CN114793896A

CN114793896A - 一种诱导西洋梨离体叶片获得再生完整植株的方法

Info

Publication number: CN114793896A
Application number: CN202210413414.1A
Authority: CN
Inventors: 王利平; 吕沙妹; 王婷婷; 杨岳昆; 何颖; 朱浩东; 张靖国; 洪霓; 王国平
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2022-04-15
Filing date: 2022-04-15
Publication date: 2022-07-29
Anticipated expiration: 2042-04-15
Also published as: CN114793896B

Abstract

本发明属于植物培育技术领域，公开了一种诱导西洋梨离体叶片获得再生完整植株的方法，包括：无菌材料的获取、组培苗继代培养、叶片再生培养、再生芽继代培养、再生苗生根培养及生根苗移栽。鉴于梨叶片再生不具备一套再生体系可以在不同品种中套用，本发明通过大量实验去摸索和明确再生参数，建立了西洋梨品种Tosca的高效再生体系，且移栽成活率高，为引种Tosca资源保存、扩繁及其遗传转化研究奠定了基础，且具有实践生产意义。

Description

一种诱导西洋梨离体叶片获得再生完整植株的方法

技术领域

本发明属于植物培育技术领域，具体涉及一种诱导西洋梨离体叶片获得再生完整植株的方法。

背景技术

建立梨叶片离体高效再生体系是开展梨无毒化栽培和提高梨果品质量的有效途径，也是进行快速繁殖的有效途径。国内梨叶片再生研究起步晚，目前仅有部分砂梨、白梨和新疆梨几个品种叶片再生的报道且普遍再生率不高。而且基于目前梨叶片再生研究发现，梨叶片再生具有以下特点：①不同品种再生存在特异性，由于不同品种梨之间基因型和遗传背景完全不同，故其适用的再生体系也就完全不同，相互之间难以套用和作为参考依据，如将东方梨的有关研究成果直接用在西方梨上，再生效果极差甚至不再生(段莹莹，梨再生体系的建议及多倍体诱导研究，2015，硕士学位论文；闫允青，东方梨扩繁体系的优化和叶片高效再生体系的建立，2016，硕士学位论文)；②即使是同一品种，但不同种质的再生频率相差很大，如砂梨中，相同培养条件下，翠冠梨叶片再生频率最高为20.4％，雪青其次为6.25％，西子绿无再生(曹霞和柴明良，砂梨叶片再生不定梢的研究， 2005，22(5)，果树学报)；③除了梨的基因型，影响梨叶片再生能力的因子还包括外植体类型、基本培养基类型、激素的种类和配比、叶片的生理生化状态、光照条件等多种因素。故在梨叶片再生研究中，不具备一套再生体系可以在不同品种中套用，研究者们还不能实现对所有梨品种的叶片培养再生。

