CN106138116A - 基于灵芝菌丝分泌酶的灵芝孢子粉优化破壁方法 - Google Patents

Abstract

一种生物工程领域的基于灵芝菌丝分泌酶的灵芝孢子粉优化破壁方法，通过将灵芝孢子粉和基于灵芝菌丝体接种发酵得到的粗酶液混合配制成悬浮液，经高压均质机破壁处理后浓缩干燥得到破壁孢子粉。本发明依据生物转化原理利用灵芝菌丝诱导产酶、并利用粗酶液辅助灵芝孢子粉的破壁，灵芝菌丝发酵粗酶液‐孢子粉的复合物中灵芝β‐葡聚糖和三萜类成分的含量明显增加，且安全、易于吸收，可用于保健食品和药物开发等。

Description

基于灵芝菌丝分泌酶的灵芝孢子粉优化破壁方法

技术领域

本发明涉及的是一种生物工程领域的技术，具体是一种利用灵芝液体发酵技术诱导菌丝分泌锰过氧化物酶，然后通过粗酶液辅助灵芝孢子粉破壁的应用方法。

背景技术

灵芝孢子(Ganoderma spore)是灵芝子实体在生长成熟期从菌盖背面菌褶中弹射出来的极其微小的卵形生殖细胞—担孢子，每个灵芝孢子只有4‐6个微米，是活体生物体，双壁结构，外被坚硬的几丁质纤维素所包围。灵芝孢子粉中含有丰富的多糖、生物碱、有机锗及萜类化合物等多种药理活性成份，能明显提高人体的免疫机能，促进IgM和IgG的产生，有抗病毒、防癌变、抑肿瘤等功能(Jin H，Jin F，Jin JX，Xu J，Tao TT，Liu J，Huang HJ.Protective effects of Ganoderma lucidum spore on cadmium hepatotoxicity in mice.Food Chem Toxicol.2013，52:171‐5.Sliva D，Sedlak M，Slivova V，Valachovicova T，Lloyd FP Jr，Ho NW.Biologic activity of spores and dried powder from Ganoderma lucidum for the inhibition of highly invasive human breast and prostate cancer cells.J Altern Complement Med.2003,9(4)：491‐7.)。灵芝孢子细胞壁由葡聚糖、几丁质等不溶于水的多糖类高分子构成，具有耐酸抗碱，耐压抗热，耐酶抗消化等性质，孢子进入肠胃后，有效成分无法被人体吸收利用，影响其功效的发挥(参考文献：陈体强.原木灵芝孢子研究(Ⅳ)—未破壁孢子与破壁孢子的比较.食用菌学报，1999，6(3):21‐26)；据有关试验表明，一个人若直接食用不经破壁处理的灵芝孢子，人体仅能利用12.0％左右的有效成分，而服用破壁后的孢子粉，利用率可达到95.0％以上(Zhang SQ，Zhu JJ，Wang CZ，et al.Development of wall breaking method of Ganoderma lucidum spores.Transact Chin Soci Agricul Machinery，2004，35(2):160‐162)。由此可见，灵芝孢子粉破壁率的大小就是能否最大程度上利用孢子粉有效成分的关键所在。因此，灵芝孢子粉在食用(或药用)时，通常均要进行破壁处理。

