색이 갈색에서 호박색으로 될 때까지 첨가하고 납-탄닌 침전물을 여과하여 투명한 여액을 제조하는 것에 의해, 탄닌을 제거하고;

v. 여액을 농축하여 5% 에탄올의 최대 비율을 유지하고 암모늄 술페이트를 대략 20% 이하의 농도로 첨가한 후에 메틸에틸케톤 및 에탄올(8:2 내지 1:1) 혼합물로 액체-액체 추출하는 것에 의해, 불용성 술페이트 형태의 납을 제거하고;

vi. 유기 상을 농축하여 50 내지 70% 고체의 농도를 얻고 60-80℃의 오븐에서 진공 건조시켜서 5% 미만의 물을 포함하는 최종 생성물을 분리하는 것에 의해, 최종 생성물을 건조시킨다.

최근 10년간, 징콜산과 같은 알레르기를 일으키는 장쇄 알킬페놀 화합물 부분은 감소시키면서 동시에 은행나무 추출물의 유효 화합물 부분을 풍부화하고자 하는 상당한 노력이 행해졌다.

플라본-글리코시드 및 테르펜-락톤이 풍부한 은행나무 잎의 추출물을 제조할 수 있는 방법을 기술하는 다수의 특허 출원 및 특허가 존재한다.

예를 들면, 미국 특허 제 5,389,370 호는 유효 화합물이 농축된 추출물을 제 조하는 방법에 관한 것이다. 이 경우에 사용된 방법은 액체-액체 추출에 의해 얻은 플라본-글리코시드가 풍부한 분획을 컬럼 크로마토그래피 분리를 사용하여 분리한 빌로발라이드 및 징콜라이드와 혼합하여 전형적으로 50%의 플라본-글리코시드 및 6%의 빌로발라이드, 50%의 플라본-글리코시드 및 7%의 징콜라이드 또는 50%의 플라본-글리코시드, 6%의 빌로발라이드 및 7%의 징콜라이드를 포함하는 바람직한 조성물을 얻는 것이다. 이 방법은 전술한 미국 특허 제 5,399,348 호의 처음 두 단계(여기에서는 단계 1 및 2로 지정)에 하기 연속 단계가 더해진 것이다:

3. 유기 상의 풍부화: 에틸 아세테이트 및 헥산(9:1)의 혼합물로 액체-액체 추출하고, 수성 상을 n-부탄올로 재추출하고 수득된 n-부탄올 상을 건조도까지 농축하여 플라본-글리코시드가 풍부한 분획을 얻는다;

4. 활성 탄소로의 처리: 아세테이트-헥산 에틸 상을 물로 세척하고, 세척된 아세테이트-헥산 에틸 상을 활성 탄소로 처리하고, 여과하고, 건조도까지 농축한다;

5. 재결정화: 고체 잔류물을 에탄올 및 물의 중량 50/50 혼합물에 용해시키고, 냉각하여 결정화시키고, 여과하여 징콜라이드를 회수한다;

6. 컬럼 크로마토그래피: 단계 5의 상청액을 건조도까지 농축하고 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 분리하여 빌로발라이드 및 징콜라이드가 풍부한 분획을 얻는다; 및

7. 분획 혼합: 단계 3의 플라본-글리코시드가 풍부한 분획과 단계 5 또는 6에서 얻은 징콜라이드 및(또는) 단계 6에서 얻은 빌로발라이드를 혼합한다.

상기 방법의 변형에 따르면, 단계 4 및 5를 컬럼 크로마토그래피로 대체할 수 있다.

또한 미국 특허 제 6,030,621 호는 플라본-글리코시드 및 테르펜-락톤이 풍부한 은행나무 추출물의 제조 방법을 기술한다. 사용된 방법은 미국 특허 제 5,389,370 호와 유사하다: 플라본-글리코시드가 풍부한 분획을 컬럼 크로마토그래피에 의해 얻은 테르펜-락톤이 풍부한 분획과 혼합한다. 제조된 추출물은 전형적으로 47.2%의 플라본-글리코시드 및 6.3%의 테르펜-락톤 또는 70%의 플라본-글리코시드 및 10%의 테르펜-락톤을 포함한다. 이 방법은 하기 단계를 포함한다:

a) 잎의 건조분말을 50중량%의 물을 포함하는 에탄올 중에서 추출하고;

b) 에탄올이 제거될 때까지 감압하에서 추출물을 농축하고, 농축물을 물로 희석하고, 혼합물을 48시간 동안 방치하고 지질 침전물을 여과하는 것에 의해, 지질을 제거하고;

c) XAD-수지(다공성 중합체의 혼합물) 및 폴리아미드의 혼합물로 구성된 수지를 통해 수성 여액을 통과시키는 것에 의해, 유효 화합물을 포집하고;

d) 30, 60 및 90중량%의 에탄올을 포함하는 에탄올-물 혼합물을 연속적으로 사용하여 유효 화합물을 용출하고;

e) d)에서 얻은 모든 분획을 합하고, 에탄올을 증발시키며, 수성 농축물을 헥산으로 세척하고, 세척된 수성 상을 건조도까지 건조시켜서, 47.2%의 플라본-글리코시드 및 6.3%의 테르펜-락톤을 포함하는 추출물을 얻는다.

상기 방법의 변형에서는, 30%의 에탄올을 포함하는 에탄올-물 혼합물로부터 얻은 분획을 플래쉬 크로마토그래피하여 80% 이상의 테르펜-락톤을 포함하는 분획을 얻는다. 동일한 방법으로, 60 및 90%의 에탄올을 포함하는 에탄올-물 혼합물로부터 얻은 분획을 합하고 플래쉬 크로마토그래피하여 80% 이상의 플라본-글리코시드를 포함하는 분획을 얻는다. 80% 이상의 플라본-글리코시드를 포함하는 분획 및 80% 이상의 테르펜-락톤을 포함하는 분획을 여러 비율로 혼합하여 70% 이하의 플라본-글리코시드 및 10%의 테르펜-락톤을 포함하는 추출물을 얻을 수 있다.

