CN1569138A - 具有降血糖作用的牛蒡子提取物的制备方法 - Google Patents

具有降血糖作用的牛蒡子提取物的制备方法 Download PDF

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CN1569138A CN 200410018283 CN200410018283A CN1569138A CN 1569138 A CN1569138 A CN 1569138A CN 200410018283 CN200410018283 CN 200410018283 CN 200410018283 A CN200410018283 A CN 200410018283A CN 1569138 A CN1569138 A CN 1569138A
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邱明丰
赵爱华
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Abstract

一种用于中药制备技术领域具有降血糖作用的牛蒡子提取物的制备方法。取牛蒡子药材，粉碎成粗粉，加6～8倍量的石油醚、正己烷或环己烷浸泡过夜，回流提取3～6h脱脂，过滤。滤渣加30％－95％乙醇5～10倍量，浸泡过夜，60℃～90℃提取2～3次，每次1～3h，过滤，合并滤液，浓缩至60℃下相对密度为1.00～1.15，喷雾干燥，得含水量小于5％、收率为10％～25％的牛蒡子提取物。该提取物含有牛蒡甙，牛蒡甙元，罗汉松脂素，Lappaol A，Lappaol C，Lappaol F，LappaolH，Arctignan E，β－谷甾醇和胡萝卜甙10种化合物。该提取物具有显著降血糖作用，成本低廉，可用于治疗糖尿病，具有广阔的应用前景。

Description

具有降血糖作用的牛蒡子提取物的制备方法
技术领域
本发明涉及一种提取物的制备方法，具体涉及一种具有降血糖作用的牛蒡子提取物的制备方法。用于中药制备技术领域。
背景技术
牛蒡子为《中国药典》2000年版一部收载的中药，属于辛凉解表类中药，具有疏散风热、宣肺透疹、解毒利咽的功能，用于风热感冒、咳嗽痰多、麻疹、风疹、咽喉肿痛、痄腮丹毒、痈肿疮毒，用量为6～12g。
随着生活水平的提高和人口的老龄化，糖尿病已经成为一种多发病、常见病，发病率呈现逐年上升趋势。无论在发达国家还是发展中国家，糖尿病的发病率都在急剧上升。糖尿病已经成为继肿瘤、心血管疾病之后的第三大严重威胁人类健康的疾病，被WHO列为世界三大顽症之一。目前，全球已确诊的II型糖尿病患者近2亿人，我国患者已超过6000万人；21世纪II型糖尿病将在中国、印度等发展中国家流行，到2005年，全球糖尿病患者将突破3亿，我国糖尿病患者总数将接近1亿，成为世界上糖尿病患者人数仅次于印度的第二大国。
中药中天然的降血糖物质可以直接缓解该类疾病的症状并提高疾病的整体治疗效果，并能避免化学或激素类药物的长期使用带来的种种毒副作用，有着独特的优势。
研究表明，牛蒡子的乙醇提取物具有显著的降血糖作用，并从中分离到牛蒡甙(arctiin)，牛蒡甙元(arctigenin)，罗汉松脂素，Lappaol A，Lappaol C，LappaolF，Lappaol H，Arctignan E，β-谷甾醇和胡萝卜甙10种化合物。牛蒡子提取物具有降血糖作用，在糖尿病的治疗方面将有较为广阔的应用前景。经对现有技术文献的检索，尚未发现有关具有降血糖作用的牛蒡子提取物的制备方法的文献报道。
发明内容
