CN1259068C - 山茱萸提取物及其制备方法和用途 - Google Patents

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CN1259068C CN 200410014769 CN200410014769A CN1259068C CN 1259068 C CN1259068 C CN 1259068C CN 200410014769 CN200410014769 CN 200410014769 CN 200410014769 A CN200410014769 A CN 200410014769A CN 1259068 C CN1259068 C CN 1259068C
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Abstract

山茱萸提取物及其制备方法和用途，包括山茱萸药材用乙醇提取，提取液减压浓缩后加水沉淀，收集沉淀减压干燥，得到提取物A；上清液上大孔吸附树脂柱，水洗脱除去杂质，乙醇梯度洗脱，收集洗脱液减压干燥，得到提取物B；将提取物A和B均匀混合，即得本发明山茱萸提取物，其医药新用途为在制备防治糖尿病血管病变和降低血糖药物中的应用。

Description

山茱萸提取物及其制备方法和用途
技术领域
本发明提供了一种山茱萸提取物，还涉及该提取物的制备方法以及该提取物的医药用途，属于中药领域。
背景技术
糖尿病是一种慢性全身进行性的内分泌代谢疾病，持续的高血糖会导致一些组织器官代谢异常，继而引起其功能障碍及形态改变。糖尿病病程超过10年，大部分患者合并程度不等的血管并发症，尤其是微血管并发症。糖尿病微血管病变是指微循环障碍、微血管瘤形成和微血管基底膜增厚，主要包括糖尿病肾病和糖尿病性视网膜病变，严重者可导致尿毒症或失明，给患者造成了巨大的身心痛苦。因此，发现和研制防治糖尿病微血管病变、降低血糖的药物具有重要意义。
山茱萸(Cornus officinalis Sieb et Zu cc.)具有补益肝肾、涩精固脱的作用，是临床常用中药，我国自古就有山茱萸应用于糖尿病(中医称为“消渴症“)治疗的记载。近年来，国内外学者对山茱萸进行了多方面的研究，从山茱萸中分离得到多个环烯醚萜苷类化合物，主要有马钱素(loganin)，莫诺苷(morroniside)，獐芽菜苷(sweroside)等，从山茱萸中还分离得到了熊果酸(ursonic acid)和齐墩果酸(oleanolic acid)等三萜酸类化合物。中国专利96109637.7公开了具有免疫抑制作用的山茱萸水煎提取物及其制备工艺。中国专利申请02159502.X公开了具有防治缺血性血管病作用的山茱萸水煎提取物及其制备方法。
但是，迄今为止，尚未见有同时得到山茱萸环烯醚萜总苷和总三萜酸两个有效部位的制备工艺，也未见山茱萸提取物用于制备防治糖尿病血管病变和降低血糖药物用途的报导。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种山茱萸提取物及其制备方法，以及该提取物的医药新用途。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下。
本发明所述的山茱萸提取物是通过下述方法获得的提取物：
(1)山茱萸药材用乙醇提取，合并乙醇提取液，过滤后减压浓缩；
(2)将浓缩液加水沉淀后离心，上清液减压浓缩备用；
(3)收集沉淀减压干燥，粉碎后得到提取物A；
(4)将(2)得到的浓缩液上中等极性或非极性大孔吸附树脂柱；
(5)用去离子水洗脱除去杂质后，再用乙醇梯度洗脱；
(6)收集乙醇洗脱液减压干燥，粉碎后得到提取物B；
(7)将提取物A和B均匀混合，即得粉末状的山茱萸提取物。
上述提取方法的条件范围为：步骤(1)中乙醇浓度为10～90％，步骤(5)中乙醇浓度为20～70％，步骤(7)中提取物A和B按照重量比1∶3～8的比例均匀混合。
上述提取方法的优选条件范围为：步骤(1)中乙醇浓度为60％～90％，步骤(5)中乙醇浓度为30～50％。
