RO122244B1 - Procedeu de obţinere a acidului oleanolic în stare pură, din herba viscum album - Google Patents
Procedeu de obţinere a acidului oleanolic în stare pură, din herba viscum album Download PDFInfo
- Publication number
- RO122244B1 RO122244B1 ROA200600292A RO200600292A RO122244B1 RO 122244 B1 RO122244 B1 RO 122244B1 RO A200600292 A ROA200600292 A RO A200600292A RO 200600292 A RO200600292 A RO 200600292A RO 122244 B1 RO122244 B1 RO 122244B1
- Authority
- RO
- Romania
- Prior art keywords
- oleanolic acid
- extract
- acid
- ratio
- resulting
- Prior art date
Links
Landscapes
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
Abstract
Invenţia se referă la un procedeu de obţinere a acidului oleanolic în stare pură, din Herba Viscum album, ce constă în aceea că materia primă vegetală se usucă, se macină, se supune extracţiei la un raport de 1/20 m/v, cu un amestec constând din 70...80% acetonă şi 20...30% apă structurată "I", cu pH acid = 1,8...2,6, timp de 12 h, la temperatura ambiantă de 15...30°C, se purifică, se filtrează, se concentrează sub vid la temperatura de 35...40°C, iar precipitatul obţinut, constituind Extractul bioactiv I brut, cu un conţinut de 25% acid oleanolic, se purifică prin dizolvare la reflux, se filtrează, se concentrează, apoi se tratează, se filtrează, se usucă la 105°C şi se pulverizează, rezultând Extractul bioactiv I purificat, sub formă de pulbere, cu un conţinut de 70% acid oleanolic, 5% alţi acizi triterpenici şi 3% flavonide, care se dizolvă la reflux în alcool etilic de 96°, se tratează cu 0,2...0,3% m/v cărbune activ, se agită timp de 1 h la 40...50°C, se concentrează sub vid la 35...40°C, se tratează cu apă structurată "I" în raportul 9:1 v/v, iar suspensia rezultată se menţine 24 h la 5...10°C, se filtrează sub vid la 35...40°C, spălându-se cu 10% apă distilată până la pH neutru; pulberea obţinută constituie acidul oleanolic în stare pură, cu un conţinut de 97...99%.
Description
Prezenta invenție se referă la un procedeu de obținere a acidului oleanolic în stare pură, din planta Viscum album (vâsc), cu utilizare în terapeutica umană și veterinară, precum și în dermatocosmetică.
Planta Viscum album (vâsc) - familia Viscaceae - crește ca parazită pe diferiți arbori gazdă (măr, brad, pin, stejar, frasin, mesteacăn etc.), fiind apreciată încă din antichitate pentru calitățile sale terapeutice de către medicina tradițională din țările europene și asiatice, care o utilizează și în prezent, sub formă de pulbere, extracte apoase, hidroalcoolice și uleioase, drept remediu pentru tratarea unor maladii precum: hipertensiune, ateroscleroză, artroze sau scăderea imunității în cursul bolilor infecțioase sau neoplazice.
Cu privire la aplicarea vâscului în terapeutica actuală, sunt cunoscute produse farmaceutice care conțin extracte apoase din vâsc, condiționate ca soluții injectabile, comercializate sub diverse mărci înregistrate (de exemplu: Iscador, Helixor, Lektinol etc.) și utilizate în clinicile de oncologie europene și americane, pentru efectele lor imunomodulatoare, în cadrul tratamentului curativ al unor afecțiuni tumorale benigne sau maligne, precum și profilactic pentru prevenirea recidivelor tumorale și metastazelor.
Cu toate că reputația terapeutică a vâscului a rămas constantă de-a lungul secolelor, abia în ultimele două decenii, extractele din vâsc au făcut obiectul unor cercetări științifice fitochimice și farmacologice, în scopul elucidării componenței și structurii chimice a substanțelor bioactive existente în speciile de vâsc, precum și a efectelor farmacologice ale acestora (Ciulei I., Plante medicinale - Fitochimie și Fitoterapie, 1998, voi. 2, pag. 643-646, Editura Medicală, București; SteineggerE., Pharmakognosie, 1992, pag. 644-646, SpringerVerlag, Berlin; Kuttan G., Immunomodulatory activity of a peptide isolated from Viscum album extract., Immunol. Invest, 1992, 21, 285-296).
Cercetările fitochimice referitoare la compoziția chimică a vâscului au evidențiat drept componente bioactive specifice următoarele grupe de substanțe naturale:
- Lectinele sunt glicoproteine cu structură chimică complexă și greutate moleculară mare (circa 60000), fiind alcătuite din catene glicopeptidice, la care cantitatea de substanță proteică variază dependent de arborele gazdă, iar conținutul în componenta glucidică este de asemenea variabil, circa 10...20%.
Diferențele structurale ale catenelor glicopeptidice determină o diferențiere a acțiunii lor biologice, evidențiindu-se catena A - cu efecte toxice, datorate inhibării sintezei proteice de ARN și catena B - care activează limfocitele T, rezultând un efect de stimulare a răspunsului imun;
- Viscotoxinele - sunt un amestec de polipeptide cu greutate moleculară mică, alcătuite din secvențe de 46 aminoacizi, dintre care viscotoxinele A2, A3 și B sunt cele mai studiate. Prezintă efecte cardiotoxice și citotoxice marcate, toxicitatea lor fiind atribuită inhibării sintezei proteice de ADN;
- Viscumproteinele - sunt o fracțiune complexă de proteine cu greutate moleculară = 14.000...125.000, care prezintă o acțiune citostatică asupra tumorilor prin influențarea sintezei de ADN în celulele tumorale, precum și o acțiune imunostimulatoare datorată efectului de redresare a timusului - organ responsabil de apărarea imunitară;
- Acidul viscic și viscina - reprezintă un complex de polizaharide obținut din fructele și ramurile de vâsc, cu structură chimică insuficient elucidată (arabinogalactan, galacturonan), care prezintă o activitate imunostimulatoare asupra macrofagelor, precum și efecte antiinflamatoare locale.
Alături de aceste componente bioactive specifice, vâscul conține și o multitudine de componente nespecifice, întâlnite și la alte plante medicinale, care prin studii analitice au fost evidențiate ca aparținând următoarelor clase de substanțe vegetale:
- aminoacizi, amine și alcaloizi;
- acizi polifenol carboxilici: acidul cafeic, ferulic, vanilie, siringic;
RO 122244 Β1
- flavonozide: cvercetol, mono-, di- și triglicozide ale cvercetolului și luteolinei; 1
- triterpenoide oxigenate pentaciclice: lupeol (β-viscol), β-amirină, acid oleanolic, ursolic, betulină, acid betulinic; 3
- fitosteroli: β-sitosterol.
Cercetările farmacologice referitoare la activitatea biologică a componentelor bio- 5 active specifice din vâsc au fost efectuate cu precădere asupra unor extracte apoase, care conțin majoritatea compușilor hidrosolubiIi: lectine, viscotoxine, acid viscic, alcaloizi, fiind pre- 7 lucrate prin tehnici de purificare uzuale, în scopul obținerii unui extract standardizat din punct de vedere al efectelor imunomodulatoare sau antitumorale, evidențiate prin studii farma- 9 cologice preclinice in vitro și/sau in vivo.
