CN101849504A - 大型丛生竹愈伤组织诱导与植株再生高效培养基及其培养方法 - Google Patents

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曹颖
陈珂
周建英
段宁
卢学琴
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胡尚连
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Abstract

本发明涉及一种适用于慈竹和绵竹等大型丛生竹的培养基和培养方法，具体为大型丛生竹愈伤组织诱导与植株再生高效培养基及其培养方法。大型丛生竹愈伤组织诱导与植株再生高效培养基，包括MS培养基和愈伤组织诱导与植株再生高效培养基，其特征在于：MS培养基按照以下原料制成：a)大量元素：硝酸钾、硝酸铵、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钙；b)微量元素：碘化钾、硼酸、硫酸锰、硫酸锌、钼酸钠、硫酸铜、氯化钴；c)有机成分：肌醇、甘氨酸、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、烟酸；d)铁盐：乙二胺四乙酸二钠、硫酸亚铁。

Description

大型丛生竹愈伤组织诱导与植株再生高效培养基及其培养方法
技术领域
本发明涉及一种适用于慈竹和绵竹等大型丛生竹的培养基和培养方法，具体为大型丛生竹愈伤组织诱导与植株再生高效培养基及其培养方法。
背景技术
目前国内外对竹子的运用范围较多，尤其是用于做纸浆的大型丛生竹，所以对竹子的需求量较大，但是培养大型丛生竹尤其是纸浆用竹时就出现了问题，以往竹的组织培养研究多集中在观赏竹的快繁上，大型丛生竹尤其是纸浆用竹的愈伤组织诱导和植株再生难以培养，目前的国内外相关的资料上均未见报道。
发明内容
本发明正是针对以上技术问题，提供一种适用于大型纸浆用竹的体细胞无性系变异、品种改良及利用基因工程技术进行外源基因的遗传转化的大型丛生竹愈伤组织诱导与植株再生高效培养基及其培养方法。
本发明的具体技术方案如下：
大型丛生竹愈伤组织诱导与植株再生高效培养基，包括MS培养基和愈伤组织诱导与植株再生高效培养基，MS培养基按照以下原料制成：
a)大量元素(mg/L)：硝酸钾(KNO3)1900、硝酸铵(NH4NO3)1650、磷酸二氢钾(KH2PO4)170、硫酸镁(MgSO4.7H2O)370、氯化钙(CaCl2.2H2O)440
b)微量元素(mg/L)：碘化钾(KI)0.83、硼酸(H3BO3)6.2、硫酸锰(MnSO4.4H2O)22.3、硫酸锌(ZnSO4.7 H2O)8.6、钼酸钠(Na2MoO4.2 H2O)0.25、硫酸铜(CuSO4.5 H2O)0.025、氯化钴(CoCl2)0.025
c)有机成分(mg/L)：肌醇100、甘氨酸2、盐酸硫胺素(VB1)0.1、盐酸吡哆醇(VB6)0.5、烟酸(VB5或VPP)0.5
d)铁盐(mg/L)：乙二胺四乙酸二钠(Na2.EDTA)37.3、硫酸亚铁(FeSO24.7H2O)27.8
愈伤组织诱导与植株再生高效培养基配方，按照以下成分组成：
a)主培养基：MS基本培养基+KT 2mg/L+IBA 0.4mg/L+2，4，5-T 2mg/L
b)A培养基(快速分化培养基)：MS基本培养基+KT 2.5mg/L+IAA0.5mg/L
c)B培养基(快速生根培养基)：MS基本培养基+IAA 0.25mg/L+IBA 0.4mg/LMS培养基要求PH 5.6-6.0，蔗糖30％，琼脂7g/L。
大型丛生竹愈伤组织诱导与植株再生高效培养基的制备方法，包括以下步骤：
a)母液的配置：母液1(50×大量元素)
500ml母液称取：41.25g NH4NO3、47.5g KNO3、4.25g KH2PO4、9.25g MgSO4·7H2O
母液2(100×)250ml母液称取：11g CaCl2·2H2O
母液3：(棕色瓶)250ml母液(100×)695mg FeSO4·7H2O、932.5mg
Na2-EDTA
分别溶解，每个试剂溶于120ml水，用电炉或微波炉加热，再混合定容，
母液4(100×微量元素)，
250ml母液称取557.5mg MnSO4·4H2O、215mg ZnSO4·7H2O、205mgH3BO4、20.75mg KI、6.25mg Na2MoO4·2H2O、0.625mg CuSO4·5H2O、0.625mgCoCl2·6H2O
