CN112931220B

CN112931220B - 一种以茎尖为外植体的植物组织培养快繁方法

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Publication number: CN112931220B
Application number: CN202110392959.4A
Authority: CN
Inventors: 祝婷婷; 任茂智; 李林宣; 方琳
Original assignee: Chengdu Agricultural Science And Technology Center; Institute of Urban Agriculture of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Chengdu Agricultural Science And Technology Center; Institute of Urban Agriculture of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2021-04-13
Filing date: 2021-04-13
Publication date: 2022-05-27
Anticipated expiration: 2041-04-13
Also published as: CN112931220A

Abstract

本发明公开了一种以茎尖为外植体的植物组织培养快繁方法：(1)外植体的消毒处理：取植株上的茎尖作为外植体，表面消毒；植株为川芎或者豆薯或者四棱豆；(2)生根培养：将消毒后的茎尖转移到生根培养基上，在24～26℃、每天光照12～16小时、光照强度为1000～1500Lx下培养；(3)炼苗和移栽：在生根培养基中培养至茎尖基部再生的不定根大约长至1～4cm时，打开瓶盖，在室内进行炼苗后将其移栽至基质中种植。本发明的茎尖组织快繁技术直接诱导茎尖体外再生不定根，无需愈伤组织诱导以及分化培养等步骤，省去了配制多种培养基和转瓶的繁琐流程，能够快速繁殖植株，相比传统组培快繁方法可缩短1～2个月的组培周期。

Description

一种以茎尖为外植体的植物组织培养快繁方法

技术领域

本发明涉及植物组织培养快速繁殖技术领域，具体涉及一种以茎尖为外植体的植物组织培养快繁方法。

背景技术

川芎(学名：Ligusticum chuanxiong hort)为我国最常见的中药材之一，同时也是许多保健品和药品的重要原料。近来，川芎成为抗击新冠(COVID-19)疫情的明星中草药，以红花、赤芍、川芎、丹参、当归等为主要原料的“血必净注射液”获批用于治疗新型冠状病毒肺炎重型、危重型的全身炎症反应综合症和多脏器功能衰竭。

川芎为两年生植物，川芎结实困难，川芎的传统育种方法是采用茎节营养繁殖栽培，这种方法需要进行山区育苓、坝区栽种或者是制备川芎冻苓子等环节，育种周期较长；另外，种芎种质资源“苓种”存在易衰老和易受病毒侵染等缺陷，使得川芎种性退化、品质下降、容易发生病虫害。

传统的组培快繁方法需要愈伤组织诱导、分化培养、生根培养等繁琐步骤，周期较长，污染率高，出苗率低。川芎根、茎、叶均可作为外植体进行组培，目前仅仅初步建立了川芎快繁再生体系。因为传统的组织培养采用的是间接型的器官从头发生方式，目前报道的川芎快繁再生体系通常都是先诱导川芎根、茎、叶等外植体形成愈伤组织，然后将非胚性愈伤组织移至根诱导培养基上再生出不定根，过程繁琐，需要的时间长。

目前也未见有直接采用茎尖作为外植体快繁豆薯和四棱豆的相关报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中存在的植物育种时间长、种质资源不稳定、“苓种”自身易衰老且带菌、传统组培快繁周期长容易污染等问题，提供一种以茎尖为外植体的植物组织培养快繁方法，该方法相比已有的组培快繁体系，可节省1～2个月的组培周期，短期内快繁出大量生长速度快、品质优和染菌率低的组培苗。

