CN107637390A - 一种活体蚕及蚕蛹培养野生蝉花的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种活体蚕及蚕蛹培养野生蝉花的方法，包括以下步骤：将野生菌株的分离与纯化，然后制备菌种悬液，选用家蚕的幼虫或蚕蛹作为受体进行接种，接种后，在培养室中恒温培养至菌丝长出蚕虫和蛹体外、出现孢梗束原基、孢柄束顶端膨大并出现星状物后，连同蚕幼虫和蚕蛹一起烘干，进行分级包装。本发明的优点在于将野生蝉花的菌种分离纯化接种至家蚕上，培育的蚕花其主要生物活性成分、药理学作用均和天然蝉花相似或超出天然蝉花；家蚕来源充足，操作相对简单，投入少，产出大，经济效益可观；人工蝉花产量大，可避免野生蝉花的过渡采摘，保护自然资源。
Description
技术领域
本发明属于生物工程领域，具体涉及一种活体蚕及蚕蛹培养野生蝉花的方法
背景技术
蝉花(Cordvceps cicadae(Miq.)Massee)又名金蝉花、蝉茸、蝉蛹草、虫花等，为麦角菌科真菌大蝉草寄生在蝉科昆虫若虫上的子座及若虫尸体的复合体。现代药理研究证实了蝉花具有镇痛、抗高血压、双向免疫调节、抑制肿瘤生长及抗炎、改善肾功能等作用。它可以寄生在蝉蛹或是山蝉的幼虫身上，使虫体死亡，然后将虫体变成菌核，同时在尸体的前段长出子座。晒干后可入药，含有氨基酸、多糖、虫草酸、生物碱、脂肪酸、麦角甾醇及糖原等物质。蝉花主要分布在中国的四川、江苏、浙江、福建等地，一般生长于竹林的丘陵地带，海拔80-500m，地势平缓，郁闭度较高，土质疏松，湿度较大，地面覆盖有枯枝落叶层，且常有竹蝉活动的某些林地，一般均能采到蝉花。
由于蝉花是一种具有药用和滋补功效的珍贵传统中药材，以蝉花为原料的药用保健品在不断的开发，野生蝉花的数量已经远远不能满足国内外市场的需求。然而在自然条件下，天然野生蝉花的产生总是依赖于寄主，而寄主又受自然环境的制约，因此蝉花的出产率非常的低。
发明内容
为克服上述技术问题，本发明提供了一种人工培养蝉花的方法，快速大量的生产蝉花，来替代日益枯竭的自然资源。
为达到上述目的，本发明是通过以下的技术方案来实现的。
一种活体蚕及蚕蛹培养野生蝉花的方法，包括以下步骤：
(1)野生菌株的分离与纯化：采挖的野生蝉花，从蝉花孢梗束中切取组织块，接种于PDA斜面试管培养基中，当长出白色绒毛状菌丝时，挑取部分菌丝接种于另一PDA斜面试管培养基中，待菌丝长满斜面试管即为纯化的母种；
(2)菌种悬液的制备：挑取纯化的母种接种至斜面试管培养基中培养7～10天后，将斜面菌种的菌苔薄层铲下，与无菌水混合匀浆，制得菌种悬液；
(3)接种：在蚕幼虫或蚕蛹的倒数第二个节间膜侧面接种菌种悬液，接种时注射器针头倾斜30度，轻挑节间膜，每条蚕幼虫或蚕蛹穿刺接种1次，使用10μL的注射器轻推至针孔处有液体渗出为宜；
(4)培养与采收：将穿刺接种后的蚕幼虫或蚕蛹放入培养室进行培养，培养至菌丝长出蚕虫和蛹体外、出现孢梗束原基，当孢柄束顶端膨大并出现星状物时停止培养，将长好的孢柄束连同蚕幼虫和蚕蛹一起烘干，进行分级包装。
进一步地所述步骤(1)中斜面试管培养基中培养在19℃恒温条件下完成；纯化的母种的置于0-4℃冰箱中保藏。
进一步地所述步骤(2)中斜面试管培养基的制备方法为，量取1000mL的水，加热至沸，然后将可溶性淀粉18～22g，奶粉8～12g，磷酸二氢钾0.4～0.6g，硫酸镁0.8～1.2g，维生素B12 250～300μg，琼脂20g加入水中，搅拌溶解，趁热分装到试管中，每个试管装12mL，将试管封口，放入高压灭菌锅内灭菌，灭菌后取出试管摆斜面，斜面的长度为试管总长度的1/2-2/3；
