CN110432151B - 一种重阳木的组培快繁方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种重阳木的组培快繁方法，其以重阳木带腋芽茎段或重阳木叶片为外植体进行组织培养繁育。当外植体为重阳木带腋芽茎段时，培养方法为：对芽茎段消毒，再将芽茎段置于诱导培养基中直接获得丛生苗，继而将丛生苗切成单个苗逐一接种在生根培养基上进行生根培养，最后将生根培养后的苗依次炼苗、移栽，实现重阳木的快速扩繁。当以重阳木的无菌叶片作为外植体时，培养方法为：对重阳木种子消毒，并进行无菌叶片的培养，接着以该无菌叶片为外植体，依次经过愈伤组织的诱导、愈伤组织分化、生根培养过程，建立重阳木组织培养快速繁殖体系。本发明操作简单、培育成本低、繁殖效率高，且受自然环境影响小，有很好的市场及产业化应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及植物培养技术领域，尤其涉及一种重阳木的组培快繁方法。
背景技术
重阳木(学名：Bischofia polycarpa)为大戟科重阳木属的落叶乔木，为中国原产树种，是我国著名园林观赏树种。重阳木具有耐阴、对土壤要求不严、耐水湿、根系发达、抗风力强等优点，常分布于秦岭、淮河流域以南各地，长江中下游以及一些水网地区。重阳木生长速度中等，树叶繁茂，树姿壮观，秋后叶红，通常作为行道树和庭园观赏树栽培，在园林绿化上用途广泛。
经查阅文献发现，学者们对于重阳木的研究，主要还是集中在重阳木栽培技术以及病虫害防治技术等方面，而关于重阳木完整的组织培养快繁技术还未有报道。然而，利用组织培养技术培育重阳木可以降低成本、提高快繁成效，并且可以摆脱自然气候变化的影响，克服野外自然条件下重阳木严酷的生境条件及种子量小、发芽率底等繁育障碍，使之以最佳的繁殖效率快速生产种苗产品。因此，建立重阳木的组培快繁体系，是对重阳木优良种质保存以及种苗批量生产的一种重要途径，具有很好的市场及产业化应用前景。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种重阳木的组培快繁方法，其操作简单、培育成本低、繁殖效率高，且受自然环境影响小，有很好的市场及产业化应用前景。
本发明采用以下技术方案解决上述技术问题：
一种重阳木的组培快繁方法，以重阳木带腋芽茎段或重阳木叶片为外植体进行组织培养繁育；
其中，当外植体为重阳木带腋芽茎段时，具体的培养繁育步骤如下：
A1、外植体的获得与消毒：采摘新鲜的重阳木带腋芽茎段用洗衣粉冲洗0.5-1.5min、流水冲洗0.5-1.5h，接着于超净工作台中依次使用75％酒精漂洗25-35s、无菌水冲洗3-5次、1％次氯酸钠浸泡4-6min，最后，再采用无菌水冲洗5-7次；冲洗完毕，用无菌吸水纸将叶片上的水分吸干备用；
A2、诱导培养：将吸干水分的重阳木带腋芽茎段于无菌条件下切块，并分别接种至丛生苗诱导培养基中进行丛生苗的诱导培养；其中，丛生苗诱导培养基的配方为：MS+1.8mg/L 6-BA+0.5mg/L 2,4-D，pH 5.8；
A3、生根培养：将培养所得的丛生苗切为单个苗直接转接至生根培养基中进行生根培养；其中，生根培养基的配方为：1/2MS+0.3mg/L IBA，pH 5.8；
当外植体为重阳木叶片时，具体的培养繁育步骤如下：
B1、外植体的获得与消毒：
①选取颗粒饱满的重阳木种子，将其浸泡到无菌水3-5h，然后在超净工作台上用利用75％酒精迅速漂洗10-20s，重复2-4次，接着用4％次氯酸钠浸泡7-9min，最后用无菌水冲洗3-5次；冲洗完毕，用无菌吸水纸将种子上的水分吸干备用；
②将吸干水分的重阳木种子于无菌条件下接种至无菌叶片培养基中进行无菌叶片的培养，培养所得的重阳木无菌叶片即为目标所需的外植体重阳木叶片；其中，无菌叶片培养基的配方为：1/2MS，pH 5.8；
B2、愈伤组织诱导：将获得的重阳木无菌叶片于无菌条件下接种至愈伤组织诱导培养基中进行愈伤组织的诱导培养；其中，愈伤组织诱导培养基的配方为：MS+1.6mg/L 6-BA+1mg/L 2,4-D，pH 5.8；
B3、愈伤组织分化：挑选愈伤组织，将其接种至分化培养基中进行愈伤组织分化培养；其中，分化培养基的配方为：MS+1.6mg/L 6-BA+0.5mg/L 2,4-D，pH 5.8；