건강상의 안전에 대한 조건이 엄격해지고 있어서, 보다 더 순수한 유효 성분을 사용하는 것이 바람직해지고 있다. 그러므로 은행나무 추출물에 대한 경향은 언젠가는 EGb 761(등록상표)과 같은 추출물을 유효 성분이 보다 더 풍부한 추출물로 인해 포기하게 될 수 있다는 것이다. 전형적으로, 50중량% 이상의 플라본-글리코시드 및 12중량%의 테르펜-락톤을 포함하는 추출물 또는 30중량% 이상의 테르펜-락톤 및 15중량% 이상의 플라본-글리코시드를 포함하는 추출물을 목표로 할 수 있을 것이다. 미국 특허 제 5,389,370 호 또는 제 6,030,621 호의 방법으로는 그러한 추출물을 얻을 수는 있으나 주로 공업적 규모로 사용될 때, 크로마토그래피에 의한 분리 단계가 사용되는 것으로 인해 번거로운 것으로 증명되었다.

본 출원인은 본 발명에 이르러 크로마토그래피에 의한 어떠한 분리 단계 없이도 상기 설명에 해당하는 은행나무 잎 추출물을 제조할 수 있는 방법을 개발하게 되었다.

그러므로 본 발명은 하기 연속 단계를 포함하는 은행나무 잎 추출물의 제조 방법에 관한 것이다:

i. 은행나무 잎의 건조 분획을 최대 20중량%의 물을 포함하는 에탄올 중에서 추출하고;

ii. 추출물을 감압하에서 소듐 클로라이드 수용액 존재하에 농축하고 진한색 오일을 나머지 투명한 용액으로부터 제거하고;

iii. 잔류 수용액을 n-헥산, n-헵탄 또는 시클로헥산으로의 액체-액체 추출에 의해 세척하고;

iv. 세척된 수성 상을 에틸 아세테이트로 액체-액체 추출하고;

v. 단계 iv에서 얻은 에틸 아세테이트 상을 소듐 클로라이드 용액으로 세척한 다음 세척된 에틸 아세테이트 상을 건조도까지 증발시킨다.

본 출원에 있어서 은행나무 잎의 건조 분획은 입자 크기가 5mm를 초과하지 않는 건조 분획을 의미한다.

바람직하게는 본 발명에 따르면, 은행나무 잎의 건조 분획은 건조 분말의 형태이다. 본 출원에 있어서 분말은 입자 크기가 1mm를 초과하지 않는(바람직하게는 5mm를 초과하지 않는) 분말을 의미한다.

본 발명에 따른 방법은 다음에 적용될 수 있다:

- 은행나무 잎의 동결건조 분획(바람직하게는 분말), 이 경우에는 50중량% 이상의 플라본-글리코시드 및 12중량%의 테르펜-락톤을 포함하는 추출물이 얻어진다; 또는

- 은행나무 잎의 건조 분획(바람직하게는 분말), 이 경우에는 30중량% 이상의 테르펜-락톤 및 15중량% 이상의 플라본-글리코시드를 포함하는 추출물-하기에는 "주요 추출물"로 지칭됨-이 얻어진다(이 경우에는 상기 방법으로 PCT 특허 출원 제 WO96/33728 호에 기술된 것들과 유사한, 즉 대략 30 내지 35중량%의 플라본-글리코시드 및 대략 1중량%의 테르펜-락톤을 포함하는 추출물인, 추출물의 관련 생성물-하기에는 "관련 추출물"로 지칭됨-도 또한 얻을 수 있다).

본 발명 방법의 한 변형에 따르면, 상기 방법은 은행나무 잎의 동결건조 분획(또는 분말)에 적용되며 수득된 주요 추출물은 바람직하게는 대략 52중량%의 플라본-글리코시드 및 13중량%의 테르펜-락톤을 포함한다.

본 발명 방법의 바람직한 변형에 따르면, 상기 방법은 은행나무 잎의 건조 분획(또는 분말)에 적용되며 수득된 주요 추출물은 바람직하게는 34 내지 46중량%의 테르펜-락톤 및 18 내지 30중량%의 플라본-글리코시드를 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 방법은 은행나무 잎의 건조 분획(또는 분말)에 적용되며, 수득된 주요 추출물은 36 내지 44중량%의 테르펜-락톤 및 18 내지 30중량%의 플라본-글리코시드를 포함한다. 특히, 상기 방법은 은행나무 잎의 건조 분획(또는 분말)에 적용되며, 수득된 주요 추출물은 대략 40중량%의 테르펜-락톤(그 중 대략 24.5중량%는 징콜라이드 A, B 및 C이고 대략 15.5중량%는 빌로발라이드이다) 및 대략 24중량%의 플라본-글리코시드를 포함할 것이다.

바람직하게는, 단계 i의 추출은 10 내지 20중량%의 물, 보다 바람직하게는 15 내지 20중량%의 물을 포함하는 에탄올을 사용하여 수행된다.

바람직하게는, 또한 단계 ii동안 추출물의 소듐 클로라이드 수용액 존재하의 감압 농축 후에 얻어진 혼합물을, 예를 들면 대략 10℃의 온도로, 바람직하게는 10 또는 15분 내지 1 또는 2시간 동안 냉각한 후에, 나머지 투명한 용액으로부터 진한색 오일을 제거한다. 보다 더 바람직하게는, 단계 ii동안 추출물의 소듐 클로라이드 수용액 존재하의 감압 농축 후에 얻어진 혼합물에 셀라이트를 첨가하고 상기 혼합물에 존재하는 에탄올의 전부를 증발시킨 다음 상기 혼합물을 냉각시킨다.

