CN116584384A - 一种有效打破野生重楼种子休眠、诱导种胚萌发的方法 - Google Patents

一种有效打破野生重楼种子休眠、诱导种胚萌发的方法 Download PDF

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李恒谦
黄晓旭
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徐庆祝
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Abstract

本发明属于诱导培养技术领域，具体涉及一种有效打破野生重楼种子休眠、诱导种胚萌发的方法。本发明提供了一种打破重楼种子休眠、诱导种胚萌发的方法，并形成诱导重楼种胚萌发的培养基，本方法取材方便，成本低；操作简单、无需高端设备及昂贵设备，对操作人员要求低；能有效提高重楼种子的萌发率、缩短萌发时间；萌发的种胚可直接用于不定芽的培养，以便建立重楼快繁技术体系。

Description

一种有效打破野生重楼种子休眠、诱导种胚萌发的方法
技术领域
本发明属于诱导培养技术领域，具体涉及一种有效打破野生重楼种子休眠、诱导种胚萌发的方法。
背景技术
中药材重楼为云南白药系列、宫血宁胶囊等产品的主要原料。近年来对重楼资源需求逐年增加，但忽视了对重楼资源的保护和繁育，乱采滥挖现象凸显，重楼野生资源已陷入开采的恶性循环，导致野生资源严重透支。因此，人工种养亟待升级，其中，种苗繁育是野生资源人工栽培研究、中药材规范化种植及整个中药产业发展的源头。但目前重楼种苗繁育研究出现瓶颈，如何有效、快捷解决“源头之困”已成为当务之急。
重楼的种子产量较大，通过种子的有性繁殖是获得大量种苗的有效方法。但重楼的种子具有“二次休眠”的特性，在自然情况下经过两个冬天才能出土成苗，依其自然状态进行播种，不但晚出苗，而且出苗率较低，大量种子在漫长的休眠期内丧失了生命力，并且出苗不一致，生长不整齐。此外，重楼的个体发育过程十分缓慢，由种子萌发到开花结实，至少需4～5年，其中苗期(幼年期)可以持续4年以上，因此，如何打破重楼种子休眠、研究重楼的组织培养技术是解决重楼无性快速繁育瓶颈的途径之一，具有一定的现实意义。
重楼除用种子育苗外，还可以用根茎切段繁殖，其中包括带顶芽部位与不带顶芽部位两种。虽然两者均可出苗，但在实际大田种植时，由于土壤温度与湿度无法控制，切段伤口愈合不理想，易感染菌类而致根茎溃烂，种质材料损失大；加之潜伏芽萌发时间长，萌发率较低，多芽同时萌发更少，导致总的繁殖系数降低，生产出的种苗质量亦不高；另外，根茎繁殖需要用大量的原料药，会加剧用种与原料药的矛盾。因此，用组织培养和快速繁殖技术解决其资源保护和开发利用之间的矛盾值得考虑。
利用组织培养技术可在短时间内大量繁殖性状优良的幼苗，且不受地区、季节等因素限制，全年均可生产，是解决珍稀濒危药用植物资源的重要途径之一，且已在多种药用植物上取得成功。鉴于组织培养途径的优越性，目前该技术已成为业界最为关注的用于突破重楼无性快繁瓶颈的方法之一。早在20世纪已有研究者试图建立重楼的离体快繁体系，但至今尚未取得令人满意的结果。据报道，只有幼芽能成功诱导出植株，而茎尖的诱导虽能成功启动，但效率较低，且不含皂苷成分；也未有种胚诱导成功的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种有效打破野生重楼种子休眠、诱导种胚萌发的方法，能有效提高重楼种子的萌发率、缩短萌发时间。
本发明提供了一种诱导重楼种胚萌发的培养基，以MS为基础培养基，还包括1.0～3.0mg/L的6-BA、0.03～0.08mg/L的NAA、0.5～1.5mg/LGA3和25～30g/L蔗糖，6-8g/L卡拉胶，pH值为5.8～6.0。
优选的，所述培养基为固体培养基。