本发明的目的在于针对常见、多发、重大疾病“糖尿病”的治疗，提供一种具有降血糖作用的牛蒡子提取物的制备方法，使用该方法制备的牛蒡子提取物具有显著的降血糖作用，且无毒副作用、成本低。
本发明是通过以下技术方案实现的，取牛蒡子药材，粉碎成粗粉，加6～8倍量的石油醚、正己烷或环己烷浸泡过夜，回流提取3～6h脱脂，过滤。滤渣加30％-95％乙醇5～10倍量，浸泡过夜，60℃～90℃提取2～3次，每次1～3h，过滤，合并滤液，浓缩至相对密度1.00～1.15(60℃测定)，喷雾干燥，得含水量小于5％、收率为10％～25％的牛蒡子提取物。
按上述方法制备的牛蒡子提取物含有牛蒡甙，牛蒡甙元，罗汉松脂素，LappaolA，Lappaol C，Lappaol F，Lappaol H，Arctignan E，β-谷甾醇和胡萝卜甙10种化合物。
本发明的优选条件为：取牛蒡子药材，粉碎成粗粉，加石油醚、正己烷或环己烷6～8倍量浸泡过夜，回流提取4～6h脱脂，过滤。滤渣加60％-95％乙醇5～10倍量，浸泡过夜，75℃～85℃提取2～3次；每次2～3h；过滤，合并滤液，浓缩至相对密度1.05～1.15(60℃测定)，经喷雾干燥，能够获得收率为12％～23％的牛蒡子提取物。
所述的喷雾干燥，其条件为：进风温度为185℃～235℃，出风温度为80℃～i00℃，雾化压力为0.20-0.40Mpa，浸膏流量1.0～2.5L/h。
进风优选温度为190℃～225℃，出风优选温度为85℃～100℃，雾化压力为0.3Mpa，浸膏优选流量1.5～2.0L/h。
采用优选条件制备的牛蒡子提取物经药理实验证明，具有显著降血糖作用，可以用于治疗糖尿病药物的制备。
1.对糖尿病模型小鼠的降血糖作用。
2.抑制α-糖苷酶体外活性。
本发明具有显著降血糖作用、源于天然、毒副作用小，可长期服用、防治并用。
附图说明
图1不同药物对小鼠血糖浓度的影响
图2不同药物高、中、低不同剂量对α-糖苷酶抑制率的影响
图3不同药物的不同剂量对α-糖苷酶抑制率的影响(曲线图)
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明进行详细说明。
实施例一：
取牛蒡子药材，粉碎成粗粉，加6倍量的石油醚浸泡过夜，回流提取3h脱脂，过滤。滤渣加5倍量30％乙醇，90℃提取2次，每次1h，过滤，合并滤液，浓缩至相对密度1.00(60℃测定)，喷雾干燥(进风温度为185℃，出风温度为80℃，雾化压力为0.4Mpa，浸膏流量2.5L/h)，得含水量小于5％的牛蒡子提取物干粉。
实施效果为制得味微苦、棕色、收率为10％的粉末状固体，喷雾干燥中无堵喷嘴、粉粘结成块的现象，该提取物含有牛蒡甙，牛蒡甙元，罗汉松脂素，LappaolA，Lappaol C，Lappaol F，Lappaol H，Arctignan E，β-谷甾醇和胡萝卜甙10种化合物。
实施例二：
取牛蒡子药材，粉碎成粗粉，加6倍量的正己烷浸泡过夜，回流提取4h脱脂，过滤。滤渣加8倍量65％乙醇，90℃提取3次，每次2h，过滤，合并滤液，浓缩至相对密度1.15(60℃测定)，喷雾干燥(进风温度为235℃，出风温度为90℃，雾化压力为0.3Mpa，浸膏流量1.8L/h)，得含水量小于5％的牛蒡子提取物干粉。
实施效果为制得味微苦、棕色、收率为25％的粉末状固体，喷雾干燥中无堵喷嘴、粉粘结成块的现象，该提取物含有牛蒡甙，牛蒡甙元，罗汉松脂素，LappaolA，Lappaol C，Lappaol F，Lappaol H，Arctignan E，β-谷甾醇和胡萝卜甙10种化合物。
实施例三：
取牛蒡子药材，粉碎成粗粉，加7倍量的环己烷浸泡过夜，回流提取6h脱脂，过滤。滤渣加10倍量95％乙醇，75℃提取2次，每次3h，过滤，合并滤液，浓缩至相对密度1.10(60℃测定)，喷雾干燥(进风温度为210℃，出风温度为100℃，雾化压力为0.2Mpa，浸膏流量1.0L/h)，得含水量小于5％的牛蒡子提取物干粉。
