CN1740333A - 海藻糖的发酵制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明是海藻糖的发酵制备方法，该糖是由扣囊复膜酵母A11菌株，其菌种保藏号为：CGMCC No.1426，保藏日期为2005年7月25日；而发酵产生的。其制备方法如下：(1)制备种子液；(2)发酵罐发酵；(3)蒸馏水提取；(4)超滤膜提取；(5)脱色；(6)真空浓缩；(7)将(6)步的浓缩液冷冻干燥，得海藻糖晶体。本发明由于用可溶性淀粉或用玉米淀粉代替葡萄糖发酵，节约了成本，使得海藻糖积累量达到了22.89％。本发明由于采用蒸馏水提取，提取率在：12.99％－16.49％。该海藻糖具有较高的热稳定性。其应用于农业、花卉栽培；用于提高双岐杆菌的存活率保证其货架寿命的保护剂；用于食品烘烤制品类；用于糖果类与其它大多数增甜剂混合；用于配制“益齿”产品；具有积极的工业实用性。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术的改进，具体讲是一种海藻糖的发酵制备方法。其属于生物技术、轻工业生产技术领域。
背景技术
现有技术中的海藻糖(Trehalose)又名覃糖，存在于细菌、酵母菌、真菌以及一些昆虫、脊椎动物和植物中。海藻糖不仅可以作为细胞碳源储存物，而且可用作高效保护剂增加细胞组分对不良环境条件(如高温、冷冻、脱水、高渗透压和高酒精浓度)的抗性。海藻糖的这种保护特性使它在许多方面具有广泛的应用，如医学和微生物学中作为细胞防冻剂、作为化妆品的有效成分、作为诊断试剂和生物产品的稳定剂。应用海藻糖作为保护剂是目前其它种类的保护剂都不可能达到的效果，例如：利用海藻糖作为诊断工具酶等生物试剂的稳定剂和保护剂，可置于常温条件下干燥并保存，不仅简化了生物试剂的制备过程，也给患者的疾病诊治带来便利。海藻糖还可以用作新鲜食品的防腐剂，还可应用于研究用生物试剂的保存，例如各种工具酶、细胞膜、细胞器、抗体、抗原及病毒等等，使得生命科学研究更为方便快捷有效。因此，致力于用廉价的方法生产海藻糖是生物技术、轻工业生产技术领域的科技人员的研究课题。
发明内容
本发明的发明目的就是要提供一种发酵制备海藻糖(Trehalose)的方法。本发明由济南地区空气中分离得到扣囊复膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera sdu)A11突变株的菌种保藏号为：CGMCC No.1426，保藏日期为2005年7月25日。保藏机构为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：中国科学院微生物研究所。
本发明采用YPD培养基：蛋白胨2％，酵母粉1％，葡萄糖2％，琼脂2％，pH5.5；将该YPD平板暴露于空气中，再在30℃下培养48小时，挑取单菌落，再在YPD平板上划线纯化，直到得到纯种扣囊复膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera sdu)。取菌种在YPD液体培养基30℃培养48h，检测海藻糖含量，取海藻糖含量最高的为目的菌株。对目的菌株鉴定为扣囊复膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera sdu)。经化学诱变；筛选；将挑选出的突变株接入YPS培养基，两次在30℃下振荡培养后。用蒽酮法检测各个突变株海藻糖积累量，并与野生型的海藻糖积累量作比较；挑选出海藻糖积累量较高的目的菌株。
本发明的任务是由以下技术方案完成的，研制了一种海藻糖(Trehalose)的发酵制备方法。所述的海藻糖(Trehalose)是由扣囊复膜酵母(Saccharomycopsis fibuligerasdu)A11菌株CGMCC No.1426发酵产生的；所述的制备方法如下：
(1)制备种子液：将菌种保藏号为：CGMCC No.1426的扣囊复膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera sdu)A11菌株活化培养1-2天后，由斜面菌苔接种入装有50ml YPD培养基的三角瓶中，30℃振荡培养24-36小时，以培养好的菌悬液为种子液；
(2)发酵罐发酵：将该A11菌株的菌悬液以6-16％接种量接种入装有可溶性淀粉培养基的发酵罐中进行培养，发酵罐培养温度为25-35℃，通气量为1.0-4.0∶1，搅拌转速100-300rpm，培养pH5.3--5.7，隔4--6小时取样在100℃烘干至恒重检测菌体干重和测海藻糖含量，培养48--54小时后终止发酵，并将发酵液分离取菌体；