在上述提取方法中，山茱萸提取物可以采用乙醇回流法、浸渍法和渗漉法提取。
本发明山茱萸提取物中，提取物A主要为环烯醚萜类化合物(iridoids)，提取物B主要为三萜酸(triterpene acids)类化合物。
本发明所说的山茱萸是山茱萸属植物山茱萸Cornus officinalis Siebet Zucc.的成熟果肉，包括生药和炮制品。
本发明对山茱萸提取物进行了薄层鉴别和含量测定。
(1)本发明提取物的薄层鉴别条件如下：
①提取物A中的马钱素和莫诺苷薄层鉴别：薄层板：硅胶G板，展开剂：氯仿-甲醇(7∶3)，显色剂：喷10％硫酸-乙醇后于105℃烘10分钟，于日光下检测可看到马钱素和莫诺苷的斑点。
②提取物B中的熊果酸薄层鉴别：
薄层板：硅胶G板，展开剂：石油醚-醋酸乙酯(5∶5)，显色剂：喷10％硫酸-乙醇后于105℃烘10分钟，置日光下检测可看到熊果酸的斑点；或于紫外光灯(365nm)下观察荧光，可看到熊果酸的亮黄色荧光。
(2)本发明提取物应用高效液相仪进行了定量分析，其含量测定条件如下：
①提取物A的色谱条件：
色谱柱：PhenomenexLuna 5μmC18，250×4.60mm；流动相：甲醇-水(30∶70)；流速：1ml/min；检测波长：240nm；柱温：28℃。
经分析，提取物A中主要为环烯醚萜苷类化合物，其中包括马钱子苷(loganin)，莫诺苷(morroniside)，獐芽菜苷(sweroside)等成分，其含量占本发明山茱萸提取物的50％以上。
②提取物B的色谱条件：
色谱柱：Kromasil ODS-1(Zirchrom)5μmC18，250×4.60mm；流动相：乙腈-甲醇-0.5％醋酸铵水(69∶15∶16)；流速：1.2ml/min；柱温：30℃。
经分析，提取物B中主要为三萜酸类化合物，其中包括熊果酸(ursonic acid)和齐墩果酸(oleanolic acid)等成分，其含量占本发明山茱萸提取物的3.5％以上。
本发明山茱萸提取物的用途为在制备防治糖尿病血管病变和降低血糖药物中的应用。
本发明的有益效果如下：
1.本发明的提取工艺简便合理，可同时得到水溶性和脂溶性两个有效部位。
2.经实验证明，本发明山茱萸提取物在防治糖尿病血管并发症、降低血糖方面有确切的疗效，特别是用于治疗糖尿病肾病和糖尿病视网膜病变等糖尿病微血管病变。所说的糖尿病微血管病变是指微循环障碍、微血管瘤形成和微血管基底膜增厚等，表现为结节性肾小球硬化型病变，弥漫性肾小球硬化型病变，肾小球基底膜增厚，蛋白排泄率增高；视网膜微血管瘤，出血，硬性渗出或棉絮状渗出。所说的降低血糖是指降低糖尿病导致的血糖升高。
3.本发明提取物能降低糖尿病导致的血糖升高；显著降低血清蛋白质糖基化终产物-肽(AGE-P)水平；降低尿微量白蛋白的排除量；降低血清早期蛋白质非酶糖化产物-果糖胺的生成量；改善糖尿病血管并发症引起的血管内皮和肾组织形态学病理改变；抑制肾皮质AGEs的形成，使其受体mRNA表达水平下降，具有减轻糖尿病肾病变的作用；显著降低糖尿病大鼠视网膜毛细血管的内周比，对实验性糖尿病视网膜病变具有一定的防治作用；显著增加血清SOD的含量，对由糖尿病血管并发症引起的氧化应激损伤具有保护作用；显著升高糖尿病血管并发症大鼠血清NO、NOS的含量，并降低血浆ET含量，部分恢复NO和ET的动态平衡，保护血管内皮细胞；显著降低糖尿病血管并发症模型大鼠血清sICAM-1、TNF-α的含量，有利于控制糖尿病血管并发症的发生和发展。
实验例1.山茱萸提取物对链脲佐菌糖尿病大鼠高血糖的治疗作用
实验目的：观察本发明提取物对链脲佐菌糖尿病大鼠高血糖的治疗作用
实验方法：取正常大鼠80只，随机取10只作为正常对照组，其余禁食24h，由大鼠腹腔注射新鲜配制的链脲佐菌素60mg/kg造成糖尿病模型，1周后(禁食12h)取尾静脉血用血糖仪测血糖值，若血糖值≥16.7mmol/L并出现多饮、多尿、消瘦的大鼠则列为糖尿病模型动物。取糖尿病模型大鼠36只随机分为3组，模型对照组(生理盐水10ml/kg，ig.)，阳性对照氨基胍组(0.1g.kg-1，ig.)，发明提取物组(0.15g.kg-1，ig.)，另设10只作为正常对照组(生理盐水10ml/kg，ig.)，连续12周，分别给药并禁食2h后6周与12周测定空腹血糖。