实施效果为制得味微苦、棕色、收率为18％的粉末状固体，喷雾干燥中无堵喷嘴、粉粘结成块的现象，该提取物含有牛蒡甙，牛蒡甙元，罗汉松脂素，LappaolA，Lappaol C，Lappaol F，Lappaol H，Arctignan E，β-谷甾醇和胡萝卜甙10种化合物。
实施例四：
取牛蒡子药材，粉碎成粗粉，加8倍量的石油醚浸泡过夜，回流提取4.5h脱脂，过滤。滤渣加8倍量95％乙醇，80℃提取3次，每次2h，过滤，合并滤液，浓缩至相对密度1.10(60℃测定)，喷雾干燥(进风温度为220℃，出风温度为90℃，雾化压力为0.3Mpa，浸膏流量2.0L/h)，得含水量小于5％的牛蒡子提取物干粉。
实施效果为制得味微苦、棕色、收率为23％的粉末状固体，喷雾干燥中无堵喷嘴、粉粘结成块的现象，该提取物含有牛蒡甙，牛蒡甙元，罗汉松脂素，LappaolA，Lappaol C，Lappaol F，Lappaol H，Arctignan E，β-谷甾醇和胡萝卜甙10种化合物。
本发明的优选条件为：取牛蒡子药材，粉碎成粗粉，加石油醚、正己烷或环己烷6～8倍量浸泡过夜，回流提取4～6h脱脂，过滤。滤渣加60％-95％乙醇5～10倍量，浸泡过夜，75℃～85℃提取2～3次；每次2～3h；过滤，合并滤液，浓缩至相对密度1.05～1.15(60℃测定)，经喷雾干燥，能够获得收率为12％～23％的牛蒡子提取物。
所述的喷雾干燥，其条件为：进风优选温度为190℃～225℃，出风优选温度为85℃～100℃，雾化压力为0.3Mpa，浸膏优选流量1.5～2.0L/h。
实施例五
按本发明所述牛蒡子提取物制备方法的优选条件，制备出牛蒡子乙醇提取物，进行该提取物的化学成分研究，得到牛蒡甙，牛蒡甙元，罗汉松脂素，Lappaol A，Lappaol C，Lappaol F，Lappaol H，Arctignan E，β-谷甾醇和胡萝卜甙10种化合物。
具体分离流程如下：
将牛蒡子乙醇提取物进行硅胶柱层析，以环己烷、乙醚、乙酸乙酯、丙酮、甲醇依次洗脱，分别得到环己烷、乙醚、乙酸乙酯、丙酮部位和甲醇5个洗脱部位。
将其中的乙醚洗脱部位进行硅胶柱层析，以氯仿-甲醇(100∶1→10∶1)梯度洗脱，50ml收集一个流份。其中流份15-16经分离纯化得到β-谷甾醇，流份55-60经分离纯化得到罗汉松脂素和Arctigenin。
将其中的乙酸乙酯洗脱部位进行硅胶柱层析，以氯仿-甲醇(50∶1→10∶1)梯度洗脱，100ml收集一个流份，流份66-78经分离纯化得到Lappaol A，流份107-108经分离纯化得到Lappaol F，流份120-123经分离纯化得到Lappaol C，流份148经分离纯化得到Arctignan E，流份158-162经分离纯化得到胡萝卜甙和牛蒡甙，流份165-166经分离纯化得到Lappaol H。
实施例六
按本发明所述牛蒡子提取物制备方法的优选条件，制备牛蒡子乙醇提取物进行降血糖实验。实验证明，该牛蒡子乙醇提取物具有显著的降血糖作用。
1.牛蒡子乙醇提取物对糖尿病小鼠的降血糖作用
1.1实验材料
1.1.1实验动物：昆明种小白鼠58只，6周龄，体重25±2g，雌雄各半，随机分组。由中科院动物实验中心提供。
1.1.2实验药物：共三种，分别为牛蒡子醇提物、水提物、75％醇提物。由上海交通大学药学院提供。
1.2实验方法
1.2.1动物分组
空白对照组：雌雄各4只。不造模，不给药，给等量生理盐水。
阴性对照组：雄性7只，雌性3只。造模，不给药，给等量生理盐水。