바람직하게는 또한 단계 iii의 세척을 n-헵탄으로 수행한다.

본 발명 방법의 특히 바람직한 변형에 따르면, 이 방법을 은행나무 잎의 건조 분획(또는 분말)에 적용할 때, 단계 iii에서 세척되는 잔류 수용액의 부피 및 용액 중 소듐 클로라이드의 양을, 한편으로는 수용성 고체의 중량 함량이, 즉 용액의 총 중량에 대하여 대략 8%이고, 다른 한편으로는 소듐 클로라이드의 중량 함량이, 즉 용액의 총 중량에 대하여 16%이도록 미리 조절한다. 수용성 고체의 함량은 에탄올 용액의 샘플을 취하고 증발시켜서 에탄올을 제거한 다음 디클로로메탄으로 추출하고, 잔류 수성 상을 건조도까지 증발시키고 칭량하여 평가하는데; 수용성 고체의 함량을 얻어진 고체 잔류물의 질량으로부터 추정할 수 있다.

단계 iv에 있어서, 선택적으로 2 내지 10부피%의 아세톤 또는 에탄올을 포함하는 메틸에틸케톤으로 에틸 아세테이트를 대체할 수 있다.

단계 ii 및 v에서 사용되는 소듐 클로라이드의 수용액은 바람직하게는 10중량% 이상의 소듐 클로라이드의 농도를 가질 것이며, 단계 v에서는 바람직하게는 소듐 클로라이드로 포화될 것이다.

은행나무 잎의 건조 분획(또는 분말)에 적용되는 상기 방법의 바람직한 변형에 따르면, 단계 iv의 액체-액체 추출 후에 회수된 식염수 수성 상을 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 재처리할 수 있다:

a) 에틸 아세테이트 및 에탄올의 대략 1:1 혼합물을 사용하여 액체-액체 추출하고;

b) 단계 a) 후에 회수된 유기 상을 건조도까지 증발시키며;

c) 단계 b)에서 수득된 잔류물을 무수 에탄올에 용해시켜서 에탄올 용액의 질량에 대하여 대략 5% 내지 10중량% 고체의 농도를 얻고;

d) 혼합물을 10℃ 이하(예를 들면, 2 내지 8℃)의 온도로, 바람직하게는 30 내지 12시간 동안 냉각하고;

e) 여과하고 회수된 여액의 에탄올을 증발시켜서 건조 추출물을 제조한다.

이러한 추가 공정으로, 대략 30 내지 35중량%의 플라본-글리코시드 및 대략 1중량%의 테르펜-락톤을 일반적으로 포함하는 추가 추출물을 회수할 수 있다.

선택적으로, 상기 방법은 단계 i 내지 v 후에 하기 단계 vi를 포함할 수 있다:

vi. 건조 추출물을 에탄올에 용해시키고, 용액을 바람직하게는 10℃ 이하(예를 들면, 2 내지 8℃의 온도)의 온도로 냉각하며, 임의로 침전된 염을 여과하고, 생성 용액을 건조도까지 증발시킨다.

이 경우에 있어서, 본 발명의 방법이 공업적 규모로 사용될 때는, 단계 v는 간단히 유기 상을 약 50 내지 70중량% 고체의 농도가 얻어질 때까지 농축시키며(건조도까지 증발시키지는 않고), 단계 vi를 수행하기 이전에 5 내지 20중량%의 물, 5 내지 20중량%의 고체 및 나머지 에탄올을 포함하는 조성을 갖도록 에탄올을 첨가하 는 것이 바람직하다. 이런 방식으로 건조 단계가 생략된다.

본 발명에 따라서 수득된 주요 추출물은 한편으로는 5ppm 미만의 알킬페놀(HPLC 분석에 의해 측정)을 포함하고 다른 한편으로는 0.3% 미만의 프로델피니딘(바람직하게는 0.25% 미만, 일반적으로는 0.05 내지 0.25%의 프로델피니딘)을 포함하기 때문에 약품 또는 식품 분야에서(예를 들면, 영양 보충제의 성분으로서) 사용될 수 있다. 게다가, 이들은 또한 친유성 불순물과 폴리사카라이드, 프로델피니딘 이외의 프로안토시아니딘 및 고분자량의 단백질도 조금밖에는 포함하지 않는다.

특히, 프로델피니딘 함량이 낮기 때문에, 본 발명에 따른 주요 추출물은 환자에게 정맥내 경로로 투여하는데 있어서 보다 적합하다. 비교를 하자면, EGb 761(등록상표)과 같은 상업적 추출물은 프로델피니딘을 1.5%까지 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 주요 추출물은 바람직하게는 O-람노피라노실-4-O-D-(트랜스-p-쿠마로일-6"')글루코피라노실옥시-3-테트라히드록시-3',4',5,7-플라보놀(또는 퀘르세틴 3-(6"'-트랜스-p-쿠마로일)-글루코람노사이드) 및 O-람노피라노실-4-O-D-(트랜스-p-쿠마로일-6"')글루코피라노실옥시-3-트리히드록시-4',5,7-플라보놀(또는 켐페롤 3-(6"'-트랜스-p-쿠마로일)-글루코람노사이드)에 상응하는 피크가 함께 크로마토그램 피크 총 면적의 대략 39%를 나타내는 것이다. 특히 본 발명의 주요 추출물은 바람직하게는 O-람노피라노실-4-O-D-(트랜스-p-쿠마로일-6"')글루코피라노실옥시-3-테트라히드록시-3',4',5,7-플라보놀(또는 퀘르세틴 3-(6"'-트랜스-p-쿠마로일)-글루코람노사이 드)에 상응하는 피크가 크로마토그램 피크 총 면적의 대략 20%를 나타내는 것이다. 유사하게 본 발명의 주요 추출물은 O-람노피라노실-4-O-D-(트랜스-p-쿠마로일-6"')글루코피라노실옥시-3-트리히드록시-4',5,7-플라보놀(또는 켐페롤 3-(6"'-트랜스-p-쿠마로일)-글루코람노사이드)에 상응하는 피크가 크로마토그램 피크 총 면적의 대략 19%를 나타내는 것이 바람직할 것이다.