B4、生根培养：选取出苗一致的芽苗，切除其基部的愈伤组织，将丛生芽基部的愈伤组织切除，分割为单个芽，再将单个芽转接至生根培养基中培养，其中，生根培养基的配方为：1/2MS+0.3mg/L IBA，pH 5.8。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤A1中，采摘新鲜的重阳木带腋芽茎段用洗衣粉冲洗1min、流水冲洗1h，接着于超净工作台中依次使用75％酒精漂洗30s、无菌水冲洗4次、1％次氯酸钠浸泡5min，最后，再采用无菌水冲洗6次；冲洗完毕，用无菌吸水纸将叶片上的水分吸干备用。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤A2中，将吸干水分的重阳木带腋芽茎段于无菌条件下切成1cm2大小的切块，并分别接种至含丛生苗诱导培养基的培养瓶中进行丛生苗的诱导培养，每个培养瓶中接种1块茎段。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤A2和步骤A3中，诱导培养与生根培养的具体培养条件为：培养温度(25±1)℃，光照时间14-16h/d，光照强度1500-2000Lx。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤A2中，培养至15d时，开始出现丛生苗，出苗率达83.3％。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤A3中，待丛生苗长至2cm高，将其切为单个苗转移到生根培养基中培养，7天后，开始出根，生根率100％。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤B1中，选取颗粒饱满的重阳木种子，将其浸泡到无菌水4h，然后在超净工作台上用利用75％酒精迅速漂洗15s，重复3次，接着用4％次氯酸钠浸泡8min，最后用无菌水冲洗4次；冲洗完毕，用无菌吸水纸将种子上的水分吸干备用。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤B1中，将吸干水分的重阳木种子于无菌条件下接种至含无菌叶片培养基的培养瓶中进行无菌叶片的培养，每瓶接种3粒种子，3周后观察，共接60瓶，重复三次试验，并统计重阳木种子的发芽率及污染率。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤B1、步骤B2、步骤B3和步骤B4中，具体的培养条件为：培养温度(25±1)℃，光照时间14-16h/d，光照强度1500-2000Lx。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤A3与步骤B4后还分别包括“试管苗的炼苗移栽”步骤：
通过逐步开盖的方式将步骤A3或步骤B4获得的试管苗放置在组培室内驯化一周，并将无菌水倒入相应培养瓶中以保持水分；一周过后，将试管苗取出，并将附着在试管苗根部的培养基清洗干净，接着将其移栽于灭菌处理好的培养基质中；放其置于室内，浇透水，并用塑料薄膜覆盖在其周围，定期浇水，并保证一周后减少浇水次数；4d后将塑料薄膜移开至完全拆除，7d后移出培养室，使其于自然光下进行生长；其中，所述培养基质的具体组成为黑土：珍珠岩＝1:3。
本发明相比现有技术的优点在于：本发明开创式地研究出了一种重阳木的组培快繁方法，其以重阳木带腋芽茎段或重阳木叶片为外植体进行操作，操作简单、培育成本低、繁殖效率高，且受自然环境影响小；与传统的播种、扦插等栽培方法相比，通过组织培养快繁技术是对重阳木优良种质保存以及种苗批量生产的一种重要途径，具有很好的市场及产业化应用前景，对资源开发利用具有重要的现实意义；其中，“以重阳木带腋芽茎段为外植体”以及“以重阳木叶片为外植体”两种方法的具体优势分别如下：
(1)当以重阳木带腋芽茎段为外植体时：本方法采用重阳木带腋芽茎段作为外植体来直接快速诱导丛生苗，继而进行生根培养，避免了愈伤组织分化成苗这个较长的过程，同时与常规的扦插、播种等栽培方法相比，极大地缩短了其育种周期；另外，不同于常规的诱导培养基添加6-BA和NAA，本方法是添加6-BA和2,4-D来诱导不定芽的发生，该培养基不仅不会产生褐化，同时可以在短时间内获得大量丛生苗，转接至只加入IBA的生根培养基中，不仅主根粗壮且较长，同时生根率可达100％；
(2)当以重阳木叶片为外植体时：本方法只需要将诱导出的愈伤组织直接转接至分化培养基中即可快速分化出大量的不定芽，无需经过增殖培养的过程，极大地缩短了组培苗的育种周期；同时，本方法是通过降低生长素2,4-二氯苯氧乙酸的量从而增加6-苄氨基嘌呤作为细胞分裂素的比重，来诱导愈伤分化；愈伤诱导与分化培养基中基本培养基一样，且使用的生长调节剂种类也一样，均只需使用6-BA和2,4-D，两种培养基中6-BA的浓度也是一样的，只需改变2,4-D的浓度，即可达到诱导愈伤和愈伤快速分化的效果，同时不会产生褐化现象；实验操作简单，试验成果非常显著。将诱导出的不定芽直接接入含有IBA的生根培养基中，七天左右即可快速生根，且生根率可高达100％；此外，关于外植体“重阳木叶片”的获得方式为“通过无菌种子在培养基中发芽形成无菌苗”，这样在很大程度上减少了消毒过程中对叶片的损伤，有利于后期组培实验的开展。