本发明为了实现其目的，采用的技术方案是：

一种以茎尖为外植体的植物组织培养快繁方法，包括如下步骤：

(1)外植体的消毒处理：取植株上的茎尖作为外植体，表面消毒处理；所述植株为川芎或者豆薯或者四棱豆；

(2)生根培养：将消毒后的茎尖转移到生根培养基上，在24～26℃、每天光照12～16小时、光照强度为1000～1500Lx条件下进行培养；

川芎的生根培养基为1/2MS+IBA 0.2～0.5mg/L+NAA 0～0.5mg/L+蔗糖15～30g/L+琼脂6～10g/L；

豆薯的生根培养基为MS+NAA 0.3～0.7mg/L+IBA 0.5～2mg/L+蔗糖15～30g/L+琼脂6～10g/L；

四棱豆的生根培养基为MS+NAA 0～0.5mg/L+IBA 0～2mg/L+蔗糖15～30g/L+琼脂6～10g/L，优选MS+蔗糖15～30g/L+琼脂6～10g/L；

(3)炼苗和移栽：在生根培养基中培养至茎尖基部再生的不定根大约长至1～4cm时，打开瓶盖，在室内进行炼苗后，将组培苗从培养瓶中取出，去掉根部的培养基，将其移栽至基质中种植。

优选地，步骤(1)中所述茎尖为2cm～5cm长度，消毒是采用酒精和次氯酸钠消毒。

优选地，步骤(1)中所述茎尖为2cm～4cm长度，所述消毒的方法具体指先将茎尖用水清洗，然后用酒精处理20～40s，再用次氯酸钠处理2～5min，最后用无菌水清洗干净。

进一步优选地，所述消毒的方法具体为：将茎尖在流水下小心冲洗1～2h，然后在超净台中用无菌水清洗3次，接着用70％或75％酒精处理30s，再用2％次氯酸钠溶液处理4min，最后用无菌水清洗3次。

优选地，步骤(2)中的所述生根培养基中还含有头孢霉素，优选头孢霉素在培养基中的浓度为300mg/L。

优选地，所述川芎的生根培养基为1/2MS+IBA 0.2～0.4mg/L+NAA 0.2～0.4mg/L+蔗糖19～21g/L+琼脂7～9g/L，pH5.6～5.8。

进一步优选地，所述川芎的生根培养基为1/2MS+IBA 0.25mg/L+NAA 0.25mg/L+蔗糖20g/L+琼脂8g/L。

优选地，所述豆薯的生根培养基为MS+NAA 0.4～0.5mg/L+IBA 0.7～1.5mg/L+蔗糖18～22g/L+琼脂6～10g/L，pH5.6～5.8；

所述四棱豆的生根培养基为MS+蔗糖20g/L+琼脂8g/L。

进一步优选地，所述豆薯的生根培养基为MS+IBA 1mg/L+NAA 0.5mg/L+蔗糖20g/L+琼脂8g/L。

优选地，所述步骤(3)中在生根培养基中培养至茎尖基部再生的不定根大约长至1～3cm时，打开瓶盖，在室内炼苗3～5天后移栽至基质中后按照川芎或豆薯或四棱豆的常规幼苗田间管理方法栽培管理。

本发明的有益效果是：本发明方法中植物再生途径与其它研究报道不同，所建立的茎尖组织快繁技术是利用直接型器官发生途径，直接诱导茎尖体外再生不定根，无需愈伤组织诱导以及分化培养等步骤，省去了配制多种培养基和转瓶的繁琐流程，因此简单易行、组培周期短、生产成本低，能够快速繁殖植株，采用本发明方法得到的组培苗根系发达、成活率高，在短时间内为生产提供大量优质幼苗，相比传统组培快繁方法可缩短1～2个月的组培周期，因此实用性强、应用前景大。

附图说明

图1是不同浓度激素处理下川芎茎尖不定根再生情况。

图2是川芎茎尖组培快繁方法中各阶段材料生长情况。

图3是川芎茎节组培快繁方法中各阶段材料生长情况。

图4是豆薯茎尖组培快繁方法中各阶段材料生长情况。

图5是四棱豆茎尖组培快繁方法中各阶段材料生长情况。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，但并不因此而限制本发明。