本发明还提供了一种诱导重楼种子萌发的方法，包括以下步骤：(1)将重楼种子在GA3溶液中浸泡后，再转入高锰酸钾水溶液中浸泡，捞出浸泡后的种子；
(2)将步骤(1)所述浸泡的种子与沙土混合后，于4～6℃第一放置15～30d，20～30℃第二放置30～45d，重复所述第一放置和第二放置一次；
(3)取出沙土中的种子，与洗洁精的水溶液混合后，流水冲洗并沥干，消毒后得消毒种子；
(4)将步骤(3)所述消毒种子的种皮切开，置于上述培养基上进行诱导培养。
优选的，步骤(1)所述GA3水溶液的浓度为120～180mg/L，在所述GA3溶液中浸泡30～45min。
优选的，步骤(1)所述高锰酸钾水溶液中高锰酸钾的质量百分含量为0.1～0.15％，在所述高锰酸钾水溶液中浸泡1～2h。
优选的，步骤(2)所述混合，包括将所述浸泡的种子置于装有消毒沙土的保温容器中(底部先垫一层厚度为3-5cm的沙土，铺上种子后在垫一层5cm左右的沙土，定期浇水保湿)。
优选的，步骤(3)所述洗洁精的水溶液(2L水添加2-3滴洗洁精)；取出沙土中的种子，在所述洗洁精的水溶液中浸泡45～60min。
优选的，步骤(3)所述消毒包括在无菌环境中，将种子首先用体积百分含量为75％的酒精消毒45～60s，无菌水清洗3～5次；再用0.1％升汞溶液消毒12～15min，无菌水清洗3～5次。
优选的，步骤(4)中沿着种子的背脊线切开种皮，露出胚乳。
优选的，步骤(4)所述诱导培养的温度为24～26℃，湿度为70～80％，光照强度为1800～2000lx，每天光照时间10～12h。
有益效果：本发明提供了一种诱导重楼种胚萌发的培养基，并基于所述培养基构建了诱导重楼种子萌发的方法，取材方便，成本低；操作简单、无需高端设备及昂贵设备，对操作人员要求低；能有效提高重楼种子的萌发率、缩短萌发时间；萌发的种胚可直接用于不定芽的培养，以便建立重楼快繁技术体系。在本发明实施例中，利用所述培养基和诱导方法，能有效提高重楼种子萌发率至70～80％，萌发时间为60～90天。种胚培养过程中污染率为8～12％，萌发率为55～65％，无菌培养25～40天，可看见种胚变绿，45～60天，可看见冒出白色芽点。
具体实施方式
本发明提供了一种诱导重楼种胚萌发的培养基，以MS为基础培养基，还包括1.0～3.0mg/L的6-BA、0.03～0.08mg/L的NAA、0.5～1.5mg/LGA3和25～30g/L蔗糖，6-8g/L卡拉胶，pH值为5.8～6.0。
本发明所述培养基优选为固体培养基。
本发明所述固体培养基中包含6-BA，所述6-BA的浓度优选为1.5～2.5mg/L，更优选为2.0mg/L。本发明所述6-BA为6-苄氨基腺嘌呤，主要作用是促进种子发芽，打破顶端优势，促进侧芽生长，也可以诱导愈伤组织发生。
本发明所述固体培养基中包含NAA，所述NAA的浓度优选为0.04～0.06mg/L，更优选为0.05mg/L。本发明所述NAA为萘乙酸，低浓度时刺激植物生长，也可用于促进种子发根。
本发明所述固体培养基中包含GA3，所述GA3的浓度优选为0.75～1.25mg/L，更优选为1.0mg/L。本发明所述GA3为赤霉素，主要作用为打破种子、块茎等器官的休眠，促进萌发、分蘖等。
本发明所述固体培养基中包含蔗糖，所述蔗糖的浓度优选为25-30g/L，更优选为27g/L。本发明所述蔗糖，主要作用是为种子发芽提供碳源，调节培养基的渗透压。
本发明所述固体培养基的制备方法，优选包括将各原料混合后定容，高温高压灭菌即可。
本发明提供了一种诱导重楼种子萌发的方法，包括以下步骤：(1)将重楼种子在GA3溶液中浸泡后，再转入高锰酸钾水溶液中浸泡，捞出浸泡后的种子；
(2)将步骤(1)所述浸泡的种子与沙土混合后，于4～6℃第一放置15～30d，20～30℃第二放置30～45d，重复所述第一放置和第二放置一次；
(3)取出沙土中的种子，与洗洁精的水溶液混合后，流水冲洗并沥干，消毒后得消毒种子；