附图说明
图1是实施例1中茎段插进丛生苗诱导培养基中进行丛生苗诱导培养的培养过程图(图中，a图为第15天时的培养状态图，b图为25天时的培养状态图)；
图2是实施例1中单个苗转接至生根培养基中进行生根培养的培养过程图(图中，a图为第7天时的培养状态图，b图为第15天时的培养状态图)；
图3是实施例5中无菌叶片转接至诱导培养基中进行愈伤组织诱导培养的培养图；
图4是实施例5中愈伤组织接种至分化培养基中进行愈伤组织分化培养的培养图；
图5是实施例5中单个芽转接至生根培养基中不定芽的生根培养的培养图；
图6是实施例5中试管苗的炼苗图。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
以下实施例1-3为“以重阳木带腋芽茎段为外植体时的重阳木组培快繁方法”。
实施例1
本实施例的一种重阳木的组培快繁方法，以重阳木带腋芽茎段为外植体，包括以下步骤：
A1、外植体的获得与消毒：实验材料来自于安徽省安庆市新官洲林场中具有较强耐水淹能力的优良单株；采摘新鲜的重阳木带腋芽茎段用洗衣粉冲洗1min、流水冲洗1h，接着于超净工作台中依次使用75％酒精迅速漂洗30s、无菌水冲洗4次、1％次氯酸钠浸泡5min，最后，再采用无菌水冲洗6次；冲洗完毕，用无菌吸水纸将叶片上的水分吸干备用。
A2、诱导培养：将吸干水分的重阳木带腋芽茎段于无菌条件下切成1cm2大小的切块，并分别接种至含丛生苗诱导培养基的培养瓶中进行丛生苗的诱导培养，每个培养瓶中接种1块茎段；如图1所示，培养至15d时，开始出现丛生苗，出苗率达83.3％，25d时出现大量丛生苗，且生长健壮。其中，丛生苗诱导培养基的配方为：MS+1.8mg/L 6-BA+0.5mg/L 2,4-D，pH 5.8；培养条件为：培养温度25℃，光照时间15h/d，光照强度1750Lx。
A3、生根培养：待丛生苗长至2cm高，将其切为单个苗直接转接至生根培养基中进行生根培养；如图2所示，培养7天后，可快速长出根，生根率100％。其中，生根培养基的配方为：1/2MS+0.3mg/L IBA，pH 5.8；培养条件为：培养温度25℃，光照时间15h/d，光照强度1750Lx。
A4、试管苗的炼苗移栽：通过逐步开盖的方式将步骤A3获得的试管苗放置在组培室内驯化一周，并将无菌水倒入相应培养瓶中以保持水分；一周过后，将试管苗取出，并将附着在试管苗根部的培养基清洗干净，接着将其移栽于灭菌处理好的培养基质(黑土：珍珠岩＝1:3)中；放其置于室内，浇透水，并用塑料薄膜覆盖在其周围，定期浇水，并保证一周后逐渐减少浇水次数；4d后将塑料薄膜逐步移开至完全拆除，7d后移出培养室，使其于自然光下进行生长。
实施例2
本实施例的一种重阳木的组培快繁方法，以重阳木带腋芽茎段为外植体，包括以下步骤：
A1、外植体的获得与消毒：实验材料来自于安徽省安庆市新官洲林场中具有较强耐水淹能力的优良单株；采摘新鲜的重阳木带腋芽茎段用洗衣粉冲洗0.5min、流水冲洗0.5h，接着于超净工作台中依次使用75％酒精迅速漂洗25s、无菌水冲洗3次、1％次氯酸钠浸泡4min，最后，再采用无菌水冲洗5次；冲洗完毕，用无菌吸水纸将叶片上的水分吸干备用。
A2、诱导培养：将吸干水分的重阳木带腋芽茎段于无菌条件下切成1cm2大小的切块，并分别接种至含丛生苗诱导培养基的培养瓶中进行丛生苗的诱导培养，每个培养瓶中接种1块茎段；培养至15d时，开始出现丛生苗，出苗率达83.3％，25d时出现大量丛生苗，且生长健壮。其中，丛生苗诱导培养基的配方为：MS+1.8mg/L 6-BA+0.5mg/L 2,4-D，pH 5.8；培养条件为：培养温度24℃，光照时间14h/d，光照强度1500Lx。
A3、生根培养：待丛生苗长至2cm高，将其切为单个苗直接转接至生根培养基中进行生根培养，7天后，可快速长出根，生根率100％。其中，生根培养基的配方为：1/2MS+0.3mg/L IBA，pH 5.8；培养条件为：培养温度24℃，光照时间14h/d，光照强度1500Lx。
A4、试管苗的炼苗移栽：通过逐步开盖的方式将步骤A3获得的试管苗放置在组培室内驯化一周，并将无菌水倒入相应培养瓶中以保持水分；一周过后，将试管苗取出，并将附着在试管苗根部的培养基清洗干净，接着将其移栽于灭菌处理好的培养基质(黑土：珍珠岩＝1:3)中；放其置于室内，浇透水，并用塑料薄膜覆盖在其周围，定期浇水，并保证一周后逐渐减少浇水次数；4d后将塑料薄膜逐步移开至完全拆除，7d后移出培养室，使其于自然光下进行生长。
实施例3
