CN110506633B - 一种苹果矮化砧木快速返童的方法 - Google Patents
一种苹果矮化砧木快速返童的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种苹果矮化砧木快速返童的方法。该方法包括如下步骤：以处于成龄期的苹果矮化砧木的幼叶或所述幼叶剪成的叶块为外植体，将外植体接种于再生培养基，先25℃、暗培养2周，再25℃、光暗交替培养4周，得到返童苗；再生培养基中含有1.0‑5.0mg/L TDZ和0.1‑0.6mg/L NAA。采用本发明提供的方法对苹果矮化砧木进行返童，从处于成龄期的苹果矮化砧木的健壮枝条开始至获得返童苗的时间为3个月；而使用连续继代实现返童获得返童组培苗的时间一般为18个月。由此可见，相比连续继代实现返童，本发明提供的方法实现返童的时间短且不定根发生能力提高。本发明具有重要的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种苹果矮化砧木快速返童的方法。
背景技术
矮化密植已成为苹果产业未来发展趋势，如何快速获得优良的矮化砧木变得尤为重要。目前，生产上主要采用压条、扦插、组织培养等方式进行繁殖。压条繁殖应用性广，但不同苹果砧木压条繁殖生根情况不同，并且压条繁殖会受到基质的影响，例如，M9-T337在以锯末为基质的条件下生根能力较强；而对M26和M9来说，木屑效果较好。进行压条繁殖时，操作繁琐，而且由于受到母株的影响，繁殖系数不高。扦插繁殖成本低，操作简单，能够保持母本的优良性状，但存在不定根发生困难的普遍问题。扦插生根难已经成为苹果矮化砧木扦插繁育关键问题之一。
研究表明，童期材料的插穗较成龄期材料的生根能力强。果树作为多年生木本植物，随着年龄的增加，童性逐渐丧失，生根能力减弱。返童能够使许多木本植物获得更高的生根和繁殖能力。木本植物从幼龄到成熟阶段的变化通常伴随着生根能力的逐渐丧失，以及miR156表达量的减少和miR172表达量的增加。研究表明，依赖组织培养手段连续继代可以实现苹果砧木返童，小金海棠成龄期叶片全缘，而童期叶片为裂刻，继代到第15代时(约一年)，叶片裂刻程度与童期叶片相一致，出现返童迹象，生根能力恢复童期水平。但是连续茎段继代生长周期较长，而且组织培养过程中容易发生遗传变异，随着继代数的增加会产生一定的遗传变异。因此，快速返童且保持遗传稳定是苹果优良矮化砧木繁育的重要环节之一。
发明内容
本发明的目的是提供一种苹果矮化砧木快速返童的方法。
本发明首先保护一种苹果矮化砧木返童的方法，是以苹果矮化砧木的幼叶或所述幼叶剪成的叶块为外植体，完成离体再生。
所述苹果矮化砧木具体可处于成龄期。
所述叶块的大小可为3-7mm2(如3-5mm2、5-7mm2、3mm2、5mm2或7mm2)。
所述“苹果矮化砧木返童的方法”可包括步骤(a1)：将所述外植体接种于再生培养基，先23-27℃(如23-25℃、25-27℃、23℃、25℃或27℃)、暗培养1-3周(如1-2周、2-3周、1周、2周或3周)，再23-27℃(如23-25℃、25-27℃、23℃、25℃或27℃)、光暗交替培养3-5周(如3-4周、4-5周、3周、4周或5周)，得到返童苗；
所述再生培养基中可含有1.0-5.0mg/L(如1.0-3.0mg/L、3.0-5.0mg/L、1.0mg/L、2.0mg/L、3.0mg/L、4.0mg/L或5.0mg/L)TDZ和0.1-0.6mg/L(如0.1-0.2mg/L、0.2-0.5mg/L、0.5-0.6mg/L、0.1mg/L、0.2mg/L、0.5mg/L或0.6mg/L)NAA。
所述“苹果矮化砧木返童的方法”还可包括步骤(a2)：完成步骤(a1)后，将返童苗进行生根。