(4)将步骤(3)所述消毒种子的种皮切开，置于上述培养基上进行诱导培养。
本发明将重楼种子在GA3溶液中浸泡后，再转入高锰酸钾水溶液中浸泡，捞出得浸泡的种子。本发明所述重楼种子优选9～10月摘取成熟种子，冰盒保存带回，以果实开裂者最佳，并用河沙搓去外种皮，得所述重楼种子。本发明将所述重楼种子浸泡在GA3溶液中，所述GA3溶液的浓度优选为120～180mg/L，更优选为130～160mg/L，最优选为150mg/L。本发明在所述GA3溶液中浸泡的时间优选为30～45min，最优选为40min。本发明所述GA3浸泡处理可帮助种子充分吸水膨胀，打破种子休眠，缩短萌发时间。
本发明优选取出GA3溶液浸泡后的种子，置于高锰酸钾水溶液进行浸泡，所述高锰酸钾水溶液中高锰酸钾的质量百分含量优选为0.1～0.15％，最优选为0.15％。本发明在所述高锰酸钾水溶液中的浸泡时间优选为1～2h，更优选为70～110min，最优选为90min。本发明所述高锰酸钾水溶液浸泡可杀灭种子表面细菌、真菌、病毒等，减少污染率；有效破坏种皮结构，提高种皮吸收性及透气性；促进种子萌发。本发明在所述高锰酸钾水溶液浸泡后，优选还包括捞出种子，沥水备用。
得上述浸泡的种子后，本发明将步骤(1)所述浸泡的种子与沙土混合后，于4～6℃第一放置15～30d，20～30℃第二放置30～45d，重复所述第一放置和第二放置一次。本发明所述混合，优选包括将所述浸泡的种子置于装有消毒沙土的保温容器中(底部先垫一层厚度为3～5cm的沙土，铺上种子后再垫一层5cm左右的沙土，定期浇水保湿)，所述保温容器优选包括泡沫箱。
本发明优选将上述保温容器置于4～6℃中放置15～30d，取出放于20～30℃环境中放置30～45d；重复如上操作1次，即共经过2次低温、2次高温处理。在本发明中，重楼为多年生草本植物，正常情况下种子需2年才能萌发，本发明通过两次低温和两次高温处理，通过人为环境的变化，在与重楼生理周期相符的情况下，缩短其生活周期，促进种子提早发芽。经本发明所述低温和高温交叉处理后的种子发芽率高，长成的幼苗对低温适应性增强，抗寒性能增强，并且成活率高。
本发明取出沙土中的种子，与洗洁精的水溶液混合后，流水冲洗并沥干，消毒后得消毒种子。本发明在取出种子后，优选还包括利用清水冲干净表面泥土，而后再与洗洁精的水溶液混合，所述洗洁精的水溶液为2L水添加2-3滴洗洁精。本发明所述混合优选包括浸泡，在所述洗洁精的水溶液中优选浸泡45～60min。本发明在所述浸泡后，优选还包括流水冲洗干净后，沥干水分备用。
本发明所述消毒优选包括在无菌环境中，将种子首先用体积百分含量为75％的酒精消毒45～60s，无菌水清洗3～5次；再用0.1％升汞溶液消毒12～15min，无菌水清洗3～5次。本发明所述无菌环境优选包括超净工作台。本发明优选在所述消毒完成后，将种子取出放置于无菌滤纸上，吸干表面水分，备用。
得消毒种子后，本发明将步骤(3)所述消毒种子的种皮切开，置于上述培养基上进行诱导培养。本发明优选用解剖针沿着背脊线切开种皮，露出胚乳，置于上述固体培养基上进行诱导培养，所述诱导培养的温度优选为24～26℃，湿度优选为70～80％，光照强度优选为1800～2000lx，每天光照时间优选为10～12h。
利用本发明所述方法，可在培养25～40d后，看见种胚变绿，培养45～60d后，看见冒出白色芽点，60～90d萌发。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种诱导重楼种胚萌发的培养基和诱导方法进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
(1)9-10月摘取成熟种子，冰盒保存带回，以果实开裂者最佳；
(2)用河沙搓去外种皮，先用浓度为150mg/L的GA3溶液浸泡45min；再用浓度为0.15％的高锰酸钾溶液中浸泡1.5小时，捞出种子，沥水备用；