灵芝孢子粉的破壁工艺大致可分为5类：(1)生物法：主要包括溶菌法、激活孢子、酶解法等。(2)化学法：包括酸或碱降解、溶剂浸泡等。(3)物理法：包括超声波、微波、低温、脆化等方法。(4)机械法。挤压、碾压、气流粉碎、撞击、喷射粉碎等方法。(5)综合法：指结合上述多种方法的新型联用技术(赵洁胜魏联虞燕萍王翔谭荣德敖雷。灵芝孢子粉破壁率的检验方法研究进展。中国医药指南.2013,11(5)：431‐433)。从理论上分析，尽管目前有多种方法对灵芝孢子进行破壁处理，但最常用的还是其中的三类方法：机械、物理、化学和生物方法。其 中机械方法、物理方法主要是利用剪切力破坏细胞壁，化学方法是利用去污剂之类的试剂，而生物学方法主要是应用酶来消化细胞壁结构(夏志兰，王春晖，姜性坚，李元文，熊兴耀.灵芝孢子粉生物酶破壁技术的研究.食用菌学报.2005，12(1)：14‐18)。目前来看，机械法比较快捷，使用该方法研磨配合冷冻干燥的破壁效果是最好的(Zhao D，Chang MW，Li JS，Suen W，Huang J.Investigation of ice‐assisted sonication on the microstructure and chemical quality of Ganoderma lucidum spores.J Food Sci.2014，79(11)：E2253‐65.)，因此，在各类灵芝孢子粉加工中最常用；但这类方法破壁率不高，破壁后的孢子有可能会带入过量的重金属杂质，且有效成分受到严重破坏，以此为原料开发的药品功效不高。化学方法对于破坏细胞膜更有用，而利用商业化生产的纯酶破壁虽然有效，但操作繁琐，价格昂贵，不适合大量在生产上使用。因此，高效能的孢子破壁技术和破壁后有效成分的保护技术已成为灵芝孢子新药开发和利用的重要因素。

经过对现有技术的检索发现，中国专利公开号CN1165032公开日1997.11.19，公开了一种灵芝孢子粉的破壁方法，该技术利用溶菌酶，蜗牛酶，纤维素酶或半纤维素酶中的一种或多种复合酶对灵芝孢子粉进行处理，用超声波进行破碎处理完成破壁过程，其破壁率达90％以上。

中国专利公开号CN102960731A公开日2013.03.13，公开了一种抗氧化的破壁灵芝孢子粉的制备方法及产品，该技术将破壁灵芝孢子粉与几丁聚糖食醋胶体溶液充分混合，使破壁灵芝孢子粉充分吸附几丁聚糖食醋胶体溶液；再将吸附有几丁聚糖食醋胶体溶液的破壁灵芝孢子粉进行干燥，得到抗氧化的破壁灵芝孢子粉；这种方法在破壁灵芝孢子粉表面附上ー层壳聚糖保护膜，有效隔绝破壁灵芝孢子粉与外部环境空气的接触，因此提高了破壁灵芝孢子粉的抗氧化能力，有效地防止产品过氧化值升高，延长了保存期限，且提高了产品质量。

上述现有技术利用生物酶对灵芝孢子粉破壁，提高了破壁率，利用破壁灵芝孢子粉与几丁聚糖食醋胶体溶液充分混合，解决了破壁灵芝孢子粉氧化的问题，有效保护了破壁孢子粉中的有效成分。前者在破壁率提高的同时，增加了成本，超声波破壁有可能引起部分有效成分的降解；后者仅注重了破壁后有效成分的保护，并未涉及在破壁过程中如何保护有效成分；且两者在生产的过程中有增加破壁的成本的问题。因此，有必要寻找一种简单经济的方法，在破壁的过程中保护孢子原有的活性成分，甚至增加孢子粉中活性成分的含量，并把这种方法用于生产，服务健康事业。

发明内容

本发明针对现有技术存在的上述不足，提出一种基于灵芝菌丝分泌酶的灵芝孢子粉优化破壁方法，依据生物转化原理利用灵芝菌丝诱导产酶、并利用粗酶液辅助灵芝孢子粉的破壁，灵芝菌丝发酵粗酶液‐孢子粉的复合物中灵芝β‐葡聚糖和三萜类成分的含量明显增加，且安全、 易于吸收，可用于保健食品和药物开发等

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明通过将灵芝孢子粉和基于灵芝菌丝体接种发酵得到的粗酶液混合配制成悬浮液，经破壁均质处理后浓缩干燥得到破壁孢子粉。

所述的粗酶液是指：采用灵芝菌丝体依次在诱导产酶培养基、灵芝预培养培养基和产酶培养基中培养后得到的上清液，其MnP酶活力为：灵芝Ganoderma lucidum51562酶活大于232.38(U/g)，灵芝Ganoderma lucidum00679酶活大于871.44(U/g)。