所述“将返童苗进行生根”为将返童苗置于生根培养基，23-27℃(如23-25℃、25-27℃、23℃、25℃或27℃)、光暗交替培养20天以上(如20天、25天、30天或35天)；所述生根培养基中含有0.3-0.7mg/L(如0.3-0.5mg/L、0.5-0.7mg/L、0.3mg/L、0.5mg/L或0.7mg/L)IBA。
采用上述任一所述方法制备的返童苗作为苹果矮化砧木的应用也属于本发明的保护范围。
本发明还保护用于苹果矮化砧木返童的试剂盒，可包括再生培养基；所述再生培养基中可含有1.0-5.0mg/L(如1.0-3.0mg/L、3.0-5.0mg/L、1.0mg/L、2.0mg/L、3.0mg/L、4.0mg/L或5.0mg/L)TDZ和0.1-0.6mg/L(如0.1-0.2mg/L、0.2-0.5mg/L、0.5-0.6mg/L、0.1mg/L、0.2mg/L、0.5mg/L或0.6mg/L)NAA。
所述试剂盒具体可由再生培养基组成。
所述试剂盒还可包括生根培养基；所述生根培养基中可含有0.3-0.7mg/L(如0.3-0.5mg/L、0.5-0.7mg/L、0.3mg/L、0.5mg/L或0.7mg/L)IBA。
上述任一所述苹果矮化砧木可为新疆野苹果31号、Smoothee、37-030、Liberty、GM256、B9、M9、M26或SH40。
上述任一所述再生培养基可为含有1.0-5.0mg/L(如1.0-3.0mg/L、3.0-5.0mg/L、1.0mg/L、2.0mg/L、3.0mg/L、4.0mg/L或5.0mg/L)TDZ和0.1-0.6mg/L(如0.1-0.2mg/L、0.2-0.5mg/L、0.5-0.6mg/L、0.1mg/L、0.2mg/L、0.5mg/L或0.6mg/L)NAA的MS固体培养基。
上述任一所述生根培养基可为含有0.3-0.7mg/L(如0.3-0.5mg/L、0.5-0.7mg/L、0.3mg/L、0.5mg/L或0.7mg/L)IBA的1/2MS固体培养基。
上文中，当苹果矮化砧木为新疆野苹果31号、Smoothee、37-030或Liberty时，所述再生培养基具体可为含2.0mg/L TDZ和0.2mg/L NAA的MS固体培养基。
上文中，当苹果矮化砧木为GM256或B9时，所述再生培养基具体可为含3.0mg/LTDZ和0.5mg/L NAA的MS固体培养基。
上文中，当苹果矮化砧木为M9、M26或SH40时，所述再生培养基具体可为含4.0mg/LTDZ和0.5mg/L NAA的MS固体培养基。
上文中，所述光暗交替培养即光培养和暗培养交替进行。所述光暗交替培养的光周期为16h光照/8h黑暗。所述光暗交替培养的光照强度具体可为1000-2000lx(如1000-1500lx、1500-2000lx、1000lx、1500lx或2000lx)。所述光暗交替培养时，光照时温度为24-25℃，黑暗时温度18-20℃。
本发明中，返童苗等同于再生苗。
实验证明，采用本发明提供的方法对苹果矮化砧木(新疆野苹果31号、37-030或Smoothee)进行返童，从处于成龄期的苹果矮化砧木的健壮枝条开始至获得返童苗的时间为3个月。而使用连续继代实现返童方法从处于成龄期的苹果矮化砧木的茎尖开始至获得返童组培苗的时间一般为18个月(期间继代18次)。而且采用本发明提供的方法获得的苹果矮化砧木返童苗的生根率、不定根数量、不定根长度和生根指标(生根指标＝生根率×平均不定根数量×平均不定根长度)均显著高于苹果矮化砧木初代苗；所述苹果矮化砧木初代苗为将苹果矮化砧木的茎段接种至MS固体培养基中，先25℃暗培养1周，然后光暗交替培养4周获得的(常规方法)。由此可见，相比连续继代实现返童，本发明提供的方法实现返童的时间短且不定根发生能力提高。本发明具有重要的应用价值。
附图说明
图1为再生培养基1对12种苹果矮化砧木的叶块的离体再生率统计结果。
图2为M26不同来源叶片的miR156基因的相对表达量的检测结果。