게다가, 본 발명에 따른 방법을 사용하여 얻은 관련 추출물은 0.5% 미만의 프로델피니딘(바람직하게는 0.40% 미만 및 일반적으로는 0.15 내지 0.40%의 프로델피니딘)을 포함할 것이다.

본 발명은 또한 본 발명의 방법에 의해 얻을 수 있는 주요 추출물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 의약품으로서의 상기 주요 추출물, 상기 주요 추출물을 유효 성분으로서 포함하는 제약학적 조성물 및 상기 주요 추출물의 하기 질병으로부터 선택된 질병의 치료 의약품을 제조하기 위한 용도에 관한 것이다: 뇌 및 말초 혈관 질병(예컨대, 혈관 유래의 이명, 아테롬성 동맥경화증, 허혈, 혈전증, 정맥부전증과 관련된 증상, 급성 염증성 정맥 발현 및 치핵 발증과 관련된 증상), 신경변성 질병(예컨대, 알쯔하이머병, 파킨슨병, 헌팅톤 무도병 또는 근위축성측색경화증) 및 노인성의 만성 감각신경 및 인식의 병적 결손(특히 알쯔하이머병 또는 기타 치매를 앓지 않는 노인 환자에서 관찰되는 기억 상실). 최종적으로 본 발명은 상기 주요 추출물의 증식성 질병(특히 암)을 보조적으로 치료하기 위한 의약품을 제조하기 위한 용도에 관한 것이다.

본 발명의 추출물을 포함하는 제약학적 조성물은, 고체 형태, 예컨대 분말, 환제, 과립, 정제, 리포솜, 젤라틴 캡슐 또는 좌약의 형태일 수 있다. 환제, 정제 또는 젤라틴 캡슐은 이 조성물이 환자의 소장까지 분해되지 않은 상태로 통과될 수 있는 충분한 시간 동안 환자 위의 위산 또는 효소 작용으로부터 조성물을 보호할 수 있는 물질로 코팅될 수 있다. 추출물은 또한 국소적으로, 예를 들면 종양의 실제 부위에 투여될 수 있다. 추출물은 서방 방법에 따라서(예를 들면, 서방형 조성물 또는 주입 펌프를 사용하여) 투여될 수 있다. 적절한 고체 지지체는 예를 들면, 칼슘 포스페이트, 마그네슘 스테아레이트, 마그네슘 카르보네이트, 탈크, 당, 락토스, 덱스트린, 전분, 젤라틴, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 소듐 카르복시메틸 셀룰로스, 폴리비닐피롤리딘 및 왁스일 수 있다.

본 발명의 추출물을 포함하는 제약학적 조성물은 또한 액체 형태, 예를 들면 용액, 유탁액, 현탁액 또는 서방형 배합물일 수 있다. 적합한 액체 지지체는 예를 들면, 물, 유기용매, 예컨대 글리세롤 또는 글리콜, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜, 마찬가지로 물 중 그의 비율을 달리한 그의 혼합물일 수 있다.

본 발명에 따른 의약품 투여는 국소, 경구, 비경구 경로, 근육내 주사 등에 의해 수행될 수 있다.

상기한 질병을 치료하기 위해 제공되는 본 발명에 따른 추출물의 투여량은 투여 방법, 치료 환자의 연령 및 체중과 상태에 따라서 변할 수 있으며, 최종적으로 의사 또는 수의사에 의해 결정된다. 환자 또는 수의사에 의해 결정된 양은, 본 명세서에서 "치료학적으로 유효한 양"으로 지칭된다.

의사의 의견 및 본 발명에 따른 주요 추출물의 유효 성분의 주어진 함량을 선결하는 것은 아니지만, 상기 주요 추출물의 5 내지 150mg, 바람직하게는 10 내지 100mg의 일일 투여량(특히 40 내지 80mg, 예를 들면 50 내지 70mg의 일일 투여량)을 인간에게 투여하는 것을 예로서 예상할 수 있다.

본 출원에 있어서, 용어 "대략"은 고려되는 값 부근의 범위를 지칭한다. 본 출원에 있어서, "대략 X"는 X-X의 10% 내지 X+X의 10%의 범위를, 바람직하게는 X-X의 5% 내지 X+X의 5%의 범위를 지칭한다.

특별한 언급이 없는 한, 여기에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 통상의 전문가에 의해 통상적으로 이해되는 바와 같은 의미를 갖는다. 유사하게, 본 명세서에서 언급된 모든 공고, 특허 출원, 모든 특허와 모든 기타 참고문헌이 참고문헌으로 인용된다.

하기 실시예는 본 발명의 방법을 설명하기 위한 것이며, 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 이해되어서는 안된다.