所述的接种发酵包括：

①预培养，是指在无菌条件下，将灵芝液体菌种按照5％‐10％的量(v/v)接入诱导产酶培养基中诱导培养；

所述的诱导产酶培养基，即PDA固体培养基，通过以下方式制备得到：去皮马铃薯200g用700‐800mL蒸馏水煮30‐40min至烂，用4层纱布过滤后溶入葡萄糖20g，KH₂PO₄5g，MgSO₄·7H₂O 3g，维生素B₁0.01g，定容至1000mL，调pH值至6.5‐7.0，加入琼脂粉16～18g，121℃、1.034×10⁵Pa、20min高压灭菌，冷至60℃时倒平板。

所述的诱导培养是指：在25‐30℃环境下培养8‐10d。

②扩大培养，是指将预培养后的菌种接入含有20～25％(培养液:培养容器v/v)液态的灵芝预培养培养基的容器中，经两阶段旋转培养后取上清液得到。

所述的灵芝预培养培养基通过以下方式制备得到：称取蔗糖35g，蛋白胨(NIHONSEIYAKU公司)5g；酵母粉(MERCK公司)25g；KH₂PO₄·H₂O 1g；MgSO₄·7H₂O 0.5g；维生素B₁0.05g于烧杯中，加入800mL去离子水，充分搅拌溶解，再补水至1000mL；调pH值到5.5，121℃、1.034×10⁵Pa、20min高压灭菌。

所述的旋转培养是指：在28℃恒温振荡器中120rpm培养4‐7d，具体为：用接种铲将1cm²左右的平板菌种接至装有20‐40mL液体灵芝预培养培养基的150mL三角瓶中捣碎；静置2‐3d活化后，将三角瓶放入28℃恒温振荡器中120rpm培养4‐6d；然后将150mL三角瓶中的培养物转入500mL或1L三角瓶中(前者加入100mL，后者加入200mL液体灵芝预培养培养基)放入28℃恒温振荡器中120rpm培养5‐7d，备用。

③发酵，是指将步骤②得到的上清液加入产酶培养基进行旋转培养后离心处理得到上清液。

所述的产酶培养基，即灵芝菌株MnP产酶培养基，其每升组分含量为：磷酸二氢钾1.0g，磷酸氢二钾0.4g，硫酸镁0.5g，氯化钙0.013g，酵母膏0.1g，氮元素26mmol(硝酸铵0.5g；L‐天冬酰胺1.5g)，维生素B₁0.0025g，吐温‐802.0mL，微量元素溶液1.0mL，葡 萄糖(1％W/V)10g，用氢氧化钾(2mol/L)和盐酸(2mol/L)将培养基调至pH 6.0。其中微量元素溶液配方如下(1L)：柠檬酸铁4.8g，七水硫酸锌2.64g，四水二氯化锰2.0g，六水二氯化钴0.4g，五水硫酸铜0.4g。

所述的离心处理是指：在4℃环境下以3000g离心机中离心5min。

所述的灵芝菌丝体是指：经过复壮、液体培养后获得的悬浮在培养液中的灵芝菌丝体和培养液的复合体。

所述的破壁均质是指：将收集的孢子粉加入粗酶液中，经充分震荡后通过高压均质实现破壁，得到孢子粉悬浊液。

所述的充分震荡是指：在25‐28℃的恒温摇床中充分震荡6‐12h。

所述的高压均质是指：在4℃、1000MPa的环境下均质破壁并循环5次。

所述的浓缩干燥是指：浓缩时采用减压浓缩，温度在55℃以下；使用微波真空低温干燥机干燥，干燥温度在55℃以下。

所述的灵芝是指：我国卫生部2001年发布的《可用于保健食品的真菌菌种名单》中的赤灵芝(Ganoderma lucidum)、紫芝(Ganoderma sinensis)或松杉灵芝(Ganoderma tsugae)，进一步优选为公开购自中国农业微生物菌种保藏中心(ACCC)的灵芝51562或灵芝00679菌株。

所述的灵芝孢子粉是指：在灵芝子实体生长发育达到成熟后，从菌管中弹出的一种用于繁殖的担孢子。

技术效果

与现有技术相比，本发明的技术效果包括：

(1)本发明利用灵芝菌丝在特殊的培养基上液体发酵产生的粗酶液(其中含锰过氧化物酶等多种酶)破壁灵芝孢子粉，比单一的商业化酶破壁效果好，成本低。

(2)改善活性成分，增加药用效果。诱导产酶的灵芝菌丝，在产酶的同时能分泌多重活性成分在培养液中，利用该方法破壁孢子粉后检测的灵芝多糖、三萜含量，比未经破壁的孢子粉重的含量明显提高。