进一步地所述步骤(3)中在接种前用消毒净或熏毒威对待接种蚕幼虫和蚕蛹进行消毒。
进一步地所述步骤(3)中蚕幼虫为5龄家蚕。
进一步地所述步骤(4)中先将穿刺接种后的蚕幼虫或蚕蛹移入培养室进行培养，控制培养温度在15～30℃左右、空气相对湿度50％-100％，培养7-10至天菌丝长出蚕幼虫或蚕蛹体外；再将长出菌丝的蚕幼虫或蚕蛹移入出草室进行培养，控制培养温度在15～30℃左右、空气相对湿度50％-100％，培养18～22天至孢梗束原基的出现，再继续培养15-20天，当孢柄束顶端膨大并出现星状物时停止培养。
进一步地所述步骤(4)中先将穿刺接种后的蚕幼虫或蚕蛹移入培养室进行培养，控制培养温度在25℃±0.5℃左右、空气相对湿度60％-70％、避光，培养7-10至天菌丝长出蚕幼虫或蚕蛹体外；再将长出菌丝的蚕幼虫或蚕蛹移入出草室进行培养，控制培养温度在20℃±0.5℃左右、空气相对湿度80％-100％、光照为6000～18000LX，培养18～22天至孢梗束原基的出现，再继续培养15-20天，当孢柄束顶端膨大并出现星状物时停止培养。
进一步地所述步骤(4)中干燥温度50～55℃、时间6～8h。
有益效果：与现有技术相比，本发明的优点在于：
1)将野生蝉花的菌种分离纯化接种至家蚕上，培育的蚕花其主要生物活性成分、药理学作用均和天然蝉花相似或超出天然蝉花；
2)家蚕来源充足，操作相对简单，投入少，产出大，经济效益可观；
3)人工蝉花产量大，可避免野生蝉花的过渡采摘，保护自然资源。
附图说明
图1蚕幼虫穿刺接种；
图2蚕蛹穿刺接种；
图3蝉花菌丝长出蚕幼虫；
图4蝉花菌丝长出蚕蛹；
图5蚕幼虫长出孢梗束原基；
图6蚕蛹长出孢梗束原基；
图7蚕幼虫长出星状孢梗束；
图8蚕蛹长出星状孢梗束。
具体实施方式
下面结合实例对本发明作进一步的详细说明。本发明所用的原料均为市售产品，野生蝉花为江苏省句容市瓦屋山地区6月份至8月份所产，通过进林采挖获得。
实施例1
一种活体蚕及蚕蛹培养野生蝉花的方法，包括以下步骤：
1.野生菌株的分离与纯化：将采挖的野生蝉花去除表面的泥土，并用70％酒精棉球擦拭蝉花的表面，在超净工作台内，按无菌操作的要求，从蝉花孢梗束中切取0.1cm左右见方组织块，接种于PDA斜面试管培养基中央，在19℃恒温下培养2～3天，当接种块上长出白色绒毛状菌丝时，在无菌条件下，挑取接种块边缘米粒大小的菌丝接种另一支PDA斜面试管培养基中央，在19℃恒温下培养7～10天，待菌丝长满斜面试管即为纯化的母种，此时若不使用，应置于0-4℃冰箱中保藏；
2.菌种悬液的制备：
(1)制备斜面试管培养基：以配制1000mL培养基为例，量取1000mL的水，加热至沸，然后将可溶性淀粉20g，奶粉10g，磷酸二氢钾0.5，硫酸镁1g，维生素B12 250μg，琼脂20g加入水中，搅拌溶解，趁热分装到试管中，每个试管装12mL，将试管封口，放入高压灭菌锅内灭菌，灭菌后取出试管摆斜面，斜面的长度为试管总长度的1/2-2/3；
(2)将已灭过菌的斜面试管培养基、接种工具、酒精棉球、酒精灯等放入超净工作台中，开启紫外线灯照射30min，用70％的酒精对野生菌株的菌种试管进行消毒，操作人员的双手用70％酒精消毒；然后点燃酒精灯，在酒精灯火焰无菌区范围内，将接种针在酒精灯火焰上灼烧灭菌，用消毒过的接种针挑取1mm见方带有PDA培养基的母种菌丝，通过酒精灯火焰的无菌区，放入到试管培养基的中央，放菌丝块的时候不要接触到瓶壁，避免污染；接种后试管放置在19℃的恒温培养箱内培养7～10天，每天逐管观察是否有污染，发现污染的试管立即弃除；然后用无菌水刮洗斜面试管菌种,每支斜面用10mL无菌水，用接种铲将斜面菌种的菌苔薄层铲下,打碎菌苔或将斜面菌苔和无菌水放入高速匀浆机的匀浆瓶，10000r/min匀浆0.5min，制得菌种悬液；