실시예 1

100g의 동결건조 분쇄된 은행나무 잎(4mm 미만의 입자 크기)을 2회 추출하는데, 한번은 800ml 그리고 두번째는 600ml의 88중량%의 에탄올 포함 에탄올-물 혼합물로 각각 60℃에서 1시간 동안 추출했다. 두 추출 단계의 추출물을 여과하고 잎의 잔류물을 회수하고 200ml의 동일한 용매 혼합물로 세정했다. 합한 추출물을 증발시켜서 고체 생성물 함량 대략 35g의 100ml의 부피로 감소시켰다. 350ml의 10중량% 소듐 클로라이드의 수용액을 에탄올 농축물에 첨가하고 증발을 50℃ 감압하에 서 계속하여 잔류 에탄올을 제거했다. 여과 깔때기 중의 솜 뭉치를 통해 경사분리시킨 다음 석션하면서 셀라이트를 통해 여과해서 연한 오렌지색의 투명한 식염수 용액을 진한색 오일로부터 분리했다. 식염수 수용액 중 추출물을 두 부분의 150ml의 n-헵탄으로 세척한 다음 각각 150ml의 에틸 아세테이트로 2회 추출했다. 합한 에틸 아세테이트 상을 50ml의 소듐 클로라이드의 포화 용액으로 세척한 다음 건조도까지 감압하에서 증발시켰다. 건조 추출물을 60ml의 무수 메탄올에 재용해하고, 5℃에서 하룻밤 동안 냉장시킨 다음, 여과하여 임의로 침전된 염을 제거하고, 여액을 건조도까지 증발시켜서 51.7%의 플라본-글리코시드 및 13%의 테르펜-락톤(6.55%의 빌로발라이드)을 포함하는 1.42g의 추출물을 제조했다.

실시예 2

공업용 회전 오븐에서 건조시키고 분쇄하여 얻은 100g의 은행나무 잎(4mm 미만의 입자크기; 1.8중량%의 플라본 글리코시드 및 0.12중량%의 징콜라이드)을 2회 추출하는데, 한번은 800ml 그리고 두번째는 600ml의 80중량%의 에탄올을 포함하는 혼합물로, 각각 60℃에서 1시간 동안 추출했다. 2개 추출 단계의 추출물을 여과하고 잎의 잔류물을 회수하며 200ml의 동일한 용매 혼합물로 세정했다. 합한 추출물을 증발시켜서 고체 생성물 함량 대략 33g의 부피 800ml로 줄였다. 60g의 소듐 클로라이드, 100ml의 물 및 22g의 셀라이트를 에탄올 농축물에 첨가하고 증발을 감압, 50℃에서 계속하여 잔류 에탄올을 제거했다. 수성 농축물을 1시간 동안 10℃로 냉각하고 여과 깔때기 중의 솜 뭉치를 통한 경사분리 및 그 다음의 셀라이트 층으로 피복된 프릿에서의 석션 여과에 의해 연한 오렌지색의 투명한 식염수 용액을 진한색 오일로부터 분리했다. 식염수 수용액(∼300ml) 중 추출물을 두 부분의 125ml의 n-헵탄으로 세척한 다음 각각 125ml의 에틸 아세테이트로 2회 추출했다. 합한 에틸 아세테이트 상을 50ml의 소듐 클로라이드 포화 용액으로 세척한 다음 건조도까지 감압 증발시켰다. 건조 추출물을 23ml의 무수 에탄올에 재용해시킨 다음, 4℃의 냉장고에 하룻밤동안 방치하고, 여과하여 임의로 침전된 염을 제거하고, 여액을 건조도까지 증발시켜서 23.6%의 플라본-글리코시드, 39.2%의 테르펜-락톤(24.6%의 징콜라이드 A, B 및 C와 14.5%의 빌로발라이드 포함) 및 대략 0.14%의 프로델피니딘을 포함하는 1.06g의 추출물을 제조했다.

실시예 3

실시예 2의 추출물 제조 방법에 있어서 n-헵탄으로의 세척 및 에틸 아세테이트로의 추출의 연속적 단계 후에 회수된 수성 상 식염수를 두 부분의 125ml의 에틸 아세테이트-에탄올 1:1 혼합물을 사용하여 액체-액체 추출했다. 회수된 유기 상을 건조도까지 증발시켰다. 건조 추출물을 무수 에탄올 중에 용액 총 중량에 대하여 5중량%의 건조 추출물의 농도를 갖도록 용해시켰다. 혼합물을 4℃ 냉장고에서 하룻밤 동안 방치한 다음 여과지로 여과했다(고체를 4℃에서 무수 에탄올로 세정했다). 건조도까지 증발시킨 후에, 31.88%의 플라본-글리코시드 및 0.67%의 테르펜(0.50%의 징콜라이드 A, B 및 C와 0.17%의 빌로발라이드 포함)과 대략 0.21%의 프로델피니딘을 포함하는 추출물을 얻었다.

본 발명에 따른 추출물의 특성화

A) HPLC:

본 발명에 따른 추출물은 하기 용출 구배의 고성능 액체 크로마토그래피 방법(HPLC)을 사용하여 특성화할 수 있었다.

장치

-하기 조건에 적합한 액체 상 크로마토그래프 및 장치

-실험용 유리기구

-0.1mg 정확도의 저울

시약

-순수한 물(HPLC 품질)

-아세토니트릴(HPLC 품질)

-이소프로판올(HPLC 품질)

-시트르산(HPLC 품질)

-메탄올 R

-대조용 표준 은행나무 추출물.

방법

분석할 추출물 200mg을 10ml의 메탄올에 용해시켜서 시험 추출물의 용액을 제조했다. 동시에, 200mg의 대조용 표준 은행나무 추출물(EGb 761(등록상표))을 10ml의 메탄올에 용해시켜서 대조용 용액을 제조했다

하기 크로마토그래피 조건이 사용되었다:

-구배 유형: 15분간의 2차 이동상의 0% 내지 100%의 선형 구배 다음의 5분간의 2차 이동상. 컬럼을 1차 이동상으로 10분간 재평형화한 후에 다음을 주입했다.