(3)高压均质机均质过程在4℃条件下进行，避免加工过程高温带来的有效成分的损失，最大限度地保留了孢子粉中原有的活性成分。

(4)避免其它物理方法加工过程中由于粉碎技术带来的金属离子超标带来的安全隐患。

附图说明

图1为本发明工艺示意图。

图2为实施例葡萄糖的标准曲线示意图。

图3为实施例熊果酸溶液的标准曲线示意图。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1

本实施例涉及灵芝液体菌种的制备，具体包括以下步骤：

步骤1.培养基的制作

(1)PDA固体培养基制作

配制方法：去皮马铃薯200g用700‐800mL蒸馏水煮30‐40min至烂，用4层纱布过滤后溶入葡萄糖20g，KH₂PO₄5g，MgSO₄·7H₂O 3g，维生素B₁0.01g，定容至1000mL，调pH值至6.5‐7.0，加入琼脂粉16～18g，121℃、1.034×10⁵Pa、20min高压灭菌，冷至60℃时倒平板，4℃保存。

(2)灵芝预培养培养基制作

配制方法：称取蔗糖35g，蛋白胨(NIHON SEIYAKU公司)5g；酵母粉(MERCK公司)25g；KH₂PO₄·H₂O 1g；MgSO₄·7H₂O 0.5g；维生素B₁0.05g于烧杯中，加入800mL去离子水，充分搅拌溶解，再补水至1000mL；调pH值到5.5，121℃、1.034×10⁵Pa、20min高压灭菌，4℃保藏。

步骤2.预培养：由试管斜面或培养皿平板固体培养基上的灵芝(Ganoderma lucidum，菌株编号51562以及00679，均公开购自中国农业微生物菌种保藏中心(ACCC))菌丝按照常规方法接至PDA固体培养基平板上，28℃恒温培养7d；

步骤3.扩大培养：用接种铲将1cm²左右的平板菌种接至装有20‐40mL液体灵芝预培养培养基的150mL三角瓶中捣碎；静置2‐3d活化后，将三角瓶放入28℃恒温振荡器中120rpm培养4‐6d；然后将150mL三角瓶中的培养物转入500mL或1L三角瓶中(前者加入100mL，后者加入200mL液体灵芝预培养培养基)放入28℃恒温振荡器中120rpm培养5‐7d，备用。

经上述扩大培养后的培养液清凉透明、菌丝球浓密，且均匀地悬浮在培养液中，培养结束。获得的菌丝球悬浮液可用于固体发酵的液体菌种。

实施例2

本实施例涉及灵芝发酵培养诱导产酶及粗酶液的制备，具体包括以下步骤：

步骤1、培养基的制作

(1)灵芝菌株MnP产酶培养基(1L)：磷酸二氢钾1.0g，磷酸氢二钾0.4g，硫酸镁0.5g，氯化钙0.013g，酵母膏0.1g，氮元素26mmol(硝酸铵0.5g；L‐天冬酰胺1.5 g)，维生素B₁0.0025g，吐温‐802.0mL，微量元素溶液1.0mL，葡萄糖(1％W/V)10g，用氢氧化钾(2mol/L)和盐酸(2mol/L)将培养基调至pH 6.0。其中微量元素溶液配方如下(1L)：柠檬酸铁4.8g，七水硫酸锌2.64g，四水二氯化锰2.0g，六水二氯化钴0.4g，五水硫酸铜0.4g。

(2)培养基的制作：按照上述配方配制好培养基后，121℃、1.034×10⁵Pa、20min高压灭菌，4℃保存。

步骤2、灵芝菌丝体诱导产酶及粗酶液的制备

用移液管取10mL实施例1中制备得到的预培养的含菌球的液体，加入含100mL的产酶培养基中，放入28℃恒温摇床中120rpm培养5‐8d，再置于4℃，3000g离心机中离心5min，取上清液，即为灵芝菌丝诱导产生的粗酶液。