(3)蒸馏水提取：将分离的湿菌体按重量/体积比1∶4-12的投料比分次加入蒸馏水，并在75--85℃下水浴中提取，累计提取时间为28--32min，然后离心取滤液，弃去菌体；
(4)超滤膜提取：(3)步滤液中仍含有少量的可溶性多糖类和蛋白质，采用截流分子量为5Kda的超滤膜超滤，以除去分子量较大的多糖类和蛋白质物质；
(5)脱色：将(4)步超滤液用201X7型阴离子树脂柱和717型阳离子树脂柱，上柱脱色，收集洗脱液；
(6)真空浓缩：采用旋转蒸发仪真空浓缩(5)步的洗脱液，检测该浓缩液中的海藻糖含量在20--50％；
(7)将(6)步的浓缩液在-50℃下直接冷冻干燥，得海藻糖晶体；
该海藻糖是非还原性双糖，其分子式为C12H22O11，含两分子结晶水的相对分子量为378.33，溶解度：10℃时为55.3，50℃时为140.1，90℃时为602.9；该糖的水溶液在37℃下可保存12个月，无色无嗅，口感略带甜味；该糖不能使斐林试剂还原，也不能被α-糖苷酶水解，在强酸条件下能被水解为两个葡萄糖分子；热稳定性：在120℃的水中或在含蛋白质溶液的沸水中，90min褐变。
所述的发酵罐装有的可溶性淀粉培养基的组成如下：豆粕水解液1.0--6.0％(w/v)，可溶性淀粉0.5--6.0％(w/v)，其余为水。
所述的可溶性淀粉，其是玉米淀粉，或薯类淀粉，或大米淀粉。
所述的YPD培养基的组成如下：酵母膏(粉)0.5--2.0％(w/v)，葡萄糖1.0--3.0％(w/v)，蛋白胨1.0--3.0％(w/v)，其余为水。
本发明的优点在于：由于分离得到的扣囊复膜酵母(Saccharomycopsisfibuligera sdu)A11突变株，其菌种保藏号为：CGMCC No.1426，保藏日期为2005年7月25日。由于该菌种经化学诱变技术，而获得酸性和中性海藻糖酶活力大大降低的A11突变株，而且该突变株在可溶性淀粉培养基中培养菌体内海藻糖的累积量较高。尤其重要的是：用可溶性淀粉代替葡萄糖进行发酵，节约了成本。又用价格便宜的豆饼粉水解液代替蛋白胨和酵母粉，使得海藻糖积累量达到了21.2％(W/W)。用玉米淀粉代替可溶性淀粉来生产海藻糖能使海藻糖的生产成本更低，A11突变株在1％(w/v)玉米淀粉培养基中发酵48小时菌体内海藻糖的累积量达到22.89％(w/w)。本发明由于采用蒸馏水提取，将分离的湿菌体按重量/体积比1∶4-16的投料比分次加入蒸馏水，并在75--85℃下水浴中提取，累计提取时间为28--32min，然后离心取滤液，弃去菌体；其提取率在：12.99％-16.49％。
具体实施方式
本发明的扣囊复膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera sdu)由济南市空气中分离得到，采用YPD培养基(蛋白胨，2％；酵母粉，1％；葡萄糖，2％；琼脂，2％；pH，5.5)分离，将YPD平板暴露于空气中，在30℃培养48h，挑取单菌落在YPD平板上划线纯化，直到得到纯种酵母菌。取菌种在YPD液体培养基30℃培养48h，检测海藻糖含量，取海藻糖含量最高的为目的菌株。对目的菌株鉴定为扣囊复膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera sdu)。
化学诱变：
1)将扣囊复膜酵母由斜面转接入50ml YPD液体培养基，30℃振荡培养18小时，取适量培养液离心去上清液，菌体用无菌水离心洗涤三次后悬浮于诱变溶液(0.1M磷酸缓冲液，pH8.0，5％(v/v)EMS)中，30℃保温30min后迅速离心去上清，洗涤菌体后用5％(w/v)硫代硫酸钠处理15min，除去EMS的毒性。
2)诱变后的酵母细胞转接入50ml YPD培养基，30℃下振荡培养18h，离心洗涤菌体后再转接入内含2.0％(w/v)海藻糖，20mg/1000ml赖氨酸的YNB培养基振荡培养12小时。加入1mg/ml的制霉菌素100μl继续振荡1h。
3)取少量菌液，用美兰染色，在显微镜下观察，估计死菌和活菌的比例后用血球计数板计活菌数。
4)离心洗涤细胞，用无菌水稀释细胞至适当倍数后，涂布在YPD平板上，30℃下培养至长出单菌落。
筛选：
1)将长出的单菌落分别点种在YPD固体培养基和YNB固体培养基(内含2.0％(w/v)海藻糖和20mg/1000ml Lys)上，挑选出在YPD平板上生长正常，在YNB平板上不长或生长缓慢的单菌落。