图3为新疆31号、37-030和Smoothee不同来源的叶片的miR156基因的相对表达量的检测结果。
图4为37-030再生苗和37-030初代苗的生根情况统计；A为不定根发生率(即生根率)统计，B为单个植株平均不定根数量统计，C为单个植株平均不定根长度统计，D为生根指标统计；*代表与37-030初代苗比较存在显著差异。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中涉及的12个苹果矮化砧木分别为新疆野苹果31号(在下文中简称新疆31号)、Smoothee、37-030、Liberty、GM256、B9、T337、M9、M26、SH6、SH40和SH1。SH6、SH40和SH1均由山西果树所选育，均记载于如下文献中：SH系列苹果矮化砧性状及生理特性的研究，1991，园艺学报。Smoothee和Liberty为两个高再生率的苹果砧木资源，均记载于如下文献中：Tan Y，Li B，Wang Y，et al.Genetic Diversity and Heritability of In VitroLeaf Regeneration Ability in Malus Species[J].Hortscience A Publication ofthe American Society for Horticultural Science，2017，52(10):1396-1400.GM256由吉林果树所选育，记载于如下文献中：刘畅.苹果抗寒矮化砧的评价与筛选[D].北京：中国农业科学院硕士学位论文.2013.B9、T337、M9、M26和37-030均为国外引进资源，由中国农业大学苹果种质资源圃(位于北京昌平八口村)提供，公众可以从申请人处获得。
实施例1、返童苗的获得及检测
一、外植体的获得
外植体为处于成龄期的苹果矮化砧木的叶块或茎段。
1、处于成龄期的苹果矮化砧木的叶块的获得
(1)2017年2月初，从中国农业大学昌平苹果试验基地田间采集处于成龄期的苹果矮化砧木(新疆31号、Smoothee、37-030、Liberty、GM256、B9、T337、M9、M26、SH6、SH40或SH1)的健壮枝条。
(2)完成步骤(1)后，将健壮枝条置于清水中，然后在向阳室内20℃±2℃培养，直至长出完全展开的嫩叶。
(3)完成步骤(2)后，用镊子取下嫩叶，用自来水冲洗0.5h。
(4)完成步骤(3)后，将嫩叶置于超净工作台，先用75％(v/v)乙醇水溶液消毒30s，无菌水冲洗3次；再用0.1％(v/v)升汞水溶液消毒8min，无菌水冲洗3次；最后将嫩叶置于无菌滤纸上吸干水分，用无菌剪刀剪去叶片的叶尖和叶基部，剪成5mm2左右的叶块。该叶块即为处于成龄期的苹果矮化砧木的叶块。
在下文中，处于成龄期的苹果矮化砧木的叶块简称苹果矮化砧木的叶块。
2、处于成龄期的苹果矮化砧木的茎段的获得
(1)2017年4-6月，从中国农业大学昌平苹果试验基地田间采集处于成龄期的苹果矮化砧木(新疆31号、Smoothee、37-030、Liberty、GM256、B9、T337、M9、M26、SH6、SH40或SH1)的茎尖。
(2)完成步骤(1)后，取茎尖，用自来水冲洗0.5h。
(3)完成步骤(2)后，将茎尖置于超净工作台，先用75％(v/v)乙醇水溶液消毒30s，无菌水冲洗3次；再用0.1％(v/v)升汞水溶液消毒8min，无菌水冲洗3次；最后将茎尖置于无菌滤纸上吸干水分，用无菌剪刀剪成长为10mm的茎段。该茎段即为处于成龄期的苹果矮化砧木的茎段。
在下文中，处于成龄期的苹果矮化砧木的茎段简称苹果矮化砧木的茎段。
二、再生苗和初代苗的获得
再生培养基1：含2.0mg/L TDZ和0.2mg/L NAA的MS固体培养基。
再生培养基2：含3.0mg/L TDZ和0.5mg/L NAA的MS固体培养基。
