CN112505221A - 基于uhplc-q-tof/ms识别消痰通腑方化学成分的分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于UHPLC‑Q‑TOF/MS识别消痰通腑方化学成分的分析方法，包括：A组分提取：醇提取或水提得免煎剂提取液；B样品前处理：提取液3000r/min离心，上层溶液15000r/min离心，取适量上清液于棕色进样瓶中；C分析：色谱条件：选用Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱，柱温30℃，流速0.3mL/min，进样量1μL，检测波长254nm，流动相：含0.1％甲酸的水溶液作为A相，乙腈作为B相，进行梯度洗脱；质谱条件：ESI离子源，分别在正、负离子模式下采集数据；数据采集范围m/z 100～1700，离子源温度350℃，正离子模式下毛细管电压3.5kV、负离子模式下4.0kV，雾化气压力45Psi，干燥气流速11L/min，鞘气流速11L/min，鞘气温度350℃，碎片电压140V。
Description
技术领域
本发明涉及成分分析技术领域，涉及中药配方化学成分的分析方法，尤其涉及基于 UHPLC-Q-TOF/MS识别消痰通腑方化学成分的分析方法。
背景技术
用于胃肠癌前病变患者的消痰通腑方，能够延缓胃肠癌前患者向肿瘤的进展，同时对 脓毒症等危重症患者的胃肠功能恢复有较好疗效(参见参考文献1-9)。该方剂由法半夏、 生大黄、制大黄、制南星、重楼和黄连等6种中药配伍组成，法半夏、制大黄为主药，旨于消痰止呕、泄下通俯之意。半夏乃燥湿化痰、降逆止呕、消痞散结之良药，法半夏为半 夏的炮制品，倍其化痰之力；制大黄经生品炒制后，泻下力缓，能通达肠腑而推陈制新， 又不伤正气，二者合用既燥湿化痰，又缓消积滞，达消痰通腑之功。黄连既能泻脾胃之火， 又可燥痰饮之湿。
目前对该方剂的研究集中在药理功效方面，尚无对该方剂化学成分、有效成分的相关 研究报道。寻找中药复方的临床效应基础，是长期困扰中医人临床研究的难点。中药药效 的发挥是多种化学成分协同作用的结果，明确中药中固有的化学成分及其含量(体外成分 群)是药效物质研究的基础。
《中国药典》2020版仅仅只对消痰通腑方所含6种药材中的大黄、制南星、重楼和黄连的相关化合物进行含量检测，从而对药材进行质量鉴定：大黄为芦荟大黄素、大黄酸、 大黄素、大黄酚和大黄素甲醚；制南星为芹菜素，重楼为重楼皂苷I、重楼皂苷II、重楼 皂苷VI和重楼皂苷VII；黄连为小檗碱、表小檗碱和黄连碱。
中药方剂在中医临床实践中形成了以汤剂为主的口服给药方式，药材煎煮制备获得复 方时是否会导致化学成分的改变，消痰通腑方免煎剂是否也需要对上述化合物进行检测来 确定方剂的质量均未知。再有，中药方剂具有多成分、多靶点、多途径、整合调节的作用 特点，因此，有必要对消痰通腑方所含所有药材的化学成分群进行分析，初步确定其化学 成分特征，为其质量控制提供数据参考。
近年来，UHPLC-Q-TOF/MS技术以其高灵敏度、准确性和高分离速率的优点，并结合其既能对化合物进行质谱高分辨分析又能对目标离子进行二级质谱碎片分析的特点，已广泛用于中药复方复杂体系化合物的快速分析鉴定，本发明也基于该项技术进行。
发明内容
本发明的目的在于基于UHPLC-Q-TOF/MS技术开展中药复方体外成分的鉴别、定量分析，明确消痰通腑方免煎剂的化学成分，为下一步阐明药效物质筛选提供科学依据。
本发明提供的基于UHPLC-Q-TOF/MS识别消痰通腑方化学成分的分析方法中，所述消痰通腑方由法半夏、生大黄、制大黄、制南星、重楼和黄连配伍组成，分析方法包括如 下步骤：
A、组分提取
采用醇提取或水提的方式获得免煎剂提取液。
醇提取的方式如下：精密称定免煎剂摇匀、密塞，加入体积为免煎剂质量100倍的70％甲醇，称定质量后超声提取30min，放至室温，再次称定质量，并用甲醇补足减失的 质量；