De aceea, majoritatea brevetelor de invenție care prezintă procedee de obținere a 11 unor bioproduse din vâsc se referă la extracte apoase, preparate prin extracția cu apă a materialului vegetal, recoltat de la un anumit arbore gazdă, urmat de purificarea și standardi- 13 zarea lor biologică. Dintre brevetele de invenție și cererile de brevet recente care prezintă procedee de obținere a unor produse bioactive din vâsc, se menționează: 15
- Brevetul de invenție US 6 846 913/2005.01.25 prezintă un procedeu de obținere a unui extract din vâscul coreean (Viscum album coloratum), preparat prin extracție cu apă, 17 centrifugarea extractului apos, filtrare sterilă și liofilizare, rezultând o pulbere brună, care se dizolvă în soluție apoasă cu tampon de fosfați la pH=7,4, din care se separă o fracție pro- 19 teică, care după cromatografie pe coloană de Sepharoză și dializă, conduce la obținerea unui complex de lectine cu efecte imunomodulatoare și antitumorale, evidențiate prin inhiba- 21 rea creșterii tumorilor și a metastazării acestora;
- Brevetul de invenție CN 1 299 826/2001.06.20 se referă la un procedeu de 23 preparare a unui extract din vâscul coreean, standardizat în glicoproteine, cu un conținut de
0,1 ...0,8% proteine și 0,05...0,4% glucide, care prezintă o activitate antitumorală superioară 25 produsului obținut în mod similar din vâscul european (Viscum album), fiind aplicabil în terapeutică după condiționarea sa ca și componentă bioactivă a unei compoziții medicamen- 27 toase;
- Cererea internațională de brevet de invenție WO 9711967 din 1997.04.03 descrie 29 un procedeu de obținere a unui extract din Viscum album, caracterizat prin conținutul său în lectine în rația: ML1:ML2:ML3 = 0,1-90:90-0,1:0-3. Procedeul de preparare a extractului pre- 31 vede extracția apoasă a plantei întregi (herba) la temperatură rece cu soluție salină izotonică (de exemplu soluție de clorură de sodiu), urmat de filtrare, îndepărtarea proteinelor din filtrat 33 prin precipitare cu sulfat de amoniu și dializa filtratului rezultat, pentru îndepărtarea componentelor cu masă moleculară joasă. Extractul astfel obținut constituie bioprodusul finit, care 35 se diluează opțional cu apă, înainte de utilizarea sa în terapeutică;
- Cererea internațională de brevet WO 0160389/2001.08.23 prezintă un procedeu de 37 obținere a unui extract din vâsc, preparat prin macerarea în apă sau soluție salină cu tampon de fosfați a plantei întregi sau numai a frunzelor sau a fructelor de vâsc, urmat de separarea 39 soluției extractive prin centrifugare sau filtrare. Se menționează că extractul apos rezultat conține cel puțin una din componentele: lectine, viscotoxine, alcaloizi, flavonoide, lignină, 41 amine, acizi fenil-carboxilici și polizaharide, fiind destinat tratării maladiilor autoimune precum: diabetul tip I (autoimun), psoriazis, artrita reumatoidă, scleroza multiplă, lupusul 43 eritematos și glomerulonefrita;
- Cererea internațională de brevet de invenție WO 9632122/1996.10.17 și brevetele 45 de invenție: US 5 547 674/1996.08.20, US 5 565 200/1996.10.15; US 5 637 563/1997.06.10 și US 5 780 037/1998.07.14, aparținând aceluiași autor T. Khwaja, prezintă diferite variante 47 de preparare și standardizare a unor extracte apoase din vâscul coreean (Viscum album coloratum), și din vâscul european (Viscum album L). Ca solvent de extracție a materialului 49
RO 122244 Β1 vegetal uscat și pulberizat se utilizează apa purificată sau o soluție apoasă salină conținând clorură de calciu sau de sodiu, pentru eficientizarea procesului de extracție a proteinelor din țesutul vegetal. în același scop se efectuează extracția apoasă în mediu tampon la pH=7,8. Extractul apos rezultat este menținut la temperatura de4°C, timp de 2 săptămâni în absența aerului (atmosferă de azot), după care reziduul insolubil depus se îndepărtează prin filtrare, iar extractul apos se refiltrează în condiții sterile și se ambalează în containere sterilizate, de unde se prelevează pentru diluare cu apă, în funcție de concentrația în glicoproteine (lectine).
Pentru evaluarea analitică a conținutului extractului în lectine, viscotoxină și alcaloizi, soluția extractivă apoasă primară se tratează cu 70% sulfat de amoniu, când rezultă un precipitat care se izolează prin centrifugare, servind la separarea lectinelor și viscotoxinei pe coloană de Sepharoză. Soluția supernatantă de la precipitarea cu sulfat de amoniu conține fracția alcaloidică și se liofilizează, alcaloizii fiind extrași din liofilizat cu cloroform, iar extractul organic rezultat se concentrează la reziduu, care constituie totalul alcaloizilor.
Nu se indică structura chimică a acestora, pentru a se putea aprecia gradul lor de toxicitate și nu se prezintă puritatea lor, evaluată prin metode analitice cantitative.
Standardizarea biologică a extractului se efectuează prin evaluarea activității sale inhibitorii in vitro față de culturile de celule leucemice L1210 sau alte tipuri de celule tumorale. Se menționează că extractul apos, după evaluarea conținutului în lectine și a activității antitumorale, poate fi deshidratat și păstrat ca pulbere, care se redizolvă în apă, în momentul administrării pe cale injectabilă.
Ca indicații terapeutice sunt prevăzute tulburările sistemului imun supresat, în special maladia SIDA, precum și afecțiunile tumorale maligne; calea de administrare este exclusiv parenterală (subcutan, intramuscularsau intravenos), dozele nefiind generalizate, ci stabilite individual, prin protocol clinic pentru fiecare pacient;
- Brevetul de invenție CN1 448 397/2003.10.15 se referă la un procedeu de extracție a unui total de flavone glicozidate din herba de vâsc, care prevede extracția cu alcool sau apă, separarea extractului prin filtrare și purificarea lui prin trecere pe o coloană de adsorbție cu rășini, care este eluată cu alcool, eluatele alcoolice fiind concentrate pentru obținerea unei pulberi care se redizolvă în alcool, iar filtratul alcoolic se concentrează, rezultând un total de flavone purificat, care se utilizează ca și component de bază activ terapeutic, aplicabil pentru prevenirea și tratarea tulburărilor vasculare cerebrale, cardiace și a hipertensiunii. Nu se menționează componența totalului flavonoidic, structura chimică a componentelor, puritatea produsului, evaluată prin metode analitice cantitative și studiile farmacologice preclinice efectuate în vederea evidențierii bioactivității produsului;
- Brevetul de invenție CN 1 417 208/2003.05.14 prezintă un procedeu de preparare a unui bioprodus anticarcinogen din vâsc, pe bază de alcaloizi, care prevede extracția materialului vegetal uscat cu alcool etilic la reflux, concentrarea extractului alcoolic la presiune redusă până la reziduu, reluarea acestuia cu soluție de acid clorhidric, pentru dizolvarea alcaloizilor sub formă de săruri (clorhidrați), tratarea soluției acide cu soluție de amoniac concentrat, când alcaloizii redevin baze libere, extracția acestora cu cloroform, concentrarea extractului cloroformic și separarea totalului alcaloidic cristalizat.
Ca și în cazul brevetului de invenție precedent, nu se menționează componența totalului alcaloidic, structura chimică a componentelor, puritatea produsului, evaluată prin metode analitice cantitative și studiile farmacologice preclinice efectuate pentru evidențierea activității antitumorale de inhibare a cancerului hepatic, stomacal, esofagian și mamar.
Datele analitice insuficiente referitoare la caracterizarea fizico-chimică a produsului implică aspecte farmacotoxicologice, având în vedere că alcaloizii, indiferent de structura lor chimică, sunt printre cele mai toxice substanțe din chimia vegetală.