母液5(1000×)100ml母液称取：10mg硫胺酸B1、50mg吡哆醇B6、50mg烟酸、200mg甘氨酸
b)激素的配置：
1mg/ml 2，4，5-T：称取10mg 2，4，5-T于干燥的容器内，加入无水乙醇至完全溶解，用蒸馏水定容至10ml；
1mg/ml NAA或IAA：称取10mg NAA或IAA于干燥的容器内，逐滴加入无水乙醇，至完全溶解。用蒸馏水定容至10ml；
1mg/ml KT：称取10mg KT于干燥的容器内，逐滴加入1M的HCl.至完全溶解，用蒸馏水定容至10ml；
c)NaOH、HCl溶液的配置：
配置100ml 5N NaOH、4N HCl用于调节PH值：20g NaOH定容至100ml的蒸馏水中，34.48ml HCl定容至100ml的蒸馏水中；
d)MS溶液的混合
配制MS培养基时，每1000ml培养基取：20ml母液1、10ml母液2、10ml母液3、10ml母液4、1ml母液5。分别依次加入到800ml蒸馏水中，混匀后加入30g蔗糖定溶至1000ml，用5N NaOH调PH到5.6-6.0；
e)添加激素
主培养基：每1000ml MS培养基中加入2ml KT(1mg/ml)+0.4ml IBA(1mg/ml)+2ml 2，4，5-T(1mg/ml)
A培养基：每1000ml MS培养基中加入2.5ml KT(1mg/ml)+0.5mlIAA(1mg/ml)
B培养基：每1000ml MS培养基中加入0.4ml IBA(1mg/ml)+0.25mlIAA(1mg/ml)
琼脂粉为0.8％，即每1000ml MS培养基中8g琼脂粉，加热溶解后分装至50ml三角瓶内；
f)高压灭菌：121度下灭菌15分钟，放置1-2天后备用；
g)外植体消毒：将竹种子洗净泡胀12小时，在超净台中用70％乙醇浸泡30s，无菌水冲洗三次，0.1％升汞浸泡30min，期间不断震荡，再用无菌水冲洗5-6次；
h)愈伤组织诱导：取胚接种于愈伤组织培养基中，暗培养7-10天后转移至光照下。12h.d-1光照条件下进行，光照强度2000lx，温度25-26℃。愈伤组织诱导同时可发生芽分化和植株再生。为加速芽分化，可将有芽点的愈伤转入快速分化培养基(A培养基)。该培养基也可以诱导无芽点的胚性愈伤组织分化成苗；
i)生根、壮苗与移栽：愈伤组织分化丛芽在B培养基上生根培养1-2周后，取出小苗在自来水下洗净根部的培养基，然后栽植到灭菌的介质中〔土∶蛭石∶泥炭土(质量比)＝1∶1∶1〕，遮荫散射光照射。
本发明的技术效果表现在：无需添加谷氨酰胺、水解酪蛋白等有机成分，可在一种培养基上完成愈伤组织诱导和植株再生全过程，还可加速芽的分化和生根。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明
实施例：
大型丛生竹愈伤组织诱导与植株再生高效培养基，包括MS培养基和愈伤组织诱导与植株再生高效培养基，MS培养基按照以下原料制成：
a)大量元素(mg/L)：硝酸钾(KNO3)1900、硝酸铵(NH4NO3)1650、磷酸二氢钾(KH2PO4)170、硫酸镁(MgSO4.7H2O)370、氯化钙(CaCl2.2H2O)440
b)微量元素(mg/L)：碘化钾(KI)0.83、硼酸(H3BO3)6.2、硫酸锰(MnSO4.4H2O)22.3、硫酸锌(ZnSO4.7 H2O)8.6、钼酸钠(Na2MoO4.2 H2O)0.25、硫酸铜(CuSO4.5 H2O)0.025、氯化钴(CoCl2)0.025
c)有机成分(mg/L)：肌醇100、甘氨酸2、盐酸硫胺素(VB1)0.1、盐酸吡哆醇(VB6)0.5、烟酸(VB5或VPP)0.5
d)铁盐(mg/L)：乙二胺四乙酸二钠(Na2.EDTA)37.3、硫酸亚铁(FeSO24.7H2O)27.8
愈伤组织诱导与植株再生高效培养基配方，按照以下成分组成：
a)主培养基：MS基本培养基+KT 2mg/L+IBA 0.4mg/L+2，4，5-T 2mg/L
b)A培养基(快速分化培养基)：MS基本培养基+KT 2.5mg/L+IAA0.5mg/L
c)B培养基(快速生根培养基)：MS基本培养基+IAA 0.25mg/L+IBA 0.4mg/LMS培养基要求PH 5.6-6.0，蔗糖30％，琼脂7g/L。
大型丛生竹愈伤组织诱导与植株再生高效培养基的制备方法，包括以下步骤：
a)母液的配置：母液1(50×大量元素)