实验结果：造模后大鼠血糖明显升高，并出现多饮、多尿和消瘦的体征。用药12周后，除正常对照组以外，各组均见不同程度的死亡，本发明提取物及氨基胍均能降低糖尿病大鼠血糖，以本发明提取物尤佳。结果见表1。
表1 山茱萸提取物对链脲佐菌糖尿病大鼠空腹血糖的影响( X±S)
组别   剂量(g.kg-1)   动物数(只)                   血糖(mmol/L)
  药前   药后6周   药后12周
  正常对照组模型对照组本发明提取物组氨基胍组   --0.150.1   10898   5.0±1.121.4±2.4△△21.5±2.1△△21.4±2.2△△   5.1±1.120.9±2.1△△18.1±1.7△△*##18.5±1.9△△*#   5.3±1.120.6±1.4△△16.4±0.4△△**##16.6±0.6△△**##
*p＜0.05 **p＜0.01与模型组比较；#p＜0.05 ##p＜0.01与给药前比较；△△p＜0.01与止常对照组比较。
表明本发明提取物对糖尿病大鼠具有一定的降糖作用。
实验例2.山茱萸提取物对糖尿病血管并发症大鼠血清、血清糖基化终产物-肽(AGE-P)水平的影响
实验目的：观察本发明提取物对糖尿病血管并发症大鼠血清糖基化终产物-肽(AGE-P)水平的影响。
实验方法：取雄性SD大鼠，180～220g，在正常进食条件下，大鼠先以30mg.kg-1ip.STZ溶液，第二天再按0.11ml/只ip.弗氏完全佐剂(FCA)，每周1次，连续3周。3周后取尾静脉血用血糖仪测血糖值，若血糖≥16.7mmol/L者则纳入为糖尿病大鼠。按血糖值范围随机分为模型组(生理盐水10ml/kg，ig.)、氨基胍组(0.1g.kg-1)和本发明提取物组(0.15g.kg-1)，同期另设一正常组(生理盐水10ml/kg，ig.)，各组连续ig.12周。给药12周后大鼠眼眶取血，分离血清后运用流动注射分析技术检测AGE-P水平。
实验结果：造模12周的糖尿病血管并发症大鼠血清AGE-P水平较正常组显著升高，而本发明提取物II组及氨基胍组均能显著降低血清AGE-P水平(P＜0.01)，见表2。
表2 对大鼠糖尿病血管并发症血糖及血清AGE-P水平的影响( X±S)
组别   剂量(g.kg-1)   动物数(只)              血糖(mmol/L)   AGE-P(mg.L-1)
  药前   药后
  正常组模型组氨基胍组本发明提取物组   --0.10.15   8888   4.9±0.520.7±2.6##20.6±2.3##20.4±2.6##   4.9±0.519.8±2.3##17.7±1.5##17.4±2.2##   2.8±0.4##14.3±3.9##9.1±0.9##**8.5±1.7##**
**p＜0.01与模型组比较；##p＜0.01与正常组比较
本实验结果表明本发明提取物组能显著降低糖尿病血管并发症模型大鼠血清AGE-P含量的作用(p＜0.01与模型组比较)，提示本发明提取物具有一定的治疗糖尿病血管并发症的AGE-P水平升高的作用。
实验例3.山茱萸提取物对糖尿病血管并发症大鼠血清果糖胺及尿微量白蛋白等的影响
实验目的：观察本发明提取物对糖尿病血管并发症大鼠的作用。
实验方法：取雄性SD大鼠，体重为180-220g，禁食12h后一次性腹腔注射STZ(链脲佐菌素)60mg.kg-1。1周后禁食6h，取尾静脉血用血糖仪测血糖值，若血糖值≥16.7mmol/L者则纳入为糖尿病大鼠。按血糖值范围随机分为模型组(生理盐水10ml/kg，ig.)、氨基胍组(0.1g.kg-1，ig.)、本发明提取物组(0.15g kg-1，ig.)。同期另设一组正常对照组(生理盐水10ml/kg，ig.)。各组连续灌胃12周。于给药后第6、12周，分别测定大鼠血清果糖胺、尿微量白蛋白等，动态观察糖尿病血管并发症大鼠的演变及本发明提取物的防治作用。