.ψ».«îh.. iiwi.i. eșua «KiiiiiilMMiM *ii tlHM*»*»»-*'··· '
RO 122244 Β1
Din datele prezentate cu privire la stadiul tehnicii în domeniul obținerii unor produse 1 bioactive din vâsc, în vederea aplicării lor în terapeutică, rezultă cele ce urmează:
Majoritatea brevetelor de invenție prezintă procedee de obținere a unor bioproduse 3 lichide, rezultate prin extracția cu soluții apoase a materialului vegetal, recoltat numai de la o anumită plantă gazdă, urmat de condiționarea lor ca soluții injectabile. Ele sunt caracteri- 5 zate analitic prin evaluarea conținutului în lectine, viscotoxine și alcaloizi și standardizate biologic prin studii pe linii celulare tumorale din punct de vedere al activității inhibitorii în cursul 7 unor procese neoplazice. Deși în terapia oncologică actuală din țările europene se folosesc extracte apoase din vâsc, cu efecte imunomodulatoare, administrate numai parenteral (de 9 exemplu: Iscador, Helixor, Lektinol), totuși utilizarea acestor preparate ca medicație adjuvantă în cancer nu este unanim acceptată de medicii oncologi, datorită unor inconveniente 11 terapeutice, dintre care:
- necunoașterea exactă a totalității componentelor biologic active și insuficienta 13 caracterizare analitică a acestora, ceea ce face dificilă stabilirea corectă a dozelor terapeutice; 15
- studii farmacologice preclinice incomplete, care neelucidând mecanismul de acțiune și dozele terapeutic-active minime necesare, limitează aplicabilitatea clinică a bioproduselor, 17 bazată în exclusivitate pe evaluarea răspunsului terapeutic, în urma creșterii progresive a dozelor pentru fiecare pacient; 19
- efecte adverse manifestate prin: reacții alergice locale sau generalizate, activarea unor procese inflamatorii, tumefieri ale ganglionilor limfatici regionali. 21
Brevetele de invenție care prezintă metode de obținere a unor bioproduse din vâsc conținând un total de flavone glicozidate sau un total alcaloidic nu prezintă suficiente date 23 fizico-chimice privind caracterizarea analitică a componentelor bioactive și nici date farmacotoxicologice, care să asigure aplicabilitatea lor în terapeutica oncologică, conform preve- 25 derilor metodologiei actuale de avizare a unor noi medicamente din Uniunea Europeană și SUA. 27
Brevetele de invenție mai sus menționate, care prezintă procedee de obținere a unor extracte apoase din vâsc, ce conțin componente bioactive polare, hidrosolubile (lectine, 29 viscotoxine) nu valorifică și componentele nepolare insolubile în apă (de exemplu: acidul oleanolic, P-sitosterolul etc.) și rămân neextrase în plantă, deși prezintă un semnificativ 31 interes terapeutic. Astfel, deși în medicina tradițională vâscul se întrebuințează ca remediu pentru tratarea aterosclerozei și hipertensiunii, extractele apoase injectabile, utilizate la ora 33 actuală în terapeutică, nu posedă aceste efecte farmacologice.
Nu se cunosc procedee de valorificare a vâscului prin obținerea acidului oleanolic în 35 stare pură, deși activitatea sa farmacologică complexă, evidențiată prin numeroase studii farmacologice publicate, este în concordanță cu majoritatea efectelor terapeutice atribuite 37 vâscului de medicina tradițională din diverse țări.
Nu se cunosc nici procedee de obținere a unor produse bioactive din vâsc, care să 39 conțină drept component principal acidul oleanolic, alături de alte componente bioactive.
Problema tehnică pe care o rezolvă prezenta invenție este obținerea acidului 41 oleanolic în stare pură, din planta Viscum album (vâsc).
Procedeului de obținere a acidului oleanolic în stare pură, conform invenției, constă 43 în aceea că materia primă vegetală se usucă până la 5...6% umiditate, se macină în particule de 3...6 mm, se supune extracției la un raport de 1/20 m/v, cu un amestec constând din 45
70...80% acetonă și 20...30% apă structurată “I” cu pH acid = 1,8...2,6, prin macerare dinamică, timp de 12 h, la temperatura ambiantă de 15...30 C, se purifică soluția extractivă 47 rezultată, prin adsorbție cu 0,3...0,5% m/v cărbune activ cu pH acid, agitându-se timp de 1 h,
RO 122244 Β1 la temperatura ambiantă, se filtrează la presiune normală, se concentrează sub vid la temperatura de 35...40°C, iar precipitatul obținut după uscare timp de 4 h la 105°C și pulverizare, constituind Extractul bioactiv I brut, cu un conținut de 25% acid oleanolic, se purifică prin dizolvare la reflux în acetonă în raport 1/100 m/v, rezultând o soluție care, după răcire, se filtrează la presiune normală și se concentrează sub vid la 35...40°C până la 1/30 v/v din volumul inițial, apoi extractul concentrat se tratează cu apă structurată “I” în raportul 9 : 1 v/v., iar suspensia rezultată se menține 24 h la 5...10°C, se filtrează sub vid la 35...40°C, formându-se un precipitat care se spală cu 10% apă distilată până la pH neutru, se usucă la 105°C timp de 4 h și se pulverizează, rezultând Extractul bioactiv I purificat, sub formă de pulbere, cu conținut de 70% acid oleanolic, 5% alți acizi triterpenici și 3% flavonoide, care se dizolvă la reflux în alcool etilic de 96°, raport 1/100 m/v, timp de 0,5 h, se tratează cu 0,2...0,3% m/v cărbune activ cu pH acid, se agită timp de 1 h la 4O...5O°C, soluția filtrată se concentrează sub vid la 35...40°C, în raportul 1/10 v/v față de volumul inițial, extractul alcoolic concentrat obținut se tratează cu apă structurată “I” în raportul 9 : 1 v/v, iar suspensia rezultată se menține 24 h la 5...10°C, se filtrează sub vid la 35...40°C, precipitatul de pe filtru spălându-se cu 10% apă distilată până la pH neutru, iar pulberea microcristalină albă, obținută după uscare la 105°C timp de 4 h și pulverizare, constituind acidul oleanolic în stare pură, cu un conținut de 97...99%.
Procedeul de obținere a acidului oleanolic în stare pură, conform invenției, prezintă următoarele avantaje:
- se obține acidul oleanolic în stare pură, concomitent cu două extracte bioactive, care conțin de asemenea acid oleanolic de diverse concentrații;
- vâscul se recoltează de la orice plantă gazdă, ceea ce favorizează accesibilitatea sa ca materie primă vegetală și rentabilitatea procedeului pentru prelucrarea la nivel industrial;
- se utilizează apa structurată „I cu pH acid = 1,8...2,6 în componența solvenților necesari pentru efectuarea fazelor tehnologice, ceea ce determină o creștere a selectivității și randamentelor proceselor de extracție, purificare și cristalizare;
- nu prevede operații de purificare laborioase și costisitoare cum ar fi cromatografia pe coloană de Silicagel, AL2O3 etc.;
- este superior prin numărul redus de faze tehnologice și posibilitatea prelucrării la scară industrială;
- se prelucrează planta de vâsc integral.