本实施例的一种重阳木的组培快繁方法，以重阳木带腋芽茎段为外植体，包括以下步骤：
A1、外植体的获得与消毒：实验材料来自于安徽省安庆市新官洲林场中具有较强耐水淹能力的优良单株；采摘新鲜的重阳木带腋芽茎段用洗衣粉冲洗1.5min、流水冲洗1.5h，接着于超净工作台中依次使用75％酒精迅速漂洗35s、无菌水冲洗5次、1％次氯酸钠浸泡6min，最后，再采用无菌水冲洗7次；冲洗完毕，用无菌吸水纸将叶片上的水分吸干备用。
A2、诱导培养：将吸干水分的重阳木带腋芽茎段于无菌条件下切成1cm2大小的切块，并分别接种至含丛生苗诱导培养基的培养瓶中进行丛生苗的诱导培养，每个培养瓶中接种1块茎段；培养至15d时，开始出现丛生苗，出苗率达83.3％，25d时出现大量丛生苗，且生长健壮。其中，丛生苗诱导培养基的配方为：MS+1.8mg/L 6-BA+0.5mg/L 2,4-D，pH 5.8；培养条件为：培养温度26℃，光照时间16h/d，光照强度2000Lx。
A3、生根培养：待丛生苗长至2cm高，将其切为单个苗直接转接至生根培养基中进行生根培养，7天后，可快速长出根，生根率100％。其中，生根培养基的配方为：1/2MS+0.3mg/L IBA，pH 5.8；培养条件为：培养温度26℃，光照时间16h/d，光照强度2000Lx。
A4、试管苗的炼苗移栽：通过逐步开盖的方式将步骤A3获得的试管苗放置在组培室内驯化一周，并将无菌水倒入相应培养瓶中以保持水分；一周过后，将试管苗取出，并将附着在试管苗根部的培养基清洗干净，接着将其移栽于灭菌处理好的培养基质(黑土：珍珠岩＝1:3)中；放其置于室内，浇透水，并用塑料薄膜覆盖在其周围，定期浇水，并保证一周后逐渐减少浇水次数；4d后将塑料薄膜逐步移开至完全拆除，7d后移出培养室，使其于自然光下进行生长。
实施例4
本实施例用以分析说明上述实施例1-3中的参数选择：
一、不同激素配比对重阳木带腋芽茎段出苗的影响
上述步骤A2中，丛生苗诱导培养基的组成为：MS、6-BA、2,4-D，现对不同激素配比下重阳木的出苗率进行统计，结果如表1所示。
表1不同激素配比对重阳木出苗的影响
| 6-BA(mg/L) | 2,4-D(mg/L) | 出苗率(％) |
| 2 | 0 | 7 |
| 2 | 0.5 | 75 |
| 2 | 1 | 47.6 |
| 1.8 | 0 | 9 |
| 1.8 | 0.5 | 83.3 |
| 1.8 | 1 | 25 |
| 1.6 | 0 | 13 |
| 1.6 | 0.5 | 80 |
| 1.6 | 1 | 24 |
| 1.4 | 0 | 13.33 |
| 1.4 | 0.5 | 20 |
| 1.4 | 1 | 15 |
结果分析：丛生苗诱导培养基配方中，当配比为“MS+1.8mg/L 6-BA+0.5mg/L 2,4-D”时，出苗率最高，达83.3％。
二、不同激素配比对重阳木生根的影响
上述步骤A3中，生根培养基的组成为：1/2MS、IBA，现对不同激素配比下重阳木的生根率进行统计，结果如表2所示。
表2不同激素配比对重阳木生根的影响
| IBA(mg/L) | 生根率(％) |
| 0.1 | 91.67 |
| 0.3 | 100 |
| 0.5 | 93.33 |
| 0.7 | 83.33 |
结果分析：生根培养基配方中，当配比为“1/2MS+0.3mg/L IBA”时，生根率最高，达100％。
以下实施例5-7为“以重阳木叶片为外植体时的重阳木组培快繁方法”。
实施例5
本实施例的一种重阳木的组培快繁方法，以重阳木叶片为外植体，包括以下步骤：
B1、外植体的获得与消毒：
①选取颗粒饱满的重阳木种子(于2018年11月采自安徽省安庆市新官洲林场，采回晾干后立即放置于4℃冰箱保存)，将其浸泡到无菌水4h，然后在超净工作台上用利用75％酒精迅速漂洗15s，重复3次，接着用4％次氯酸钠浸泡8min，最后用无菌水冲洗4次；冲洗完毕，用无菌吸水纸将种子上的水分吸干备用；
②将吸干水分的重阳木种子于无菌条件下接种至含无菌叶片培养基的培养瓶中进行无菌叶片的培养，每瓶接种3粒种子，3周后观察，共接60瓶，重复三次试验，并统计重阳木种子的发芽率及污染率，培养所得的重阳木无菌叶片即为目标所需的外植体重阳木叶片；其中，无菌叶片培养基的配方为：1/2MS，pH 5.8；培养条件为：培养温度25℃，光照时间15h/d，光照强度1750Lx；种子污染率(％)＝(污染种子数/接种种子总数)×100％；种子发芽率(％)＝(发芽的种子数/接种的种子总数)×100％。