再生培养基3：含4.0mg/L TDZ和0.5mg/L NAA的MS固体培养基。
光暗交替培养即光培养和暗培养交替进行；光周期为16h光照/8h黑暗；光照强度为1500lx。光照时温度为24-25℃，黑暗时温度18℃。
1、苹果矮化砧木的叶块的再生苗的获得
实验重复三次取平均值，每次重复20个苹果矮化砧木的叶块。具体重复的步骤如下：将步骤一中1获得的苹果矮化砧木的叶块接种至再生培养基1、再生培养基2或再生培养基3中，先25℃暗培养两周，然后光暗交替培养4周，得到再生苗。
光暗交替培养2周时统计离体再生率。
离体再生率＝再生叶芽数/接种叶块数×100％
再生培养基1对12种苹果矮化砧木的叶块的离体再生率见图1。全部的实验结果见表1。结果表明，新疆31号、Smoothee、37-030和Liberty适宜的再生培养基均为再生培养基1；在再生培养基1上培养，新疆31号、Smoothee、37-030和Liberty的叶块的离体再生率均为90％以上；GM256适宜的再生培养基为再生培养基2，叶块的离体再生率达到60％；B9适宜的再生培养基为再生培养基2，叶块的离体再生率达到25％；M9、M26和SH40适宜的再生培养基为再生培养基3，叶块的离体再生率分别达到20％、35％和10％。
由此可见，新疆31号、Smoothee、37-030和Liberty属于高再生种质资源，GM256属于较易再生种质资源，M9、M26、SH40、B9、T337、SH1和SH6属于难再生种质资源。
表1.再生培养基对苹果矮化砧木的叶块离体再生率的影响
注：采用Duncan’s方法检验，小写字母代表差异达显著水平，“/”表示无。
2、苹果矮化砧木的茎段的初代苗的获得
实验重复三次取平均值，每次重复20个苹果矮化砧木的茎段。具体重复的步骤如下：将步骤一中2获得的苹果矮化砧木的茎段接种至MS固体培养基中，先25℃暗培养1周，然后光暗交替培养4周，得到初代苗。
三、检测苹果叶片中miR156基因的相对表达量
1、检测苹果叶片中miR156基因的相对表达量的方法
(1)RNA的提取和检测
苹果叶片中RNA的提取和检测的步骤依次如下：
(1-1)取液氮预冷的研钵，加入0.5g苹果叶片，然后用研杵研磨，期间不断加入液氮，直至研磨至粉末状；
(1-2)向所述研钵中加入2mL RNAiso for Small RNA(Takara公司的产品)(目的为裂解样品)，将粉末状样品完全覆盖，室温静置，待样品完全融化后，继续研磨至透明状，得到匀浆液；
(1-3)将匀浆液转入离心管，室温静置5min；之后4℃、12000g离心5min，小心吸取上清液并转入新离心管中；
(1-4)取装有上清液的离心管，加入400μL氯仿，盖紧离心管管盖，用手剧烈震荡15s，待溶液充分乳化后，室温静置5min；之后4℃、12000g离心15min；
(1-5)小心取出离心管，吸取上清至另一新离心管中，加入等体积异丙醇，上下颠倒充分混匀，室温静置10min；之后4℃、12000g离心10min；
(1-6)弃上清，用1mL75％(v/v)乙醇水溶液清洗沉淀2次，最后吸尽上清保留沉淀；
(1-7)室温干燥5min，加入适量DEPC水溶解沉淀，得到RNA溶液；
(1-8)取2μL RNA溶液，加入2μL 10×loading buffer(Takara公司的产品)混匀后，用3％(m/v)琼脂糖凝胶电泳检测小分子RNA的完整性；
(1-9)取RNA溶液，使用微量紫外分光光度计检测小分子RNA的浓度及纯度。
(2)实时荧光PCR检测miR156基因相对表达量
实时荧光PCR检测的引物见表2(5.8s rRNA为内参)。
表2
(2-1)取PCR管(规格为0.2mL)，先加入1.5μg步骤(1)提取的RNA、1μL miR156的RT-Primer、1μL dNTPs(浓度为10mmol/L)，用DEPC水补足至14μL，混匀。