(3)将浸泡后的种子置于装有消毒沙土的泡沫箱中，然后于4℃中放置30天，取出放于25℃环境中放置30天。重复如上操作1次，即经过2次低温、2次高温处理。
(4)取出种子，清水冲干净表面泥土。用洗洁精水浸泡45分钟，流水冲洗干净后，沥干水分备用；
(5)将清洗后的种子放于超净工作台中，先用75％的酒精消毒45s，无菌水清洗3-5次；再用0.1％升汞消毒15min，无菌水清洗3-5次。消毒完成后取出放置于无菌滤纸上，吸干表面水分，备用。
(6)用解剖针沿着背脊线切开种皮，露出胚乳，置于胚乳诱导培养基上培养。培养基以MS为基础培养基，添加2.0mg/L的6-BA、0.05mg/L的NAA、1.0mg/LGA3、25g/L蔗糖，pH为5.8-6.0。培养环境为：培养室温度24～26℃，湿度70～80％，光照强度1800～2000lx，每天光照时间10h。
该方法能有效提高重楼种子萌发率至70～80％，萌发时间(长出白色芽点的时间)为60～90天。种胚培养过程中污染率为8～12％，萌发率为55～65％。无菌培养25～40天，可看见种胚变绿，45～60天，可看见冒出白色芽点。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (10)

1.一种有效打破野生重楼种子休眠、诱导种胚萌发的方法，其特征在于，所述培养基以MS为基础培养基，还包括1.0～3.0mg/L的6-BA、0.03～0.08mg/L的NAA、0.5～1.5mg/LGA3和25～30g/L蔗糖，pH值为5.8～6.0。
2.根据权利要求1所述培养基，其特征在于，所述培养基为固体培养基，卡拉胶含量为6-8g/L。
3.一种有效打破野生重楼种子休眠、诱导种胚萌发的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将重楼种子在GA3溶液中浸泡后，再转入高锰酸钾水溶液中浸泡，捞出浸泡后的种子；
(2)将步骤(1)所述浸泡的种子与沙土混合后，于4～6℃第一放置15～30d，20～30℃第二放置30～45d，重复所述第一放置和第二放置一次；
(3)取出沙土中的种子，与洗洁精的水溶液混合后，流水冲洗并沥干，消毒后得消毒种子；
(4)将步骤(3)所述消毒种子的种皮切开，置于权利要求1或2所述培养基上进行诱导培养。
4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，步骤(1)所述GA3溶液(水溶液)的浓度为120～180mg/L，在所述GA3溶液中浸泡30～45min。
5.根据权利要求3所述方法，其特征在于，步骤(1)所述高锰酸钾水溶液中高锰酸钾的质量百分含量为0.1～0.15％，在所述高锰酸钾水溶液中浸泡1～2h。
6.根据权利要求3所述方法，其特征在于，步骤(2)所述混合，包括将所述浸泡的种子置于装有消毒沙土的保温容器中(底部先垫一层厚度为3-5cm的沙土，铺上种子后在垫一层5cm左右的沙土，定期浇水保湿)。
7.根据权利要求3所述方法，其特征在于，步骤(3)所述洗洁精的水溶液(2L水添加2-3滴洗洁精)；取出沙土中的种子，在所述洗洁精的水溶液中浸泡45～60min。
8.根据权利要求3所述方法，其特征在于，步骤(3)所述消毒包括在无菌环境中，将种子首先用体积百分含量为75％的酒精消毒45～60s，无菌水清洗3～5次；再用0.1％升汞溶液消毒12～15min，无菌水清洗3～5次。
9.根据权利要求3所述方法，其特征在于，步骤(4)中沿着种子的背脊线切开种皮，露出胚乳。
10.根据权利要求3所述方法，其特征在于，步骤(4)所述诱导培养的温度为24～26℃，湿度为70～80％，光照强度为1800～2000lx，每天光照时间10～12h。
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