水提的方式如下：精密称定免煎剂，用100C开水搅拌5min，超声30min得水提液。
本发明中采用水提和醇提两种方式进行中药组分提取，原因在于，该中药方剂以水冲 服的方式，而70％甲醇提取物能够识别更多的化合物，比水提液获得的化合物多10个， 且化合物的峰面积也较高。与70％甲醇提取方式获得化合物相比，水提液获得的是即将 吸收入血的体外化合物群的信息，而70％甲醇提取液获得的则是方剂尽可能多的化合物 的信息，有助于解析其多成分的特定。
B、样品前处理
取提取液以3000r/min的转速离心10min，取上层溶液15000r/min转速离心10min，取适量上清液(优选200微升)于棕色进样小瓶中，待UHPLC-Q-TOF/MS分析。
C、UHPLC-Q-TOF/MS分析
色谱条件：Agilent 1290Infinity型超高效液相色谱，选用Waters ACQUITY UPLCBEH C18色谱柱，柱温：30℃，流速：0.3mL/min，进样量：1μL，检测波长：254nm，流动 相：含0.1％甲酸的水溶液作为A相，乙腈作为B相，进行梯度洗脱，程序如下：
质谱条件：Agilent 6530型四极杆-飞行时间串联质谱仪，ESI离子源，分别在正、负离 子模式下采集数据；数据采集范围m/z 100～1700，离子源温度350℃，正离子模式下毛细 管电压3.5kV、负离子模式下4.0kV，雾化气压力45Psi，干燥气流速11L/min，鞘气流速11L/min，鞘气温度350℃，碎片电压140V，
根据标准品和在线获得的化合物质谱数据，得到法半夏、生大黄或制大黄、制南星、 重楼以及黄连的化学组分。
进一步，在本发明提供的基于UHPLC-Q-TOF/MS识别消痰通腑方化学成分的分析方法中，还包括配置对照品溶液的步骤，既用于作为标准对照，又用于进行方法精密度验证，具体配置方法如下：称取葫芦巴碱、柠檬酸、奎宁酸、对香豆酸、大黄素甲醚、异佛莱心 苷、芹糖异甘草苷、表小檗碱、甘草酸、大黄酸、重楼皂苷II、重楼皂苷H、重楼皂苷VI、 芦荟大黄素、薯蓣皂苷、重楼皂苷I和大黄酚标准品，加入甲醇分别制成每1mL含对照品1 mg的储备溶液；精密吸取上述储备溶液各10μL，置于1.5mL离心管中混合，涡旋混匀， 加入甲醇配制成各标准品浓度分别为10μg/mL的混合标准溶液。
通过上述分析方法可分析得到55种化合物，其中，精氨酸、奎宁酸、柠檬酸、黄连碱、 格兰地新、绿原酸、木犀草素、色氨酸共8个化合物来自黄连；脱氧腺苷、薯蓣皂苷、重楼皂苷G、polyphylloside III、重楼皂苷II、纤细薯蓣皂苷、重楼皂苷H、重楼皂苷VI、重楼皂苷I共9个化合物来自重楼；异亮氨酸、苯丙氨酸、夏佛托苷、秋水仙碱、胡萝卜苷共5 个化合物来自天南星；鼠李糖甘草苷、异佛莱心苷、芹糖异甘草苷、异甘草苷、甘草皂苷 G2、甘草酸共6个化合物来自法半夏；没食子酸-3-O-β-D-葡萄糖苷、没食子酸、对香豆酸 -O-葡萄糖苷、儿茶素-O-葡萄糖苷/表儿茶素-O-葡萄糖苷、原花青素B2、儿茶素、阿魏酸、 4-(4'-羟基苯基)-2-丁酮-O-阿魏酰-没食子酰-葡萄糖苷、没食子酸-O-没食子酰基葡萄糖苷、 对香豆酸、大黄素甲醚、2-甲基-5-羧甲基-7-羟基色原酮、表儿茶素没食子酸酯、大黄酸-8-O- 葡萄糖苷、异莲花掌苷、2-O-桂皮-β-D-葡萄糖苷、2-(2′-羟丙基)-5-甲基-7-羟基色原酮、 番泻苷B、桂皮酸-O-没食子酰-葡萄糖苷、6-甲氧基酸模素-8-O-β-D-葡萄糖苷、芦荟大黄 素-3-羟甲基-O-葡萄糖苷、大黄酚-8-O-葡萄糖苷、大黄素甲醚-8-O--D葡萄糖苷、决明柯酮 -O-乙酰基葡萄糖苷、大黄酸、芦荟大黄素、大黄酚共27个化合物来自生大黄或制大黄，具 体参见表2。
本发明的有益保障及效果如下：