实验结果：本发明提取物及氨基胍能显著减少果糖胺及尿微量白蛋白(与模型组比较，P＜0.05，0.01)，结果见表3。
表3 本发明提取物对糖尿病血管并发症大鼠血清果糖胺及尿微量白蛋白等的影响( X±S)
  组别   剂量(g.kg-1)   动物数(只)              血清果糖胺(mM)           尿微量白蛋白(mg.24h-1)
  6w   12w   6w   12w
  正常组模型组氨基胍组本发明提取物组   --0.10.15   8888   1.77±0.212.30±0.23##1.69±0.37**1.82±0.39**   1.76±0.222.45±0.24##1.95±1.45**1.88±0.34**   0.1±0.18.4±4.2##3.4±3.2*2.6±1.6**   0.1±0.16.9±3.7##2.5±1.2**2.5±1.4**
##P＜0.01与正常组比较；*P＜0.05  **P＜0.01与模型组比较
本实验表明本发明提取物组能显著降低糖尿病血管并发症模型大鼠果糖胺及尿微量白蛋白的形成(与模型组比较，P＜0.05，0.01)，提示其对糖尿病血管并发症果糖胺及尿微量白蛋白的升高具有一定的抑制作用。
实验例4.山茱萸提取物对糖尿病血管并发症大鼠胸主动脉血管内皮及肾组织形态学的影响
实验目的：从形态学的角度探讨本发明提取物是否具有防治糖尿病血管并发症的作用。
实验方法：腹腔注射STZ(链脲佐菌素)60mg.kg-1。1周后禁食6h，取尾静脉血用血糖仪测血糖值，若血糖值≥16.7mM者则纳入为糖尿病大鼠。按血糖值范围随机分为模型组、氨基胍组(0.1g.kg-1，ig.)、本发明提取物(0.15g kg-1，ig.)。同期另设一组正常对照组。各组连续灌胃12周。实验结束后用扫描电镜的方法观察胸主动脉血管内皮通透性。内皮细胞的形态改变以及白细胞等在动脉壁内皮粘附等病理改变：本文选用光镜并经相应染色(如HE及PAS)。观察肾小球的形态变化如基底膜增厚、糖原沉积、毛细血管扩张等：用透射电镜观察肾小球基底膜等结构的改变。
实验结果：模型组各样本在形态学上呈观明显的病理改变，如血管内皮细胞肿胀，细胞排列紊乱并向血管腔突起，内皮表面凹凸不平，相邻细胞间有明显的缝隙存在以致内皮通透性增高：细胞表面粗糙，有很多红细胞、细胞粘咐其表面：肾小球体积明显缩小并伴有弥漫性系膜增生，肾小球基底膜由正常圈襻状挤压成髓纹状并增厚，球体毛细血管闭塞，而球囊相对扩大。肾小管有明显空泡透明变性(AE变性)。肾间质中小动脉、入球细动脉玻变、增厚，血管内皮细胞肿胀并呈立方状凸入管腔。而本发明提取物组上述病变明显减轻，表现出较好的血管内皮保护作用及抗肾小球内基质增生、基底膜增厚等作用。表明本发明提取物具有改善糖尿病大鼠形态学病理改变的作用，我们推断本发明提取物对糖尿病血管并发症所引起的结构和功能改变都具有一定的防治作用。
实验例5.山茱萸提取物对糖尿病血管并发症大鼠肾皮质AGEs及其受体(RAGE)mRNA表达的影响
实验目的：探讨本发明提取物对糖尿病血管并发症大鼠肾皮质AGEs的抑制作用，及在分子水平上探讨其对肾皮质内AGEs受体(RAGE)mRNA转录水平的影响。
实验方法：取雄性SD大鼠，体重为180-220g，禁食12h后一次性腹腔注射STZ(链脲佐菌素)60mg.kg-1。1周后禁食6h，取尾静脉血用血糖仪测血糖值，若血糖值≥16.7mmol/L者则纳入为糖尿病大鼠。按血糖值范围随机分为模型组(生理盐水10ml/kg，ig.)、氨基胍组(0.1g.kg-1，ig.)、本发明提取物组(0.15g kg-1，ig.)。同期另设一组正常对照组(生理盐水10ml/kg，ig.)。各组连续灌胃12周。实验结束后取右肾皮质，根据AGEs具有产生荧光的特点，通过测定其荧光强度，间接表示肾皮质内AGEs的含量；用RT-PCR半定量的方法，体外扩增目的基因RAGE，并以β-action(house-keeping gene)作为内参，根据两者结合的EB光密度积分的比值进行组间比较肾皮质内RAGE mRNA的表达情况。