通过叶片再生得到的再生苗的移栽成活率是影响叶片再生体系应用和推广的关键因素。目前研究多集中在叶片诱导产生不定稍以及不定稍继代培养，对所得再生苗的移栽关注较少。

目前，国内外无Tosca品种叶片再生报道。发明人在前期试验中，尝试采用已报道的其他梨品种再生体系去建立Tosca的再生体系，但效果极差。

发明内容

针对现有技术中的问题，本发明的目的在于建立西洋梨品种离体叶片再生体系，获得该品种材料的资源保存。

为了实现上述目的，本发明的技术方案具体如下：

一种诱导西洋梨离体叶片获得再生完整植株的方法，包括以下步骤：

(1)无菌材料的获取：采集带休眠芽枝条，取下休眠芽，消毒清洗后取茎尖接种于MS培养基培养得到无菌离体植株；

(2)组培苗继代培养：通过切取无菌植株的茎尖，接种于MS培养基中培养得到组培苗；

(3)叶片再生培养：选取组培苗叶片，划伤后置于NN69培养基诱导产生再生芽；

(4)再生芽继代培养：将再生芽置于MS培养基中培养，多次继代培养得到再生植株；

(5)再生苗生根培养：将再生植株接种于1/2MS培养基进行生根培养；

(6)生根苗移栽，

其中，所述MS培养基中含有6-BA、IBA、蔗糖、琼脂；

所述NN69培养基中含有6-BA、NAA、蔗糖、植物凝胶；

所述1/2MS培养基中含有IBA、NAA、蔗糖、琼脂；

步骤(3)所述叶片再生培养的方式为：先暗培养30～40d再光照培养；

步骤(5)所述再生苗生根培养的方式为：先暗培养再光照培养，暗培养为3～ 8d，总的培养的时间为35～40d。

优选地，MS培养基中所含成份的含量为：6-BA为0.6～1mg/L，IBA为 0.2mg/L，蔗糖为30g/L，琼脂为6g/L；需要说明的是，虽然无菌材料的获取、组培苗继代培养、再生芽继代培养都用到MS培养基，但并不要求MS培养基中所含的6-BA、IBA、蔗糖、琼脂的量完全一致。

优选地，NN69培养基中所含成份的含量为：6-BA为4～5mg/L，NAA为 0.05～0.15mg/L，蔗糖为20g/L，植物凝胶为2.5g/L。

最佳地，NN69培养基中所含成份的含量为：6-BA为5mg/L，NAA为0.15mg/L，蔗糖为20g/L，植物凝胶为2.5g/L。

优选地，1/2MS培养基中所含成份的含量为：IBA为0.5mg/L，NAA为0.05～ 1.5mg/L，蔗糖为20g/L，琼脂为6g/L。

优选地，组培苗继代培养的条件是在光照16h、黑暗8h的光周期下培养。

优选地，步骤(3)中叶片再生培养的方式为：暗培35d后置于光照下培养 5d，其中光照培养周期为光照16h、黑暗8h。

优选地，叶片划伤的方法为垂直于主叶脉划2～4刀。

优选地，步骤(5)中再生苗生根培养的方式为：先暗培养再光照培养，暗培养为3～8d，总的培养的时间为35～40d。

优选地，再生芽在初次继代培养时保留再生芽的底部外植体及愈伤组织，直接移入再生芽继代培养基中培养。

优选地，西洋梨品种为Pyrus communis L.cv.Tosca。

本发明的有益效果为：本发明通过大量实验去摸索和明确再生参数，建立了西洋梨品种Tosca高效再生体系及获取移栽的成活植株，且移栽成活率高，不仅为引种Tosca资源保存、扩繁及其遗传转化研究奠定了基础，而且利于该再生体系的应用和推广。

附图说明

图1为实施例1中Tosca再生体系建立流程图，其中A为体视显微镜下剥离休眠芽，B为再生所需的叶片状态(优选圈中叶片)，C为进行再生的叶片伤口处理方式及程度，D为叶片产生的再生芽，E为再生芽初代培养20d生长状况， F为再生植株继代3次后生长状况，G为再生植株生根状况，H为生根苗移栽60d 后生长状况；

图2为不同组培苗继代培养基对叶片状态的影响对比图，其中A为J1处理， B为J2处理，C为J3处理，D中左侧3株为J1处理、右侧3株为J3处理；

图3为不同伤口处理程度对叶片愈伤组织产生状况的影响对比图；

图4为不同再生培养基诱导产生的再生芽图，其中A～D依次对应实施例1、实施例3、实施例4和对比例2；

图5为再生芽的不同处理方式接种后的生长状况，其中A为方式一接种0d (左)和20d(右)，B为方式二接种20d，C为方式二(左)和方式一(右)分别生长30d的对比；

图6为不同生根培养基下再生苗生根状况；

图7为不同培养方式下再生苗根系的生长状况图。

具体实施方式

下面将结合本发明中的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

本发明实施例所用的MS培养基基盐、1/2MS培养基基盐、NN69培养基基盐(不含蔗糖和琼脂)均购自于Coolaber(北京)，6-BA、IBA、NAA均购自于 Coolaber(北京)，蔗糖、NaOH购自于沪式(上海)，琼脂粉购自于BioFroxx(德国)，植物凝胶购自于Solarbio(北京)。

实施例1

本实施例中西洋梨离体叶片再生过程如图1所示，具体参数如下：

(1)外植体无菌材料的获取

2020年9月，采集自湖北省农科院果树茶叶研究所国家砂梨种质资源圃中“Tosca”的带休眠芽枝条，实验室内自来水冲洗干净，取下休眠芽，轻剥外层鳞片 3～4层，置4℃冰箱备用。将其置于超净工作台中，无菌水冲洗芽2次，将其转入灭菌的锥形瓶，75％酒精浸泡消毒1min或分2步各浸泡30s，无菌水冲洗3 次，0.1％氯化汞浸泡消毒8min，无菌水冲洗5次。