因此，本研究基于UHPLC-Q-TOF/MS技术开展中药复方体外成分的鉴别、定量分析，对消痰通腑方免煎剂中的六种配方的化学成分进行具体分析。具有快捷、简便、易行，样 品用量小和高通量分析等特点，且样品前处理简单，所建立的方法可用于快速识别消痰通 腑方的免煎剂的化学成分，为临床用药的安全、有效提供准确的参考依据，为下一步阐明 药效物质筛选提供科学依据。
附图说明
图1为正离子模式下消痰通腑方在不同流动相体系的UHPLC-Q-TOF/MS色谱图：(A)甲醇-水；(B)乙腈-水；(C)甲醇-水(含0.1％甲酸)；(D)乙腈-水(含0.1％甲酸)；
图2为正离子模式下消痰通腑方在乙腈-水(含0.1％甲酸)流动相的 UHPLC-Q-TOF/MS色谱图：(A)0.3mL/min；(B)0.4mL/min；(C)0.5mL/min。
图3为正离子模式下消痰通腑方在乙腈-水(含0.1％甲酸)流动相的 UHPLC-Q-TOF/MS色谱图：(A)柱温25C；(B)柱温30C；(C)柱温35C。
图4为正离子模式下消痰通腑方在乙腈-水(含0.1％甲酸)流动相的 UHPLC-Q-TOF/MS色谱图：(A)210nm；(B)254nm；(C)360nm。
图5为正离子模式下消痰通腑方不同质谱条件的UHPLC-Q-TOF/MS色谱图：(A)鞘气流速11L/min，(B)鞘气流速10L/min，(C)鞘气温度350C，(D)鞘气温度320C。
图6为正离子模式下消痰通腑方在不同CE值下的UHPLC-Q-TOF/MS色谱图：(A)10V；(B)20V；(C)30V。
图7为混合标准品的UHPLC-Q-TOF/MS色谱图：(A)正离子模式；(B)负离子模 式。
图8为消痰通腑方的UHPLC-Q-TOF/MS色谱图：(A)水提液正离子模式；(B)水 提液负离子模式；(C)70％甲醇提取物正离子模式；(D)70％甲醇提取物负离子模式。
具体实施方式
现结合实施例和附图，对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。
本发明所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。下列实施例中未注明具体条 件的实验方法，通常按照常规条件，或按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除 非另外说明，否则百分比和份数按体积计算。
一、实验材料
1.1 UHPLC-Q-TOF/MS系统
Agilent 1290Infinity型超高效液相色谱和Agilent 6530型四极杆-飞行时间串联质谱仪 (UHPLC-Q-TOF/MS，Agilent，美国)，CPA255D型1/10万电子天平(Sartorius，德国)， Lyovapor L-200冷冻干燥机(BUCHI，瑞士)，Eppendorf mini spin离心机(Eppendorf， 德国)，Eppendorf 5430r离心机(Eppendorf，德国)，SK7200H型超声仪(上海科导超声 仪器有限公司)，Milli-Q型纯化水系统(Millipore，美国)。
1.2试剂与药材
甘草酸、芦荟大黄素、大黄素甲醚、大黄酚、大黄酸、对香豆酸、葫芦巴碱、重楼皂苷I、重楼皂苷II、重楼皂苷VI、薯蓣皂苷、重楼皂苷H、表小檗碱、奎宁酸、柠檬酸、 异佛莱心苷、芹糖异甘草苷等均购自上海紫霞生物科技有限公司。水为去离子水，甲醇、 乙腈、甲酸、为质谱纯(德国E.Merck公司)，其余试剂均为分析纯。
消痰通腑免煎剂由法半夏、生大黄、制大黄等药物组成。由江阴制药厂统一生产，长 征医院监制，生产批号：20200420。
二、药液准备及分析
1、药材提取
醇取：精密称定免煎剂0.5g，置于具塞锥形瓶中，摇匀，密塞，加入70％甲醇50mL，称定质量；超声提取30min，放至室温，再次称定质量，并用甲醇补足减失的质量。
水提取：精密称定免煎剂0.5g，用100℃开水搅拌5min，超声30min得水提液。
2、样品前处理
