CN104569271B - 葡萄酒中吡唑类杀菌剂的固相萃取-气相色谱-串联质谱检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种葡萄酒中吡唑类杀菌剂的固相萃取-气相色谱-串联质谱检测方法，本发明能够同时测定葡萄酒中样品中戊苯吡菌胺、氟唑菌酰胺、吡唑萘菌胺、吡咪唑、呋吡菌胺5种吡唑类杀菌剂。在葡萄酒样品中加入超纯水稀释得到待检液，待检液经HLB固相萃取柱净化，使用C₁₈反相柱分离；目标分析物在多反应监测模式下以保留时间和离子对信息比较进行定性分析，外标法定量，本方法分析速度快、灵敏度高、重现性和准确度好，为评价葡萄酒样品质量提供了新的检测方法。

Description

葡萄酒中吡唑类杀菌剂的固相萃取-气相色谱-串联质谱检测方法

技术领域

本发明属于食品检测领域，涉及固相萃取-气相色谱-串联质谱法(GC-MS/MS)，具体是指一种葡萄酒中戊苯吡菌胺、氟唑菌酰胺、吡唑萘菌胺、吡咪唑、呋吡菌胺等5种吡唑类杀菌剂的检测方法。

背景技术

葡萄酒生产主要原料的葡萄在田间管理过程中，为防止病虫害发生，通常会喷施一定量的农药，有些农药在葡萄酒生产发酵过程中不易去除分解，会不同程度地残留在葡萄酒中，给饮用者健康带来潜在的危害。

杀菌剂是用于防治由各种病原微生物引起的植物病害的一类低毒农药，主要指杀真菌剂。目前，吡唑类化合物因其具有高效、低毒以及吡唑环上取代基可多方位变换等优势，已成为新型杀菌剂开发的热点之一。这些杀菌剂具有特殊的作用方式，并有多种生物活性。例如，唑菌胺酯（Pyraclostrobin）为甲氧基丙烯酸酯类线粒体电子传递抑制剂，显示了对许多植物真菌广泛的抑制作用。而呋吡菌胺（furametpyr），属于琥珀酸脱氢酶抑制剂（SDHI），可以抑制真菌呼吸的复合II琥珀酸脱氢酶。近些年来，多种吡唑类杀菌剂被越来越广泛地应用于农业生产中的植物病害控制，如谷物，蔬菜和水果等。

因此，食品产品中出现杀菌剂残留物并不意外。这些吡唑类杀菌剂虽然对环境相对友好，但若在农产品中使用不当，会造成其在食品中的高残留问题，威胁人体健康。因此，建立准确、可靠地测定葡萄酒中戊苯吡菌胺、氟唑菌酰胺、吡唑萘菌胺、吡咪唑、呋吡菌胺等5种吡唑类杀菌剂的含量非常重要。

分析方法可分为定性分析、定量分析和定性定量分析技术。定量分析一般采用色谱技术和色谱质谱联用技术，色谱技术有气相色谱和气相色谱等方法，色谱质谱联用技术有气相色谱-质谱联用和气相色谱-质谱联用等方法；定性定量分析则要兼具两种技术为一体，检测结果要同时提供目标物的结构信息和数量信息，根据欧盟委员会非强制执行法案2002/657/EC的规定，对禁用药物进行确证检测的方法必须能提供结构方面的信息，且要达到该法案规定的4个确证点。

目前，由于国内外无相关标准或文献可循，因此，有必要对葡萄酒尤其是葡萄酒中的戊苯吡菌胺、氟唑菌酰胺、吡唑萘菌胺、吡咪唑、呋吡菌胺等5种吡唑类杀菌剂的检测方法进行研究，从而对葡萄酒中吡唑类杀菌剂进行监测，同时为国内葡萄酒企业出口到欧盟等地区时，能出具符合欧盟委员会非强制执行法案2002/657/EC的规定的检测数据。

