CN108469473B

CN108469473B - 一种利用rrlc-dad-esi-q-tof-ms检测金银花在大鼠血清中的代谢产物的方法

Info

Publication number: CN108469473B
Application number: CN201810134209.5A
Authority: CN
Inventors: 王晓; 王岱杰; 赵恒强; 朱姮; 纪文华; 闫慧娇
Original assignee: Shandong Analysis and Test Center
Current assignee: Shandong Analysis and Test Center
Priority date: 2018-02-09
Filing date: 2018-02-09
Publication date: 2020-10-02
Anticipated expiration: 2038-02-09
Also published as: CN108469473A

Abstract

本发明公开了一种利用RRLC‑DAD‑ESI‑Q‑TOF‑MS检测金银花在大鼠血清中的代谢产物的方法，从给药的大鼠中获取含金银花代谢产物的血清，采用提取溶剂提取血清中的代谢产物，然后对提取液采用RRLC‑DAD‑ESI‑Q‑TOF/MS技术进行检测。

Description

一种利用RRLC-DAD-ESI-Q-TOF-MS检测金银花在大鼠血清中的代谢产物的方法

技术领域

本发明属于分析测试领域，具体涉及一种利用RRLC-DAD-ESI-Q-TOF-MS检测金银花在大鼠血清中的代谢产物的方法。

背景技术

金银花为忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥花蕾或带初开的花，药用历史悠久，为临床常用大宗中药材。有关金银花化学成分研究很多，已从金银花中分离鉴定出百余种化学成分，主要有挥发油类、有机酸类、黄酮类、环烯醚萜类、三萜皂苷类等。中药金银花作为一种传统中草药，现今大部分临床制剂或者复方制剂均含有金银花成分。金银花性寒味甘，归肺、心、胃经，具有清热解毒和疏散风热的功效。可用于痈肿疔疮，喉痹，丹毒，热毒血痢，风热感冒，温病发热等症。现代药理研究表明，金银花化学成分种类较多，使其药理作用也复杂多样。

由于中药治疗作用的发挥依赖于多成分、多靶点的综合作用，因此，一个或两个指标成分不能代表中药整体质量，难以全面评价药材的质量。中药指纹图谱是基于大多数药材、道地药材或标准制剂而建立的，能够在一定程度上反映中药的化学组成及分布情况，但是，难以说明图谱与药效之间的关系。由于中药有效成分进入人体后与生物体之间的相互作用非常复杂，许多成分尽管在药材中含量很高，但是由于生物利用度低、代谢消除迅速等原因，并非发挥药效的真正贡献成分。中药血清药物化学研究引起了人们的广泛关注。中药血清药物化学是采用现代分析方法对含药血清中药源性成分进行定性定量分析，通过药效相关性实验确定真正的有效成分，并对有效成分的体内动态、代谢及消长规律进行研究，从而阐明整个复方的药动学特征。至今为止，关于金银花血清代谢成分的研究较少。

发明内容

针对上述现有技术中存在的技术问题，本发明的目的是提供一种利用RRLC-DAD-ESI-Q-TOF-MS检测金银花在大鼠血清中的代谢产物的方法。

为了解决以上技术问题，本发明的技术方案为：

一种利用RRLC-DAD-ESI-Q-TOF-MS检测金银花在大鼠血清中的代谢产物的方法，从给药的大鼠中获取含金银花代谢产物的血清，采用提取溶剂提取血清中的代谢产物，然后对提取液采用RRLC-DAD-ESI-Q-TOF/MS技术进行检测；

液相色谱条件为：色谱柱为Agilent SB-C18，3.0×100mm，1.8μm，流动相A为质量浓度为1.0％的甲酸乙腈溶液，流动相B为质量浓度为0.5％的甲酸水溶液，梯度洗脱：0～2min，5％A；2～10min，5～10％A；10～20min，10～18％A；20～30min，18～30％A；30～40min，30～38％A，40～50min，38～45％A；50～60min，45～50％A；60～61min，50～60％A；61～65min，60～65％A；65～70min，65～70％A；70～72min，70～90％A；72～82min，90％A；82～85min，90～100％A；85～95min，100％A；进样量：20μL，流速：0.3mL·min-1。

由于金银花在大鼠血清中的代谢产物种类很多，液相色谱检测过程中，这些组分能否成功分离以及如何成功分离是影响实验能否成功的关键因素。当采用Agilent SB-C18柱进行分离时，分离度较好，色谱峰较多，而进一步采用上面的梯度洗脱程序时，可以将大部分色谱峰成功分离开。而当在水相中加入0.5％甲酸和在乙腈中加入1.0％甲酸时，分离得到的色谱峰的对称性较好，峰型尖锐，顶端不分叉，为金银花在大鼠血清中的代谢产物的定性和定量分析奠定了基础。

