CN106417036B - 一种诱导重楼未成熟合子胚产生体细胞胚的组织培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明是一种诱导重楼未成熟合子胚产生体细胞胚的组织培养方法，步骤为：将带肉质种皮的重楼种子去掉附着的纤维组织后流水清洗后自来水浸泡后消毒、清洗；无菌条件下将已消毒的种子剥离掉肉质种皮纵切胚乳；将剥离的未成熟胚接种于培养基上持续暗培养；培养6个月后，将诱导成功的体细胞胚生长至纺锤形后剥离并置于新的诱导培养基上继续培养即可获得90％诱导成功率的重楼体细胞胚。本发明诱导的体细胞胚可以直接诱导生成具有根和芽的完整植株，较愈伤组织具有更好的可塑性；本发明获得的体细胞胚生长分化速度远高于营养器官诱导的愈伤组织，且具有更高的遗传稳定性，通过体细胞胚诱导生成的重楼植株重楼皂苷组分及含量与原植物相比差异不显著。
Description
技术领域
本发明涉及中药组织栽培技术领域，具体来说是一种诱导重楼未成熟合子胚产生体细胞胚的组织培养方法。
背景技术
重楼为我国云南、四川地区地道稀缺名贵药材，是“云南白药”、“宫血宁”及“季德胜蛇药片”等中成药的主要原料，也可直接入药用于止血、止痛及治疗蛇咬、骨折、腮腺炎、肿瘤和免疫失调等症。因为极高的药用价值，重楼需求量每年增长近20％。且重楼种子休眠期长、发芽率低，资源再生周期长，同时因为巨大的需求量，重楼野生资源的无节制掠夺式采集现象极其严重，这导致了严重的重楼资源危机。目前重楼规模化栽培的有效措施尚未获得实质性进展，重楼每年单株结实量波动巨大，这也严重阻碍了重楼规模化栽培。因此大规模的稳定生产重楼种苗以满足制药工业化生产迫在眉睫。植物组织培养快繁可以使植株繁殖系数成倍数增加，是解决重楼资源短缺的有效方法。传统重楼组培多以根茎或芽轴为外植体进行培养，目前已报道的重楼愈伤组织诱导发生率高达43.52％。但是从诱导形成愈伤组织，分化不定芽，诱导生根及最终移栽至土壤成活整个周期历时580天。同时重楼根茎内生菌较多，组培难度大，目前的组培效果并不显著，其繁殖系数低。此外随着继代次数的增加，重楼愈伤组织不定芽诱导率不断降低。因此目前尚无可行的规模化重楼种苗繁育技术推广，探索短期内扩大重楼繁育的组培快繁方法以缓解重楼资源需求压力势在必行。
发明内容
本发明的目的是针对上述技术存在的问题，提供一种诱导重楼未成熟合子胚产生体细胞胚的组织培养方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种诱导重楼未成熟合子胚产生体细胞胚的组织培养方法，其特征在于，步骤包括：
1)取样及消毒：每年的8-9月，将带肉质种皮的重楼种子去掉附着的纤维组织后流水清洗后自来水浸泡24小时，在无菌条件下经0.1％浓度HgCl2消毒5min后，无菌水清洗10次；
2)未成熟合子胚剥离：无菌条件下将已消毒的种子剥离掉肉质种皮，体式解剖显微镜下用组培镊子固定住剥去种皮的胚乳，用手术刀片纵切胚乳；
3)体细胞胚诱导：将剥离的未成熟胚接种于pH为5.8的培养基上，20±1℃下持续暗光培养；
4)胚性组织培养体系建立：培养6个月后，诱导成功的体细胞胚生长至纺锤形后未成熟胚剥离并置于新的诱导培养基上继续培养使其获得90％诱导成功率的重楼体细胞胚。
进一步的，所述培养基为1/2MS、琼脂粉浓度为7.5g/L、蔗糖浓度为30g/L。
本发明适用于包括华重楼(Paris polyphylla Smith var.chinensis(Franch.)Hara)及云南重楼(Paris polyphylla Smith var.yunnanensis(Franch.)Hand.-Mazz)的组织培养快繁。
本发明的有益技术效果是：目前报道的重楼组培以根茎或芽轴为外植体，这类外植体内生菌感染概率极大，在加入高浓度的抗生素培养条件下仍有较高的染菌率。本发明采用重楼种子中未成熟合子胚进行诱导，该方法可以避免内生菌感染问题，染菌率极低。目前重楼组培通过诱导根茎或芽轴等外植体产生愈伤组织，愈伤组织经诱导分化产生不定芽，再诱导生根后才能得到可大田栽培的完整植株。本发明诱导的体细胞胚可以直接诱导生成具有根和芽的完整植株，较愈伤组织具有更好的可塑性。通过重楼幼芽等器官诱导的愈伤组织生长缓慢，且药效成分低于原植物。本发明获得的体细胞胚生长分化速度远高于营养器官诱导的愈伤组织，且具有更高的遗传稳定性，通过体细胞胚诱导生成的重楼植株重楼皂苷组分及含量与原植物相比差异不显著。本发明为重楼规模化种苗繁育提供了重要的技术支撑。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