-1차 이동상: 정제수----------1000ml

아세토니트릴----200ml

이소프로판올----30ml

시트르산--------4.92g

-2차 이동상: 정제수----------1000ml

아세토니트릴----470ml

이소프로판올----50ml

시트르산--------6.08g

-유속: 1.5ml/분

-검출: UV 360nm

-컬럼: 스테인리스 스틸, 15cm, 직경 4.6mm; 크로마토그래피용 실리카겔 Macherey-Nagel R Nucleosil 5C18 또는 동등물(5㎛)로 충전.

-주입 부피: 5㎕

결과

실시예 2에서 얻은 추출물에 대한 크로마토그램을 도 1에 나타내고, 실시예 3에서 얻은 추출물에 대한 크로마토그램을 도 2에 나타내었다.

각각의 피크에 대하여 결정된 성분을 하기 표 I(실시예 2의 추출물) 및 II(실시예 3의 추출물)에 기재했다. 상기 조건에서 대략 13 내지 15분의 체류 시간을 갖는 주요 피크들은 각각 O-람노피라노실-4-O-D-(트랜스-p-쿠마로일-6"')글루코피라노실옥시-3-테트라히드록시-3',4',5,7-플라보놀(또는 퀘르세틴 3-(6"'-트랜스-p- 쿠마로일)-글루코람노사이드) 및 O-람노피라노실-4-O-D-(트랜스-p-쿠마로일-6"')글루코피라노실옥시-3-트리히드록시-4',5,7-플라보놀(또는 켐페롤 3-(6"'-트랜스-p-쿠마로일)-글루코람노사이드)에 해당되었다.

피크 번호	R.T.(분)	통합 유형	표면적	% 표면적
1	5.66	BV	323169.34	1.63
2	6.09	VV	40920.21	0.21
3	7.12	VV	69832.25	0.35
4	7.53	VV	335574.32	1.69
5	7.86	VV	119797.71	0.60
6	8.42	VV	2633527.95	13.25
7	9.38	VV	272916.32	1.37
8	9.76	VV	1226466.81	6.17
9	10.04	VV	72124.84	0.36
10	10.29	Vv	97259.69	0.49
11	10.61	vv	2967432.21	14.93
12	10.88	vV	343065.16	1.73
13	11.25	VV	61980.66	0.31
14	11.58	VV	405705.79	2.04
15	12.02	VV	193158.96	0.97
16	12.32	VV	295426.85	1.49
17	12.66	VV	139571.25	0.70
18	13.25	VV	39600621.99	19.93
19	13.79	Vv	145778.77	0.73
20	13.99	vV	38952.25	0.20
21	14.26	VV	39634.91	0.20
22	14.67	VV	119350.40	0.60
23	14.87	VV	85122.51	0.43
24	15.18	VV	3789171.34	19.07
25	15.67	VV	60575.37	0.30
26	15.94	VV	118616.10	0.60
27	16.51	VV	208977.01	1.05
28	16.69	VV	345205.90	1.74
29	17.13	VV	206765.44	1.04
30	17.32	VV	241246.27	1.21
31	17.68	Vv	95087.16	0.48
32	17.80	vV	311413.97	1.57
33	18.08	VV	108167.40	0.54
34	18.40	VV	103158.38	0.52
35	18.88	VV	19884.37	0.10
36	19.15	VV	9701.13	0.05
37	19.35	VV	18389.23	0.09
38	19.75	VV	109237.26	0.55
39	20.42	VV	21754.52	0.11
40	20.82	VV	13348.93	0.07
41	21.35	VV	26491.23	0.13
42	21.82	VV	55867.45	0.28
43	22.18	VV	14634.07	0.07
44	22.58	VB	7095.01	0.04
총			19872178.50

피크 번호	R.T.(분)	통합 유형	표면적	% 표면적
1	4.25	BV	1082912.49	3.74
2	4.84	VV	853793.45	2.95
3	5.52	VV	767098.18	2.65
4	6.06	VV	1634400.29	5.68
5	6.59	VV	53647.35	0.19
6	6.91	VV	127266.30	0.44
7	7.37	VV	5275614.83	18.22
8	7.69	VV	1062334.77	3.67
9	8.28	VV	1918663.93	6.63
10	8.95	Vv	103523.93	0.36
11	9.23	vV	1390204.37	4.80
12	9.63	VV	3866788.04	13.35
13	9.87	VV	2102182.30	7.26
14	10.48	VV	968935.87	3.35
15	10.97	VV	314304.16	1.0
16	11.46	VV	1167341.28	4.03
17	11.86	VV	143179.61	0.49
18	12.20	VV	193515.76	0.67
19	12.56	Vv	91823.99	0.32
20	13.13	vV	1197144.99	4.13
21	13.62	VV	94540.18	0.33
22	13.99	VV	33698.24	0.12
23	14.34	VV	78763.83	0.27
24	14.59	VV	334542.58	1.16
25	15.19	VV	944041.64	3.26
26	15.45	VV	244838.93	0.85
27	15.84	VV	473019.80	1.51
28	16.39	VV	569694.64	1.97
29	16.55	Vv	323620.29	1.12
30	16.72	vV	255311.37	0.88
31	17.02	VV	370249.91	1.28
32	17.55	Vv	106207.91	0.37
33	17.69	vV	338307.55	1.17
34	17.97	VV	134115.60	0.46
35	18.33	VV	148609.32	0.51
36	18.78	Vv	31564.17	0.11
37	18.91	vV	17047.61	0.06
38	19.20	VV	25147.79	0.09
39	19.64	VV	67214.23	0.23
40	20.06	VV	16329.48	0.06
41	20.65	VV	11266.06	0.04
42	21.23	VV	10502.29	0.04
43	21.62	VV	40624.23	0.14
총			28956906.57

B) 프로델피니딘 함량의 측정:

본 발명 추출물의 프로델피니딘 함량을 하기에서 개시한 바와 같이 평가했 다.