实验结果：模型组AGEs沉积显著增加，RAGE表达明显上调。而本发明提取物在减少AGEs在肾皮质过度沉积的同时，亦能显著抑制RAGE的过高表达。表明其具有减轻糖尿病肾病变的作用。结果见表4。
表4 本发明提取物对模型大鼠肾皮质AGEs及RAGE的影响( X±S)
组别   剂量(g.kg-1)   动物数(只)   AGEs(AU/mg羟脯氨酸) RAGE
  正常组模型组氨基胍组本发明提取物   --0.10.15   10899   13.8±4.644.3±14.5##22.8±4.2**21.0±5.8**   0.56±0.192.75±1.28##1.23±0.39**0.83±0.17**
##p＜0.01与正常组比较；**p＜0.01与模型组比较。
本实验表明本发明提取物在减少AGEs在肾皮质过度沉积的同时，亦能显著抑制RAGE的过高表达，表明其具有减轻糖尿病肾病变的作用。
实验例6.山茱萸提取物对糖尿病大鼠视网膜病变的影响
实验目的：观察本发明提取物对由STZ诱导的糖尿病视网膜病变的防治作用。
实验方法：取雄性SD大鼠，体重为180-220g，禁食12h后一次性腹腔注射STZ(链脲佐菌素)60mg kg-1。1周后禁食6h，取尾静脉血用血糖仪测血糖值，若血糖值≥16.7mmol/L者则纳入为糖尿病大鼠。按血糖值范围随机分为模型组(生理盐水10ml/kg，ig.)、氨基胍组(0.1g.kg-1，ig.)、本发明提取物组(0.15g kg-1，ig.)。同期另设一组正常组(生理盐水10ml/kg，ig.)。各组连续灌胃12周。12周后，处死大鼠后立即取出眼球固定于4％甲醛溶液中24～48小时。沿赤道部切开眼球，去除前节及玻璃体，余下眼球分为6等分，小心剥离视网膜，流水冲洗24小时后，用3％胰酶(用PH7.4的Tris缓冲液配制)消化3～4小时，取出置蒸馏水中轻冲摇，分离出血管网，铺于载波片上自然吹干。PAS加苏木精染色，光镜观察。每张铺片随机取7个视野，于400倍下计数内皮细胞(EC)与周细胞(PC)数目及其灰度面积，并计算两者的比值(E/P值)，同时观察新生血管形成情况。
实验结果：模型组视网膜毛细血管内皮细胞数及其灰度面积均明显高于正常大鼠，而周细胞数目则明显减少，本发明提取物及阳性对照物氨基胍均能显著降低糖尿病大鼠视网膜毛细血管的内周比(P＜0.01)，表明本发明提取物对实验性糖尿病视网膜病变具有一定的防治作用。结果见表5。
表5 本发明提取物对糖尿病大鼠视网膜病变的影响( X±S)
  组别   剂量(g.kg-1)   动物数(只)   EC(n/view)   PC(n/view) E/P   Ec area(um2)   Pc area(um2)   E/Parea
  正常组模型组   --   89   21±532±6##   27±612±5##   0.80±0.222.94±1.07##   79.9±24.2135.0±47.6##   82.8±29.485.1±39.4   1.08±0.441.77±0.71#
  本发明提取物组氨基胍组   0.150.1   1010   24±5**27±6   14±515±5   1.77±0.43**1.92±0.29**   86.1±23.1**100.2±20.1*   55.5±15.5*65.9±23.3   1.62±0.431.59±0.27
##P＜0.01与正常组比较；*P＜0.05  **P＜0.01与模型组比较
本实验表明本发明提取物能显著降低糖尿病大鼠视网膜毛细血管的内周比，表明其对实验性糖尿病视网膜病变具有一定的防治作用。
实验例7.山茱萸提取物对糖尿病血管并发症模型大鼠血清SOD的影响
实验目的：通过对血清SOD值的变化分析，初步探讨出SFZ诱导的糖尿病血管并发症大鼠模型的氧化应激观象，以及本发明提取物的保护作用。