阳性对照组：雌雄各5只。造模，给阳性药。
实验药物组：雌雄各5只。造模，分别给三种实验药物。
1.2.2药物分组
A组：牛蒡子醇提物。
B组：牛蒡子水提物。
C组：牛蒡子75％醇提物。
D组：阳性药(片剂)——优降糖(上海信谊药业有限公司)。
1.2.3糖尿病实验动物模型的建立
小鼠禁食12小时后，腹腔注射四氧嘧啶(ALX)100mg/kg。即配制ALX溶液10mg/ml，以小鼠体重×0.01计注射量(如25g小鼠注射0.25ml ALX)。但最大计量不宜超过0.3ml。
造模当晚及第二日注意观察小鼠状态，急救因血糖过低明显发生痉挛的小鼠，即以饱和葡萄糖溶液灌胃0.2ml/只。
1.2.4给药
造模2天后开始给药，连续给药8天，给药途径为灌胃。
据药典，给药量：人10g/60kg，换算为小鼠140g/60kg，即2.3g/kg。
A、B、C三种实验药物各称取4.8g溶于15ml水中，即得0.32g/ml。给药前每只小鼠先称重，如体重30g的灌胃0.2ml、20g的灌胃0.13ml，依此类推。给药量为2.1g药/kg小鼠。
D优降糖取4片(2.25mg/片)，即4×2.25＝9mg溶于15ml双蒸水中，得到0.6mg/ml，以“小鼠体重/2×0.01”计量给药，如体重26g的给药0.13ml。给药量为3mg药/kg小鼠。
1.2.5血糖测定
第8天给药1小时后，小鼠眼内眦取血1ml左右于appendoff管中，而后处死小鼠。
取血后静置1小时，然后4℃、2000rpm离心5min，分离上层血清。
用葡萄糖氧化酶法，根据葡萄糖试剂盒(上海荣盛生物技术有限公司)说明书操作：取10ul血清+1ml工作液(R1∶R2＝1∶1)，混匀后37℃水浴20min，用半自动生化分析仪测定葡萄糖含量；其中，取10ul双蒸水+1ml工作液作为空白管，取10ul标准液+1ml工作液作为标准品管。
1.3实验结果
与牛蒡子醇提物、水提物、75％醇提物三个实验药物组相比，阴性对照组小鼠血糖明显高于其他任何实验组，说明造模成功。牛蒡子醇提物组小鼠血糖基本能恢复到空白对照组水平，相对最为有效，次之是C组，结果提示：牛蒡子醇提物具有显著的降血糖作用(见附图1)。
图1中，control为空白对照组，-为阴性对照组，+为阳性药物组，A、B、C分别为实验药物组。
2.牛蒡子乙醇提取物的α-糖苷酶体外活性抑制实验
2.1实验材料
2.1.1实验药物：共三种，分别为牛蒡子醇提物、水提物、75％醇提物。由上海交通大学药学院提供。
2.1.2药品与试剂：拜唐平(阳性药，片剂)、α-PNPG(底物)、BSA、NaH2PO4(AR)、Na2HPO4(AR)、α-糖苷酶冻干粉、Na2CO3(AR)。
2.1.3仪器：移液器、24孔板(配药)、96孔板(测定)、酶标仪。
2.2实验方法
2.2.1试剂配制
A.磷酸缓冲液(0.1M pH7.0)：分别配制0.1M Na2HPO4和10.1M NaH2PO4溶液各100ml，取Na2HPO4∶NaH2PO4＝2∶1(体积比)混合，pH试纸检验，直至pH＝7.0。
B.酶稀释液：称取0.2g BSA(0.2％，w/v)，溶于100ml 0.01M pH7.0磷酸缓冲液中(即10ml A溶液+90ml双蒸水)。
C.酶溶液：
①原α-糖苷酶冻干粉(Sigma公司)共18mg(5.7unit/mg)，约100unit；
②加2ml B溶液于原瓶中稀释、打匀，得50unit/ml；
③分别取出20ul分装到4个appendoff管中备用，其余留于原瓶中，得1unit/管；
④加100ul B溶液于其中1管稀释、打匀；
⑤再分别取出20ul分装到另外4个appendoff管中，得0.2unit/管(共5管)；
⑥临用前加1ml B溶液于其中1管稀释、打匀；