500ml母液称取：41.25g NH4NO3、47.5g KNO3、4.25g KH2PO4、9.25g MgSO4·7H2O
母液2(100×)250ml母液称取：11g CaCl2·2H2O
母液3：(棕色瓶)250ml母液(100×)695mg FeSO4·7H2O、932.5mg
Na2-EDTA
分别溶解，每个试剂溶于120ml水，用电炉或微波炉加热，再混合定容，母液4(100×微量元素)，
250ml母液称取557.5mg MnSO4·4H2O、215mg ZnSO4·7H2O、205mgH3BO4、20.75mg KI、6.25mg Na2MoO4·2H2O、0.625mg CuSO4·5H2O、0.625mgCoCl2·6H2O
母液5(1000×)100ml母液称取：10mg硫胺酸B1、50mg吡哆醇B6、50mg烟酸、200mg甘氨酸
b)激素的配置：
1mg/ml 2，4，5-T：称取10mg 2，4，5-T于干燥的容器内，加入无水乙醇至完全溶解，用蒸馏水定容至10ml；
1mg/ml NAA或IAA：称取10mg NAA或IAA于干燥的容器内，逐滴加入无水乙醇，至完全溶解。用蒸馏水定容至10ml；
1mg/ml KT：称取10mg KT于干燥的容器内，逐滴加入1M的HCl.至完全溶解，用蒸馏水定容至10ml；
c)NaOH、HCl溶液的配置：
配置100ml 5N NaOH、4N HCl用于调节PH值：20g NaOH定容至100ml的蒸馏水中，34.48ml HCl定容至100ml的蒸馏水中；
d)MS溶液的混合
配制MS培养基时，每1000ml培养基取：20ml母液1、10ml母液2、10ml母液3、10ml母液4、1ml母液5，分别依次加入到800ml蒸馏水中，混匀后加入30g蔗糖定溶至1000ml，用5N NaOH调PH到5.6-6.0；
e)添加激素
主培养基：每1000ml MS培养基中加入2ml KT(1mg/ml)+0.4ml IBA(1mg/ml)+2ml 2，4，5-T(1mg/ml)
A培养基：每1000ml MS培养基中加入2.5ml KT(1mg/ml)+0.5mlIAA(1mg/ml)
B培养基：每1000ml MS培养基中加入0.4ml IBA(1mg/ml)+0.25mlIAA(1mg/ml)
琼脂粉为0.8％，即每1000ml MS培养基中8g琼脂粉，加热溶解后分装至50ml三角瓶内；
f)高压灭菌：121度下灭菌15分钟，放置1-2天后备用；
g)外植体消毒：将竹种子洗净泡胀12小时，在超净台中用70％乙醇浸泡30s，无菌水冲洗三次，0.1％升汞浸泡30min，期间不断震荡，再用无菌水冲洗5-6次；
h)愈伤组织诱导：取胚接种于愈伤组织培养基中，暗培养7-10天后转移至光照下。12h.d-1光照条件下进行，光照强度2000lx，温度25-26℃。愈伤组织诱导同时可发生芽分化和植株再生。为加速芽分化，可将有芽点的愈伤转入快速分化培养基(A培养基)。该培养基也可以诱导无芽点的胚性愈伤组织分化成苗；
i)生根、壮苗与移栽：愈伤组织分化丛芽在B培养基上生根培养1-2周后，取出小苗在自来水下洗净根部的培养基，然后栽植到灭菌的介质中(土∶蛭石∶泥炭土(质量比)＝1∶1∶1)，遮荫散射光照射。
培养基组成以MS为基本培养基，添加特定的3种激素，无需添加谷氨酰胺、水解酪蛋白等有机成分，可在一种培养基上完成愈伤组织诱导和植株再生全过程，愈伤组织的诱导率可达90％，从愈伤组织诱导至再生苗的形成仅需40-60天。提供了A、B两种附加培养基可加速芽的分化和生根，可以适用于大型纸浆用竹的体细胞无性系变异、品种改良及利用基因工程技术进行外源基因的遗传转化等。

Claims (4)

1.大型丛生竹愈伤组织诱导与植株再生高效培养基，包括MS培养基和愈伤组织诱导与植株再生高效培养基，其特征在于：MS培养基按照以下原料制成：
a)大量元素(mg/L)：硝酸钾(KN03)1900、硝酸铵(NH4NO3)1650、磷酸二氢钾(KH2PO4)170、硫酸镁(MgSO4.7H2O)370、氯化钙(CaCl2.2H2O)440
b)微量元素(mg/L)：碘化钾(KI)0.83、硼酸(H3BO3)6.2、硫酸锰(MnSO4.4H2O)22.3、硫酸锌(ZnSO4.7 H2O)8.6、钼酸钠(Na2MoO4.2 H2O)0.25、硫酸铜(CuSO4.5 H2O)0.025、氯化钴(CoCl2)0.025