粗酶液的质量以测定锰过氧化物酶(MnP)的活性而定。

步骤3、MnP酶活力测定方法

(1)MnP活力定义：定义1min催化1μmol底物的酶量为一个酶活单位(U)。

(2)操作步骤：准确移取100mM丙二酸‐丙二酸钠缓冲液0.5mL于容积为1.4mL的比色皿中，加入10mM MnSO₄溶液0.1mL。准确加入待测酶液XμL(X＝0‐50)，加入无菌水(400‐X)μL。30℃水浴加热，加入浓度为10mM H₂O₂溶液0.01mL启动反应，迅速测定270nm处的吸光度，1min后再测定一次，计算二者之差，即为每分钟的吸光度变化(OD₂₇₀变化)。

(3)Mnp活力计算：每升酶液所含有的酶活量计算公式如下：

$\left(\mathrm{MnP}\right)=\frac{{\mathrm{\ΔOD}}_{270}/1\mathrm{cm}}{{11590\mathrm{mol}}^{-1}\×{L\×\mathrm{cm}}^{-1}}\×\frac{{10}^6\mathrm{\μmol}}{\mathrm{mol}}\×\frac{{10}^{-3}L}{\mathrm{mL}}\×1.01\mathrm{mol}\÷\frac{X}{{10}^6}L$

$=\frac{{\mathrm{\ΔOD}}_{270}}{11.59}\×1.01\×\frac{{10}^6}{X}(V/L)$

其中，锰过氧化物酶氧化Mn²⁺为Mn³⁺，Mn³⁺与丙二酸形成的复合物在270nm下的摩尔吸光系数为11590mol·L·cm_‐ ¹。

对经过产酶培养2种灵芝菌丝得到的含MnP酶液进行酶活力的测定，得到两种酶液中的MnP酶活力为：灵芝Ganoderma lucidum51562为232.38(U/g)，灵芝Ganodermalucidum00679为871.44(U/g)。

实施例3

本实施例涉及利用粗酶液破壁灵芝孢子粉，具体包括以下步骤：

步骤1、破壁方法

称取10g灵芝孢子粉分别置于150mL的三角瓶中，再加入50‐100mL利用赤芝(Ganoderma lucidum)(编号：00679)以及灵芝(Ganoderma lucidum)(编号：51562)菌丝制备的 粗酶液制成悬浮液，并标记为C和B号样品；然后将三角瓶置于25‐28℃恒温摇床中充分震荡，反应时间为6‐12h，反应完毕后，悬浮液混匀，4℃下利用高压均质机在1000MPa的压力下均质破壁，循环5次。处理过的孢子粉悬浊液用于进一步的加工。

步骤2、破壁率的测定

取破壁前的孢子粉1g，放在曲面玻璃上，进行4小时的真空干燥(≤50℃)，用分析天平(精度±0.1μg)分别称取干燥孢子粉2μg，放入10mL的试管中，用移液器分别在试管中加入2mL的蒸馏水，并振荡搅拌5min成悬浊液待用。用移液器分别吸取少许制备的破壁前后的孢子粉悬浊液滴入血球计数板上，并在显微镜下观察，并按规定计数带入公式：(A–B)/A₀。A为破壁前完整的孢子数，B为破壁后完整的孢子数。

结果显示：孢子粉的破壁率≥95％。

实施例4

本实施例涉及灵芝孢子粉破壁前后多糖含量的测定(苯酚硫酸法)，具体包括以下步骤：

采用实施例3中收集的样品进行下列实验。

步骤1.标准曲线的绘制

精密称取一定重量的样品,于105℃干燥至恒重；准确称取已干燥恒重的葡萄糖0.5000g，加水溶解，定容至50mL，作为葡萄糖标准储备液(此溶液1mL含10.0mg葡萄糖)。准确吸取葡萄糖标准储备液1.0mL，置于100mL容量瓶中，加水至刻度，混匀，作为葡萄糖标准使用液(此溶液1mL含0.10mg葡萄糖)。