实验方法：腹腔注射STZ(链脲佐菌素)60mg.kg-1。1周后禁食6h，取尾静脉血用血糖仪测血糖值，若血糖值≥16.7mM者则纳入为糖尿病大鼠。按血糖值范围随机分为模型组、氨基胍组(0.1g.kg-1，ig.)、本发明提取物(0.15g kg-1，ig.)。同期另设一组正常对照组。各组连续灌胃12周。试验结束后用黄嘌呤氧化酶法测定血清SOD的含量。
表6 本发明提取物对模型大鼠血清SOD的含量的影响( X±S)
组别   剂量(g.kg-1)   动物数(只) SOD(活性/U.mL-1)
  正常组模型组氨基胍组本发明提取物   --0.10.15   10898   50.5±5.038.9±4.5##48.8±5.2**47.5±5.4**
##p＜0.01与正常组比较；**p＜0.01与模型组比较。
实验结果：造模12周后，糖尿病血管并发症模型大鼠血清SOD值较正常组显著降低；而本发明提取物及氨基胍均能显著增加SOD的含量。本实验表明本发明提取物对由糖尿病血管并发症引起的氧化应激损伤具有保护作用。
实验例8.山茱萸提取物对糖尿病血管并发症大鼠NO、NOS和ET的影响
实验目的：探讨环山茱萸提取物对NO、NOS、ET的影响，以了解其对糖尿病血管并发症大鼠的作用及作用机理。
实验方法：腹腔注射STZ(链脲佐菌素)60mg.kg-1。1周后禁食6h，取尾静脉血用血糖仪测血糖值，若血糖值≥16.7mM者则纳入为糖尿病大鼠。按血糖值范围随机分为模型组、氨基胍组(0.1g.kg-1，ig.)、本发明提取物(0.15g kg-1，ig.)。同期另设一组正常对照组。各组连续灌胃12周。实验结束后取血，测定大鼠血清NO、NOS和血浆ET。
表7 本发明提取物对模型大鼠血清NO、NOS和血浆ET的影响( X±S)
组别   剂量(g.kg-1) 动物数(只) NO/μmol.L-1 NOS/U.mL-1 ET/pg.mL-1
  正常组模型组氨基胍组本发明提取物   --0.10.15   10898   68.55±7.4442.13±7.46##63.55±8.12**60.12±10.43**   0.66±0.080.39±0.06##0.54±0.12*0.53±0.10*   64.55±17.12132.15±33.77##78.45±18.34**76.15±18.18**
##p＜0.01与正常组比较；*p＜0.05，**p＜0.01与模型组比较。
实验结果：模型组与正常组比较，NO、NOS含量显著降低(P＜0.01，p＜0.05)，ET含量显著升高(P＜0.01)：而本发明提取物组与氨基胍组均能显著升高糖尿病血管并发症大鼠血清NO、NOS的含量，并降低血浆ET含量。本实验表明本发明提取物可部分恢复NO和ET的动态平衡，保护血管内皮细胞，对糖尿病血管并发症具有改善作用。
实验例9.山茱萸提取物对糖尿病血管并发症大鼠sICAM-1、TNF-α的影响
实验目的：探讨本发明提取物对糖尿病血管并发症大鼠血清可溶性细胞间粘附分子(slCAM-1)、肿瘤坏死因子(TNF-α)的影响，分析本发明提取物防治糖尿病血管；并发症的作用及其作用机理。
实验方法：腹腔注射STZ(链脲佐菌素)60mg.kg-1。1周后禁食6h，取尾静脉血用血糖仪测血糖值，若血糖值≥16.7mM者则纳入为糖尿病大鼠。按血糖值范围随机分为模型组、氨基胍组(0.1g.kg-1，ig.)、本发明提取物(0.15g kg-1，ig.)。同期另设一组正常对照组。各组连续灌胃12周后，取血清用相应的EIA Kit分别测定slCAM-1、TNF-α的含量。
表8 本发明提取物对模型大鼠血清slCAM-1、TNF-α的影响( X±S)
组别   剂量(g.kg-1) 动物数(只) sIAM-1(pg.ml-1) TNF-α(pg.ml-1)
  正常组模型组氨基胍组本发明提取物   --0.10.15   10898   0.35±0.070.82±0.07##0.45±0.12**0.46±0.09**   5.5±1.29.7±2.5##5.8±2.7**5.9±1.9**