Prin procedeul de obținere a acidului oleanolic în stare pură, conform invenției, materia primă vegetală, constituită din Herba Viscum album (vâsc), este recoltată de la orice plantă gazdă (măr, brad, pin, stejar, frasin, mesteacăn etc.) în faza de început al fructificării (sezonul de iarnă în zona europeană), uscată până la 5... 6% umiditate, cu un conținut de 0,5...1% acid oleanolic, măcinată în particule de 3...6 mm, se aduce într-un vas de extracție tip percolator și se extrage în raportul 1/20 m/v (masă vegetală/volum solvent) cu solventul de extracție constituit din amestecul: 70...80% acetonă cu 20...30% apă structurată „I cu pH acid = 1,8...2,6, prin macerare dinamică, timp de 12 h la temperatura ambiantă (15...30°C); soluția extractivă se purifică prin adsorbție cu 0,3...0,5% m/v cărbune activ cu pH acid, realizată prin agitare timp de 1 h, la temperatura ambiantă și filtrare la presiune normală, după care se concentrează sub vid la temperatura 35...40°C în raportul: 1/20 v/v față de volumul inițial, rezultând o suspensie care se menține 24 h la temperatura de 5...10°C, după care se filtrează sub vid la 35...40°C, precipitatul obținut după uscare timp de 4 h la 105°C și pulverizare, constituind extractul bioactiv I brut, cu un conținut de minimum 25% acid oleanolic,
RO 122244 Β1 care se purifică prin dizolvare la reflux în acetonă în raport 1/100 m/v, soluția obținută se 1 filtrează după răcire la presiune normală, concentrându-se apoi sub vid până la 1/30 v/v din volumul inițial, la temperatura de 35...40°C, apoi extractul concentrat se tratează cu apă 3 structurată „I în raportul 9 : 1 v/v, rezultând o suspensie care se menține 24 h la 5...10°C, se filtrează sub vid la 35...40°C, precipitatul obținut se spală cu 10% apă distilată până la pH 5 neutru, se usucă la 105°C timp de 4 h și se pulverizează, rezultând Extractul bioactiv I purificat, sub formă de pulbere, care conține minimum 70% acid oleanolic, evaluat prin 7 HPLC, minimum 5% alți acizi triterpenici și minimum 3% flavonoide, fiind aplicabil în terapeutica locală umană și veterinară, precum și în dermatocosmetică. 9 în scopul obținerii acidului oleanolic în stare pură, Extractul bioactiv I purificat se dizolvă la reflux în alcool etilic 96° (raport 1/100 m/v), timp de minimum 0,5 h, se tratează cu 11 0,2...0,3% m/v cărbune activ cu pH acid, suspensia se agită timp de 1 h la 4O...5O°C, soluția filtrată se concentrează sub vid la 35...40°C, în raportul 1/10 v/v față de volumul inițial, 13 extractul alcoolic concentrat se tratează cu apă structurată „I în raportul 9:1 v/v, suspensia rezultată se menține 24 h la 5...10°C, se filtrează sub vid, precipitatul de pe filtru se spală cu 15 10% apă distilată până la pH neutru, pulberea microcristalină albă, obținută după uscare la 105°C timp de 4 h și pulverizare, constituind acidul oleanolic în stare pură, cu un conținut de 17
97...99%, evaluat prin HPLC, care, datorită purității avansate este aplicabil în terapeutica umană și veterinară, pentru uz intern. 19 în vederea obținerii Extractului bioactiv II lichid, materia primă vegetală, rămasă în vasul de extracție după efectuarea extracției primare, se utilizează pentru a ll-a extracție cu 21 amestecul de solvenți: 20...30% acetonă cu 70...80% apă structurată „I, pH=1,8...2,6, în raport 1/10 m/v - masă vegetală/volum solvent - aplicându-se extracția prin macerare dina- 23 mică, timp de 12 h, la temperatura ambiantă (15...30°C); soluția extractivă, filtrată la presiune normală, se concentrează sub vid până la un volum egal cu 1/2 din cantitatea de plantă 25 prelucrată, rezultând un extract apos concentrat, care se tratează în vasul de concentrare, cu un volum egal de propilenglicol, care conține drept conservant amestecul format din 0,3% 27 p-hidroxi-benzoat de metil și 0,1% p-hidroxi-benzoat de n-propil (g/g), continuându-se concentrarea sub vid, până la distilarea totală a apei și obținerea unui extract lichid în 29 propilenglicol 100%, care se centrifughează, supernatantul limpede constituind Extractul bioactiv II lichid, stabilizat în propilenglicol, care conține: minimum 1% acid oleanolic glico- 31 zidat, precum și alte componente bioactive polare: minimum 0,5% flavonoide și minimum 0,3% acizi polifenol-carboxilici, fiind aplicabil în dermatocosmetică și în balneofitoterapie. 33
Acidul oleanolic în stare pură, obținut prin procedeul conform invenției, este o pulbere microcristalină, albă, nehigroscopică, fără gust sau miros, insolubilă în apă, solubilă la reflux 35 în alcooli, acetonă și solvenți organici nepolari, cu un conținut de 97...99%. evaluat prin HPLC, fiind aplicabil în terapeutica umană și veterinară, pentru uz intern. 37
Extractul bioactiv I se prezintă sub formă de pulbere amorfă, alb-gălbuie, nehigroscopică, fără gust sau miros, insolubilă în apă, solubilă la reflux în alcooli, amestecuri hidro- 39 alcoolice și hidroacetonice, care conține minimum 70% acid oleanolic, evaluat prin HPLC, minimum 5% alți acizi triterpenici și minimum 3% flavonoide, fiind aplicabil în terapeutica 41 locală umană și veterinară, precum și în dermatocosmetică.
Extractul bioactiv 11 este stabilizat sub formă de lichid limpede, de culoare brună, fără 43 miros, cu gust slab amărui, miscibil cu apa și amestecurile hidroalcoolice sau hidroacetonice, nemiscibil cu solvenții organici nepolari și conține minimum 1% acid oleanolic glicozidat, 45 precum și alte componente bioactive bipolare: minimum 0,5% flavonoide și minimum 0,3% acizi polifenol-carboxilici, fiind aplicabil în dermatocosmetică și în balneofitoterapie. 47
Se prezintă, în continuare, câteva exemple de realizare a invenției.
RO 122244 Β1
Exemplul 1. Obținerea Extractului bioactiv I - pulbere kg materie primă vegetală, constituită din Herba Viscum album (vâsc), recoltată de la orice plantă gazdă (măr, brad, pin, stejar, frasin, mesteacăn etc.) în faza de început al fructificării (sezonul de iarnă), în stare uscată (maximum 5...6% umiditate) și măcinată în particule de 3...6 mm (sita III - FRX), cu un conținut de 0,5...1% acid oleanolic, se aduce întrun vas de extracție tip percolator și se extrage cu 200 I (raport 1/20 m/v - masă vegetală/solvent), solvent de extracție constituit din amestecul: 1601 acetonă cu 401 apă structurată „I (pH=1,8...2,6), prin macerare dinamică, recircularea continuă a solventului cu ajutorul unei pompe peristaltice, timp de 12 h, la temperatura ambiantă de 15...30 C, după care se colectează minimum 1701 soluție extractivă, colorată în verde-brun, care în scopul purificării de clorofilă și de alte impurități lipofile, se aduce într-un vas prevăzut cu sistem de agitare, în care se adaugă sub agitare 0,5...0,8 kg cărbune activ - pulbere, cu pH acid - raport 0,3...0,5% m/v - continuându-se agitarea timp de 1 h, la temperatura ambiantă, pentru adsorbția impurităților pe cărbune activ. Suspensia se filtrează la presiune normală, obținându-se circa 160 I soluție extractivă purificată, colorată în brun, care se concentrează sub vid, la temperatura de 35...40°C, până la volumul de 81 - raport 1/20 față de volumul inițial - rezultând o suspensie care se menține 24 h la temperatura de 5...10°C, după care se filtrează sub vid la 35...40°C, iar precipitatul de pe filtru se usucă la 105°C, timp de 4 h și se pulverizează.
Rezultă minimum 300 g pulbere amorfă, galben-verzuie, care constituie extractul bioactiv I brut, cu un conținut de 72,4% acid oleanolic, evaluat prin HPLC, alături de alți acizi triterpenici, flavonoide, precum și componente lipofile (clorofilă, xantofilă) etc.
în scopul purificării extractului brut, acesta se dizolvă la reflux în 30 I acetonă, raport 1/100 m/v, soluția rezultată se filtrează după răcire, la presiune normală și se concentrează sub vid, la temperatura de 35...40°C, până la 1/30 din volumul inițial, 0,91, extractul concentrat se tratează cu apă structurată „I cu pH acid, pH=1,8...2,6, în raportul 9:1 v/v, respectiv 0,11, obținându-se 11 suspensie care se menține 24 h la temperatura de 5... 10°C, după care se filtrează sub vid la 35...40°C, iar precipitatul de pe filtru se spală cu 0,1 I apă distilată, până la pH neutru, se usucă la 105°C, timp de 4 h și se pulverizează.