再于体视镜下剥离休眠芽，取茎尖2～3mm，接种于备用的MS培养基 (MS+6-BA(1.0mg/L)+IBA(0.2mg/L)+Sucrose(30g/L)+Agar(6g/L))上，暗培养7d后光照培养30d，及时清理被污染植株，观察其生长状况；对于有内生菌植株，进行了热处理(恒温37℃、16h/8h)、30d培养。最终获取无菌离体植株。

(2)组培苗继代培养

将步骤(1)获取的无菌离体植株切取茎尖1～2cm，接种于组培苗继代培养基中在光照16h、黑暗8h的光周期下培养30d。每瓶接种4株植株，每种重复处理10瓶。组培苗继代培养基的组成为：MS+BA(0.8mg/L)+IBA(0.2mg/L)+Sucrose (30g/L)+Agar(6g/L)，其中培养基用1M NaOH溶液调整pH至5.8～6.0，并 121℃灭菌20min。

(3)叶片再生

选取步骤(2)制备的叶龄25～35d、生长健壮的组培苗，取上部平展、嫩绿叶片，于无菌培养皿中垂直于主叶脉划3刀，背面接触再生培养基，每种处理接种1皿，每皿接种10片。培养条件为暗培35d后置于光照下培养5d，其中光照培养周期为光照16h、黑暗8h。

所使用的叶片再生培养基为：NN69+5mg/L 6-BA+0.15mg/L NAA+20g/L Sucrose+2.5g/L Phytagel。

(4)再生芽的继代培养

将步骤(3)获得的再生芽连同底部外植体及愈伤组织统一移入继代培养基中继代3次，其中继代培养基的组成为：MS+6-BA(0.8mg/L)+IBA(0.2mg/L) +蔗糖(30g/L)+琼脂粉(6.0g/L)，其中pH用1M NaOH溶液调至5.8～6.0，121℃，灭菌20min。

(5)再生苗生根培养

去除步骤(4)获得的再生植株的底部老叶，顶部叶片用剪刀修剪平整，植株高度约1.5～2cm，接种于生根培养基中培养。生根培养基以1/2MS为基础培养基，IBA含量为0.5mg/L，NAA含量为1.5mg/L，蔗糖为20g/L，琼脂为6g/L。

培养时间为：先暗培7d，再光照培养28d，光照培养周期为光照16h、黑暗 8h。

(6)再生生根苗移栽

取(5)培养35d的生根苗，洗净根部琼脂和愈伤组织(防止烂根)，放置生长室炼苗5d后，移栽装入营养土的育苗盆，培养基质为普通营养土，土粒不成团、不滴水、较松散为宜，生长期间可喷施赤霉素促进植株节间伸长，最终获得无性繁殖优质种苗。图1中H为生根苗移栽60d的植株生长状况，植株有明显的节间伸长，长势较好。

实施例2

与实施例1不同的是，步骤(2)中组培苗继代培养基的组成为：MS+BA (0.6mg/L)+IBA(0.2mg/L)+Sucrose(30g/L)+Agar(6g/L)。

实施例3

与实施例1不同的是，步骤(3)中叶片再生培养基为：NN69+4mg/L 6-BA+0.15 mg/LNAA+20g/L Sucrose+2.5g/L Phytagel。

实施例4

与实施例1不同的是，步骤(3)中叶片再生培养基为：NN69+5mg/L 6-BA+0.05 mg/LNAA+20g/L Sucrose+2.5g/L Phytagel。

实施例5

与实施例1不同的是，生根培养基以1/2MS为基础培养基，IBA含量为0.5 mg/L，NAA含量为0.05mg/L，蔗糖为20g/L，琼脂为6g/L。

对比例1

与实施例1不同的是，步骤(2)中组培苗继代培养基的组成为：MS+BA (0.6mg/L)+IBA(0.2mg/L)+NAA(0.05mg/L)+Sucrose(30g/L)+Agar(6g/L)。