1)取样及消毒：所用外植体适取样时间为8月，重楼果临近成熟，但果皮尚未开裂时最佳。将重楼整果剪下后剖开，将带肉质种皮的重楼种子去掉附着的纤维组织后流水清洗后自来水浸泡24小时，在无菌条件下经0.1％浓度HgCl2消毒5分钟后，无菌水清洗10次；
2)未成熟合子胚剥离：无菌条件下用镊子将1)中已消毒的种子剥离掉肉质种皮，在体式显微镜下利用特细的组培镊子固定住剥去种皮的胚乳，用手术刀片纵切胚乳。因胚颜色与胚乳颜色一致，但组织密度存在差异，因此调试显微镜垂直光照强度，可以发现位于胚乳中的阴影状未成熟合子胚。利用手术刀片尖端部位沿胚边缘斜下压迫挤出完整未成熟胚。
3)体细胞胚诱导：将剥离的未成熟胚接种于培养基上，培养基为1/2MS培养基，琼脂粉浓度为7.5g/L，蔗糖浓度为30g/L，PH调制5.8，培养基中不添加生长激素。培养温度(20±1)℃，光照设置为持续暗培养。
4)胚性组织培养体系建立：培养6个月后，约35.01％的未成熟胚会分化生产淡黄色卵圆形胚性组织，该组织即为体细胞胚。卵圆形胚性组织继续纵向生长形成纺锤型单体组织，将这类组织剥离，置于新的诱导培养基上继续培养2个月后，超过90％的纺锤形胚性组织会继续产生淡黄色卵圆形胚性组织。
实施例2
1)取样及消毒：每年的9月，将带肉质种皮的重楼种子去掉附着的纤维组织后流水清洗后自来水浸泡24小时，在无菌条件下经0.1％浓度HgCl2消毒5min后，无菌水清洗10次；
2)未成熟合子胚剥离：无菌条件下将已消毒的种子剥离掉肉质种皮，用组培镊子固定住剥去种皮的胚乳，用手术刀片纵切胚乳；
3)体细胞胚诱导：将剥离的未成熟胚接种于pH为5.8的培养基(培养基为1/2MS、琼脂粉浓度为7.5g/L、蔗糖浓度为30g/L)上，19℃下持续暗光培养；
4)胚性组织培养体系建立：培养6个月后，培养6个月后，将诱导获得的体细胞胚剥离置于新的诱导培养基上继续培养使其90％的纺锤形胚性组织产生淡黄色卵圆形胚性组织。
实施例3
1)取样及消毒：每年的8月，将带肉质种皮的重楼种子去掉附着的纤维组织后流水清洗后自来水浸泡24小时，在无菌条件下经0.1％浓度HgCl2消毒5min后，无菌水清洗10次；
2)未成熟合子胚剥离：无菌条件下将已消毒的种子剥离掉肉质种皮，用组培镊子固定住剥去种皮的胚乳，用手术刀片纵切胚乳；
3)体细胞胚诱导：将剥离的未成熟胚接种于pH为5.8的培养基(培养基为1/2MS、琼脂粉浓度为7.5g/L、蔗糖浓度为30g/L)上，21℃下持续暗光培养；
4)胚性组织培养体系建立：培养6个月后，将诱导获得的体细胞胚剥离置于新的诱导培养基上继续培养使其90％的纺锤形胚性组织产生淡黄色卵圆形胚性组织。
本技术领域技术人员可以理解，除非另外定义，这里使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)具有与本发明所属领域中的普通技术人员的一般理解相同的意义。还应该理解的是，诸如通用字典中定义的那些术语应该被理解为具有与现有技术的上下文中的意义一致的意义，并且除非像这里一样定义，不会用理想化或过于正式的含义来解释。
最后所应说明的是：以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应该理解：依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (2)
1.一种诱导重楼未成熟合子胚产生体细胞胚的组织培养方法，其特征在于，步骤包括：
1)取样及消毒：每年的8-9月，将带肉质种皮的重楼种子去掉附着的纤维组织后流水清洗后自来水浸泡24小时，在无菌条件下经0.1％浓度HgCl2消毒5min后，无菌水清洗10次；
2)未成熟合子胚剥离：无菌条件下将已消毒的种子剥离掉肉质种皮，体式解剖显微镜下用组培镊子固定住剥去种皮的胚乳，用手术刀片纵切胚乳；
3)体细胞胚诱导：将剥离的未成熟胚接种于pH为5.8的培养基上，20±1℃下持续暗光培养；
4)胚性组织培养体系建立：培养6个月后，诱导成功的体细胞胚生长至纺锤形后未成熟胚剥离并置于新的诱导培养基上继续培养使其获得90％诱导成功率的重楼体细胞胚。
2.根据权利要求1所述诱导重楼未成熟合子胚产生体细胞胚的组织培养方法，其特征在于，所述培养基为1/2MS、琼脂粉浓度为7.5g/L、蔗糖浓度为30g/L。
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