准确吸取葡萄糖标准使用液0、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00mL(相当于葡萄糖0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.l0mg)分别置于25mL比色管中，准确补充水至2.0mL，加入50mg/mL的苯酚溶液1.0mL，在旋转混匀器上混匀，小心加入浓硫酸10.0mL，于旋转混匀器上小心混匀，置沸水浴中煮沸2min，冷却后用分光光度计在490nm波长处以试剂空白溶液为参比，1cm比色皿测定吸光度值。以葡萄糖质量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。

步骤2.待测样品溶液的制备：

①样品提取：准确称取三种待测样品2.0g(精准至0.0001g)混匀，置于100mL容量瓶中，加水80mL左右，于沸水浴上加热2h，冷却至室温后补水定容至100mL，混匀后过滤，弃去初滤液，收集余下滤液供沉淀多糖。

②沉淀粗多糖：准确吸取①中终滤液5.0mL以3000r/min离心5min，弃去上清液。残渣用80％(v/v)乙醇溶液数毫升洗涤，离心后弃上清液，反复操作3～4次。残渣用水溶解并 定容至5.0mL，混匀后，供沉淀葡聚糖。

③沉淀葡聚糖：准确吸取②中终溶液2mL置于20mL离心管中，加入100g/L氢氧化钠溶液2.0mL、铜试剂溶液2.0mL，沸水浴中煮沸2min，冷却，以3000r/min离心5min，弃去上清液。残渣用洗涤液数毫升洗涤，离心后弃去上清液，反复操作3次，残渣用10％(v/v)硫酸溶液2.0mL溶解并转移至100mL容量瓶中，加水稀释至刻度定容，混匀。此溶液为样品测定液。

步骤3.葡聚糖糖含量测定

准确吸取样品测定液2.0mL置于25mL比色管中，加入50g/L苯酚溶液1.0mL，在旋转混匀器上混匀，小心加入浓硫酸10.0mL于旋转混匀器上小心混匀，置沸水浴中煮沸2min，冷却至室温，用分光光度计在490nm波长处，以试剂空白为参比，1cm比色皿测定吸光度值。依据标准曲线计算样品中葡萄糖含量。同时做样品空白实验。

测定结果

(1)回归方程。按照王亚光《保健食品功效成分检测方法》(中国轻工业出版社，2002)报道的方法，以葡萄糖糖质量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，见图2。葡萄糖含量和吸光度值经回归处理，回归方程为y＝2.9191x+0.0834，R²＝0.9924(n＝7)，含量在0～0.1mg范围内线性比较好。

葡萄糖质量和吸光度值经回归处理，回归方程为y＝2.9191x+0.0834，R²＝0.9924(n＝7)，含量在0～0.1mg范围内线性比较好。

(2)样品中β‐葡聚糖含量测定。通过添加酶液对孢子粉进行破壁测定其多糖含量，结果见表1。

表1 灵芝孢子粉破壁后多糖含量分析结果如下表所示。

注：表中样品A为未添加酶液，B为添加灵芝Ganoderma lucidum51562菌丝产MnP酶液，C为添加灵芝Ganoderma lucidum00679菌丝产MnP酶液。

多糖作为灵芝抱子粉的有效生物活性成分之一，本实验含量最高的是通过添加赤芝的酶液达到了0.082mg/mL，不添加酶液的含量最低0.065mg/mL，这说明添加粗酶液破壁灵芝孢子粉较未添加酶液破壁的孢子粉，多糖含量有明显提高。

实施例5

本实施例涉及灵芝孢子粉破壁前后三萜类物质含量的测定，具体包括以下步骤：

步骤1、标准曲线的绘制

精密吸取熊果酸标准对照溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL，在548nm处测定吸光值，以熊果酸的毫克数为横坐标，吸光值为纵坐标，作图得到标准曲线与回归方程，见图2，回归方程为y＝0.87211x+0.0580，R²＝0.9644(n＝5)，表示含量在0.0146～0.073mg范围内线性比较好。

步骤2、样品吸光值及三萜含量分析结果

按照常规方法，对添加酶液辅助破壁灵芝孢子粉后，样品中三萜的含量进行了测定，其结果见表2。

表2 灵芝孢子粉破壁后三萜类物质含量测定结果

表3中样品A为未添加酶液，B为添加灵芝Ganoderma lucidum51562菌丝产MnP酶液，C为添加灵芝Ganoderma lucidum00679菌丝产MnP酶液。