对比实施例1、实施例2和对比例1中步骤(2)分别获得的组培苗(培养时间为30d)，具体见表1和图2：

表1

实施例1中获取的植株叶片平展、叶片长宽比例均匀，呈现颜色嫩绿；实施例2获取的植株叶片形状狭长，但增殖系数最高；对比例2获取的植株叶片细小、不平展。实施例1和实施例2进行步骤(3)再生实验时，均具有很好地再生率。但对比例1中的叶片再生效果很差。有此可见，梨叶片再生培养对组培苗叶片要求很高，故组培苗所用培养基是影响叶片再生的关键因素之一。

对比例2

与实施例1不同的是，步骤(3)中叶片再生培养基为：NN69+3mg/L 6-BA+0.1 mg/LNAA+20g/L Sucrose+2.5g/L Phytagel。

对比例3

与实施例1不同的是，步骤(3)中叶片再生培养基为：NN69+6mg/L 6-BA+0.2 mg/LNAA+20g/L Sucrose+2.5g/L Phytagel。

对比例4

与实施例1不同的是，步骤(3)中叶片再生培养基为：NN69+6mg/L 6-BA +0.3mg/LNAA+20g/L Sucrose+2.5g/L Phytagel。

对比例5

与实施例1不同的是，步骤(3)中叶片再生培养基为：NN69+4mg/L 6-BA +0.3mg/LNAA+20g/L Sucrose+2.5g/L Phytagel。

对比实施例1、实施例3、4以及对比例2中叶片的再生情况，对叶片再生率和平均每叶再生梢数的统计数据进行单因素方差分析，二者方差齐性检验P>0.05，满足方差齐性，对其进行单因素方差检验P<0.05，在此之后运用LSD方法进行多重比较，测定结果如表2和图4所示(再生率＝再生梢叶片数/接种叶片数×100％；平均每叶再生梢数＝再生梢总数/再生叶片数)。

表2

按照同样的分析方法，分析对比例3～5中的再生率，具体如表3所示：

表3

由表2和表3可知，再生培养基激素配比是影响再生率的关键因素，其中实施例1中叶片再生利率可达70％以上，平均每叶再生梢数约为2个，褐化率和污染率为0，效果最好；对比例3～5中不仅叶片再生率低且再生稳定性差。

对比例6

与实施例1不同的是，步骤(4)中再生芽初次继代时，剪去底部外植体及愈伤组织，将再生芽单独移入培养基中(将此方式记作方式二，实施例中的继代方式记作方式一)。培养结果如表4和图5所示。

表4

由此可见，由于叶片诱导产生的再生芽不定梢较嫩，其初代培养方式会直接影响继代培养中植株能否正常生长；方式一利于丛芽再生，其平均株高和增殖系数参数较高。

对比例7

与实施例1不同的是，生根培养基以1/2MS为基础培养基，6-BA含量为0.05 mg/L，IBA含量为0.5mg/L，NAA含量为0.05mg/L，蔗糖为20g/L，琼脂为6g/L。

对比例8

与实施例1不同的是，步骤(5)中生根培养基以1/2MS为基础培养基，6-BA 含量为0.05mg/L，IBA含量为0.5mg/L，NAA含量为1.5mg/L，蔗糖为20g/L，琼脂为6g/L。

统计实施例1、5和对比例7、8的生根情况(每种处理重复10瓶，每瓶接种4株)，具体统计最早生根时间，35d后的生根率、生根数目和根长度，结果见表5和图6。

表5

结果显示，实施例1中处理平均根数大于实施例5处理，二者的生根率和平均根长相当。生根过程中，植株顶芽生长势较弱，但加入6-BA后，不仅延迟了生根时间，也没有改善顶芽的生长状况；虽然在对比例8中，根系较为粗壮，但根系太短，在同样条件下移栽成活率很低，仅为16.6％(实施例1、5中的移栽成活率为58％)。

对比例9

与实施例1不同的是，改变步骤(5)中的培养时间为：先暗培7d，再光照培养53d，共计培养60d。本实施例的移栽成活率为0。另外，把实施例5中的培养时间改为60d后，移栽成活率同样为0。