由于金银花在大鼠血清中的代谢产物种类很多，多达40来种，各种产物之间能否成功分离与流速、固定相及分离柱的性质、流动相的性质、梯度洗脱程序等因素有关，40种左右的代谢产物中有很多产物具有类似的极性，将如此众多的产物成功分离并不是简单的通过有限次实验就可以实现的，还需要发明人对金银花中的成分，金银花在血清中的代谢情况，以及所有可能的产物的性质有较全面的了解。

优选的，液相色谱条件中，检测波长为254nm。

优选的，质谱条件为Agilent G6520A飞行时间质谱仪，流速为0.3mL·min-1。正离子电离模式，雾化气压力35psi，干燥气N2流速12.0mL·min-1，干燥气体温度325℃，毛细管电压4500V，裂解电压120V，锥孔电压65V，全扫描质荷比(m/z)范围50～1000；负离子电离模式，毛细管电压3500V，全扫描质荷比(m/z)范围50～1100，其它条件同正离子电离模式。

优选的，所述提取溶剂为甲醇和乙腈的混合溶剂，甲醇和乙腈的体积比为1:1。

由于提取液中的杂质严重影响金银花在大鼠血清中的代谢产物的种类和数量检测的准确性，所以需要彻底除去提取液中的杂质，对提取液的选取至关重要。本发明选择的提取溶剂可以将金银花在大鼠血清中的代谢产物较全面且有选择性的提取出来，将蛋白、脂类、糖类等内源性杂质屏蔽在外，保证了代谢产物检测的准确性和全面性。

优选的，采用提取溶剂提取代谢产物的方法为：将提取溶剂加入至血清样品中，涡旋震荡，在3-5℃下离心分离，取上清液即为提取液。

进一步优选的，涡旋震荡的时间为2-3min。

进一步优选的，离心分离的转速为10000rpm，离心分离的时间为6min。

进一步优选的，将所述提取液吹干，用50％甲醇水溶液复溶提取物，离心后，吸取上清液注入高效液相色谱仪进行检测。

更进一步优选的，离心分离的转速为10000rpm，离心分离的时间为6min。

本发明的有益效果为：

当采用Agilent SB-C18柱进行分离时，分离度较好，色谱峰较多，而进一步采用上面的梯度洗脱程序时，可以将大部分色谱峰成功分离开。而当在水相中加入0.5％甲酸和在乙腈中加入1.0％甲酸时，分离得到的色谱峰的对称性较好，峰型尖锐，顶端不分叉，为金银花在大鼠血清中的代谢产物的定性和定量分析奠定了基础。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。

图1是金银花大鼠血清提取物色谱图及总离子流图，A-金银花血清色谱图，B-金银花血清总离子流图(正、负离子)。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

材料与方法

1、材料

Agilent 1260高效液相色谱仪(美国Agilent公司)，配有四元梯度泵、在线脱气机、自动进样器、柱温箱、DAD检测器；Agilent G6520A飞行时间质谱仪，配有电喷雾离子源(美国Agilent公司)；CPA225D型十万分之一电子分析天平(德国Sartorius公司)；SB-5200D型高功率数控超声波仪(宁波新芝生物科技股份有限公司)；Vortex-Genie 2涡旋振荡器(美国Scientific Industries公司)；FW100型高速万能粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)。

甲醇(美国Tedia公司，色谱纯)，乙腈(德国Merck公司，色谱纯)，无水乙醇(国药集团，分析纯)，甲酸(美国ROE公司，色谱纯)，实验用水为Milli-Q超纯水(18.2MΩ)。

2、方法

1)金银花提取物的制备

取金银花100.02g，加入50％甲醇回流提取3次，每次10倍量料液比，趁热抽滤，合并三次滤液减压蒸发至干，得金银花提取物干粉38.42g。临用时，加20％PEG400水溶液溶解样品，配制成每毫升约相当于2.5g原药材的溶液(每毫升溶解约0.96g提取物)作为金银花提取物样品。

2)给药方案及样品采集

取雄性SD大鼠9只(每只重量220g左右)分为两组，第一组6只(给药组)和第二组3只(空白组)，实验室适应饲养3d。实验前禁食12h，给药组以每千克体重15mL的剂量灌胃金银花提取物，空白组给予相同剂量的蒸馏水作为空白对照。给药组的大鼠在给药30min后腹腔注射0.2mL 10％水合氯醛麻醉，每只大鼠肝门静脉取血6mL，10000rpm离心6min，分别取上层血清，合并后作为含药血清用于下一步实验或-80℃保存备用，空白组操作同前。