Rezultă minimum 90 g pulbere amorfă, alb-gălbuie, constituită din Extractul bioactiv I purificat, cu un conținut de 72,4% acid oleanolic, evaluat prin HPLC, 5,3% alți acizi triterpenici și 3,6% flavonoide, fiind aplicabil în terapeutica locală umană și veterinară, precum și în dermatocosmetică, la obținerea unor bioproduse condiționate sub formă de cremă, gel, emulsie, loțiuni, spray, cu efecte antiageing, revitalizant tisulare și tonifiant vasculare.
Exemplul 2. Obținerea acidului oleanolic în stare pură g Extract bioactiv I purificat - pulbere, obținut conform modului de lucru descris în exemplul 1, se aduce într-o instalație prevăzută cu sistem de încălzire, agitare și reflux, în care se adaugă 91 alcool etilic 96° - raport 1/100 m/v - suspensia încălzindu-se la reflux, timp de 30 min, până la dizolvare completă, rezultând o soluție galben-deschis, care se purifică prin adsorbție cu 0,2...0,3% m/v cărbune activ cu pH acid, adăugat în vasul de dizolvare și continuându-se agitarea la 4O...5O°C, timp de 1 h; se filtrează la presiune normală, soluția decolorată și filtrată se concentrează sub vid, la temperatura de 35...40°C, până la volumul de 0,9 I - raport 1/10 v/v față de volumul inițial - extract alcoolic concentrat, care se tratează cu 0,1 I apă structurată „I, cu pH acid în raport 9:1 v/v; suspensia rezultată se menține 24 h la temperatura de 5...10°C, după care se filtrează sub vid la 35...40°C, precipitatul de pe filtru se spală cu 0,1 I apă distilată, până la pH neutru, se usucă la 105°C, timp de 4 h și se pulverizează.
Se obțin minimum 50 g acid oleanolic în stare pură, sub formă de pulbere albă, microcristalină, cu un conținut de 98,3%, evaluat prin HPLC, ceea ce reprezintă un randament tehnologic final de 48...50%, raportat la conținutul în acid oleanolic al materiei prime vegetale prelucrate (1%).
RO 122244 Β1
Exemplul 3. Obținerea Extractului bioactiv II - lichid 1
Materia primă vegetală rămasă în vasul de extracție după efectuarea extracției primare, conform exemplului de realizare 1, se utilizează pentru a Il-a extracție, efectuată cu 3 100 I, raport 1/10 m/v - masă vegetală/volum solvent, amestec de solvenți constituit din
20...30% acetonă, 20...30 I, cu 70...80% apă structurată „I cu pH=1,8...2,6, 70...80 I, prin 5 extracția prin macerare dinamică, timp de 12 h la temperatura ambiantă (15...30°C), după care se colectează minimum 90 I soluție extractivă, colorată în brun, care se filtrează la 7 presiune normală, rezultând minimum 801 soluție extractivă limpede, care se concentrează sub vid, până la volumul de 51 -1/2 din cantitatea de plantă prelucrată - rezultând un extract 9 apos concentrat, sub formă de suspensie fină, care se tratează în vasul de concentrare, cu un volum egal de propilenglicol (5 I), care conține drept conservant amestecul format din: 11
0,3% p-hidroxi benzoat de metil și 0,1% p-hidroxi benzoat de n-propil (g/g); se continuă concentrarea sub vid la 35...40°C, până la distilarea totală a apei și obținerea a 5 I extract 13 lichid în propilenglicol 100%, care se centrifughează, supernatantul limpede obținut constituind Extractul bioactiv II lichid, stabilizat în propilenglicol, care conține 1,8% acid oleanolic 15 glicozidat, precum și alte componente bioactive polare: 0,63% flavonoide și 0,44% acizi polifenol-carboxilici, fiind aplicabil în dermatocosmetică și în balneofitoterapie. 17
Teste pentru caracterizarea analitică calitativă și cantitativă a produselor realizate conform invenției 19
Caracterizarea analitică calitativă și cantitativă a acidului oleanolic și a celor două extracte bioactive obținute conform invenției s-a efectuat prin aplicarea următoarelor metode 21 de analiză:
- cromatografie în strat subțire; 23
- cromatografie lichidă de înaltă performanță (HPLC)
- spectrometrie de absorbție moleculară în VIS. 25
Testul 1 - Evaluarea calitativă a acidului oleanolic prin cromatografie în strat subțire
Reactivi și metodă 27
- Plăci cromatografice cu Silicagel60F254 (Merk);
- Fază mobilă: ciclohexan - acetonă - acetat de etil (4:2:1) v/v; 29
- Reactiv de identificare: cloroform - anhidridă acetică - acid sulfuric (50:10: 1)v/v;
- Soluție de referință: 0,1 g% acid oleanolic - substanță de referință în alcool metilic; 31
- Soluție de analizat: 0,1 g% acid oleanolic - probă de analizat în alcool metilic.
Rezultate experimentale 33
A. Identificarea acidului oleanolic în substanța pură
Pe cromatoplacă se observă prezența a 2 spoturi de culoare roșie-violacee, la Rf = 35
0,74, corespunzătoare substanței de referință și probei de analizat, care nu trebuie să mai prezinte alte spoturi secundare, fiind de puritate identică cu substanța de referință. 37
B. Identificarea acidului oleanolic în Extractul bioactiv I - pulbere în cazul acestui produs, cromatoplaca prezintă un spot principal, predominant canti- 39 tativ, cu Rf = 0,74, corespunzător acidului oleanolic, concomitent cu încă 2...3 spoturi, mai puțin intense, cu suprafață redusă, de culoare violacee, la Rf = 0,75; 0,71; 0,68, care aparțin 41 altor acizi triterpenici (ursolic, hidroxi-ursolic, hidroxi-oleanolic), existenți în vâsc, alături de acidul oleanolic și care îl însoțesc în procesele de extracție, purificare și cristalizare. 43
C. Identificarea acidului oleanolic în Extractul bioactiv II - lichid
Reactivi și metodă: 45
Acidul oleanolic glicozidat, prezent în Extractul bioactiv II, se hidrolizează în mediu acid - 5% HCI - la acid oleanolic liber, care se extrage din mediul de hidroliză cu cloroform, 47 iar reziduul extractului cloroformic, solubilizat în alcool metilic, se analizează prin cromatografie în strat subțire, în condițiile experimentale menționate la punctul B. 49
RO 122244 Β1
Rezultate experimentale
Pe cromatoplacă se observă prezența a 2 spoturi principale, de culoare roșieviolacee, la Rf = 0,74, corespunzătoare substanței de referință și probei de analizat, concomitent cu încă 2...3 spoturi, mai puțin intense, cu suprafață redusă, de culoare violacee, la Rf = 0,75; 0,71; 0,68, care aparțin altor acizi triterpenici, existenți în extractele din vâsc cu solvenți polari, în stare glicozidată, ca și acidul oleanolic și care sunt transformați în agliconii respectivi, prin scindarea catenei glucidice, în urma hidrolizei acide, aplicate conform modului de lucru menționat.
Testul 2 - Evaluarea cantitativă a acidului oleanolic prin HPLC în substanța pură și în Extractul bioactiv I - pulbere
Metoda de lucru
Prin analiza HPLC s-a efectuat evaluarea cantitativă a probelor de acid oleanolic și de Extract bioactiv I, prin metoda standardului extern, utilizându-se un sistem cromatografie Agilent 1100, prevăzut cu detector cu serie de diode și colector de fracții. Probele de acid oleanolic și de Extract bioactiv I au fost supuse separării pe o coloană cu fază inversă Hipersil Cis și eluării cu faza mobilă, constituită din amestecul: metanol/acid formic 0,1 M (90/10 v/v); detecția în UV s-a înregistrat la 205 nm.
Datele experimentale obținute sunt cuprinse în tabelul 1 și cromatogramele 1 și 2.