2)将挑选出的突变株点种在分别以淀粉、海藻糖、蔗糖、麦芽糖、葡萄糖为唯一碳源的YNB固体培养基上，观察生长情况，弃去在海藻糖以外的碳源上生长缓慢的菌株。
3)将挑选出的突变株接入50ml YPS培养基，30℃下振荡培养24h后再转接入100ml YPS培养基，30℃下振荡培养48h。用蒽酮法检测各个突变株海藻糖积累量，并与野生型的海藻糖积累量作比较。挑选出海藻糖积累量较高的目的菌株。
本发明的保护范围不仅局限于实施例中，利用发酵罐研究一种海藻糖(Trehalose)的发酵制备方法。所述的海藻糖(Trehalose)是由扣囊复膜酵母(Saccharomycopsisfibuligera sdu)A11菌株CGMCC No.1426发酵产生的；所述的制备方法如下：
(1)制备种子液：将菌种保藏号为：CGMCC No.1426的扣囊复膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera sdu)A11菌株活化培养1-2天后，由斜面菌苔接种入装有50ml YPD培养基的三角瓶中，30℃振荡培养24-36小时，以培养好的菌悬液为种子液；
(2)发酵罐发酵：将该A11菌株的菌悬液以8-12％接种量接种入装有可溶性淀粉培养基的发酵罐中进行培养，发酵罐培养温度为28-32℃，通气量(体积比)为1.0-4.0∶1，搅拌转速100-300rpm，培养pH5.3-5.7，隔4-6小时取样在100℃烘干至恒重检测菌体干重和测海藻糖含量，培养48-54小时后终止发酵，并将发酵液分离取菌体；
(3)蒸馏水提取：将分离的湿菌体按重量/体积比1∶4-16的投料比分次加入蒸馏水，并在75-85℃下水浴中提取，累计提取时间为28-32min，然后离心取滤液，弃去菌体；
(4)超滤膜提取：(3)步滤液中仍含有少量的可溶性多糖类和蛋白质，采用截流量为5Kda的超滤膜超滤，以除去分子量较大的多糖类和蛋白质物质；
(5)脱色：将(4)步超滤液用201X7型阴离子树脂柱和717型阳离子树脂柱，上柱脱色，收集洗脱液；
(6)真空浓缩：采用旋转蒸发仪真空浓缩(5)步的洗脱液，检测该浓缩液中的海藻糖含量在20--50％；
(7)将(6)步的浓缩液在-50℃下直接冷冻干燥，得海藻糖晶体；
该海藻糖是非还原性双糖，其分子式为C12H22O11，含两分子结晶水的相对分子量为378.33，溶解度：10℃时为55.3，50℃时为140.1，90℃时为602.9；该糖的水溶液在37℃下可保存12个月，无色无嗅，口感略带甜味；该糖不能使斐林试剂还原，也不能被α-糖苷酶水解，在强酸条件下能被水解为两个葡萄糖分子；热稳定性：在120℃的水中或在含蛋白质溶液的沸水中，90min褐变。
所述的发酵罐装有的可溶性淀粉培养基的组成如下：豆粕水解液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0％(w/v)；可溶性淀粉0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0％(w/v)；其余为水。
所述的可溶性淀粉，其是玉米淀粉，或薯类淀粉，或大米淀粉。
所述的YPD培养基的组成如下：酵母膏(粉)0.5，1.0，2.0％(w/v)；葡萄糖1.0，2.0，3.0％(w/v)；蛋白胨1.0，2.0，3.0％(w/v)；其余为水。
本发明的具体发酵条件与结果见表1：
本发明的最佳发酵工艺实例：应用玉米淀粉生产海藻糖，可得A11菌株积累海藻糖的最佳条件是：培养基初始pH5.5，培养温度30℃，发酵罐转速200rpm，通气量41/min，最佳碳源浓度为2.0％(w/v)的玉米淀粉，在这种最佳条件下，该突变株转化玉米淀粉可以产生22.89％(w/w)的海藻糖，这是利用玉米淀粉直接转化生产海藻糖最高产量的酵母菌菌株，建立了利用玉米淀粉直接经过产淀粉酶酵母菌转化生产海藻糖的工艺。
本发明的发酵法制备的海藻糖应用实例：
(1)应用于农业：水稻、玉米杂交种子经消毒后，用18～23mg/L海藻糖液在8～12℃下浸泡24h，浸泡后用蒸馏水冲洗，在30℃下鼓风干燥至含水量与原料处理前相同。处理后贮存在湿度小于70％的环境下可长期保存。
(2)应用于花卉栽培：玫瑰花整枝浸泡在2～3％的海藻糖溶液中，15～18分钟后取出，将其插入同浓度的海藻糖溶液中，在30～32℃的室内环境下，25天后玫瑰花仍亭亭玉立，娇艳如初。而用自来水处理的对照样，保鲜期最多只能7天左右。