3)血清样品前处理

精确吸取上述含药血清1mL，加5mL甲醇-乙腈(1:1)混合试剂，涡旋振荡2min，在4℃下10000rpm离心6min。精确吸取上清液5mL，氮吹至干，取200μL 50％甲醇水溶液复溶样品，10000rpm离心6min，取上清液待测。

4)色谱条件

Agilent 1260高效液相色谱仪，Agilent SB-C18(3.0×100mm，1.8μm)柱。流动相A为乙腈(1.0％甲酸)，流动相B为水(0.5％甲酸)，梯度洗脱：0～2min，5％A；2～10min，5～10％A；10～20min，10～18％A；20～30min，18～30％A；30～40min，30～38％A，40～50min，38～45％A；50～60min，45～50％A；60～61min，50～60％A；61～65min，60～65％A；65～70min，65～70％A；70～72min，70～90％A；72～82min，90％A；82～85min，90～100％A；85～95min，100％A；进样量：20μL；流速：0.3mL·min-1；检测波长：254nm。

5)质谱条件

Agilent G6520A液相色谱-质谱联用仪，流速为0.3mL·min-1。正离子电离模式，雾化气压力35psi，干燥气(N₂)流速12.0mL·min-1，干燥气体温度325℃，毛细管电压4500V，裂解电压120V，锥孔电压65V，全扫描质荷比(m/z)范围50～1000。负离子电离模式，毛细管电压3500V，全扫描质荷比(m/z)范围50～1100，其它条件同正离子电离模式。

3、结果与分析

1)提取条件的优化

血清样品进样之前需要经过前处理除去蛋白、脂类、糖类等内源性杂质，本实验考察了提取溶剂、提取时间、提取次数等因素对提取效率的影响。

2)提取溶剂的选择

精密吸取上述方法中含药血清样品6份，每份200μL，分成三组，每组两份样品。分别加5倍量的甲醇、乙腈和甲醇-乙腈(1:1)溶剂，涡旋振荡2min，在4℃下10000rpm离心6min，精确吸取上清液200μL，氮吹至干，取200μL 50％甲醇水溶液复溶样品，10000rpm离心6min，精密吸取上清液20μL注入高效液相色谱仪分析。综合比较分析，采用甲醇-乙腈(1:1)作为提取溶剂时，色谱峰较多、信号较强，故本发明选择甲醇-乙腈(1:1)作为提取金银花入血成分及沉淀血清中蛋白及其他内源性杂质的提取溶剂。

3)提取时间的优化

精密吸取上述方法中含药血清样品6份，每份200μL，分成3组，每组2份样品。分别加5倍量的甲醇-乙腈(1:1)溶剂，分别涡旋振荡1min、2min、5min，在4℃下10000rpm离心6min，精确吸取上清液200μL，氮吹至干，取200μL 50％甲醇水溶液复溶样品，10000rpm离心6min，精密吸取上清液20μL注入高效液相色谱仪分析。结果显示2min和5min提取效率略高于1min，但采用2min和5min提取无明显差别，故选择时间较短的2min作为提取时间。

4)提取次数的优化

精密吸取上述方法中含药血清样品4份，每份200μL，分成2组，每组2份样品。第一组样品分别加5倍量的甲醇-乙腈(1:1)溶剂，分别涡旋振荡2min，在4℃下10000rpm离心6min，精确吸取上清液200μL，氮吹至干，取200μL 50％甲醇水溶液复溶样品，10000rpm离心6min，精密吸取上清液(样品1)20μL注入高效液相色谱仪分析。第二组样品加5倍量的甲醇-乙腈(1:1)溶剂，分别涡旋振荡2min，在4℃下10000rpm离心6min，精确吸取上清液200μL；离心后的下层沉淀再次加入5倍量的甲醇-乙腈(1:1)溶剂同样方法处理一次，合并两次上清液，氮吹至干，取200μL 50％甲醇水溶液复溶样品，10000rpm离心6min，精密吸取上清液(样品2)20μL注入高效液相色谱仪分析。上述2种样品分析结果显示，样品1和2的色谱图中几乎无明显的色谱峰出现，说明含药血清提取1次已达到很好的提取效果，无需多次提取。