Testul 3 - Evaluarea cantitativă a acidului oleanolic prin spectrometrie de absorbție moleculară în VIS
A. Determinarea conținutului în acid oleanolic în substanța pură și Extractul bioactiv I - pulbere
Reactivi și metodă
Proba de acid oleanolic sau Extract bioactiv I se dizolvă în alcool metilic, iar reziduul sicc, obținut prin concentrarea soluției alcoolice, se tratează cu soluție 5% vanilină în acid acetic și acid percloric; se formează un complex de culoare violacee, a cărui absorbantă se măsoară la 550 mm.
Conținutul în acid oleanolic se determină în raport cu o curbă etalon pentru acid oleanolic - substanță de referință ca soluție 0,1% în alcool metilic, aplicându-se următoarea formulă de calcul:
Ap x Csr
Conținutul în acid oleanolic % =-χ 10'2
Asrx P în care:
Ap = absorbanta soluției de acid oleanolic - probă la 550 nm;
Asr = absorbanta soluției de referință la 550 nm;
Csr = concentrația substanței de referință pg/ml corespunzătoare absorbantei Asr;
P = cantitatea de probă luată în lucru - g;
102 = factor de corecție.
»
Datele experimentale obținute sunt prezentate în tabelele 1 și 2.
B. Determinarea conținutului în acid oleanolic glicozidat în Extractul bioactiv II - lichid
Reactivi și metodă
Acidul oleanolic glicozidat, prezent în Extractul bioactiv II, se hidrolizează în mediu acid (5% HCI) la acid oleanolic liber, care se extrage din mediul de hidroliză cu cloroform, iar reziduul extractului cloroformic, solubilizatîn alcool metilic, se tratează cu soluție 5% vanilină în acid acetic și acid percloric, măsurându-se absorbanta complexului de culoare violacee, format la 550 nm.
RO 122244 Β1
Conținutul în acid oleanolic glicozidat se determină în raport cu o curbă etalon pentru 1 acid oleanolic - substanță de referință, ca soluție 0,1% în alcool metilic, aplicându-se următoarea formulă de calcul: 3
Ap x Csr
Conținutul în acid oleanolic glicozidat % =-x 0,0015 x 1,71 5
Asr x P în care: 7
Ap = absorbanta soluției de probă la 550 nm;
Asr = absorbanta soluției de referință la 550 nm; 9
Csr = concentrația substanței de referință pg/ml corespunzătoare absorbantei Asr;
P = cantitatea de probă luată în lucru - g; 11
0,0015 = factor de corecție;
1,71= factor de transformare a acidului oleanolic liber în acid oleanolic glicozidat. 13
Datele experimentale obținute sunt prezentate în tabelul 3.
Testul 4 - Evaluarea calitativă a flavonoidelor prin cromatografie în strat subțire 15 în Extractele bioactive I și II
Reactivi și metodă 17
- Plăci cromatografice cu Silicagel60F254 (Merk);
- Fază mobilă: acetat de etil - metanol - apă (100 : 16,5 : 13,5) v/v; 19
- Reactiv de identificare: soluție 1% AICI3 în alcool etilic;
- Soluție de referință: 0,1 g Rutozid - substanță de referință/100 ml alcool metilic; 21
- Soluție de analizat: A. 2 g Extract bioactiv 1/100 ml alcool metilic;
B. 50 ml Extract bioactiv II + 50 ml alcool metilic. 23
Rezultate experimentale
Pe cromatoplacă se observă, în cazul soluției de referință, prezența unui spot de 25 culoare galben închis la Rf = 0,34, corespunzător Rutozidului, iar în cazul soluțiilor de analizat A și B, se evidențiază 4 spoturi colorate tot în galben închis la Rf = 0,38; 0,46; 0,52 și 27 0,57, care aparțin flavonoidelor glicozidate existente în Extractele bioactive I și II.
Testul 5 - Evaluarea cantitativă a flavonoidelor în Extractele bioactive I și II prin 29 spectrometrie de absorbție moleculară în VIS
Reactivi și metodă 31
- Soluție de referință 0,1 g Rutozid - substanță de referință/100 ml alcool metilic;
- Soluție de analizat:: A. 2 g Extract bioactiv 1/100 ml alcool metilic; 33
B. 50 ml Extract bioactiv II + 50 ml alcool metilic;
- Soluție 2,5 g% AICI3 în apă distilată; 35
- Soluție 10% acetat de sodiu în apă distilată g/v.
Complexul de flavonoide, conținut de Extractele bioactive I și II, se extrage cu alcool 37 metilic, iar extractul alcoolic rezultat se tratează cu soluție 10% acetat de sodiu și soluție 2,5% AICI3, când se formează un complex de culoare galbenă, a cărui absorbantă se 39 măsoară la 430 nm.
Conținutul în flavonoide se determină în raport cu o curbă etalon pentru Rutozid - 41 substanță de referință, ca soluție 0,1% în alcool metilic, aplicându-se următoarea formulă de calcul: 43
Ap x Csr
Conținutul în flavonide exprimat în Rutozid % =-x 0,0025 45
Asrx P în care: 47
Ap = absorbanta soluției de probă la 430 nm;
Asr = absorbanta soluției de referință (Rutozid 0,1%) la 430 nm; 49
RO 122244 Β1
Csr = concentrația substanței de referință ug/ml corespunzătoare absorbantei Asr;
P = cantitatea de probă luată în lucru - g;
0,0025 = factor de corecție.
Datele experimentale obținute sunt prezentate în tabelele 2 și 3
Testul 6 - Evaluarea cantitativă a acizilor polifenol-carboxilici prin spectrometrie de absorbție moleculară în VIS în Extractul bioactiv II - lichid
Reactivi și metodă
Acizii polifenol-carboxilici prezenți în Extractul bioactiv II formează cu Reactivul Folin (soluție apoasă 10% Wolframat de sodiu și 10% acid fosforic) un complex de culoare albastră, a cărui absorbantă se măsoară la 660 mm.
Conținutul în acizi polifenol-carboxilici se determină în raport cu o curbă etalon pentru acid cafeic - substanță de referință, ca soluție 0,01% în apă distilată, aplicându-se următoarea formulă de calcul:
Ap x Csr
Conținutul în acizi polifenol-carboxilici exprimat în acid cafeic % =-x 0,005
Asr x P în care:
Ap = absorbanta soluției de probă la 660 nm;
Asr = absorbanta soluției de referință (acid cafeic 0,01%) la 660 nm;
Csr = concentrația substanței de referință g/ml, corespunzătoare absorbantei Asr;
P = cantitatea de probă luată în lucru - g;
0,005 = factor de corecție.
Datele experimentale obținute sunt prezentate în tabelul 3.