B2、愈伤组织诱导：将长至1个月的重阳木无菌叶片于无菌条件下接种至愈伤组织诱导培养基中进行愈伤组织的诱导培养，如图3所示；25d后统计其愈伤组织诱导率及愈伤组织生长状况，并对其进行愈伤组织观察。其中，愈伤组织诱导培养基的配方为：MS+1.6mg/L 6-BA+1mg/L 2,4-D，pH 5.8；培养条件为：培养温度25℃，光照时间15h/d，光照强度1750Lx；诱导率(％)＝(出现愈伤组织叶片数/接种叶片总数)×100％。
B3、愈伤组织分化：挑选生长状况良好的愈伤组织，将其接种至分化培养基中进行愈伤组织分化培养，20d后观察愈伤组织分化的状况，如图4所示。其中，分化培养基的配方为：MS+1.6mg/L 6-BA+0.5mg/L 2,4-D，pH 5.8；培养条件为：培养温度25℃，光照时间15h/d，光照强度1750Lx；愈伤组织的分化率(％)＝(分化出不定芽的愈伤组织数/接种的愈伤组织总数×100％)。
B4、生根培养：选取生长健壮、出苗一致的芽苗，切除其基部的愈伤组织，将丛生芽基部的愈伤组织切除，分割为单个芽，再将单个芽转接至生根培养基中不定芽的生根培养，如图5所示；70d后观察统计其生根率和平均生根数情况。其中，生根培养基的配方为：1/2MS+0.3mg/L IBA，pH 5.8；培养条件为：培养温度25℃，光照时间15h/d，光照强度1750Lx；生根率(％)＝(生根苗数/接种苗总数)×100％。
B5、试管苗的炼苗移栽：通过逐步开盖的方式将步骤B4获得的试管苗放置在组培室内驯化一周，并将无菌水倒入相应培养瓶中以保持水分；一周过后，将试管苗取出，并将附着在试管苗根部的培养基清洗干净，接着将其移栽于灭菌处理好的培养基质(黑土：珍珠岩＝1:3)中；放其置于室内，浇透水，并用塑料薄膜覆盖在其周围，定期浇水，并保证一周后逐渐减少浇水次数；4d后将塑料薄膜逐步移开至完全拆除，7d后移出培养室，使其于自然光下进行生长，如图6所示。
实施例6
本实施例的一种重阳木的组培快繁方法，以重阳木叶片为外植体，包括以下步骤：
B1、外植体的获得与消毒：
①选取颗粒饱满的重阳木种子(于2018年11月采自安徽省安庆市新官洲林场，采回晾干后立即放置于4℃冰箱保存)，将其浸泡到无菌水3h，然后在超净工作台上用利用75％酒精迅速漂洗10s，重复2次，接着用4％次氯酸钠浸泡7min，最后用无菌水冲洗3次；冲洗完毕，用无菌吸水纸将种子上的水分吸干备用；
②将吸干水分的重阳木种子于无菌条件下接种至含无菌叶片培养基的培养瓶中进行无菌叶片的培养，每瓶接种3粒种子，3周后观察，共接60瓶，重复三次试验，并统计重阳木种子的发芽率及污染率，培养所得的重阳木无菌叶片即为目标所需的外植体重阳木叶片；其中，无菌叶片培养基的配方为：1/2MS，pH 5.8；培养条件为：培养温度24℃，光照时间14h/d，光照强度1500Lx。
B2、愈伤组织诱导：将长至1个月的重阳木无菌叶片于无菌条件下接种至愈伤组织诱导培养基中进行愈伤组织的诱导培养；25d后统计其愈伤组织诱导率及愈伤组织生长状况，并对其进行愈伤组织观察。其中，愈伤组织诱导培养基的配方为：MS+1.6mg/L 6-BA+1mg/L 2,4-D，pH 5.8；培养条件为：培养温度24℃，光照时间14h/d，光照强度1500Lx。
B3、愈伤组织分化：挑选生长状况良好的愈伤组织，将其接种至分化培养基中进行愈伤组织分化培养，20d后观察愈伤组织分化的状况。其中，分化培养基的配方为：MS+1.6mg/L 6-BA+0.5mg/L 2,4-D，pH 5.8；培养条件为：培养温度24℃，光照时间14h/d，光照强度1500Lx。
B4、生根培养：选取生长健壮、出苗一致的芽苗，切除其基部的愈伤组织，将丛生芽基部的愈伤组织切除，分割为单个芽，再将单个芽转接至生根培养基中培养，70d后观察统计其生根率和平均生根数情况。其中，生根培养基的配方为：1/2MS+0.3mg/L IBA，pH 5.8；培养条件为：培养温度24℃，光照时间14h/d，光照强度1500Lx。
B5、试管苗的炼苗移栽：通过逐步开盖的方式将步骤B4获得的试管苗放置在组培室内驯化一周，并将无菌水倒入相应培养瓶中以保持水分；一周过后，将试管苗取出，并将附着在试管苗根部的培养基清洗干净，接着将其移栽于灭菌处理好的培养基质(黑土：珍珠岩＝1:3)中；放其置于室内，浇透水，并用塑料薄膜覆盖在其周围，定期浇水，并保证一周后逐渐减少浇水次数；4d后将塑料薄膜逐步移开至完全拆除，7d后移出培养室，使其于自然光下进行生长。
实施例7
本实施例的一种重阳木的组培快繁方法，以重阳木叶片为外植体，包括以下步骤：
B1、外植体的获得与消毒：
①选取颗粒饱满的重阳木种子(于2018年11月采自安徽省安庆市新官洲林场，采回晾干后立即放置于4℃冰箱保存)，将其浸泡到无菌水5h，然后在超净工作台上用利用75％酒精迅速漂洗20s，重复4次，接着用4％次氯酸钠浸泡9min，最后用无菌水冲洗5次；冲洗完毕，用无菌吸水纸将种子上的水分吸干备用；