c)有机成分(mg/L)：肌醇100、甘氨酸2、盐酸硫胺素(VB1)0.1、盐酸吡哆醇(VB6)0.5、烟酸(VB5或VPP)0.5
d)铁盐(mg/L)：乙二胺四乙酸二钠(Na2.EDTA)37.3、硫酸亚铁(FeSO24.7H2O)27.8。
2.根据权利要求1所述的愈伤组织诱导与植株再生高效培养基配方，其特征在于按照以下成分组成：
a)主培养基：MS基本培养基+KT 2mg/L+IBA 0.4mg/L+2，4，5-T 2mg/L
b)A培养基(快速分化培养基)：MS基本培养基+KT 2.5mg/L+IAA0.5mg/L
c)B培养基(快速生根培养基)：MS基本培养基+IAA 0.25mg/L+IBA 0.4mg/L。
3.根据权利要求1所述的MS培养基，其特征在于：MS培养基要求PH 5.6-6.0，蔗糖30％，琼脂7g/L。
4.大型丛生竹愈伤组织诱导与植株再生高效培养基的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
a)母液的配置：母液1(50×大量元素)
500ml母液称取：41.25g NH4NO3、47.5g KNO3、4.25g KH2PO4、9.25g MgSO4·7H2O
母液2(100×)250ml母液称取：11g CaCl2·2H2O
母液3：(棕色瓶)250ml母液(100×)695mg FeSO4·7H2O、932.5mg
Na2-EDTA
分别溶解，每个试剂溶于120ml水，用电炉或微波炉加热，再混合定容，
母液4(100×微量元素)，
250ml母液称取557.5mg MnSO4·4H2O、215mg ZnSO4·7H2O、205mgH3BO4、20.75mg KI、6.25mg Na2MoO4·2H2O、0.625mg CuSO4·5H2O、0.625mgCoCl2·6H2O
母液5(1000×)100ml母液称取：10mg硫胺酸B1、50mg吡哆醇B6、50mg烟酸、200mg甘氨酸
b)激素的配置：
1mg/ml 2，4，5-T：称取10mg 2，4，5-T于干燥的容器内，加入无水乙醇至完全溶解，用蒸馏水定容至10ml；
1mg/ml NAA或IAA：称取10mg NAA或IAA于干燥的容器内，逐滴加入无水乙醇，至完全溶解。用蒸馏水定容至10ml；
1mg/ml KT：称取10mg KT于干燥的容器内，逐滴加入1M的HCl.至完全溶解，用蒸馏水定容至10ml；
c)NaOH、HCl溶液的配置：
配置100ml 5N NaOH、4N HCl用于调节PH值：20g NaOH定容至100ml的蒸馏水中，34.48ml HCl定容至100ml的蒸馏水中；
d)MS溶液的混合
配制MS培养基时，每1000ml培养基取：20ml母液1、10ml母液2、10ml母液3、10ml母液4、1ml母液5。分别依次加入到800ml蒸馏水中，混匀后加入30g蔗糖定溶至1000ml，用5N NaOH调PH到5.6-6.0；
e)添加激素
主培养基：每1000ml MS培养基中加入2ml KT(1mg/ml)+0.4ml IBA(1mg/ml)+2ml 2，4，5-T(1mg/ml)
A培养基：每1000ml MS培养基中加入2.5ml KT(1mg/ml)+0.5mlIAA(1mg/ml)
B培养基：每1000ml MS培养基中加入0.4ml IBA(1mg/ml)+0.25mlIAA(1mg/ml)
琼脂粉为0.8％，即每1000ml MS培养基中8g琼脂粉，加热溶解后分装至50ml三角瓶内；
f)高压灭菌：121度下灭菌15分钟，放置1-2天后备用；
g)外植体消毒：将竹种子洗净泡胀12小时，在超净台中用70％乙醇浸泡30s，无菌水冲洗三次，0.1％升汞浸泡30min，期间不断震荡，再用无菌水冲洗5-6次；
h)愈伤组织诱导：取胚接种于愈伤组织培养基中，暗培养7-10天后转移至光照下。12h.d-1光照条件下进行，光照强度2000lx，温度25-26℃。愈伤组织诱导同时可发生芽分化和植株再生。为加速芽分化，可将有芽点的愈伤转入快速分化培养基(A培养基)。该培养基也可以诱导无芽点的胚性愈伤组织分化成苗；
i)生根、壮苗与移栽：愈伤组织分化丛芽在B培养基上生根培养1-2周后，取出小苗在自来水下洗净根部的培养基，然后栽植到灭菌的介质中〔土∶蛭石∶泥炭土(质量比)＝1∶1∶1〕，遮荫散射光照射。
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