(3)应用于提高双岐杆菌的存活率保证其货架寿命，采用海藻糖作保护剂，双岐杆菌的存活率比脱脂牛奶提高一倍以上，特别令人振奋的是，海藻糖能够使冻干双岐杆菌在常温下长期保持活性，大幅度延长活菌制剂的保质期。从而可以解决活菌制剂行业所面临的产品储存性能差，货架寿命短的问题。
(4)应用于食品烘烤制品类：在烘烤制品中应用海藻糖能调节蛋糕和饼干、糕点上的糖霜、面包奶油和水果馅的甜味与芳香，不损害贮藏寿命，保持食品原有的风味。同时，海藻糖能有助于甜饼、面包奶油和糖霜中脂肪的降低，在可口饼及快餐中产生独特的糖霜感觉。在保持产品贮藏期时，海藻糖能减少多成份的烘烤制品中湿气流动，以能使甜味更佳。
(5)应用于糖果类与其它大多数增甜剂混合，海藻糖可在糖果特别是果汁饮料和药草产品中使用，以调节产品甜度，从而能真正保持产品的原有风味。这对成人消费者来说特别重要。海藻糖适用于用配方配制″益齿″产品。海藻糖极稳定，工艺及加工产品中不被水解。海藻糖能用作糖果的外层而形成一种稳定的非吸湿性保护层。由于工艺的稳定性，海藻糖能在长期高温下进行而不用担心水解和色变。滚海藻糖衣性能极好。海藻糖特有的溶解特性能真正使它们本身滚动形成保护层，这层履盖物极稳定、坚固，从而改善其它大多数增甜剂相对的白色层面。
本领域的普通技术人员都会理解，在本发明的保护范围内，对于上述实施例进行修改，添加和替换都是可能的，其都没有超出本发明的保护范围。
Claims (4)
1、一种海藻糖(Trehalose)的发酵制备方法，其特征在于：所述的海藻糖(Trehalose)是由扣囊复膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera sdu)A11菌株CGMCC No.1426发酵产生的；所述的制备方法如下：
(1)制备种子液：将菌种保藏号为：CGMCC No.1426的扣囊复膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera sdu)A11菌株活化培养1-2天后，由斜面菌苔接种入装有50ml YPD培养基的三角瓶中，30℃振荡培养24-36小时，以培养好的菌悬液为种子液；
(2)发酵罐发酵：将该A11菌株的菌悬液6-16％接种量接种入装有可溶性淀粉培养基的发酵罐中进行培养，发酵罐培养温度为25-35℃，通气量为1.0-4.0∶1，搅拌转速100-300rpm，培养pH5.3-5.7，隔4-6小时取样在100℃烘干至恒重检测菌体干重和测海藻糖含量，培养48-54小时后终止发酵，并将发酵液分离取菌体；
(3)蒸馏水提取：将分离的湿菌体按重量/体积比1∶4-12的投料比分次加入蒸馏水，并在75-85℃下水浴中提取，累计提取时间为28-32min，然后离心取滤液，弃去菌体；
(4)超滤膜提取：(3)步滤液中仍含有少量的可溶性多糖类和蛋白质，采用截流量为5Kda的超滤膜超滤，以除去分子量较大的多糖类和蛋白质物质；
(5)脱色：将(4)步超滤液用201X7型阴离子树脂柱和717型阳离子树脂柱，上柱脱色，收集洗脱液；
(6)真空浓缩：采用旋转蒸发仪真空浓缩(5)步的洗脱液，检测该浓缩液中的海藻糖含量在20--50％；
(7)将(6)步的浓缩液在-50℃下直接冷冻干燥，得海藻糖晶体；
该海藻糖是非还原性双糖，其分子式为C12H22O11，含两分子结晶水的相对分子量为378.33，溶解度：10℃时为55.3，50℃时为140.1，90℃时为602.9；该糖的水溶液在37℃下可保存12个月，无色无嗅，口感略带甜味；该糖不能使斐林试剂还原，也不能被α-糖苷酶水解，在强酸条件下能被水解为两个葡萄糖分子；热稳定性：在120℃的水中或在含蛋白质溶液的沸水中，90min褐变。
2、根据权利要求2所述海藻糖(Trehalose)的发酵制备方法，其特征在于：所述的发酵罐装有的可溶性淀粉培养基的组成如下：豆粕水解液1.0-6.0％(w/v)，可溶性淀粉0.5-6.0％(w/v)，其余为水。
3、根据权利要求2所述海藻糖(Trehalose)的发酵制备方法，其特征在于：所述的可溶性淀粉，其是玉米淀粉，或薯类淀粉，或大米淀粉。
4、根据权利要求2所述海藻糖(Trehalose)的发酵制备方法，其特征在于：所述的YPD培养基的组成如下：酵母膏(粉)0.5-2.0％(w/v)，葡萄糖1.0-3.0％(w/v)，蛋白胨1.0-3.0％(w/v)，其余为水。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |