CN1109489C - 滇重楼种子发芽及其繁殖方法 - Google Patents
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滇重楼种子发芽及其繁殖方法，取滇重楼(Paris polyphylla Smithvar.ynynanensis(Fr.)Hand—Mazz)种子，用水冲洗，70%乙醇浸泡2-5分钟，用0.2%HgC12浸泡10-30分钟，在百万分之20-80重量浓度(ppm)的赤霉素中、22℃黑暗条件下浸泡48小时，置于无菌培养皿中，在4℃或22℃黑暗下交替放置各1周，反复3-5次，然后每天光照10小时，光强1000lux，以1/2MS为基本培养基，附加萘乙酸(NAA)0.5mg/L和6-苄氨基嘌呤(6BA)0.1mg/L进行繁殖。该方法能有效打破滇重楼种子休眠期、繁殖速度快、周期短、工厂化快繁的优点，能有效地提高滇重楼的产量和质量。
Description
本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及打破滇重楼种子休眠期的种子发芽方法以及微繁殖方法的技术领域。
滇重楼(Paris polyphylla Smith var.ynynanensis(Fr.)Hand-Mazz)属延龄草科(Trilliaceae)多年生草本，为重楼属蚤休组(Sect.EuthyraFranch)多叶重楼(Paris polyphylla Smith)的一变种，为中药重楼的主要药用种。重楼生长十分缓慢，每株年生长量约为2-3克鲜重，由于近年不断发现其新的药用价值，致使需求量越来越大，加之盲目收购和采挖，致使重楼资源受到极大的破坏，除传统药用的滇重楼和七叶一枝花资源十分稀少外，其它种类也十分少。目前依靠重楼为主要组分的中成药已很难大规模生产。而滇重楼种子具有休眠1-2年的现象，在正常情况下发芽情况很差，且无性增殖很慢，现有技术中还未解决这一问题。
本发明针对现有技术中存在的问题，提供一种能有效打破滇重楼种子休眠期，成功地进行滇重楼繁殖的生物技术方法，具有繁殖速度快、周期短、工厂化快速繁殖的优点，同时能有效地提高滇重楼的产量和质量。
为了达到本发明的上述目的，本发明提供了下面的技术方案：
滇重楼种子发芽及其繁殖方法，取滇重楼(Paris polyphylla Smithvar.ynynanensis(Fr.)Hand-Mazz)种子，用水冲洗，70％乙醇浸泡2-5分钟，用0.2％HgCl2浸泡10-30分钟后，在百万分之20-80重量浓度(ppm)度的赤霉素中、22℃黑暗条件下浸泡48小时，置于无菌培养皿中，在4℃或22℃、黑暗下交替放置各1周，反复3-5次进行种子发芽，然后每天光照10小时，光强1000lux，以1/2 MS为基本培养基，附加萘乙酸(NAA)0.5mg/L和6-苄氨基嘌呤(6BA)0.1mg/L进行快速繁殖。
上述快速繁殖技术中，可优选在基本培养基中加入滇重楼寡糖素。
下面结合本发明的试验内容和结果来进一步说明本发明的实质内容，同时来说明本发明与现有技术相比的优点，但本发明的内容并不局限于此。
1、冷处理和光照对种子发芽的影响(见表1)：3次不连续的冷处理(处理1)有利于滇重楼种子休眠期的打破，提高种子的发芽率。连续4℃低温(处理4)并不能提高种子的发芽率。连续22℃常温(处理2)可使种子发芽，但发芽率要低于冷处理的发芽率，但常温下光照(处理4)不利于种子发芽。
表1冷处理和光照对滇重楼种子发芽的影响
| 处理方法* | 60天统计的 120天统计的发芽率(％) 发芽率(％) |
| 1234 | 60 9030 5010 2020 30 |
*：处理方法见实施例1-4。2赤霉素处理对种子发芽的影响
赤霉素对滇重楼种子发芽的影响实验是在冷处理对种子发芽有明显促进作用的基础上进行的。从表2可以看出，适宜的赤霉素(40～80ppm)处理，在常温(22℃)暗处发芽(处理2)可以达到与冷处理相似的结果。如果采用适当浓度的赤霉素浸泡，同时对种子进行不连续冷处理，能更有效地提高种子的发芽率。