3.接种：选择5龄家蚕作为蝉花接种栽培的寄主,此时蚕虫体大肥硕,体内的丝腺蛋白占体重40％左右的，这将为蝉花的生长提供丰富的营养,有利于培养出活性成分高的蝉花；先用蚕用消毒净或熏毒威对待接种蚕和蚕蛹进行消毒，在蚕幼虫或蚕蛹的倒数第二个节间膜侧面接种，接种时微型注射器的针头倾斜30°左右，轻挑节间膜，切不可用力过大，易刺伤虫体内消化系统，引起虫体死亡或感染，每条蚕幼虫和蛹宜穿刺接种1次，每次的接种量为10μL的注射器轻推至针孔处有液体渗出为宜；
4.培养与采收：先将穿刺接种后的蚕幼虫或蚕蛹移入培养室进行培养，控制培养温度在15～30℃左右、空气相对湿度50％-100％、光照为0～3000LX，培养7-10至天菌丝长出蚕幼虫或蚕蛹体外；再将长出菌丝的蚕幼虫或蚕蛹移入出草室进行培养，控制培养温度在15～30℃左右、空气相对湿度50％-100％，光照为6000-18000LX，培养18～22天至孢梗束原基的出现，再继续培养15-20天，当孢柄束顶端膨大并出现星状物时停止培养，将长好的孢柄束连同蚕幼虫和蚕蛹一起放入50℃-55℃的鼓风干燥箱内烘6-8h，烘干后进行分级包装。
试验发现不同的穿刺接种次数、接种后的培养温度、湿度、光照度对菌丝萌发率、菌丝生长速度、蚕蛹存活率、出孢梗束率的产生影响，具体见下表：
表1穿刺接种次数对菌丝萌发率、菌丝生长速度、蚕蛹存活率、出孢梗束率的影响
表2接种后的培养温度对菌丝萌发率、菌丝生长速度、蚕蛹存活率、出孢梗束率的影响
表3接种后的培养湿度对菌丝萌发率、菌丝生长速度、蚕蛹存活率、出孢梗束率的影响
表4接种后的培养光照度对菌丝萌发率、菌丝生长速度、蚕蛹存活率、出孢梗束率的影响
由上述数据得出最适的接种量为每只蚕和蚕蛹穿刺接种一次，菌丝生长期最适温度为25℃，孢梗束的最适生长温度为20℃，菌丝生长期最适空气湿度为60％-70％，孢柄束生长期最适空气湿度为90％，菌丝生长期不需要光照，黑暗或弱光条件更利于菌丝的萌发与生长；而孢柄束生长期需要一定的光照刺激，在6000-18000LX下有利于孢梗束的发生与生长。
实施例2
与实施例1基本相同，按最佳培养条件操作，所不同的是制备斜面试管培养基：以配制1000mL培养基为例，量取1000mL的水，加热至沸，然后将可溶性淀粉18g，奶粉12g，磷酸二氢钾0.4g，硫酸镁1.2g，维生素B12 250μg，琼脂20g加入水中，搅拌溶解，趁热分装到试管中，每个试管装12mL，将试管封口，放入高压灭菌锅内灭菌，灭菌后取出试管摆斜面，斜面的长度为试管总长度的1/2-2/3。
实施例3
与实施例1基本相同，按最佳培养条件操作，所不同的是制备斜面试管培养基：以配制1000mL培养基为例，量取1000mL的水，加热至沸，然后将可溶性淀粉22g，奶粉8g，磷酸二氢钾0.6g，硫酸镁0.8g，维生素B12 300μg，琼脂20g加入水中，搅拌溶解，趁热分装到试管中，每个试管装12mL，将试管封口，放入高压灭菌锅内灭菌，灭菌后取出试管摆斜面，斜面的长度为试管总长度的1/2-2/3。
表5人工培养蝉花的与野生蝉花的营养成分比较