②将吸干水分的重阳木种子于无菌条件下接种至含无菌叶片培养基的培养瓶中进行无菌叶片的培养，每瓶接种3粒种子，3周后观察，共接60瓶，重复三次试验，并统计重阳木种子的发芽率及污染率，培养所得的重阳木无菌叶片即为目标所需的外植体重阳木叶片；其中，无菌叶片培养基的配方为：1/2MS，pH 5.8；培养条件为：培养温度26℃，光照时间16h/d，光照强度2000Lx。
B2、愈伤组织诱导：将长至1个月的重阳木无菌叶片于无菌条件下接种至愈伤组织诱导培养基中进行愈伤组织的诱导培养；25d后统计其愈伤组织诱导率及愈伤组织生长状况，并对其进行愈伤组织观察。其中，愈伤组织诱导培养基的配方为：MS+1.6mg/L 6-BA+1mg/L 2,4-D，pH 5.8；培养条件为：培养温度26℃，光照时间16h/d，光照强度2000Lx。
B3、愈伤组织分化：挑选生长状况良好的愈伤组织，将其接种至分化培养基中进行愈伤组织分化培养，20d后观察愈伤组织分化的状况。其中，分化培养基的配方为：MS+1.6mg/L 6-BA+0.5mg/L 2,4-D，pH 5.8；培养条件为：培养温度26℃，光照时间16h/d，光照强度2000Lx。
B4、生根培养：选取生长健壮、出苗一致的芽苗，切除其基部的愈伤组织，将丛生芽基部的愈伤组织切除，分割为单个芽，再将单个芽转接至生根培养基中培养，70d后观察统计其生根率和平均生根数情况。其中，生根培养基的配方为：1/2MS+0.3mg/L IBA，pH 5.8；培养条件为：培养温度26℃，光照时间16h/d，光照强度2000Lx。
B5、试管苗的炼苗移栽：通过逐步开盖的方式将步骤B4获得的试管苗放置在组培室内驯化一周，并将无菌水倒入相应培养瓶中以保持水分；一周过后，将试管苗取出，并将附着在试管苗根部的培养基清洗干净，接着将其移栽于灭菌处理好的培养基质(黑土：珍珠岩＝1:3)中；放其置于室内，浇透水，并用塑料薄膜覆盖在其周围，定期浇水，并保证一周后逐渐减少浇水次数；4d后将塑料薄膜逐步移开至完全拆除，7d后移出培养室，使其于自然光下进行生长。
实施例8
本实施例用以分析说明上述实施例5-7中的参数选择：
一、不同消毒组合对种子污染及出芽率的影响
验选取1％HgCl2、4％次氯酸钠为消毒剂，一共6个处理组合，分别为A：1％HgCl2处理2min；B：1％HgCl2处理5min；C：1％HgCl2处理8min；D：4％次氯酸钠处理8min；E：4％次氯酸钠处理9min；F：4％次氯酸钠处理10min。6种组合中，每组需要30粒重阳木种子，每个培养瓶中接种3粒重阳木种子，每组接种10瓶，重复三次试验。
3周后统计不同消毒组合处理后种子的污染率，如表3；根据表3可以看出，消毒效果最好的是C和F，平均染菌率为6％；其次是B和F，污染率为10％；A平均污染率最高，为20％。D处理组合消毒效果最佳。
将上述处理好的种子，接入1/2MS，PH5.8的培养基中，经统计不同消毒组合处理后种子发芽率，如表4；根据表4可以看出，D组发芽率最高，平均发芽率为90％；其次是F组，平均发芽率为76.7％；B组发芽率为73.3％。综合考虑污染率及发芽率，D组消毒方式最佳，即用4％次氯酸钠处理8min。
表3不同消毒组合处理后对种子污染率的影响
表4不同消毒组合处理后对种子发芽率的影响
| 处理组合 | 接种种子数/个 | 发芽种子数/个 | 出芽率/％ |
| A | 30 | 20 | 66.7 |
| B | 30 | 22 | 73.3 |
| C | 30 | 24 | 80 |
| D | 30 | 27 | 90 |
| E | 30 | 24 | 80 |
| F | 30 | 23 | 76.7 |
二、不同激素配比对愈伤组织诱导的影响
对叶片诱导愈伤试验有两个因子，分别为培养基6-BA与2,4-D，如表5。其基本培养基为MS，一共处理了18种浓度组合，6-BA浓度有1.0mg/L、1.2mg/L、1.4mg/L、1.6mg/L、1.8mg/L、2.0mg/L；2,4-D浓度有0mg/L、0.5mg/L、1mg/L，以重阳木叶片为外植体培养7d时，叶片边缘开始卷曲并出现少量的愈伤组织，15d时，出现明显愈伤组织，25d时，出现大量黄绿色愈伤组织，激素组合MS+1.6mg/L6-BA+1mg/L2,4-D，出愈率可达95％。
表5不同激素配比对重阳木叶片愈伤组织的影响
三、不同激素配比对愈伤组织分化的影响
选取黄绿色疏松的愈伤组织，转接到不同分化培养基中，激素配比方式与愈伤诱导时一致，20d观察时有的培养基上可见在黄绿色的愈伤组织颗粒的上部出现绿色的小芽点，35d观察并统计,结果如表6。统计可以发现，在6-BA为1.6mg/L，2,4-D为0.5mg/L的培养基上，不仅不定芽的数量最多，不定芽的长势也是最好的，大多呈现丛生状、叶片伸展、茎较粗壮。进行了三次重复试验，实验结果基本一致，此时的激素组合为MS+1.6mg/L6-BA+0.5mg/L2,4-D，为愈伤分化的适宜培养基。