##p＜0.01与正常组比较；**p＜0.01与模型组比较。
实验结果：糖尿病血管并发症模型大鼠血清sICAM-1、TNF-α较正常组上调，而本发明提取物及氨基胍均能显著降低糖尿病血管并发症模型大鼠血清sICAM-1、TNF-α的含量。这一作用可能有利于控制糖尿病血管并发症的发生和发展。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细描述。但是，本发明不局限于所给出的这些实施例。
实施例1
将山茱萸药材1000g用乙醇回流提取3次，乙醇浓度70％，加醇量为药材重量的15倍，提取时间120min，提取温度80℃。合并提取液，滤过并减压浓缩，将浓缩液加4倍量水沉淀后离心，收集沉淀减压干燥，粉碎后得到提取物A，将离心后的上清液减压浓缩备用。
取非极性大孔吸附树脂，按与生药重量比1∶1的比例装柱，然后将上述备用的浓缩液以1柱体积/小时的流速通过此大孔树脂柱，完全通过后，先用去离子水洗脱，再用30％和50％乙醇进行梯度洗脱，洗脱流速为2柱体积/小时。收集乙醇洗脱液，减压干燥粉碎后得到提取物B。
将上述提取物A和B按照重量比1∶6的比例混匀后得到山茱萸提取物，得率为7.02％。
实施例2
将山茱萸药材1000g用乙醇回流提取2次，乙醇浓度85％，加醇量为药材重量的12倍，提取时间90min，提取温度75℃。合并提取液，滤过并减压浓缩，将浓缩液加5倍量水沉淀后离心，收集沉淀减压干燥，粉碎后得到提取物A，将离心后的上清液减压浓缩备用。
取中等极性大孔吸附树脂，按与生药重量比1∶2的比例装柱，然后将上述备用的浓缩液以1.5柱体积/小时的流速通过此大孔树脂柱，完全通过后，先用去离子水洗脱，再用50％～70％乙醇进行梯度洗脱，洗脱流速为3柱体积/小时。收集乙醇洗脱液，减压干燥粉碎后得到提取物B。
将上述提取物A和B按照重量比1∶5的比例混匀后得到山茱萸提取物，得率为6.98％。
实施例3
将山茱萸药材1000g粉碎后过40目筛，用20％乙醇浸渍48小时后渗漉提取，流速4～5毫升/分钟，渗漉量为药材重量的10倍。合并提取液，滤过并减压浓缩，将浓缩液加4倍量水沉淀后离心，收集沉淀减压干燥，粉碎后得到提取物A，将离心后的上清液减压浓缩备用。
取中等极性大孔吸附树脂，按与生药重量比1∶3的比例装柱，然后将上述备用的浓缩液以1柱体积/小时的流速通过此大孔树脂柱，完全通过后，先用去离子水洗脱，再用30％～70％乙醇进行梯度洗脱，洗脱流速为2柱体积/小时。收集乙醇洗脱液，减压干燥粉碎后得到提取物B。
将上述提取物A和B按照重量比1∶7的比例混匀后得到山茱萸提取物，得率为6.01％。
实施例4
将山茱萸药材1000g粉碎后过30目筛，用60％乙醇浸渍36小时后渗漉提取，流速3～4毫升/分钟，渗漉量为药材重量的12倍。合并提取液，滤过并减压浓缩，将浓缩液加6倍量水沉淀后离心，收集沉淀减压干燥，粉碎后得到提取物A，将离心后的上清液减压浓缩备用。
取非极性大孔吸附树脂，按与生药重量比1∶2的比例装柱，然后将上述备用的浓缩液以1.5柱体积/小时的流速通过此大孔树脂柱，完全通过后，先用去离子水洗脱，再用50％～80％乙醇进行梯度洗脱，洗脱流速为2.5柱体积/小时。收集乙醇洗脱液，减压干燥粉碎后得到提取物B。
将上述提取物A和B按照重量比1∶4的比例混匀后得到山茱萸提取物，得率为5.94％。
实施例5
将山茱萸药材1000g粉碎后过30目筛，用乙醇浸渍法提取。乙醇浓度60％，加醇量为药材重量的5倍，浸渍时间72小时，提取3次。合并提取液，滤过并减压浓缩，将浓缩液加5倍量水沉淀后离心，收集沉淀减压干燥，粉碎后得到提取物A，将离心后的上清液减压浓缩备用。
取中等极性大孔吸附树脂，按与生药重量比1∶1的比例装柱，然后将上述备用的浓缩液以0.5柱体积/小时的流速通过此大孔树脂柱，完全通过后，先用去离子水洗脱，再用30％～70％乙醇进行梯度洗脱，洗脱流速为2柱体积/小时。收集乙醇洗脱液，减压干燥粉碎后得到提取物B。
将上述提取物A和B按照重量比1∶5的比例混匀后得到山茱萸提取物，得率为5.79％。