不添加酶液破壁孢子粉的三萜含量2.297mg/mL，而添加酶液破壁后三萜的含量都在3.0mg/mL以上，且都高于不添加酶液破壁的的孢子粉三萜含量，表明添加酶液破壁后的孢子粉较未添加酶液破壁的孢子粉，三萜类活性物质含量明显提高，这说明添加酶液对孢子粉的破壁有显著提高三萜类物质含量的效果。

Claims (10)

1.一种基于灵芝菌丝分泌酶的灵芝孢子粉优化破壁方法，其特征在于，通过将灵芝孢子粉和基于灵芝菌丝体接种发酵得到的粗酶液混合配制成悬浮液，经破壁均质处理后浓缩干燥得到破壁孢子粉，所述的粗酶液是指：采用灵芝菌丝体依次在诱导产酶培养基、灵芝预培养培养基和产酶培养基中培养后得到的上清液。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的接种发酵包括：

①预培养，是指在无菌条件下，将灵芝菌丝体按照5‐10％的量(v/v)接入诱导产酶培养基中诱导培养；

②扩大培养，是指将预培养后的菌种接入含有液态的灵芝预培养培养基的容器中，经两阶段旋转培养后取上清液得到；

③发酵，是指将步骤②得到的上清液加入产酶培养基进行旋转培养后离心处理得到上清液。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征是，所述的诱导产酶培养基，即PDA固体培养基，通过以下方式制备得到：去皮马铃薯200g用700‐800mL蒸馏水煮30‐40min至烂，用4层纱布过滤后溶入葡萄糖20g，KH₂PO₄5g，MgSO₄·7H₂O 3g，维生素B₁0.01g，定容至1000mL，调pH值至6.5‐7.0，加入琼脂粉16～18g，121℃、1.034×10⁵Pa、20min高压灭菌，冷至60℃时倒平板。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征是，所述的灵芝预培养培养基通过以下方式制备得到：称取蔗糖35g，蛋白胨5g；酵母粉25g；KH₂PO₄·H₂O 1g；MgSO₄·7H₂O 0.5g；维生素B₁0.05g于烧杯中，加入800mL去离子水，充分搅拌溶解，再补水至1000mL；调pH值到5.5，121℃、1.034×10⁵Pa、20min高压灭菌。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征是，所述的两阶段旋转培养是指：用接种铲将1cm²左右的平板菌种接至装有20‐40mL液体灵芝预培养培养基的150mL三角瓶中捣碎；静置2‐3d活化后，将三角瓶放入28℃恒温振荡器中120rpm培养4‐6d；然后将150mL三角瓶中的培养物转入含有液体灵芝预培养培养基的三角瓶中，放入28℃恒温振荡器中120rpm培养5‐7d，备用。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征是，所述的产酶培养基，即灵芝菌株MnP产酶培养基，其每升组分含量为：磷酸二氢钾1.0g，磷酸氢二钾0.4g，硫酸镁0.5g，氯化钙0.013g，酵母膏0.1g，氮元素26mmol(硝酸铵0.5g；L‐天冬酰胺1.5g)，维生素B₁0.0025g，吐温‐802.0mL，微量元素溶液1.0mL，葡萄糖(1％W/V)10g，用氢氧化钾(2mol/L)和盐酸(2mol/L)将培养基调至pH 6.0，其中微量元素溶液配方如下(1L)：柠檬酸铁4.8g，七水硫酸锌2.64g，四水二氯化锰2.0g，六水二氯化钴0.4g，五水硫酸铜0.4g。

7.根据权利要求2所述的方法，其特征是，所述的离心处理是指：在4℃环境下以3000g离心机中离心5min。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的破壁均质是指：将收集的孢子粉加入粗酶液中，经充分震荡后通过高压均质实现破壁，得到孢子粉悬浊液。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征是，所述的充分震荡是指：在25‐28℃的恒温摇床中充分震荡6‐12h；所述的高压均质是指：在4℃、1000MPa的环境下均质破壁并循环5次。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的浓缩干燥是指：浓缩时采用减压浓缩，温度在55℃以下；使用微波真空低温干燥机干燥，干燥温度在55℃以下。