表6不同激素配比对愈伤组织分化的影响
| 6-BA(mg/L) | 2,4-D(mg/L) | 分化率(％) |
| 1 | 0 | 0 |
| 1 | 0.5 | 0 |
| 1 | 1 | 0 |
| 1.2 | 0 | 0 |
| 1.2 | 0.5 | 0 |
| 1.2 | 1 | 0 |
| 1.4 | 0 | 0 |
| 1.4 | 0.5 | 30 |
| 1.4 | 1 | 16.67 |
| 1.6 | 0 | 0 |
| 1.6 | 0.5 | 86.67 |
| 1.6 | 1 | 13.33 |
| 1.8 | 0 | 0 |
| 1.8 | 0.5 | 75 |
| 1.8 | 1 | 18.33 |
| 2 | 0 | 0 |
| 2 | 0.5 | 53.33 |
| 2 | 1 | 15 |
四、不同激素配比对不定芽生根的影响
选择茎较粗壮、生长旺盛的不定芽切开转接至有不同浓度的IBA培养基中，其基本培养基均为1/2MS培养基，IBA的浓度有0.1mg/L、0.3mg/L、0.5mg/L、0.7mg/L，一周即可开始萌动生根，10d后开始观察生根情况，3次重复试验，统计结果见表7；表7表明，生根率在浓度为0.3mg/L时最高，且根系较粗壮，平均生根率为100％；当IBA浓度为0.1mg/L时须根较多，但随着IBA浓度的达到0.5mg/L与0.7mg/L时，不定芽的生根率和平均生根数均下降，这说明当IBA的浓度过高时对不定芽根的诱导有一定的抑制作用。因此，综合考虑不定芽的诱导生根率以及平均生根数两种因素，不定芽的诱导生根培养基组合为1/2MS+0.3mg/L IBA。
表7不同激素配比对不定芽生根的影响
| IBA(mg/L) | 生根率(％) |
| 0.1 | 91.67 |
| 0.3 | 100 |
| 0.5 | 93.33 |
| 0.7 | 83.33 |
五、试管苗的炼苗与移栽
将试管苗在无菌组培室进行初期炼苗时发现，水分缺失非常快，所以采取了逐步在开盖的组培瓶中加入无菌水，以保持试管苗正常生长所需的水分。再将试管苗取出培养基时，尽量减少对根部的伤害，用流水将其基部残留的培养基全部冲洗干净，再转移至培养基质中。前期生长较缓慢，但移植时根系较发达的重阳木试管苗生长旺盛。
六、讨论
上述试验采用了常用的以叶片作为外植体，经过脱分化形成愈伤组织的，进一步再分化形成芽苗的试验方法。在本试验初期，是选用室外的重阳木叶片进行消毒，再进行愈伤诱导，但在消毒的过程中，对叶片有一定的损伤，此时，正好在11月份，即重阳木种子收获的时节，我们尝试通过种子消毒无菌培养，诱导发芽获得无菌苗；结果发现，能有效地避免了消毒过程中对叶片的损伤，进一步有效避免了不同叶片的损伤程度不同对其愈伤组织诱导的影响。叶片诱导的愈伤组织的生长状态对后期愈伤分化芽苗的影响较大，筛选出合适的愈伤组织诱导培养基相当重要，对后期能否成功诱导出芽苗十分重要。此外，众所周知，基本培养基主要分为有机物和无机物两大类，本试验所选用得MS基本培养基，均为实验室内部现配现用的，其钾盐、铵盐及硝酸盐含量均较高，微量元素种类齐全，养分数量及其比例均比较适合重阳木叶片的诱导愈伤分化芽苗。然而，基本培养基只能满足外植体的生存和最低的生理活动，只有加入适当的外源物质后才能诱导细胞分裂的启动、愈伤组织的形成以及外植体的分化等变化，在进行叶片诱导愈伤时生长素调节剂对其至关重要，后期进行愈伤分化时，应适当增加细胞分裂素所占的比重，经过试验分析，本试验是通过降低生长素2,4-二氯苯氧乙酸的量从而增加6-苄氨基嘌呤作为细胞分裂素的比重，来诱导愈伤分化。试验发现在植物组织培养过程中，植物生长调节剂虽用量极少，但对于组织的生长发育起着十分关键的作用。在炼苗移栽过程中，前期逐步开盖的方法能够缓解污染问题，逐步加入无菌水也可以缓解水分缺失的问题，转移至营养土中栽培的初期用薄膜覆盖，同样有效地避免了水分消耗太快的问题。
最终通过本试验的筛选得出在重阳木叶片组织培养快繁中，以叶片作为外植体时，最佳处理方式为1％次氯酸钠处理5min，通过种子来获得无菌苗的方式，种子最佳处理方式用4％次氯酸钠处理8min。适宜的愈伤诱导培养基为MS+1.6mg/L 6-BA+1mg/L 2,4-D，愈伤分化培养基为MS+1.6mg/L 6-BA+0.5mg/L 2,4-D，生根培养基为1/2MS+0.3mg/L IBA。成熟稳定的重阳木叶片快繁体系不仅可以降低生产成本，还可提高生产效益，是今后工厂化生产的必要条件，同时也是对重阳木优良种质保存的一种重要途径，具有很好的市场及产业化应用前景。