(2-2)取完成步骤(2-1)的体系，先65℃变性5min，然后立即放入冰水混合物中冷却，加入1μL反转录酶AMV(浓度为5U/μL)、4μL Buffer(5×)(Takara公司的产品)和1μLRNase抑制剂，混合。
(2-3)取完成步骤(2-2)的体系，反转录，得到cDNA溶液1。
反应程序为：16℃30min；20℃30s，42℃30s，50℃1s，60个循环；85℃10min。
(2-4)按照步骤(2-1)-(2-3)的方法，将miR156的RT-Primer替换为5.8s rRNA的RT-Primer，其它步骤均不变，得到cDNA溶液2。
(2-5)通过荧光定量PCR检测miR156基因的相对表达量(5.8s rRNA为内参)。具体的，以cDNA溶液1为模板，以miR156的PCR Primer-F和PCR Primer-R为引物进行PCR扩增。以cDNA溶液2为模板，以5.8s rRNA的PCR Primer-F和PCR Primer-R为引物进行PCR扩增。
反应体系均为10μL，由1μL cDNA溶液、1μLPCR Primer-F(浓度为10mM)、1μL PCRPrimer-R(浓度为10mM)、5μL Premix Taq(Takara公司的产品)和DEPC水组成。
反应程序为：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃45s，30个循环；72℃7min。
2、检测待测苹果叶片中miR156基因的相对表达量
苹果植株从幼龄到成熟阶段的变化通常伴随着miR156表达量的减少。幼龄期苹果叶片中miR156的相对表达量高于成龄期。因此，可以通过检测miR156的相对表达量，来判断苹果植株是否处于幼龄期。
(1)检测一
M26返童组培叶片为步骤二中2获得的M26初代苗连续继代获得，具体操作步骤参考如下文献：肖祖飞.童性对苹果砧木绿枝扦插生根的影响[D].北京：中国农业大学博士学位论文.2014.
按照步骤1的方法，检测待测苹果叶片(M26返童组培叶片、M26再生苗(步骤二中1采用再生培养基3培养获得)叶片、M26初代苗(步骤二中2获得)叶片或从中国农业大学昌平苹果试验基地田间采集的成龄期的M26叶片(简称M26田间成龄叶片))中miR156基因的相对表达量。
检测结果见图2。结果表明，M26再生苗叶片中miR156基因的相对表达量为M26初代苗叶片中miR156基因的相对表达量的31倍，为M26田间成龄叶片中miR156基因的相对表达量的4.25倍；M26再生苗叶片和M26返童组培叶片中miR156基因的相对表达量无显著差异。
上述结果表明，M26再生苗处于幼龄期。
(2)检测二
按照步骤1的方法，检测待测苹果叶片中miR156基因的相对表达量。待测苹果叶片为新疆31号再生苗(步骤二中1采用再生培养基1培养获得)叶片、新疆31号初代苗(步骤二中2获得)叶片、从中国农业大学昌平苹果试验基地田间采集的成龄期的新疆31号叶片(简称新疆31号田间成龄叶片)、37-030再生苗(步骤二中1采用再生培养基1培养获得)叶片、37-030初代苗(步骤二中2获得)叶片、从中国农业大学昌平苹果试验基地田间采集的成龄期的37-030叶片(简称37-030田间成龄叶片)、Smoothee再生苗(步骤二中1采用再生培养基1培养获得)叶片、Smoothee初代苗(步骤二中2获得)叶片或从中国农业大学昌平苹果试验基地田间采集的成龄期的Smoothee叶片(简称Smoothee田间成龄叶片)。
检测结果见图3。结果表明，新疆31号、37-030和Smoothee的再生苗叶片中miR156基因的相对表达量均显著高于相应的初代苗叶片或田间成龄叶片。
上述结果表明，新疆31号再生苗、37-030再生苗和Smoothee再生苗均处于幼龄期。