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

各实施例中所用化学、生物试剂，如无特别说明，均为本领域常规商品，均可通过商购获得。

实施例1、不同激素配比对川芎茎尖再生不定根的影响

(1)取材：直接摘取成熟时期的川芎大约2cm～4cm的幼嫩茎尖作为外植体，无需在解剖镜下用解剖针进行幼叶和叶原基的剥离或茎尖的切取等操作。现有技术中采用川芎茎尖作为外植体进行繁殖培养的是取带有1到2片真叶的川芎茎尖外植体，需要在显微镜下剥离茎尖分生组织，取2-3毫米的外植体，然后经过愈伤组织诱导和分化培养进行繁殖，过程繁琐，需要的时间长。

(2)外植体的消毒处理：将川芎茎尖在流水下小心冲洗1h，然后在超净台中用无菌水清洗3次，接着用70％或75％酒精处理30s，再2％次氯酸钠溶液处理4min，最后用无菌水清洗3次。

实验说明：川芎茎节为中空结构，为真菌微生物生长提供了有利条件，消毒不彻底容易导致组培快繁中出现大面积污染，而幼嫩的茎尖部位受病原菌污染少，适合作为组织培养快繁外植体材料。使用酒精和次氯酸钠对茎尖外植体进行消毒更温和，与氯化汞相比，可以显著减少川芎茎尖褐化现象，因此，对于茎尖外植体而言，使用酒精和次氯酸钠是最佳的消毒方式，但次氯酸钠处理时间过长，也会导致川芎茎尖褐化程度加深，降低茎尖再生率，实验发现，次氯酸钠最佳处理时间为3～5min。

(3)茎尖生根培养基的筛选：

基本培养基用1/2MS(品牌：Coolaber，产品编号：PM1171-50L)，添加常见的生根植物激素IBA(吲哚丁酸)、NAA(萘乙酸)和IAA(生长素)的不同组合来测试川芎茎尖再生根效率，各种培养基蔗糖浓度为20mg/L，琼脂浓度为8mg/L，pH调至5.8，高压灭菌20min。将消毒后的川芎茎尖在不同激素配比的生根培养基培养，30天后统计生根数量及根长，培养条件为25℃、每天光照14小时、光照强度为1200Lx。

结果如表1和表2所示，根据实验结果发现不同激素对川芎茎尖再生不定根影响不同，其中植物激素IBA对川芎茎尖再生不定根效果最好，其次为NAA。在不同激素配比中，IBA和NAA的组合对川芎茎尖再生不定根效果最好，其川芎茎尖生根数量最多，再生根的平均长度最长，其中IBA 0.25mg/L+NAA 0.25mg/L的组合效果最好。

表1 在不同植物激素的培养基上川芎再生不定根的数量(条)

表2 在不同植物激素的培养基上川芎再生不定根的长度(cm)

(4)川芎茎尖在不同生根培养基上的表型分析：

基本培养基用1/2MS，按照激素种类和比例分别编号为处理组1、2、3、4，各种培养基蔗糖浓度为20mg/L，琼脂8g/L，pH5.6～5.8。处理组1：NAA 0.5mg/L+IBA 0mg/L，处理组2：NAA 0mg/L+IBA 0.5mg/L，处理组3：IBA 0.5mg/L+NAA 0.5mg/L，处理组4：IBA 0.25mg/L+NAA 0.25mg/L。所有处理组均在培养基中添加300mg/L的头孢霉素，降低污染率。将消毒后的茎尖在4组培养基培养30天后统计茎尖不定根再生情况，结果如图1所示，根据实验结果发现不同激素配比对川芎茎尖再生不定根影响不同，观察到1、2、3号处理组中生根数量和根系发达程度均不及处理组4；4号处理组中统计到生根率为96％，观察到幼苗健壮，叶色浓绿，根的生长速度快，根系发达，生根条数在12条以上，且根系比处理组1、2、3更发达。相同时间内，处理组4得到的幼苗生根数量最多，且再生根的平均长度大于处理组1、2、3。故选择处理组4的激素配比作为最佳的茎尖生根培养基。