此外，还需说明的是，本发明所采用的MS培养基与1/2MS为本领域常规培养基，MS培养基的配方见表8。
表8 MS培养基配方
注：1/2MS培养基为MS培养基大量元素减半即可。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种重阳木的组培快繁方法，其特征在于，以重阳木带腋芽茎段或重阳木叶片为外植体进行组织培养繁育；
其中，当外植体为重阳木带腋芽茎段时，具体的培养繁育步骤如下：
A1、外植体的获得与消毒：采摘新鲜的重阳木带腋芽茎段用洗衣粉冲洗1min、流水冲洗1h，接着于超净工作台中依次使用75％酒精漂洗30s、无菌水冲洗4次、1％次氯酸钠浸泡5min，最后，再采用无菌水冲洗6次；冲洗完毕，用无菌吸水纸将叶片上的水分吸干备用；
A2、诱导培养：将吸干水分的重阳木带腋芽茎段于无菌条件下切块，并分别接种至丛生苗诱导培养基中进行丛生苗的诱导培养；其中，丛生苗诱导培养基的配方为：MS+1.8mg/L6-BA+0.5mg/L 2,4-D，pH 5.8；
A3、生根培养：将培养所得的丛生苗切为单个苗直接转接至生根培养基中进行生根培养；其中，生根培养基的配方为：1/2MS+0.3mg/L IBA，pH 5.8；
当外植体为重阳木叶片时，具体的培养繁育步骤如下：
B1、外植体的获得与消毒：
①选取颗粒饱满的重阳木种子，将其浸泡到无菌水4h，然后在超净工作台上用利用75％酒精迅速漂洗15s，重复3次，接着用4％次氯酸钠浸泡8min，最后用无菌水冲洗4次；冲洗完毕，用无菌吸水纸将种子上的水分吸干备用；
②将吸干水分的重阳木种子于无菌条件下接种至无菌叶片培养基中进行无菌叶片的培养，培养所得的重阳木无菌叶片即为目标所需的外植体重阳木叶片；其中，无菌叶片培养基的配方为：1/2MS，pH 5.8；
B2、愈伤组织诱导：将获得的重阳木无菌叶片于无菌条件下接种至愈伤组织诱导培养基中进行愈伤组织的诱导培养；其中，愈伤组织诱导培养基的配方为：MS+1.6mg/L 6-BA+1mg/L 2,4-D，pH 5.8；
B3、愈伤组织分化：挑选愈伤组织，将其接种至分化培养基中进行愈伤组织分化培养；其中，分化培养基的配方为：MS+1.6mg/L 6-BA+0.5mg/L 2,4-D，pH 5.8；
B4、生根培养：选取出苗一致的芽苗，切除其基部的愈伤组织，将丛生芽基部的愈伤组织切除，分割为单个芽，再将单个芽转接至生根培养基中培养，其中，生根培养基的配方为：1/2MS+0.3mg/L IBA，pH 5.8。
2.根据权利要求1所述的重阳木的组培快繁方法，其特征在于，所述步骤A2中，将吸干水分的重阳木带腋芽茎段于无菌条件下切成1cm2大小的切块，并分别接种至含丛生苗诱导培养基的培养瓶中进行丛生苗的诱导培养，每个培养瓶中接种1块茎段。
3.根据权利要求1所述的重阳木的组培快繁方法，其特征在于，所述步骤A2和步骤A3中，诱导培养与生根培养的具体培养条件为：培养温度(25±1)℃，光照时间14-16h/d，光照强度1500-2000Lx。
4.根据权利要求1所述的重阳木的组培快繁方法，其特征在于，所述步骤A2中，培养至15d时，开始出现丛生苗，出苗率达83.3％。
5.根据权利要求1所述的重阳木的组培快繁方法，其特征在于，所述步骤A3中，待丛生苗长至2cm高，将其切为单个苗转移到生根培养基中培养，7天后，开始出根，生根率100％。
6.根据权利要求1所述的重阳木的组培快繁方法，其特征在于，所述步骤B1中，将吸干水分的重阳木种子于无菌条件下接种至含无菌叶片培养基的培养瓶中进行无菌叶片的培养，每瓶接种3粒种子，3周后观察，共接60瓶，重复三次试验，并统计重阳木种子的发芽率及污染率。
7.根据权利要求1所述的重阳木的组培快繁方法，其特征在于，所述步骤B1、步骤B2、步骤B3和步骤B4中，具体的培养条件为：培养温度(25±1)℃，光照时间14-16h/d，光照强度1500-2000Lx。
8.根据权利要求1-7任一所述的重阳木的组培快繁方法，其特征在于，所述步骤A3与步骤B4后还分别包括“试管苗的炼苗移栽”步骤：
通过逐步开盖的方式将步骤A3或步骤B4获得的试管苗放置在组培室内驯化一周，并将无菌水倒入相应培养瓶中以保持水分；一周过后，将试管苗取出，并将附着在试管苗根部的培养基清洗干净，接着将其移栽于灭菌处理好的培养基质中；放其置于室内，浇透水，并用塑料薄膜覆盖在其周围，定期浇水，并保证一周后减少浇水次数；4d后将塑料薄膜移开至完全拆除，7d后移出培养室，使其于自然光下进行生长；其中，所述培养基质的具体组成为黑土：珍珠岩＝1:3。
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