从对比例8和9可知，根系的生长状况和生根培养时间是决定移栽成活的关键因素。

对比例10

与实施例1不同的是，改变步骤(5)中的培养方式，即接种后直接光照培养的处理方式。与实施例1相比，本实施例的最早生根时间平均为24d左右，(如图7中A)；而实施例1的最早生根时间平均为15d左右(如图7中B)，且其每株产生根数及根长度均高于对比例10。其可能原因在于：黑暗处理期间能够加快促进其愈伤组织形成，有利促进根系萌发和生长。

对比例11

与实施例1不同的是，步骤(3)中的培养条件为不经过暗培养，直接光照培养。相对于实施例1，本实施例不能分化出再生芽。

而现有报道中指出“雪花梨”不经过暗培养能够分化出再生芽，而提高暗培养时间会导致褐化率增加，影响叶片再生(闫允青,姜桦韬,谷超,等.“雪花梨” 扩繁和叶片再生体系的建立[J].南京农业大学学报,2017,40(1):68-75.)。由此可见，可见不同梨品种间无可参考性。

另外，在研究过程中发现，叶片伤口划伤程度对叶片愈伤组织形成具有明显影响，进而对叶片再生产生影响。本实施例进行了伤口划伤深、浅不同处理的对比分析，具体如图3所示：A中的叶片划伤伤口浅，产生的愈伤组织发白、干燥且不能成团，不具有再生能力，不能产生再生芽；B中所示为正常状态愈伤组织，其划伤伤口深，愈伤组织成团，呈现透明状，可产生再生植株。表明了划伤力度引起对伤口深浅的影响，是产生再生植株的决定因素。

本发明中各培养基组分的上下限、区间取值，以及培养参数的上下限、区间取值都能实现本发明，在此不一一列举实施例。

综上，本发明基于西洋梨Tosca基因的特异性，对外植体状态、暗培养时间、再生体系激素配比等多种因素摸索，建立了西洋梨离体叶片高效再生体系。

以上所述是本发明的优选实施方式而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种诱导西洋梨离体叶片获得再生完整植株的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(6)生根苗移栽；

其中，所述MS培养基中含有6-BA、IBA、蔗糖、琼脂；

所述NN69培养基中含有6-BA、NAA、蔗糖、植物凝胶；

所述1/2MS培养基中含有IBA、NAA、蔗糖、琼脂；

步骤(5)所述再生苗生根培养的方式为：先暗培养再光照培养，暗培养为3～8d，总的培养的时间为35～40d。

2.根据权利要求1所述诱导西洋梨离体叶片获得再生完整植株的方法，其特征在于，所述MS培养基中所含成份的含量为：6-BA为0.6～1mg/L，IBA为0.2mg/L，蔗糖为30g/L，琼脂为6g/L。

3.根据权利要求1所述诱导西洋梨离体叶片获得再生完整植株的方法，其特征在于，所述NN69培养基中所含成份的含量为：6-BA为4～5mg/L，NAA为0.05～0.15mg/L，蔗糖为20g/L，植物凝胶为2.5g/L。

4.根据权利要求1所述诱导西洋梨离体叶片获得再生完整植株的方法，其特征在于，所述1/2MS培养基中所含成份的含量为：IBA为0.5mg/L，NAA为0.05～1.5mg/L，蔗糖为20g/L，琼脂为6g/L。

5.根据权利要求1所述诱导西洋梨离体叶片获得再生完整植株的方法，其特征在于，所述组培苗继代培养的条件是在光照16h、黑暗8h的光周期下培养。

6.根据权利要求1所述诱导西洋梨离体叶片获得再生完整植株的方法，其特征在于，步骤(3)所述叶片再生培养的方式为：暗培35d后置于光照下培养5d，其中光照培养周期为光照16h、黑暗8h。

7.根据权利要求1所述诱导西洋梨离体叶片获得再生完整植株的方法，其特征在于，所述叶片划伤的方法为垂直于主叶脉划2～4刀。

8.根据权利要求1所述诱导西洋梨离体叶片获得再生完整植株的方法，其特征在于，步骤(5)中所述再生苗的暗培养时间为7d。

9.根据权利要求1所述诱导西洋梨离体叶片获得再生完整植株的方法，其特征在于，所述再生芽在继代培养时保留再生芽的底部外植体及愈伤组织。

10.根据权利要求1所述诱导西洋梨离体叶片获得再生完整植株的方法，其特征在于，所述西洋梨为品种为Pyrus communis L.cv.Tosca。