本发明按照上述实施例进行了说明，应当理解，上述实施例不以任何形式限定本发明，凡采用等同替换或等效变换方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种活体蚕及蚕蛹培养野生蝉花的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）野生菌株的分离与纯化：采挖的野生蝉花，从蝉花孢梗束中切取组织块，接种于PDA斜面试管培养基中，当长出白色绒毛状菌丝时，挑取部分菌丝接种于另一PDA斜面试管培养基中，待菌丝长满斜面试管即为纯化的母种；
（2）菌种悬液的制备：挑取纯化的母种接种至斜面试管培养基中培养7~10天后，将斜面菌种的菌苔薄层铲下，与无菌水混合匀浆，制得菌种悬液；
（3）接种：在蚕幼虫或蚕蛹的倒数第二个节间膜侧面接种菌种悬液，接种时注射器针头倾斜30度，轻挑节间膜，每条蚕幼虫或蚕蛹穿刺接种1次，使用10μL的注射器轻推至针孔处有液体渗出为宜；
（4）培养与采收：将穿刺接种后的蚕幼虫或蚕蛹放入培养室进行培养，培养至菌丝长出蚕虫和蛹体外、出现孢梗束原基，当孢柄束顶端膨大并出现星状物时停止培养，将长好的孢柄束连同蚕幼虫和蚕蛹一起烘干，进行分级包装。
2.根据权利要求1所述的一种活体蚕及蚕蛹培养野生蝉花的方法，其特征在于，所述步骤（1）中斜面试管培养基中培养在19℃恒温条件下完成；纯化的母种置于0-4℃冰箱中保藏。
3.根据权利要求1所述的一种活体蚕及蚕蛹培养野生蝉花的方法，其特征在于，所述步骤（2）中斜面试管培养基的制备方法为，量取1000mL的水，加热至沸，然后将可溶性淀粉18~22g，奶粉8~12g，磷酸二氢钾0.4~0.6g，硫酸镁0.8~1.2g，维生素B12 250~300µg，琼脂20 g加入水中，搅拌溶解，趁热分装到试管中，每个试管装12mL，将试管封口，放入高压灭菌锅内灭菌，灭菌后取出试管摆斜面，斜面的长度为试管总长度的1/2-2/3。
4.根据权利要求1所述的一种活体蚕及蚕蛹培养野生蝉花的方法，其特征在于，所述步骤（3）中在接种前用消毒净或熏毒威对待接种蚕幼虫和蚕蛹进行消毒。
5.根据权利要求1所述的一种活体蚕及蚕蛹培养野生蝉花的方法，其特征在于，所述步骤（3）中蚕幼虫为5龄家蚕。
6.根据权利要求1所述的一种活体蚕及蚕蛹培养野生蝉花的方法，其特征在于，所述步骤（4）中先将穿刺接种后的蚕幼虫或蚕蛹移入培养室进行培养，控制培养温度在15~30℃左右、空气相对湿度50%-100%，培养7-10天至菌丝长出蚕幼虫或蚕蛹体外；再将长出菌丝的蚕幼虫或蚕蛹移入出草室进行培养，控制培养温度在15~30℃左右、空气相对湿度50%-100%，培养18~22天至孢梗束原基的出现，再继续培养15-20天，当孢柄束顶端膨大并出现星状物时停止培养。
7.根据权利要求6所述的一种活体蚕及蚕蛹培养野生蝉花的方法，其特征在于，所述步骤（4）中先将穿刺接种后的蚕幼虫或蚕蛹移入培养室进行培养，控制培养温度在25±0.5℃左右、空气相对湿度60%-70%、避光，培养7~10天至菌丝长出蚕幼虫或蚕蛹体外；再将长出菌丝的蚕幼虫或蚕蛹移入出草室进行培养，控制培养温度在20±0.5℃左右、空气相对湿度80%-100%、光照为6000~18000LX，培养18~22天至孢梗束原基的出现，再继续培养15-20天，当孢柄束顶端膨大并出现星状物时停止培养。
8.根据权利要求1所述的一种活体蚕及蚕蛹培养野生蝉花的方法，其特征在于，所述步骤（4）中干燥温度50~55℃、时间6~8h。
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