取提取液以3000r/min的转速离心10min，取上层溶液于1.5ml离心管中，15000r/min 转速离心10min，取上清液200μL于棕色进样小瓶中，待UHPLC-Q-TOF/MS分析。
3、对照品溶液制备
精密称取适量甘草酸、芦荟大黄素等对照品，加甲醇分别制成每1mL含对照品1mg的储备溶液。精密吸取上述储备溶液各10μL，置于1.5mL离心管中混合，涡旋混匀，加 入甲醇配制成各标准品浓度分别为10μg/mL的混合标准溶液。
4、化合物分析库的建立和数据分析
该方剂各味药的成分信息从已有的药材化合物成分分析文献，确保数据库中收录的化 合物能够在已报道文章中检索可得，由此基于Agilent自带的defult文档建立方剂化合物 数据库。数据分析采用Agilent MassHunter Qualitative Analysis 10.0软件进行。
5、UHPLC-Q-TOF/MS分析条件
色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(2.1mm×100mm，1.7μm)
柱温：30℃
流速：0.3mL/min
进样量：1μL
检测波长：254nm
流动相：流动相A相(0.1％甲酸-水)-B相(乙腈)，梯度洗脱程序见下表1。
分析时间：30min，后运行时间：3min
表1流动相梯度洗脱程序
质谱条件：ESI离子源，分别在正、负离子模式下采集数据。数据采集范围m/z 100～1700， 离子源温度350℃，毛细管电压3.5kV(正离子)、4.0kV(负离子)，雾化气压力45Psi， 干燥气流速11L/min，鞘气流速11L/min，鞘气温度350℃，碎片电压140V。
三、最优分析条件摸索
3.1提取液前处理条件的选择
为了实现化合物的高效、快速提取，在选定的条件下，对影响目标分析物提取效率的 一些因素进行了优化，包括超声提取溶剂(水、70％及100％甲醇溶液)、提取时间(30、45和60min)、样品与溶剂的比例(1:5、1:10和1:20)。
结果表明，以10倍溶剂即50ml的75％甲醇溶液超声提取30min为最佳样品制备方法，故提取方法确定为0.5g药材加入75％甲醇溶液50mL，超声提取30min，通过此法 可以获得最多化合物信息的提取方法。
3.2色谱柱的选择
由于超高效液相色谱(UHPLC)的设计是为了使得液相系统能够承受较小粒径(<2μm)固定相的色谱柱，在使用较短的色谱柱或较高的流速进行分离时获得较高的分辨率 和灵敏度，因此本发明考察了常用的亚2μm的色谱柱对方剂所含化学成分的分离效果。
结果表明，相对于Agilent Zobax SB-C18(3.0×100mm,1.8μm)和Waters ACQUITYUPLC HSS T3色谱柱(100×2.1mm，1.7μm)，使用Waters ACQUITY UPLC BEH C18 (2.1mm×100mm，1.7μm)能获得分析物的最佳分离效率和响应信号。
3.3流动相、柱温和检测波长等的选择
为了获得分离效果好、总离子流强的色谱图，选择了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-水(含 0.1％甲酸)和乙腈-水(含0.1％甲酸)流动相体系进行分析。结果表明，在表1所示的优化梯度模式下，乙腈-0.1％甲酸水溶液组成的流动相在正、负离子扫描模式下均表现出良好的分离效果和丰富的信号响应(图1)。
本试验还考察了不同流速(0.3、0.4和0.5mL/min)和不同柱温(25、30和35℃) 对于分析效果的影响。结果显示，当柱温设置在30℃，流速为0.3ml/min时，色谱峰峰 形尖锐、色谱图基线稳定，柱压较为稳定(图2和图3)。
采用二极管阵列检测器，根据文献报道分别将检测波长设置在210、254和360nm，结果发现待测溶液在254nm波长时所能检测成分有较大吸收峰(图4)，因此最终选择 254nm作为检测波长。
3.4质谱条件的优化