Rezultate experimentale obținute în cadrul evaluărilor cantitative
Tabelul 1
Dozarea acidului oleanolic - substanță pură prin HPLC și spectrometrie de absorbție moleculară în VIS
| Nr. probă | Acid oleanolic% | |
| HPLC | Spectrometrie | |
| 1. | 97,2 | 97,6 |
| 2. | 97,8 | 98,2 |
| 3. | 98,3 | 98,8 |
| 4. | 98,8 | 99,3 |
| 5. | 99,5 | 99,9 |
Tabelul 2
Dozarea componentelor bioactive în Extractul bioactiv I - pulbere
| Nr. probă | Acid oleanolic% HPLC | Alți acizi triterpenici% | Flavonoide% exprimate în Rutozid |
| 1. | 70,3 | 5,2 | 4,3 |
| 2. | 71,8 | 5,5 | 4,1 |
| 3. | 72,4 | 5,3 | 3,6 |
| 4. | 73,2 | 5,9 | 3,8 |
| 5. | 73,9 | 6,4 | 4,5 |
RO 122244 Β1
Tabelul 3
Dozarea componentelor bioactive în Extractul bioactiv II - lichid
| Nr. probă | Acid oleanolic glicozidat % | Flavonoide % exprimate în Rutozid | Acizi polifenolcarboxilici % exprimate în acid cafeic |
| 1. | 1,2 | 0,54 | 0,35 |
| 2. | 1,4 | 0,57 | 0,38 |
| 3. | 1,8 | 0,63 | 0,44 |
| 4. | 1,6 | 0,66 | 0,41 |
| 5. | 1,3 | 0,59 | 0,36 |
Caracteristici analitice ale acidului oleanolic în stare pură
| Nr. crt. | Caracteristici analitice | Specificații standard de calitate |
| 1. | Definiție | Olean-12en-28-oic-acid 3a/phidroxi |
| 2. | Proprietăți fizice: - descriere - solubilitate - punct de topire | - pulbere microcristalină, albă, nehigroscopică, fără gust sau miros - insolubilă în apă, greu solubilă în alcooli la temperatura de 2O...25°C, solubilă la reflux în alcooli, acetonă și solvenți organici nepolari 3O5...31O°C |
| 3. | Identificare: - prin cromatografie în strat subțire | un singur spot - Rf = 0,74 |
| 4. | Determinare cantitativă prin HPLC: - conținut acid oleanolic% | Minimum 97 |
| 5. | Pierdere prin uscare% | Maximum 1,0 |
| 6. | Reziduu la calcinare% | Maximum 0,1 |
| 7. | Controlul purității - metale grele - reziduu solvenți organici | Maximum 10 ppm Absent |
| 8. | Contaminare microbiană: - nr. total bacterii aerobe, ufc/ml - nr. total levuri și fungi filamentoși/ml - bacterii condiționat patogene: - Enterobacteriaceaelm\ | Maximum 104 Maximum 104 Maximum 102 |
| - Staphilococcus aureuslml - Escherichia colilml - Salmonella tiphimuriumlî Og | Absent Absent Absent | |
| 9. | Conservabilitate | Minimum 3 ani, la temperatura ambiantă (20...25°C) în containere etanșe, ferit de lumină |
RO 122244 Β1
Caracteristici analitice ale Extractului bioactiv I - pulbere
| Nr. crt. | Caracteristici analitice | Specificații standard de calitate |
| 1. | Definiție | Extract bioactiv, pulbere, standardizat în acid oleanolic din Viscum album (vâsc) Herba |
| 2. | Proprietăți fizice: - descriere - solubilitate | - pulbere amorfă, alb-gălbuie, nehigroscopică, fără gust sau miros - insolubilă în apă, greu solubilă în alcooli la temperatura de 2O...25°C, solubilă la reflux în alcooli, amestecuri hidroalcoolice și hidroacetonice (50...80%) |
| 3. | Identificare: - prin cromatografie în strat subțire - acid oleanolic - alți acizi triterpenici - Flavonoide | - spot principal - Rf=0,74 - 2...3 spoturi secundare - Rf=0,75; 0,71; 0,68 - 4 spoturi - Rf=0,38; 0,46; 0,52; 0,57 |
| 4. | Determinare cantitativă A. prin HPLC - acid oleanolic % B. metoda spectrofotometrică - total acizi triterpenici % exprimat în acid oleanolic - total flavonoide % exprimat în Rutozid | Minimum 70 Minimum 75 Minimum 3 |
| 5. | Pierdere prin uscare % | Maximum 1,0 |
| 6. | Reziduu la calcinare % | Maximum 0,1 |
| 7. | Controlul purității: - metale grele, reziduu - solvenți organici | Maximum 10 ppm Absent |
| 8. | Contaminare microbiană: - nr. total bacterii aerobe, ufc/ml - nr. total levuri și fungi filamentoși/ml - bacterii condiționat patogene: - Enterobacteriaceaelrrti - Staphilococcus aureus/rrA - Escherichia colilrrA - Salmonella tiphimurium/îO g | Maximum 104 Maximum 102 Maximum 102 Absent Absent Absent |
| 9. | Conservabilitate | Minimum 3 ani, la temperatura ambiantă (20...25’C) în containere etanșe, ferit de lumină |
RO 122244 Β1
Caracteristici analitice ale Extractului bioactiv II - lichid
| Nr crt | Caracteristici analitice | Specificații standard de calitate |
| 1. | Definiție | Extract bioactiv, lichid, stabilizat în propilenglicol din Viscum album (vâsc) Herba |
| 2. | Proprietăți fizice: - descriere - solubilitate -pH - densitate relativă d20 20 | - lichid limpede, de culoare brună, fără miros, gust slab amărui - miscibil cu apa și amestecurile hidroalcoolice sau hidroacetonice, nemiscibil cu solvenții organici nepolari 5,0...6,0 1,040... 1,080 |
| 3. | Identificare: - prin cromatografie în strat subțire - acid oleanolic - alți acizi triterpenici - flavonoide - p-hidroxibenzoat de metil și n-propil | spot principal - Rf= 0,74 2...3 spoturi secundare - Rf=0,75; 0,71; 0,68 4 spoturi -Rf=0,38; 0,46; 0,52; 0,57 2 spoturi cu Rf=0,81 și 0,83 |
| 4. | Determinare cantitativă prin metoda spectrofotometrică: - acid oleanolic glicozidat % - total flavonoide % exprimat în Rutozid - total acizi polifenolcarboxilici % exprimat în acid cafeic | Minimum 1 Minimum 0,5 Minimum 0,3 |
| 5. | Controlul purității: - metale grele - reziduu solvenți organici | Maximum 10 ppm Absent |
| 6. | Contaminare microbiană: - nr. total bacterii aerobe, ufc/ml - nr. total levuri și fungi filamentoși/ml - bacterii condiționat patogene: - Enterobacteriaceaelm\ - Staphilococcus aureus/m\ - Escherichia colilm\ - Salmonella tiphimurium/î 0 g | Maximum 103 Maximum 102 Maximum 102 Absent Absent Absent |
| 7. | Conservabilitate | Minimum 2 ani, la temperatura ambiantă (2O...25°C) în recipiente etanșe, ferit de lumină |
RO 122244 Β1
Procedeul conform invenției utilizează apa structurată „I cu pH acid = 1,8...2,6 în componența solvenților necesari pentru efectuarea fazelor tehnologice, ceea ce determină o creștere a selectivității și randamentelor proceselor de extracție, purificare, cristalizare și separare a bioproduselor realizate conform invenției.
Apa structurată „I - activată inhibitor - se obține prin introducerea unei ape demineralizate sau distilate, îmbogățită, controlat, cu săruri minerale, pentru a atinge valori ale conductivității între 250 și 450 pS, într-o coloană paralelipipedică, chimic neutră, cu mai multe celule de structurare compuse din activatoare cu câte 2 electrozi lamelari, unul negativ și altul pozitiv, din plasă inox, dispuși de o parte și de alta a unui sandvici de membrane poroase, inerte chimic și în urma proceselor de interacție dintre structurile moleculare dipolare ale apei cu câmpul electrostatic generat între electrozi, are loc un proces prin care se asigură ordonări, polarizări și energia necesară de legare prin punți de hidrogen cu radicali negativi [R ], rezultând apă structurată „I cu pH = 1,8...2,6 și conductivitate între 1200 și 2500 pS, care se evacuează din spațiile din stânga, respectiv dreapta electrozilor pozitivi ai fiecărui activator.
Claims (5)
1. Procedeu de obținere a acidului oleanolic în stare pură din Herba Viscum album, caracterizat prin aceea că materia primă vegetală se usucă până la 5...6% umiditate, se macină în particule de 3...6 mm, se supune extracției la un raport de 1/20 m/v, cu un amestec constând din 70...80% acetonă și 20...30% apă structurată “I” cu pH acid = 1,8...2,6, prin macerare dinamică, timp de 12 h, la temperatura ambiantă de 15...30 C, se purifică soluția extractivă rezultată, prin adsorbție cu 0,3...0,5% m/v cărbune activ cu pH acid, agitându-se timp de 1 h, la temperatura ambiantă, se filtrează la presiune normală, se concentrează sub vid la temperatura de 35...40°C, iar precipitatul obținut după uscare timp de 4 h la 105°C și pulverizare, constituind Extractul bioactiv I brut, cu un conținut de 25% acid oleanolic, se purifică prin dizolvare la reflux în acetonă, în raport 1/100 m/v, rezultând o soluție care, după răcire, se filtrează la presiune normală și se concentrează sub vid la
35.. .40°C până la 1/30 v/v din volumul inițial, apoi extractul concentrat se tratează cu apă structurată “I” în raportul 9 : 1 v/v, iar suspensia rezultată se menține 24 h la 5...10°C, se filtrează sub vid la 35...40°C, formându-se un precipitat care se spală cu 10% apă distilată până la pH neutru, se usucă la 105°C timp de 4 h și se pulverizează, rezultând Extractul bioactiv I purificat, sub formă de pulbere, cu conținut de 70% acid oleanolic, 5% alți acizi triterpenici și 3% flavonoide, care se dizolvă la reflux în alcool etilic de 96°, raport 1/100 m/v, timp de 0,5 h, se tratează cu 0,2...0,3% m/v cărbune activ cu pH acid, se agită timp de 1 h la 40...50°C, soluția filtrată se concentrează sub vid la 35...40°C, în raportul 1/10 v/v față de volumul inițial, extractul alcoolic concentrat obținut se tratează cu apă structurată “I” în raportul 9 : 1 v/v, iar suspensia rezultată se menține 24 h la 5...10°C, se filtrează sub vid la
35.. .40°C, precipitatul de pe filtru spălându-se cu 10% apă distilată până la pH neutru, iar pulberea microcristalină albă, obținută după uscare la 105°C timp de 4 h și pulverizare, constituind acidul oleanolic în stare pură, cu un conținut de 97...99%.
2. Procedeu conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că materia primă vegetală, rămasă în vasul de extracție după efectuarea extracției primare, se supune unei noi extracții, cu amestecul de solvenți format din 20...30% acetonă și 70...80% apă structurată “I”, cu pH acid = 1,8...2,6, în raport 1/10 m/v masă vegetală/volum solvent, prin macerare dinamică, timp de 12 h, la temperatura ambiantă de 15...30°C, soluția extractivă se filtrează la presiune normală, se concentrează sub vid la 35...40°C, până la un volum egal cu 1/2 din
RO 122244 Β1 cantitatea de plantă prelucrată, rezultând un extract apos concentrat, care se tratează cu un 1 volum egal de propilenglicol, care conține un conservant format din 0,3% p-hidroxi-benzoat de metil și 0,1% p-hidroxi-benzoat de n-propil g/g, continuându-se concentrarea sub vid, 3 până la distilarea totală a apei și obținerea unui extract lichid în propilenglicol 100%, care se centrifughează, supernatantul limpede obținut, constituind un Extract bioactiv II - lichid, 5 stabilizat în propilenglicol, cu un conținut de 1% acid oleanolic glicozidat, precum și 0,5% flavonoide și 0,3% acizi polifenol-carboxilici. 7
3. Procedeu conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că se prelucrează planta Viscum album - herba - în stare uscată, recoltată în faza de început a fructificării - 9 sezonul de iarnă în zona europeană, de la orice gazdă, cum ar fi: măr, pin, stejar, frasin, mesteacăn etc. 11
4. Procedeu conform revendicării 1, de obținere a Extractului bioactiv I, caracterizat prin aceea că rezultă o pulbere amorfă, alb-gălbuie, nehigroscopică, fără gust sau miros, 13 insolubilă în apă, solubilă la reflux în alcooli, amestecuri hidroalcoolice și hidroacetonice, care conține 70% acid oleanolic, 5% alți acizi triterpenici și 3% flavonoide. 15
5. Procedeu conform revendicării 1, de obținere a Extractului bioactiv II, caracterizat prin aceea că se stabilizează sub formă de lichid limpede, de culoare brună, fără miros, cu 17 gust slab amărui, miscibil cu solvenții organici nepolari și conține 1 % acid oleanolic glicozidat și alte componente bioactive bipolare precum: 0,5% flavonoide și 0,3% acizi polifenol- 19 carboxilici.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ROA200600292A RO122244B1 (ro) | 2006-05-04 | 2006-05-04 | Procedeu de obţinere a acidului oleanolic în stare pură, din herba viscum album |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ROA200600292A RO122244B1 (ro) | 2006-05-04 | 2006-05-04 | Procedeu de obţinere a acidului oleanolic în stare pură, din herba viscum album |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RO122244B1 true RO122244B1 (ro) | 2009-03-30 |
Family
ID=40510070
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ROA200600292A RO122244B1 (ro) | 2006-05-04 | 2006-05-04 | Procedeu de obţinere a acidului oleanolic în stare pură, din herba viscum album |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RO (1) | RO122244B1 (ro) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013160881A1 (en) | 2012-04-26 | 2013-10-31 | Universidade De Aveiro | Method for obtaining an extract rich in triterpenic acids from eucalyptus barks |
-
2006
- 2006-05-04 RO ROA200600292A patent/RO122244B1/ro unknown
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013160881A1 (en) | 2012-04-26 | 2013-10-31 | Universidade De Aveiro | Method for obtaining an extract rich in triterpenic acids from eucalyptus barks |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5324084B2 (ja) | コケモモ抽出物並びにその製造方法及び使用 | |
| Sułkowska-Ziaja et al. | Physiologically active compounds in four species of Phellinus | |
| JP2009013159A6 (ja) | コケモモ抽出物並びにその製造方法及び使用 | |
| US20050002962A1 (en) | Immunostimulatory agents in botanicals | |
| CN113425757A (zh) | 一种蒲公英提取物及其制备方法和应用 | |
| AU2002342778A1 (en) | Solvent extraction process | |
| WO2003029269A1 (en) | Solvent extraction process | |
| KR20030087068A (ko) | 유효 성분이 풍부한 은행나무 잎 추출물의 제조 방법 | |
| DK166806B1 (da) | Anvendelse af plantepollenekstrakter til fremstilling af farmaceutiske, tumorcellevaeksthaemmende praeparater | |
| Baby et al. | Phytochemical screening and invitro anti-inflamatory activity of ethanolic extract of centella asiatica | |
| CN105193650B (zh) | 人参、落叶松提取物制备方法及其在化妆品方面的应用 | |
| RO122244B1 (ro) | Procedeu de obţinere a acidului oleanolic în stare pură, din herba viscum album | |
| EP4349845A1 (en) | Novel isoflavone compound | |
| CA2455655C (en) | A glycoprotein with antidiabetic, antihypertensive, antiobesity and antihyperlipidemic effects from grifola frondosa, and a method for preparing same | |
| JP2000072665A (ja) | ヒアルロニダーゼ阻害剤 | |
| KR102543610B1 (ko) | 참마의 저장단백질 추출방법 및 이를 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물 | |
| Zuparova et al. | Determination of Some Technological Properties and Authenticity of Immunacea Bio Tablets | |
| KR20150036856A (ko) | 알러지 성분이 제거된 분리정제봉독을 이용한 기능성 봉독 화장품 조성물의 제조방법 | |
| Alshammaa et al. | Preliminary phytochemical screening with evaluation of antioxidant activity of merabilis jalapa leaves cultivated in iraq | |
| JP4480204B2 (ja) | カワリハラタケの抗腫瘍性画分 | |
| TWI618540B (zh) | Composition for preventing renal toxicity caused by drug toxicity, preparation method thereof and Its use | |
| Adjileye et al. | Antihypertensive effect of Dialium guineense Wild. and Trema orientalis L. in L-NAME-induced hypertensive rats | |
| KR102543076B1 (ko) | Dna 구성성분을 포함하는 특정 유전자 발현 억제, 후성유전학적 변이 조절 피부 상태 개선용 조성물 및 이의 제조방법 | |
| Zuparova et al. | Determining The Authenticity Of Immunacea Bio Tablets With Immunomodulatory Action | |
| CN103083376B (zh) | 可用于治疗鼻炎的藁本提取物 |