四、检测37-030再生苗和37-030初代苗的不定根发生能力
光暗交替培养即光培养和暗培养交替进行；光周期为16h光照/8h黑暗；光照强度为2000Lx。光照时温度为24-25℃，黑暗时温度18℃。
1、实验重复三次取平均值，每次重复的步骤如下：将20株37-030再生苗(步骤二中1采用再生培养基1培养获得)或37-030初代苗(步骤二中2获得)置于生根培养基(含0.5mg/L IBA的1/2MS固体培养基)中，光暗交替培养25天，然后测定不定根数量和不定根长度，得到单个植株平均不定根数量和单个植株平均不定根长度。
2、完成步骤1后，计算获得生根率和生根指标(生根指标是对不定根发生能力的一种综合分析)，从而评价植株的不定根发生能力。
生根率＝生根苗的数量/20×100％
生根指标＝生根率×平均不定根数量×平均不定根长度
实验结果见图4。结果表明，37-030再生苗的生根率(91.7％)显著高于37-030初代苗(66.7％)，37-030再生苗的不定根数量(7.5个)显著多于37-030初代苗(4.8)，37-030再生苗的不定根长度(1.63cm)显著长于37-030初代苗(1.41cm)，37-030再生苗的生根指标(11.2)显著高于37-030初代苗(4.6)。由此可见，37-030再生苗的不定根发生能力显著高于37-030初代苗。
由此可见，将苹果矮化砧木(新疆31号、Smoothee、37-030、Liberty、GM256、B9、M9、M26或SH40)的叶块接种至再生培养基(含TDZ和NAA的MS固体培养基)，先25℃暗培养两周，然后25℃光暗交替培养4周，得到再生苗。该再生苗中miR156基因的相对表达量显著提高，不定根发生能力显著提高，基本达到童期水平，再生苗即为返童苗。将返童苗置于生根培养基(含0.5mg/L IBA的1/2MS固体培养基)，光暗交替培养25天，即获得返童苗的生根植物。
此外，从处于成龄期的苹果矮化砧木的健壮枝条开始至获得再生苗的时间为3个月；而使用连续继代实现返童方法从处于成龄期的苹果矮化砧木的茎尖开始至获得返童组培苗的时间一般为18个月(期间继代18次)。由此可见，相比连续继代实现返童，上述方法实现返童的时间短且不定根发生能力提高。
Claims (3)
1.一种苹果矮化砧木返童的方法，是以苹果矮化砧木的幼叶或所述幼叶剪成的叶块为外植体，完成离体再生；
所述苹果矮化砧木返童的方法包括步骤（a1）和步骤（a2）：
所述步骤（a1）为：将所述外植体接种于再生培养基，先23-27℃、暗培养1-3周，再23-27℃、光暗交替培养3-5周，得到返童苗；
所述再生培养基为含有1.0-5.0mg/L TDZ和0.1-0.6mg/L NAA的MS固体培养基；
所述步骤（a2）为：完成步骤（a1）后，将返童苗进行生根；
所述将返童苗进行生根为将返童苗置于生根培养基，23-27℃、光暗交替培养20天以上；
所述生根培养基为含有0.3-0.7mg/L IBA的1/2 MS固体培养基；
所述苹果矮化砧木为新疆野苹果31号、Smoothee、37-030、Liberty、GM256、B9、M9、M26或SH40。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述苹果矮化砧木处于成龄期。
3.采用权利要求1或2所述的方法制备的返童苗作为苹果矮化砧木的应用。
Priority Applications (1)
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| CN201910903073.4A CN110506633B (zh) | 2019-09-24 | 2019-09-24 | 一种苹果矮化砧木快速返童的方法 |
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