5)色谱条件的优化

本发明考察比较了Agilent SB C18(3.0×100mm，1.8μm)，Agilent XDB C18(4.6×50mm，1.8μm)柱和Accucore C18(2.1×100mm，2.6μm)柱，共三个不同类型C18柱对金银花血清提取物的分离效果，结果发现，采用Agilent SB C18(3.0×100mm，1.8μm)柱时分离度较好、色谱峰较多。因此，选用Agilent SB C18(3.0×100mm，1.8μm)柱对金银花血清提取物进行色谱分离。

选用洗脱范围较广的乙腈-水作为流动相、梯度洗脱对金银花血清提取物进行色谱分离。考虑金银花中含有有机酸类和黄酮类等酸性成分，其入血成分及其代谢产物应该也含有此两类成分，色谱峰容易拖尾，考虑在流动相中加入酸来改善色谱峰峰型。考察了水相和乙腈相中分别加入不同比例的甲酸(0.1％，0.2％，0.5％，0.8％和1.0％)对金银花血清提取物色谱分离的影响，结果发现水相中加入0.5％甲酸和乙腈中加入1.0％甲酸时色谱峰对称性较好、峰型尖锐、顶端不分叉。另外，先后调节柱温箱温度在25℃，30℃和35℃时比较得出，当柱温为30℃时，色谱峰分离度和峰型较好。在波长选择上，经二极管阵列检测器考察各类成分在不同波长(190～600nm)下的紫外吸收波长，结果表明，在254nm下各类成分均具有吸收，且各化合物具有较好的分离度和灵敏度，因此选择254nm作为金银花提取物的检测波长。在优化后的色谱条件下，金银花大鼠血清提取物的色谱图及总离子流图如图1所示。

6)金银花入血成分的DAD-ESI-Q-TOF/MS鉴别

在优化后的色谱条件下，采用RRLC-DAD-ESI-Q-TOF/MS技术，对金银花入学成分中化学成分进行高分辨质谱鉴别，可以快速准确的获得化合物的精确分子量信息。ESI-Q-TOF/MS的一级质谱给出化合物的准分子离子峰，由分子离子峰可以确定化合物分子量，结合二级质谱的碎片信息，参考相关文献可以进一步对各化合物进行确认。结果如表1所示。

表1金银花血清提取物的RRLC-DAD-ESI-Q-TOF/MS测量结果

本发明利用RRLC-DAD-ESI-Q-TOF-MS检测方法，检测出金银花中入血或代谢成分共40种，其中鉴别出15种。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims

1.一种利用RRLC-DAD-ESI-Q-TOF-MS检测金银花在大鼠血清中的代谢产物的方法，其特征在于：从给药的大鼠中获取含金银花代谢产物的血清，采用提取溶剂提取血清中的代谢产物，然后对提取液采用RRLC-DAD-ESI-Q-TOF/MS技术进行检测；

液相色谱条件为：色谱柱为Agilent SB-C18，3.0×100mm，1.8μm，流动相A为质量浓度为1.0％的甲酸乙腈溶液，流动相B为质量浓度为0.5％的甲酸水溶液，梯度洗脱：0～2min，5％A；2～10min，5～10％A；10～20min，10～18％A；20～30min，18～30％A；30～40min，30～38％A，40～50min，38～45％A；50～60min，45～50％A；60～61min，50～60％A；61～65min，60～65％A；65～70min，65～70％A；70～72min，70～90％A；72～82min，90％A；82～85min，90～100％A；85～95min，100％A；进样量：20μL，流速：0.3mL·min-1；

所述提取溶剂为甲醇和乙腈的混合溶剂，甲醇和乙腈的体积比为1:1。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：液相色谱条件中，检测波长为254nm。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：质谱条件为采用Agilent G6520A飞行时间质谱仪，正离子电离模式，雾化气压力35psi，干燥气N2流速12.0mL·min-1，干燥气体温度325℃，毛细管电压4500V，裂解电压120V，锥孔电压65V，全扫描质荷比(m/z)范围50～1000；负离子电离模式，毛细管电压3500V，全扫描质荷比(m/z)范围50～1100，其它条件同正离子电离模式。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：采用提取溶剂提取代谢产物的方法为：将提取溶剂加入至血清样品中，涡旋震荡，在3-5℃下离心分离，取上清液即为提取液。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：涡旋震荡的时间为2-3min。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：离心分离的转速为10000rpm，离心分离的时间为6min。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法还包括将所述提取液吹干，用50％甲醇水溶液复溶提取物，离心后，吸取上清液注入高效液相色谱仪进行检测。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：离心分离的转速为10000rpm，离心分离的时间为6min。