综合表1和表2，滇重楼种子在常温和4℃下连续发芽60天和120天，统计发芽率均在50％以下，说明种子有休眠现象。通过冷处理和赤霉素处理均可以打破滇重楼种子的休眠。光照不利于种子的发芽。
表2赤霉素对滇重楼种子发芽的影响
Table 2 Effects of giberellin concentration on seed
germination of P.polyphylla var.yunnanensis赤霉素浓度 处理方法* 60天统计的发芽率(％) 120天统计的发芽率(％)Concentration of Methods of Germinati on rate after Geraination rate aftergiberellin(ppm) treatment 60 days’experiments 120 days’experiments0 1 65 85
2 25 4520 1 65 95
2 45 7040 1 75 100
2 50 8580 1 70 100
2 55 80
*处理方法见实施例1、2。
3滇重楼的微繁殖
将已发芽的滇重楼种子转至无激素的MS培养基上，在光照下培养，即可获得无菌植株。初步实验结果表明，降低无机盐含量，有利于无菌苗的生长，为了有利于芽增殖或者根的生长，采用了一系列的1/2MS培养基。所采用的培养基种类及其幼苗的生长情况，结果(见表3)表明，添加NAA0.5mg/L和6BA0.1mg/L的1/2MS培养基既有利于芽的增殖，同时也有利于根的生长。将试管苗经室内过渡到室外，慢慢过渡到盆栽，盆栽一周后统计成活率达95％，且生长良好。按每株试管苗每月增加两个芽计算，每年每株可繁殖4096株苗。
表3不同培养基对滇重楼的微繁殖的影响
Table 3 Effects of different media on milipropagation
of P.polyphylla var.yunnanensis培养基 观察结果media results1/2MS+NAA0.5mg/L 植株长根，无芽增殖。1/2MS+NAA0.5mg/L+6BA0.1mg/L 植株较细小，芽多，根亦生长1/2MS+NAA0.25mg/L+6BA1.0mg/L 植株粗壮，根茎膨大，芽增殖较少1/2MS+6BA1.0mg/L 根茎膨大，无芽增殖4寡糖素对滇重楼芽增殖的影响
在培养基中加入不同浓度的寡糖素PP-DP7、PP-DP8和PP-DP9，初步结果(见表4)表明寡糖素对根的分化和生长没有明显的影响，但能影响芽的增殖，PP-DP7、PP-DP8和PP-DP9有利于芽增殖的最适浓度分别为2.5ppm、10ppm和20ppm。
表4寡糖素对滇重楼芽增殖的影响
Table 4 Effects of oligosaccharins PP-DP7，PP-DP8 and PP-DP9 on
shoot multiplication of P.polyphylla var.yunnanensis寡糖素 浓度(ppm) 芽增殖情况Oligosaccharin Concentration Shoot multiplication对照 0 +
2.5 +++PP-DP7 5.0 ++
10 +
20 +
2.5 +PP-DP8 5.0 ++
10 +++
20 +
2.5 +PP-DP9 5.0 +
10 ++
20 ++++：表示每株试管苗每月增加1～2个芽；++：表示每株试管苗每月增加3个芽；+++：表示每株试管苗每月增加4个芽以上。
从上述实验结果和结论可以看出本发明的优益效果为：
1、采用滇重楼的快速繁殖，用生物技术的办法促使重楼根茎年生长量的增加，有计划地发展重楼的种植业，确保重楼药材的供应，克服了重楼药材完全依靠野生资源的被动局面。
2、通过温度调节、赤霉素调节，能有效地打破滇重楼种子休眠期，提高了种子发芽率，可达100％，克服了现有技术发芽情况很差，且有性苗增殖很慢的缺点。
3、相比现有技术具有繁殖速度快、周期短的优点，可实现工业快速繁殖。