⑦取出500ul到另1个appendoff管中，再分别加500ul B溶液于上述2管中(现1ml/管)稀释、打匀，得0.1unit/管(共2管)，即可用。
D.底物(20mMα-PNPG)：称取60.3mgα-PNPG(Sigma公司)，溶于10ml水中。
E.反应终止液(0.2M Na2CO3)：称取2.12g Na2CO3溶于100ml双蒸水中。
注意事项：
①A和E溶液消耗量相对较大，可考虑适当多配制一些备用。
②B溶液(酶易失活)于4℃冰箱保存，C溶液(酶易失活)于-20℃冰箱保存，D溶液(易光解)于-20℃冰箱避光(用锡纸/牛皮纸包裹所盛的容器)保存。
③各试剂配制后分别取10ml于5支离心管中备用，以免实验过程中反复取用而污染原液。
2.2.2药物配制
实验药物A：称取250mg(油状)牛蒡子醇提物，溶于5ml DMSO(因为水不溶，故用DMSO溶)中，得50mgA/ml DMSO。
实验药物B：称取100mg牛蒡子水提物，溶于10ml DMSO(为了对照平行，所以不用水而用DMSO溶)中，得10mgB/ml DMSO。
实验药物C：称取100mg牛蒡子75％醇提物，溶于10ml DMSO(因为水不溶，故用DMSO溶)中，得10mgC/ml DMSO。
阳性药：取2片(50mg/片)拜唐平(分子量645.6g/mol)，研碎，溶于1550ul双蒸水中，1000rpm离心5min，取出上清液(因为药片中的辅料不溶于水，也无需使其溶解)，得0.1M。
2.2.3药物稀释
    浓度(mg/ml)        10        1        0.5         0.1
药物A溶液     50mg/ml的取20ul     10mg/ml的取88ul      1mg/ml的取330ul     0.5mg/ml的取110ul
    加试剂A溶液(ul)        80       792        330 440
    浓度(mg/ml)        1       0.5        0.1
药物B/C溶液     10mg/ml的取88ul      1mg/ml的取330ul     0.5mg/ml的取110ul
    加试剂A溶液(ul)       792       330         440
    浓度(M)       0.1       0.01       0.001
拜唐平溶液     0.1M的取300ul      0.1M的取33ul      0.01M的取30ul
    加试剂A溶液(ul)       297       270
备注：用24孔板配药，配后均要用枪头打匀；四种药各配高、中、低3个浓度梯度；以上剂量分别是以实验药物A、B、C组各做4个平行孔，阳性药组做2个平行孔计算的。
2.2.4操作步骤(于96孔板中)
调零孔(2孔)：不加任何东西(检验96孔板的本底)。
空白孔(2孔)：依次加40ulA溶液，20ulD溶液，混匀(用酶标仪mixing)，37℃保温5min(于细胞培养箱中保温)，再加20ulB溶液，混匀(用酶标仪mixing)，37℃保温15min(于细胞培养箱中保温)，最后加80ulE溶液。
空白对照孔(4孔)：只加80ulA溶液，最后再加80ulE溶液，中间过程同上。
阴性孔(4孔)：依次加40ulA溶液，20ulD溶液，混匀(用酶标仪mixing)，37℃保温5min(于细胞培养箱中保温)，再加20ulC溶液，混匀(用酶标仪mixing)，37℃保温15min(于细胞培养箱中保温)，最后加80ulE溶液。
阳性孔(每个浓度2孔)：依次加40ul拜唐平溶液，20ulD溶液，混匀(用酶标仪mixing)，37℃保温5min(于细胞培养箱中保温)，再加20ulC溶液，混匀(用酶标仪mixing)，37℃保温15min(于细胞培养箱中保温)，最后加80ulE溶液。
阳性对照孔(每个浓度2孔)：只加80ul拜唐平溶液，最后再加80ulE溶液，中间过程同上。
样品测定孔(每个浓度4孔)：依次加40ul实验药物A/B/C溶液，20ulD溶液，混匀(用酶标仪mixing)，37℃保温5min(于细胞培养箱中保温)，再加20ulC溶液，混匀(用酶标仪mixing)，37℃保温15min(于细胞培养箱中保温)，最后加80ulE溶液。
样品对照孔(每个浓度4孔)：只加80ul实验药物A/B/C溶液，最后再加80ulE溶液，中间过程同上。
读数：以空白孔清零，用酶标仪测定405nm处(设定mixing、singlel)的吸光度值。
2.2.5计算
a：阴性孔；b：空白对照孔；c：样品测定孔；d：样品对照孔。
抑制率(％)＝[1-(c-d)/(a-b)]×100％
2.3实验结果
牛蒡子醇提物、水提物、75％醇提物三个实验药物均呈现出一定的α-糖苷酶抑制剂的作用，在实验所设定的高、中、低三个浓度下，牛蒡子醇提物对α-糖苷酶的抑制率都是最高的，即抑制效果最好。总体上看，醇提物和75％醇提物的α-糖苷酶抑制作用要优于水提物(见附图2)。
随着药物浓度的增加，无论是实验药物还是阳性药+组，对α-糖苷酶的抑制率都有一定程度的增加。统计学结果提示，牛蒡子醇提物有α-糖苷酶抑制剂的功能，且对α-糖苷酶的抑制效果呈现较显著的量效关系(见附图3)。
图2、3中，+为阳性药物组，A、B、C分别为实验药物组。A、B、C组high浓度为1mg/ml，middle浓度为0.5mg/ml，low浓度为0.1mg/ml。+组high浓度为0.1M，middle浓度为0.01M，low浓度为0.001M。

Claims (5)

1、一种具有降血糖作用的牛蒡子提取物的制备方法，其特征在于，取牛蒡子药材，粉碎成粗粉，加6～8倍量的石油醚、正己烷或环己烷浸泡过夜，回流提取3～6h脱脂，过滤。滤渣加30％-95％乙醇5～10倍量，浸泡过夜，60℃～90℃提取2～3次，每次1～3h，过滤，合并滤液，浓缩至60℃下相对密度为1.00～1.15，喷雾干燥，得含水量小于5％、收率为10％～25％的牛蒡子提取物。
2、根据权利要求1所述的具有降血糖作用的牛蒡子提取物含有牛蒡甙，牛蒡甙元，罗汉松脂素，Lappaol A，Lappaol C，Lappaol F，Lappaol H，Arctignan E，β-谷甾醇和胡萝卜甙10种化合物。
3、根据权利要求1所述的具有降血糖作用的牛蒡子提取物的制备方法，其特征是，优选条件：取牛蒡子药材，粉碎成粗粉，加石油醚、正己烷或环己烷6～8倍量浸泡过夜，回流提取4～6h脱脂，过滤，滤渣加60％-95％乙醇5～10倍量，浸泡过夜，75℃～85℃提取2～3次，每次2～3h，过滤，合并滤液，浓缩至60℃下相对密度为1.05～1.15，经喷雾干燥，获得收率为12％～23％的牛蒡子提取物。
4、根据权利要求1或者3所述的具有降血糖作用的牛蒡子提取物的制备方法，其特征是，所述的喷雾干燥，其条件为：进风温度为185℃～235℃，出风温度为80℃～100℃，雾化压力为0.20-0.40Mpa，浸膏流量1.0～2.5L/h。
5、根据权利要求4所述的具有降血糖作用的牛蒡子提取物的制备方法，其特征是，进风优选温度为190℃～225℃，出风优选温度为85℃～100℃，雾化压力为0.3Mpa，浸膏优选流量1.5～2.0L/h。
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