方剂中化合物结构的巨大多样性使得在MS分析中很难对所有化学成分做出良好的 响应。Agilent QTOF 6530采用了带有喷射流技术的ESI源，增加了对化合物的灵敏度。一般来说，正、负离子模式的毛细管电压分别设置为4000V和3500V，因此本实验主要 对鞘气流速、鞘气温度(图5)和二级质谱的碰撞电压(CE值，图6)进行了优化，以 获得最多的化合物信号。
结果显示，鞘气流速11L/min、鞘气温度350℃(图5)、碰撞电压为10V(图6)时 分析效果最好。
3.5精密度考察
首先采用UHPLC-Q-TOF/MS技术对17个标准品化合物进行分析，包括葫芦巴碱、 柠檬酸、奎宁酸、对香豆酸、大黄素甲醚、异佛莱心苷、芹糖异甘草苷、表小檗碱、甘草 酸、大黄酸、重楼皂苷II、重楼皂苷H、重楼皂苷VI、芦荟大黄素、薯蓣皂苷、重楼皂 苷I和大黄酚，连续进样6次，记录峰面积。实验得到了混合标准品的正、负离子色谱图(图7)，化合物的峰面积和保留时间的RSD均小于3.0％，表明仪器和方法的精密度良 好。
3.6化合物的识别
在全扫描质谱图中，大多数标准品化合物在正模式下显示[M+H]+离子，或在负模式 下显示[M-H]-。由于流动相中存在Na+和甲酸，部分化合物中观察到[M+Na]+和 [M+HCOOH-H]-离子，少许化合物观察到[M+K]+、[M+NH4]+及[M+CH3COOH-H]-。化合 物的鉴定首先使用Agilent MassHunter软件中的按化学式查找(Findby Formula)功能， 根据精确质量、同位素丰度，以及上述分子离子峰进行鉴定。
当有标准品时，通过比较其在图谱上的保留时间和m/z信息与标准品的相关信息进行 鉴别。在没有标准品的情况下，主要根据质谱信息(包括化合物二级质谱信息)和参考文 献进行初步的鉴定。
根据标准品和在线获得的化合物质谱数据，鉴定或初步鉴定了55个化合物(图8)。其中，黄连碱、格兰地新、绿原酸、色氨酸等8个化合物来自黄连，薯蓣皂苷、重楼皂苷 II等9个化合物来自重楼，大黄酸、大黄酚等27个化合物来自生大黄或制大黄，夏佛托 苷、秋水仙碱等5个化合物来自天南星，鼠李糖甘草苷、异佛莱心苷等6个化合物来自法 半夏，具体参见表2。
根据质谱信息(包括化合物二级质谱信息)和参考文献进行初步的鉴定时，通过导入 已建立的方剂化合物数据库，利用Agilent MassHunter Qualitative Analysis 10.0软件进行 识别，并结合massbank、pubchem、chemspider等在线数据库进行辅助分析，根据化合物 准确分子量及碎片信息进行判断，排除假阳性结果。
例如化合物1：通过数据库识别到0.906min的分子离子峰在正负离子模式下分别出 现m/z175.1193的[M+H]+离子和m/z173.1036的[M-H]-离子，软件自动生成分子式中匹配度最高分值的为C6H14N4O2，说明其可能为精氨酸。其次，结合massbank在线数据库 对其二级碎片离子进行查找，发现正离子模式下可识别到158、116碎片离子，负离子模 式下可识别到173、131等碎片离子，因此推断化合物1为精氨酸，结合我们建立化合物 数据库信息，判断该化合物来源于黄连。
化合物12：通过数据库识别到1.394min的分子离子峰在正负离子模式下分别出现m/z 333.0878的[M+H]+离子和m/z 331.0672的[M-H]-离子，软件自动生成分子式中匹配 度最高分值的为C13H16O10。其次，化合物产生m/z 169没食子酸的特征碎片离子，而大 黄中的简单酚酸类成分基本结构主要是没食子酸、对香豆酸、阿魏酸、对羟基苯丙酸等， 因此推测该化合物为来源于大黄的没食子酸-3-O-β-D-葡萄糖苷。
化合物44：负离子模式下在17.208min识别到m/z 837.3886的[M-H]-离子，软件自动生成分子式中匹配度最高分值的为C42H62O17。其次，化合物产生m/z 351的离子峰， 为其结构中2分子的葡萄糖醛酸苷键断裂形成的碎片离子m/z 351[2×C6H8O6-H]-离子， 因此推断化合物44为甘草皂苷G2，来源于法半夏。