4、有利于进一步进行滇重楼遗传育种(如高产甾体皂甙含量、高产多糖和寡糖含量品系的建立)和生理生化(如胶质与粉质重楼的关系、微生物群落与重楼质量的关系等)的研究和产业化。
实施例一：
取滇重楼(Paris polyphylla Smith var.yunnanensis(Fr.)Hand-Mazz.)种子，搓揉，使种子与多汁的假种皮分离以后，将种子淘出，晾干。将种子用水冲洗，70％乙醇浸泡2分钟，无菌水冲洗两次，用0.2％HgCl2浸泡30分钟，在40ppm浓度的赤霉素中、22℃黑暗条件下浸泡48小时，平铺在湿润的滤纸上置于无菌培养皿中作发芽床，然后在22℃下放置1周，4℃下放置1周，如此交替进行，经过3次处理后，置22℃下发芽，黑暗。每一处理为100颗种子，当胚根露出神皮1毫米以上，即认为已发芽。然后以1/2 MS为基本培养基，附加萘乙酸(NAA)0.5mg/L和6-苄氨基嘌呤(6BA)0.1mg/L进行快速繁殖，试管苗每天光照10小时，光强1000lux。
实施例二：
取滇重楼(Paris polyphylla Smith var.yunnanensis(Fr.)Hand-Mazz.)种子，搓揉，使种子与多汁的假种皮分离以后，将种子淘出，晾干。将种子用水冲洗，70％乙醇浸泡5分钟，无菌水冲洗两次，用0.2％HgCl2浸泡20分钟，，在60ppm浓度的赤霉素中、22℃黑暗条件下浸泡48小时，平铺在湿润的滤纸上置于无菌培养皿中作发芽床，置22℃下发芽，黑暗。每一处理为100颗种子，当胚根露出种皮1毫米以上，即认为已发芽。然后以1/2 MS为基本培养基，附加萘乙酸(NAA)0.5mg/L、6-苄氨基嘌呤(6BA)0.1mg/L和10ppm寡糖素9进行快速繁殖，试管苗每天光照10小时，光强1000lux。
实施例三：
取滇重楼(Paris polyphylla Smith var.yunnanensis(Fr.)Hand-Mazz.)种子，搓揉，使种子与多汁的假种皮分离以后，将种子淘出，晾干。将种子用水冲洗，70％乙醇浸泡5分钟，无菌水冲洗，用0.2％HgCl2浸泡15分钟，在80ppm浓度的赤霉素中、22℃黑暗条件下浸泡48小时，平铺在湿润的滤纸上置于无菌培养皿中作发芽床，置4℃下发芽，黑暗。每一处理为100颗种子，当胚根露出种皮1毫米以上，即认为已发芽。然后以1/2 MS为基本培养基，附加萘乙酸(NAA)0.5mg/L、6-苄氨基嘌呤(6BA)0.1mg/L和20ppm寡糖素8进行快速繁殖，试管苗每天光照10小时，光强1000lux。
实施例四：
取滇重楼(Paris polyphylla Smith var.yunnanensis(Fr.)Hand-Mazz.)种子，搓揉，使种子与多汁的假种皮分离以后，将种子淘出，晾干。将种子用水冲洗，70％乙醇浸泡3分钟，无菌水冲洗，用0.2％HgCl2浸泡25分钟，在20ppm浓度的赤霉素中、22℃黑暗条件下浸泡48小时，平铺在湿润的滤纸上置于无菌培养皿中作发芽床，置22℃下发芽，黑暗。每一处理为100颗种子，当胚根露出种皮1毫米以上，即认为已发芽。然后以1/2 MS为基本培养基，附加萘乙酸(NAA)0.5mg/L、6-苄氨基嘌呤(6BA)0.1mg/L和5ppm寡糖素7进行快速繁殖，试管苗每天光照10小时，光强1000lux。
Claims (2)
1、滇重楼种子发芽及其繁殖方法，其特征是取滇重楼(Parispolyphylla Smith var.ynynanensis(Fr.)Hand-Mazz)种子，用水冲洗，70％乙醇浸泡2-5分钟，用0.2％HgCl2浸泡10-30分钟，在百万分之20-80重量浓度(ppm)的赤霉素中、22℃黑暗条件下浸泡48小时，置于无菌培养皿中，在4℃或22℃黑暗下交替放置各1周，反复3-5次，然后每天光照10小时，光强1000lux，以1/2MS为基本培养基，附加萘乙酸(NAA)0.5mg/L和6-苄氨基嘌呤(6BA)0.1mg/L进行繁殖。
2、根据权利要求1所述的方法，其特征是在基本培养中可加入滇重楼寡糖素。
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