发明内容

本发明的目的是提供一种葡萄酒中吡唑类杀菌剂的固相萃取-气相色谱-串联质谱检测方法，该方法结合固相萃取-气相色谱-串联质谱法，能够对葡萄酒中戊苯吡菌胺、氟唑菌酰胺、吡唑萘菌胺、吡咪唑、呋吡菌胺等5种吡唑类杀菌剂同时进行测定，该方法具有准确、快速、灵敏度高的优点，为葡萄酒的快速检测提供了可靠的分析方法。

为实现上述目的，本发明的技术方案是包括以下步骤：

（一）待测样品的制备：称取4.7-5.3g葡萄酒样品，葡萄酒中加入超纯水，混匀后得到待检液；

（二）待测样品的净化：将固定相萃取柱进行预处理，将步骤（一）制备的待检液上萃取柱，经水和甲醇/水溶液淋洗除去杂质，再用洗脱溶剂洗脱固定相萃取柱上的戊苯吡菌胺、氟唑菌酰胺、吡唑萘菌胺、吡咪唑、呋吡菌胺得到洗脱液，将洗脱液浓缩富集后，用甲醇溶剂稀释并经0.22μm微孔滤膜过滤后得到待测样品溶液；

（三）待测样品的检测：配制戊苯吡菌胺、氟唑菌酰胺、吡唑萘菌胺、吡咪唑、呋吡菌胺溶液阶梯浓度的混合标准工作溶液(1.0,5.0,10.0,20.0,50.0,100.0ng/mL)，将步骤（二）中的待测样品溶液和混合标准工作溶液在气相色谱-串联质谱仪上分别进样，获得以标准溶液中戊苯吡菌胺、氟唑菌酰胺、吡唑萘菌胺、吡咪唑、呋吡菌胺的浓度为横坐标，再以混合标准工作溶液中戊苯吡菌胺、氟唑菌酰胺、吡唑萘菌胺、吡咪唑、呋吡菌胺的峰面积为纵坐标的工作曲线，还有获得可以确定母离子的戊苯吡菌胺、氟唑菌酰胺、吡唑萘菌胺、吡咪唑、呋吡菌胺的一级质谱图，确定母离子后，采用子离子扫描获得二级质谱图，然后从二级质谱图中选取定量离子和定性离子，然后用工作曲线对定量离子进行定量计算获得待测样品溶液中戊苯吡菌胺、氟唑菌酰胺、吡唑萘菌胺、吡咪唑、呋吡菌胺的浓度。

进一步设置是所述步骤（二）中的固定相萃取柱为WatersOasisHLBSPE柱，并通过甲醇、水对WatersOasisHLBSPE柱进行活化处理。

进一步设置是所述步骤（二）中的淋洗溶剂为水和体积比为2/3的甲醇水混合溶液，洗脱溶剂为甲醇。

进一步设置是所述的步骤（三）中气相色谱和串联质谱的参数条件如下：

色谱柱：SGE公司BPX35；30m×0.25mm×0.25μm

流速：1.0ml/min高纯氦

仪器：Agilent7890A-7000B

碰撞气：高纯氮：1.5ml/min，猝灭流量：2.25ml/min高纯氦

升温程序：50℃（1min）-290℃（8min）40℃/min

多模式进样口（MMI）：50℃（0.1min）-300℃；600℃/min

1分钟打开分流阀，流量60ml/min

离子化：EI源。

本发明的的原理和优点：

采用上述方案，首先，本发明通过加入超纯水对葡萄酒样品进行稀释，

其次，本发明还对由超纯水稀释得到的待检液进行净化处理，该净化处理包括纯化和富集的过程。第一步纯化：先将待检液通过固相萃取小柱，依次经过经水和甲醇/水溶液淋洗、甲醇洗脱；第二步富集：将第一步中纯化的待检液氮气浓缩近干，然后加入甲醇溶液溶解、经0.22μm微孔滤膜过滤，得到净化的待检液。该净化后的待检液则不会对检测仪器造成污染。本发明中固相萃取的SPE柱为WatersOasisHLBSPE柱，由于5种吡唑类杀菌剂和其他杂质的极性大小存在差异，在固相萃取柱上吸附产生保留差异，然后通过优选的淋洗条件和洗脱条件，达到净化富集香料的目的。