대략 50mg의 추출물을 25ml의 이소프로판올 및 3N 염산 용액의 혼합물(5/1 v/v)에 용해시켰다. 수득한 혼합물 5ml를 액체-기밀 마개로 밀봉된 10ml 플라스크로 옮기고 플라스크를 끓는 물에 45분간 담가두었다. 20℃로 냉각한 후에, 이소프로판올 및 3N 염산 용액의 혼합물을 첨가하여 부피를 10ml로 증가시켰다. 흡광도를 556nm에서 측정하고 프로델피니딘의 백분율을 하기 식으로 계산했다:

% 프로델피니딘 = A x 86.206897/B

A: 556nm에서의 흡광도

B: 샘플의 mg

결과에 대한 부정확성을 줄이기 위해, 실험을 3회 반복하고 얻은 결과로부터 평균값을 계산했다.

본 발명에 따른 추출물의 약리학적 성질

본 발명에 따른 추출물의 약리학적 성질을 증명하기 위해, 하기 시험을 수행할 수 있다.

1) 세포증식

세포주

MDA-231 유방암 세포주를 롬바르디 암 센터(Lombardi Cancer Center)(조지타운 유니버시티 메디칼 센터(Georgetown University Medical Center))로부터 입수했다. 이들 세포주를 폴리스티렌 배양 디쉬(코닝(Corning))에서 배양하고 10%의 소 태아 혈청(FBS)으로 보충된 달베코 변형 이글 배지(DMEM) 중에서 증식시켰다.

결합 시험

5ml의 포스페이트 완충 식염수 용액(PBSS)에 배산시켜서 MDA-231 세포를 분산시킨 다음 500g에서 15분간 원심분리했다. 원심분리 세포를 PBSS에 재현탁시킨 다음 그의 단백질 함량을 측정하기 위해 시험했다. [³H]PK 11195 시험을 파파도포울로스(Papadopoulos) 등의 문헌[J. Biol. Chem.(1990), 265, 3772-3779] 및 하드윅(Hardwick) 등의 문헌[Cancer Res. (1999), 59, 831-842]에 기술된 바와 같이 수행할 수 있었다. [N-메틸-³H]PK 11195 또는 (1-(2-클로로페닐)-N-메틸-N-(1-메틸-프로필)-3-이소퀴놀린 카르복사미드를 듀퐁-뉴 잉글랜드 뉴클리어(Du Pont-New England Nuclear, 미국 델라웨어주 윌밍톤)로부터 입수하고 PK 11195는 리서치 바이오케미칼즈 인코포레이티드(Research Boiochemicals Incorporated, 미국 매사추세츠주 나틱)로부터 입수했다. 얻은 결과는 프로그램 LIGAND(문손(Munson) 및 로바드(Robard)의 문헌[Anal. Biochem. (1976), 72, 248-254])를 사용하여 분석했다.

노던(Northern) RNA 분석

실시예 1 또는 실시예 2의 추출물 또는 EGb 761(등록상표)(대조용)로 처리된 MDA-231 세포의 말초형 벤조디아제핀 수용체(PBR)의 mRNA 발현을 하드윅 등의 문헌[Cancer Res, (1999), 59, 831-842]에 기술되어 있는 노던 분석을 사용하여 평가할 수 있었다. 총 세포 RNA를 시약 RNAzol B(TEL-TEST Inc., 미국 텍사스 프렌즈우드) 및 클로로포름을 사용하여 분리했다. 20㎍의 총 RNA를 1% 아가로스 겔에 통과시키고 나일론 막(S&S Nitran, 사이허 & 슈엘(Scheicher & Schuell), 미국 뉴 햄프셔주 키니)으로 하룻밤 동안 이동시켰다. 길이 0.2kb PBR의 인간 cDNA 단편(인간 PBR의 완전한 서열을 포함하는 pCMV5-PBR 플라스미드 벡터로부터 유래)을 DNA 프라이머의 랜덤 동정 시스템(라이프 텍크놀로지스(Life Technologies), 미국 메릴랜드주 가이더스버그)을 사용하고 [α-³²P]d CTP를 사용하여 표지했다. 사용된 잡종형성 조건은 전술한 참고문헌에 기술되어 있다. 블롯을 X-OMAT AR 필름(코닥(Kodak), 미국 뉴욕주 로체스터)에 -70℃에서 4-48시간 동안 노출시켜서 오토라디오그래피를 수행했다. PBR mRNA의 정량을 SigmaGel 소프트웨어(잔델 사이언티픽(Jandel Sceintific, 미국 캘리포니아주 상 라펠)를 사용하여 수행했다.

세포 증식

MDA-231 세포를 96-웰 플레이트(코닝, 미국 뉴저지주)에 0.1% FBS로 보충된 DMEM 중 웰당 대략 10,000세포(24시간 배양) 또는 웰당 500세포의 농도(48시간 배양)로 넣었다. 실시예의 화합물 또는 대조용 화합물(EGb 761(등록상표))의 농도를 변화시키면서 10% FBS 중에서 세포를 상기한 시간 동안 배양했다. 세포 증식 기간의 차이를 혼입된 5-브로모-2'-데옥시우리딘(BrdU)의 양을 측정하여 분석했는데, 이것은 ELISA BrdU 장치(베링거 만하임(Boehringer Manheim), 미국 인디아나주 인디애나폴리스)를 사용하여 측정했다. BrdU의 혼입을 450nm의 파장(대조용:690nm)에서 측정했다.