考虑到此中药方剂以水冲服的方式，本研究还同步分析了水提液得化学成分，结果同 样参见图8和表2。结果表明，70％甲醇提取物能够识别的化合物比水提液获得的化合物 多10个，且化合物的峰面积也较高。与70％甲醇提取方式获得化合物相比，水提液获得的是即将吸收入血的体外化合物群的信息，而70％甲醇提取液获得的则是方剂尽可能多的化合物的信息，是有助于解析其多成分的特定，保证消痰通腑免煎剂所含有的化合物的准确性，有助于为下一步免煎剂的质量控制。
表2方剂中化学成份的鉴定分析结果
*表示在水提液中未检测出的化合物。
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以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施 例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型 或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
Claims (5)
1.基于UHPLC-Q-TOF/MS识别消痰通腑方化学成分的分析方法，所述消痰通腑方由法半夏、生大黄、制大黄、制南星、重楼和黄连配伍组成，其特征在于，包括如下步骤：
A、组分提取
采用醇提取或水提的方式获得免煎剂提取液；
B、样品前处理
取提取液以3000r/min的转速离心，取上层溶液15000r/min转速离心，取适量上清液于棕色进样小瓶中，待UHPLC-Q-TOF/MS分析；
C、UHPLC-Q-TOF/MS分析
色谱条件：选用Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱，柱温：30℃，流速：0.3mL/min，进样量：1μL，检测波长：254nm，流动相：含0.1％甲酸的水溶液作为A相，乙腈作为B相，进行梯度洗脱，
质谱条件：ESI离子源，分别在正、负离子模式下采集数据；数据采集范围m/z 100～1700，离子源温度350℃，正离子模式下毛细管电压3.5kV、负离子模式下4.0kV，雾化气压力45Psi，干燥气流速11L/min，鞘气流速11L/min，鞘气温度350℃，碎片电压140V，
根据标准品和在线获得的化合物质谱数据，得到法半夏、生大黄或制大黄、制南星、重楼以及黄连的化学组分。
2.根据权利要求1所述的基于UHPLC-Q-TOF/MS识别消痰通腑方化学成分的分析方法，其特征在于，还包括配置对照品溶液的步骤：
称取葫芦巴碱、柠檬酸、奎宁酸、对香豆酸、大黄素甲醚、异佛莱心苷、芹糖异甘草苷、表小檗碱、甘草酸、大黄酸、重楼皂苷II、重楼皂苷H、重楼皂苷VI、芦荟大黄素、薯蓣皂苷、重楼皂苷I和大黄酚标准品，加入甲醇分别制成每1mL含对照品1mg的储备溶液；精密吸取上述储备溶液各10μL，置于1.5mL离心管中混合，涡旋混匀，加入甲醇配制成各标准品浓度分别为10μg/mL的混合标准溶液。
3.根据权利要求1所述的基于UHPLC-Q-TOF/MS识别消痰通腑方化学成分的分析方法，其特征在于，
其中，步骤A中，醇提取的方式如下：精密称定免煎剂摇匀、密塞，加入体积为免煎剂质量100倍的70％甲醇，称定质量后超声提取30min，放至室温，再次称定质量，并用甲醇补足减失的质量；
水提的方式如下：精密称定免煎剂，用100C开水搅拌5min，超声30min得水提液。
4.根据权利要求1所述的基于UHPLC-Q-TOF/MS识别消痰通腑方化学成分的分析方法，其特征在于：
其中，步骤B中，两次离心时间均为10min。
5.根据权利要求1所述的基于UHPLC-Q-TOF/MS识别消痰通腑方化学成分的分析方法，其特征在于：
其中，步骤C中，色谱分析时，进行梯度洗脱的程序如下：
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