再次，本发明对于葡萄酒中戊苯吡菌胺、氟唑菌酰胺、吡唑萘菌胺、吡咪唑、呋吡菌胺等5种吡唑类杀菌剂成分的定性定量检测分析是通过气相色谱-串联质谱仪(GC-MS/MS)分析。先配置一组阶梯形的标准工作溶液，然后将标准工作液和待检液在气相色谱-串联质谱仪上分别进样。待检液中出现的色谱峰保留时间与标准工作溶液一致，允许偏差小于±2.5%，该色谱峰所对应的质谱定性离子的相对丰度与浓度相当的标准工作溶液的相对丰度一致，而且相对丰度偏差不超过规定，则可确定该待检液中含有吡唑类杀菌剂。

下面结合说明书附图和具体实施方式对本发明做进一步介绍。

附图说明

图1为本发明具体实施例中的5种吡唑类杀菌剂结构图，(A.戊苯吡菌胺；B.吡咪唑；C.吡唑萘菌胺；D.呋吡菌胺；E.氟唑菌酰胺)；

图2为本发明具体实施例中5种吡唑类杀菌剂标准溶液(50.0ng/mL)MRM色谱图，图2中，（2-1）为吡咪唑;（2-2）为戊苯吡菌胺，（2-3）为吡唑萘菌胺；（2-4）为呋吡菌胺；（2-5）为氟唑菌酰胺；

图3为本发明具体实施例中5种吡唑类杀菌剂扫描二级质谱图；图3中，（3-1）为吡咪唑;（3-2）为戊苯吡菌胺，（3-3）为吡唑萘菌胺；（3-4）为呋吡菌胺；（3-5）为氟唑菌酰胺；

图4为本发明具体实施例中标准工作曲线，图4中，（4-1）为吡咪唑;（4-2）为戊苯吡菌胺，（4-3）为吡唑萘菌胺；（4-4）为呋吡菌胺；（4-5）为氟唑菌酰胺。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体的描述，只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限定，该领域的技术工程师可根据上述发明的内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。

实施例1

包括以下步骤：

（一）待测样品的制备：称取葡萄酒样品5.0g，加入3mL超纯水混匀得到待检液；

（二）固相萃取净化：取HLBSPE柱，依次用甲醇和水活化SPE柱，取全部待检液至SPE柱，再依次用4～6mL水和4～6mL甲醇/水混合溶液(v/v,2/3)淋洗SPE柱，将SPE柱真空抽干，用6～8mL的甲醇对SPE柱进行洗脱，得到洗脱液，将洗脱液浓缩后，用2mL甲醇稀释过微孔滤膜后得到待测样品溶液；

（三）标准溶液的配置：取戊苯吡菌胺、氟唑菌酰胺、吡唑萘菌胺、吡咪唑、呋吡菌胺标准品，用甲醇分别配制成质量浓度为200mg/L的单标储备液，进行测定使用时，用甲醇稀释上述标准储备液，将戊苯吡菌胺、氟唑菌酰胺、吡唑萘菌胺、吡咪唑、呋吡菌胺分别配制成1.0,5.0,10.0,20.0,50.0,100.0ng/mL的混合标准工作溶液；

（四）待测样品的检测：将步骤（二）（三）中的待测样品溶液和标准工作溶液在气相色谱-串联质谱仪上分别进样，获得以标准溶液中戊苯吡菌胺、氟唑菌酰胺、吡唑萘菌胺、吡咪唑、呋吡菌胺等5种吡唑类杀菌剂的浓度为横坐标，再以标准溶液中戊苯吡菌胺、氟唑菌酰胺、吡唑萘菌胺、吡咪唑、呋吡菌胺等5种吡唑类杀菌剂的的峰面积为纵坐标的工作曲线，结果表明，5种吡唑类杀菌剂在1.0-100ng/mL范围内具有良好的线性关系，R²≥0.99，以10倍信噪比(S/N)为方法定量限即LOQ，经样品添加试验确定5种吡唑类杀菌剂的定量限均为0.5ng/g。还有获得可以确定母离子的戊苯吡菌胺、氟唑菌酰胺、吡唑萘菌胺、吡咪唑、呋吡菌胺等5种吡唑类杀菌剂的一级质谱图，确定母离子后，采用子离子扫描获得二级质谱图，然后从二级质谱图中选取定量离子和定性离子，然后用工作曲线对定量离子进行定量计算获得待测样品溶液中戊苯吡菌胺、氟唑菌酰胺、吡唑萘菌胺、吡咪唑、呋吡菌胺等5种吡唑类杀菌剂的浓度。