实施例6
将山茱萸药材1000g粉碎后过20目筛，用乙醇浸渍法提取。乙醇浓度50％，加醇量为药材重量的6倍，浸渍时间96小时，提取2次。合并提取液，滤过并减压浓缩，将浓缩液加4倍量水沉淀后离心，收集沉淀减压干燥，粉碎后得到提取物A，将离心后的上清液减压浓缩备用。
取非极性性大孔吸附树脂，按与生药重量比1∶1.5的比例装柱，然后将上述备用的浓缩液以1柱体积/小时的流速通过此大孔树脂柱，完全通过后，先用去离子水洗脱，再用30％～50％乙醇进行梯度洗脱，洗脱流速为3柱体积/小时。收集乙醇洗脱液，减压干燥粉碎后得到提取物B。
将上述提取物A和B均匀混合后得到山茱萸提取物，得率为5.67％。
以上实施例所得山茱萸提取物，经高效液相色谱仪分析，提取物A中主要为环烯醚萜苷类化合物，其中包括马钱子苷(loganin)，莫诺苷(morroniside)，獐芽菜苷(sweroside)等成分，其含量占本发明山茱萸提取物的50％以上；提取物B中主要为三萜酸类化合物，其中包括熊果酸(ursonic acid)和齐墩果酸(oleanolic acid)等成分，其含量占本发明山茱萸提取物的3.5％以上。

Claims (12)

1.一种山茱萸提取物，其特征在于所说的提取物是通过下述方法获得的提取物：
(1)山茱萸药材用乙醇提取，合并乙醇提取液，过滤后减压浓缩；
(2)将浓缩液加水沉淀后离心，上清液减压浓缩备用；
(3)收集沉淀减压干燥，粉碎后得到提取物A；
(4)将(2)得到的浓缩液上中等极性或非极性大孔吸附树脂柱；
(5)用去离子水洗脱除去杂质后，再用乙醇梯度洗脱；
(6)收集乙醇洗脱液减压干燥，粉碎后得到提取物B；
(7)将提取物A和B均匀混合，即得粉末状的山茱萸提取物。
2.根据权利要求1所述的提取物，其特征是所说的提取物是通过乙醇回流提取法获得的提取物。
3.根据权利要求1所述的提取物，其特征是所说的提取物是通过乙醇渗漉提取法获得的提取物。
4.根据权利要求1所述的提取物，其特征是所说的提取物是通过乙醇浸渍提取法获得的提取物。
5.根据权利要求1所述的提取物，其特征是所说的提取物是通过下述方法获得的提取物：步骤(1)中乙醇浓度为10～90％，步骤(5)中乙醇浓度为20～70％，步骤(7)中提取物A和B按照重量比1∶3～8的比例均匀混合。
6.根据权利要求5所述的提取物，其特征是所说的提取物是通过下述方法获得的提取物：步骤(1)中乙醇浓度为60％～90％，步骤(5)中乙醇浓度为30～50％。
7.一种山茱萸提取物的制备方法，其特征是包括下列步骤：
(1)山茱萸药材用乙醇提取，合并乙醇提取液，过滤后减压浓缩；
(2)将浓缩液加水沉淀后离心，上清液减压浓缩备用；
(3)收集沉淀减压干燥，粉碎后得到提取物A；
(4)将(2)得到的浓缩液上中等极性或非极性大孔吸附树脂柱；
(5)用去离子水洗脱除去杂质后，再用乙醇梯度洗脱；
(6)收集乙醇洗脱液减压干燥，粉碎后得到提取物B；
(7)将提取物A和B均匀混合，即得粉末状的山茱萸提取物。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征是乙醇提取采用回流提取法。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征是乙醇提取采用渗漉提取法。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征是乙醇提取采用浸渍提取法。
11.根据权利要求7所述的方法，其特征是：步骤(1)中乙醇浓度为10～90％，步骤(5)中乙醇浓度为20～70％，步骤(7)中提取物A和B按照重量比1∶3～8的比例均匀混合。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征是：步骤(1)中乙醇浓度为60％～90％，步骤(5)中乙醇浓度为30～50％。
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