(5)炼苗和移栽：

在生根培养基培养大约30天后，茎尖基部再生的不定根大约长至1～3cm时，打开瓶盖，在室内炼苗4天后，将组培苗从培养瓶中取出，洗掉根部的培养基，将其移栽至松软的基质中，并在幼苗上方用保鲜膜遮盖保湿，采用川芎常规田间管理办法管理(移栽苗在室内培养时温度可设置为22℃，培养室湿度保持在60％以上)。

根据实验结果发现，处理组4中茎尖再生不定根的速度更快，移栽后更健壮，成活率更高，达99％，处理组2、3得到的幼苗大部分移栽成活，处理组1未移栽成活。因此，相比处理组1、2、3，最佳的茎尖生根培养基为：1/2MS+IBA 0.25mg/L+NAA 0.25mg/L+蔗糖20g/L+琼脂8g/L。

实施例2、川芎茎尖组培快繁方法

根据前期筛选的茎尖最佳生根培养基，利用直接型器官发生方式建立川芎茎尖组培快繁方法，操作步骤如下：

(1)取材：选取成熟时期的川芎大约2cm～4cm的幼嫩茎尖作为外植体。

(2)外植体的消毒处理：将川芎茎尖在流水下小心冲洗1～2h，然后在超净台中用无菌水清洗3次，接着用70％或75％酒精处理30s，再用2％(W/V)次氯酸钠溶液处理4min，最后用无菌水清洗3次。

(3)茎尖生根培养基：将消毒处理后的川芎茎尖转移到生根培养基上，在24～26℃、每天光照12～16小时、光照强度为1500～2000Lx条件下进行培养，生根培养基为：1/2MS+IBA 0.25mg/L+NAA 0.25mg/L+蔗糖20g/L+琼脂8g/L，pH5.6～5.8；与此同时，可在培养基中添加300mg/L的头孢霉素，降低污染率。采用该生根培养基时统计到生根率为96％，观察到根的生长速度快，根系发达，生根条数在12条以上，幼苗健壮，叶色浓绿，移栽成活率达99％。

(4)炼苗和移栽：在最佳茎尖生根培养基培养大约30天后，茎尖基部再生的不定根大约长至1～3cm时，打开瓶盖，在室内炼苗3～5天后，将组培苗从培养瓶中取出，洗掉根部的培养基，将其移栽至松软的基质中，并在幼苗上方用保鲜膜遮盖保湿。

实验过程中各阶段材料情况如图2所示：图2A虚线圈出的为川芎茎尖外植体，图2B为川芎茎尖外植体消毒处理，图2C为川芎茎尖在4号处理组生根培养基培养大约30天后的幼苗，图2D为将幼苗移栽松软的基质中，图2E为移栽成活后生长健壮的茎尖再生植株。

实施例3、川芎茎节组培快繁体系

借鉴川芎茎尖组培快繁体系，利用前期筛选的最佳生根培养基，建立川芎茎节组培快繁体系，操作步骤如下：

(1)选取靠近茎尖端的川芎茎节外植体，靠近地下部的茎节除菌困难，污染率高。

(2)对川芎茎节外植体进行消毒灭菌处理。所采用的消毒方法是：先将茎节在流水下冲洗3小时左右，然后在无菌条件下用75％酒精处理45s、2％次氯酸钠处理8min，最后用无菌水将外植体清洗3～5次。

(3)将消毒处理后的川芎茎节转移至MS培养基培养，此时可添加0.1mg/L NAA和0.1mg/L 6-BA诱导川芎茎节分化不定芽，大约4天后，如图3C所示，川芎茎节分化出不定芽。