2) 글루타메이트 유도 신경독성

본 발명에 따른 추출물을 다음과 같이 시험할 수 있었다: 쥐 뇌 뉴론을 상기 실시예 1 또는 2의 추출물의 농도를 증가시키면서 처리하거나 처리하지 않은 다음, 30분 후에 250μM의 농도의 글루타메이트에 노출시켰다. 글루타메이트의 독성을 50% 저해하는 투여량(IC₅₀으로 지정)을 평가한 다음 플라본-글리코시드 및 테르펜 락톤이 덜 풍부한 EGb 761(등록상표)과 같은 추출물(즉 ml 당 100㎍의 EGb 761(등록상표))에 대해 얻은 것과 비교할 수 있었다.

3) 세포독성

본 발명에 따른 추출물의 세포 생존도에 대한 효과를 HT 22 세포주(생쥐 해마 세포)에 대해 연구할 수 있었다. 세포주의 생존도는 상기 실시예 1 또는 실시예 2의 추출물의 투여량을 증가시키면서 처리한 세포에 의해 방출된 LDH의 양을 측정하는 것과 트립판(Trypan) 블루 배제 시험에 의해 평가했다.

세포주

HT-22 세포주는 설크 인스티튜트 포 바이올로지칼 리서치(Salk Institute for Biological Research, 미국 캘리포니아주 라졸라)로부터 입수했다. 이 세포주를 하기에 완전 배지로 지칭되는 10%의 소 태아 혈청(FBS)으로 보충된 달베코 변형 이글 배지(DMEM) 중에 37℃에서 보존했다.

시험 프로토콜

HT-22 세포를 96-웰 플레이트에 완전 배지 중 웰당 5.10³ 세포의 농도로 넣었다. 24시간 후에, 실시예의 추출물을 DMEM에 용해시키고 10, 25, 50, 100, 250, 500 및 1000㎍/ml의 농도로 첨가했다; 추출물을 24 또는 48시간 동안 접촉시켰다. 제조사에 의해 제공된 사용설명서에 따라서 Promega 분석 키트를 사용하여 LDH 측정을 수행했다. 흡광도를 470nm에서 읽었다. Triton X-100을 사용하여 세포를 완전히 용해시킨 후에 최대 LDH 방출을 얻었다. 트립판 블루 배제 시험에 의해 평가되는 생존도 측정을 위해, 세포를 6-웰 플레이트에 넣고 실시예 1 또는 실시예 2의 추출물을 100㎍/ml의 농도로 24시간 동안 첨가했다.

세포를 칼슘 및 마그네슘이 없는 포스페이트 완충 용액으로 세척하고 5분간 37℃에서 트립신에 노출시켰다. 완전 배지로 반응을 정지시키고 0.04%의 트립판 블루를 세포 현탁액에 첨가했다. 균주(즉, 살아 있는 세포)를 배제한 세포의 수를 헤마토사이토미터를 사용하여 측정했다. 세포 생존율을 다음과 같이 계산했다: 생존 세포의 수(염색 안된 세포)/세포의 총 수(염색된 세포 및 염색 안된 세포) X 100.

Claims

i. 은행나무 잎의 건조 분획을 최대 20중량%의 물을 포함하는 에탄올 중에서 추출하고;

ii. 추출물을 감압하에서 소듐 클로라이드 수용액 존재하에 농축하고, 나머지 투명한 용액으로부터 오일을 제거하고;

iii. 잔류 수용액을 n-헥산, n-헵탄 또는 시클로헥산으로의 액체-액체 추출에 의해 세척하고;

iv. 세척된 수성 상을 에틸 아세테이트로 액체-액체 추출하고;

v. 단계 iv에서 얻은 에틸 아세테이트 상을 소듐 클로라이드 용액으로 세척한 다음, 세척된 에틸 아세테이트 상을 증발에 의해 건조시키는 연속 단계를 포함하고,

크로마토그래피 단계를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는,

은행나무 잎 추출물의 제조 방법.
삭제
제 1 항에 있어서, 단계 i의 은행나무 잎의 건조 분획을 은행나무 잎의 건조 분말로 대체하는 방법.
제 1 항에 있어서, 단계 i의 추출을 10 내지 20중량%의 물을 포함하는 에탄올을 사용하여 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 단계 iii의 세척을 n-헵탄으로 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 단계 ii 및 v에서 사용된 소듐 클로라이드의 수용액이 10중량% 이상의 소듐 클로라이드의 농도를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 단계 i 내지 v 후에 vi. 건조 추출물을 에탄올에 용해시키고, 용액을 냉각시킨 다음, 침전된 염을 여과하고, 생성 용액을 증발에 의해 건조시키는 단계를 더 포함하는 방법.
동결 건조된 은행나무 잎의 건조 분획으로 출발하여 42 중량% 내지 62 중량%의 플라본 글리코시드 및 3 중량% 내지 23 중량%의 테르펜-락톤을 포함하는 추출물을 얻도록 수행되는 것을 특징으로 하는 제 1 항에 따른 제조 방법에 의해 얻을 수 있는 은행나무 잎 추출물.
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제 8 항에 있어서, 52중량%의 플라본-글리코시드 및 13중량%의 테르펜-락톤을 포함하는 것을 특징으로 하는 은행나무 잎 추출물.
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제 8 항에 따른 추출물을 포함하는, 암을 치료하기 위한 보조 요법 제공용 의약품.