参见表1，其为5种吡唑类杀菌剂LC-MS/MS检测条件

表1各个化合物LC-MS/MS检测条件

^*MS/MS定量离子对

参见表2，其为5种吡唑类杀菌剂的线性方程、相关系数、定量限

参见表3为本发明实施例1的5种吡唑类杀菌剂添加回收率、精密度及定量限

表25种吡唑类杀菌剂添加回收率、精密度及定量限(n=6)

Claims (1)

1.一种葡萄酒中吡唑类杀菌剂的固相萃取-气相色谱-串联质谱检测方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

(一)待测样品的制备：称取4.7-5.3g葡萄酒样品，葡萄酒中加入超纯水，混匀后得到待检液；

（二）待测样品的净化：将固定相萃取柱进行预处理，将步骤（一）制备的待检液上萃取柱，经水和甲醇/水溶液淋洗除去杂质，再用洗脱溶剂洗脱固定相萃取柱上的戊苯吡菌胺、氟唑菌酰胺、吡唑萘菌胺、吡咪唑、呋吡菌胺得到洗脱液，将洗脱液浓缩富集后，用甲醇溶剂稀释并经0.22μm微孔滤膜过滤后得到待测样品溶液；所述步骤（二）中的固定相萃取柱为WatersOasisHLBSPE柱，并通过甲醇、水对WatersOasisHLBSPE柱进行活化处理；所述步骤（二）中的淋洗溶剂为水和体积比为2/3的甲醇水混合溶液，洗脱溶剂为甲醇；

（三）待测样品的检测：配制戊苯吡菌胺、氟唑菌酰胺、吡唑萘菌胺、吡咪唑、呋吡菌胺溶液阶梯浓度的混合标准工作溶液，该混合标准工作溶液的浓度为1.0ng/mL、5.0ng/mL、10.0ng/mL、20.0ng/mL、50.0ng/mL和100.0ng/mL，将步骤（二）中的待测样品溶液和混合标准工作溶液在气相色谱-串联质谱仪上分别进样，获得以标准溶液中戊苯吡菌胺、氟唑菌酰胺、吡唑萘菌胺、吡咪唑、呋吡菌胺的浓度为横坐标，再以混合标准工作溶液中戊苯吡菌胺、氟唑菌酰胺、吡唑萘菌胺、吡咪唑、呋吡菌胺的峰面积为纵坐标的工作曲线，还有获得可以确定母离子的戊苯吡菌胺、氟唑菌酰胺、吡唑萘菌胺、吡咪唑、呋吡菌胺的一级质谱图，确定母离子后，采用子离子扫描获得二级质谱图，然后从二级质谱图中选取定量离子和定性离子，然后用工作曲线对定量离子进行定量计算获得待测样品溶液中戊苯吡菌胺、氟唑菌酰胺、吡唑萘菌胺、吡咪唑、呋吡菌胺的浓度；所述的步骤（三）中气相色谱和串联质谱的参数条件如下：

色谱柱：SGE公司BPX35；30m×0.25mm×0.25μm

流速：1.0ml/min高纯氦

仪器：Agilent7890A-7000B

碰撞气：高纯氮：1.5ml/min，猝灭流量：2.25ml/min高纯氦

升温程序：50℃维持1min，以40℃/min升温至290℃，维持8min；

多模式进样口：50℃维持0.1min，并以600℃/min升温到300℃；

1分钟打开分流阀，流量60ml/min

离子化：EI源。