(4)当川芎茎节分化的不定芽长到2cm以上时，将其从茎节上切下并转移至实施例1中的最佳生根培养基培养(即实施例1中的处理组4的培养基)，直至不定芽再生根。

实验过程中各阶段材料情况如图3所示：图3A虚线圈出部分表示选取的川芎茎节外植体，图3B表示川芎茎节外植体消毒处理，图3C为川芎茎节在MS培养基培养大约4天后的情况，图3D为从川芎茎节切下的不定芽，培养在最佳生根培养基，图3E为茎节分化的不定芽在生根培养基培养30天后生长情况。

本实施例说明：本发明中的最佳生根培养基同样适用于以川芎茎节为外植体建立的组培快繁体系。

实施例4、豆薯茎尖组培快繁方法

参照实施例2中的川芎茎尖组培快繁方法，建立豆薯(学名：Pachyrhizus erosus(Linn.)Urb.)茎尖组培快繁体系，操作步骤如下：

(1)在无菌条件下直接剪取1～3cm的豆薯无菌苗茎尖(如图4A虚线圈出部位)。在本实施例中是采用种子繁殖出来的无菌苗，获取其茎尖。

(2)将豆薯茎尖转移至生根培养基培养，经过培养基筛选和优化，发现豆薯茎尖最佳生根培养基为MS+IBA 1mg/L+NAA 0.5mg/L+蔗糖20g/L+琼脂8g/L，pH5.6～5.8。

(3)在生根培养基上培养大约20～30天后，豆薯茎尖再生根长约2～3cm时，炼苗后移栽(如图4E为移栽成活的豆薯茎尖再生植株)。

图4是豆薯茎尖组培快繁方法中各阶段材料生长情况，图4A获取豆薯组培苗茎尖，图4B是豆薯茎尖在培养基培养10天生长情况，图4C豆薯茎尖在培养基培养15天生长情况，图4D豆薯茎尖在培养基培养20天生长情况，图4E是移栽成功的豆薯茎尖再生植株。

不同培养基筛选情况为：

当生根培养基采用①MS+IBA 1mg/L+NAA 0.5mg/L+蔗糖20g/L+琼脂8g/L，pH5.6～5.8观察到根的生长速度快，根系健壮、发达，生根数在5条以上，平均根长大于3cm，大部分移栽成活。

当生根培养基采用②MS+IBA 2mg/L+NAA 0.5mg/L+蔗糖20g/L+琼脂8g/L，pH5.6～5.8观察到根的生长速度相对较慢，根系粗壮，生根数和平均根长均不及培养基①，移栽成活率低于培养基①。

当生根培养基采用③MS+蔗糖20g/L+琼脂8g/L，观察豆薯茎尖几乎没有再生根的迹象，均未移栽成活。

实施例5、四棱豆茎尖组培快繁方法

参照实施例2中的川芎茎尖组培快繁方法，建立四棱豆(学名：Psophocarpustetragonolobus(Linn.)DC.)的茎尖组培快繁体系，操作步骤如下：

(1)在无菌条件下直接剪取1～3cm的四棱豆无菌苗茎尖；

(2)将豆薯茎尖转移至生根培养基培养，经过培养基筛选和优化，发现四棱豆茎尖在MS培养基上长势良好。

(3)在MS培养基大约30天后，四棱豆茎尖再生根长约3～5cm时(如图5D)，炼苗后移栽，如图5E为移栽成活的四棱豆茎尖再生植株。

图5是四棱豆茎尖组培快繁方法中各阶段材料生长情况，图5A是四棱豆茎尖在培养基培养30天生长情况，图5B是图5A组培瓶底部照片，即四棱豆茎尖在培养基培养30天后生根情况，图5C是图5A组培瓶放大图，图5D是四棱豆茎尖在培养基培养30天后的再生植株照片，图5E是移栽成功的豆薯茎尖再生植株。

不同培养基筛选情况为：

当生根培养基采用MS+蔗糖20g/L+琼脂8g/L，观察到根的生长速度快，根系健壮、发达，生根数在8条以上，平均根长大于4cm，大部分移栽成活。

当生根培养基采用MS+IBA 2mg/L+NAA 0.5mg/L+蔗糖20g/L+琼脂8g/L，pH5.6～5.8观察到根的生长速度相对较慢，根系粗壮，生根数在12条以上，平均根长2～4cm，移栽成活率低。

当生根培养基采用MS+IBA 1mg/L+NAA 0.5mg/L+蔗糖20g/L+琼脂8g/L，pH5.6～5.8观察到根的生长速度相对较慢，根系粗壮，生根数在10条以上，平均根长大于3～4cm，移栽成活率低。

发明人在实验过程中发现：豆薯和四棱豆茎尖组培快繁的培养基有一定差异，四棱豆茎尖和茎段可以在不含任何激素的MS培养基生根，而豆薯在不含任何激素的MS培养基目前还没观察到任何再生迹象。

Claims

1.一种以茎尖为外植体的植物组织培养快繁方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）外植体的消毒处理：取植株上的茎尖作为外植体，表面消毒处理；所述植株为川芎或者豆薯或者四棱豆；

（2）生根培养：将消毒后的茎尖转移到生根培养基上，在24～26℃、每天光照12～16小时、光照强度为1000～1500 Lx条件下进行培养；

川芎的生根培养基为1/2MS+IBA 0.2～0.5 mg/L+NAA 0～0.5 mg/L +蔗糖15～30 g/L+琼脂6～10 g/L；

豆薯的生根培养基为MS+NAA 0.3～0.7 mg/L+IBA 0.5～2 mg/L+蔗糖15～30 g/L+琼脂6～10 g/L；

四棱豆的生根培养基为MS+NAA 0～0.5 mg/L+IBA 0～2 mg/L+蔗糖15～30 g/L+琼脂6～10 g/L；

（3）炼苗和移栽：在生根培养基中培养至茎尖基部再生的不定根长至1～4 cm时，打开瓶盖，在室内进行炼苗后，将组培苗从培养瓶中取出，去掉根部的培养基，将其移栽至基质中种植。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）中所述茎尖为2 cm～5 cm长度，消毒是采用酒精和次氯酸钠消毒。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤（1）中所述茎尖为2 cm～4 cm长度，所述消毒的方法具体指先将茎尖用水清洗，然后用酒精处理20～40 s，再用次氯酸钠处理2～5min，最后用无菌水清洗干净。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述消毒的方法具体为：将茎尖在流水下小心冲洗1～2 h，然后在超净台中用无菌水清洗3次，接着用70％或75％酒精处理30 s，再用2%次氯酸钠溶液处理4 min，最后用无菌水清洗3次。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）中的所述生根培养基中还含有头孢霉素。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述头孢霉素在培养基中的浓度为300 mg/L。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述川芎的生根培养基为1/2MS+IBA 0.2～0.4 mg/L+NAA 0.2～0.4 mg/L +蔗糖19～21 g/L+琼脂7～9 g/L，pH5.6～5.8。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：所述川芎的生根培养基为1/2MS+IBA 0.25mg/L+NAA 0.25 mg/L +蔗糖20 g/L+琼脂8 g/L。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述豆薯的生根培养基为MS+NAA 0.4～0.5mg/L+IBA 0.7～1.5 mg/L+蔗糖18～22 g/L+琼脂6～10 g/L，pH5.6～5.8；

所述四棱豆的生根培养基为MS+蔗糖20 g/L+琼脂8 g/L。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于：所述豆薯的生根培养基为MS+IBA 1 mg/L+NAA 0.5 mg/L +蔗糖20 g/L+琼脂8 g/L。

11.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（3）中在生根培养基中培养至茎尖基部再生的不定根长至1～3 cm时，打开瓶盖，在室内炼苗3～5天后移栽至基质中后按照川芎或豆薯或四棱豆的常规幼苗田间管理方法栽培管理。