CN109042319B

CN109042319B - 一种防止苹果组培褐化和不定芽诱导的方法

Info

Publication number: CN109042319B
Application number: CN201810805048.8A
Authority: CN
Inventors: 白团辉; 谢贝阳; 郑先波; 黄松; 宋春晖; 张玉; 冯建灿
Original assignee: Henan Agricultural University
Current assignee: Henan Agricultural University
Priority date: 2018-07-20
Filing date: 2018-07-20
Publication date: 2021-10-19
Anticipated expiration: 2038-07-20
Also published as: CN109042319A

Abstract

本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种防止苹果组培褐化和不定芽诱导的方法。该组合培养基包括初代组织培养基和不定芽诱导培养基。苹果组培方法包括：选择外植体、并进行预处理，初代诱导培养，诱导形成不定芽等步骤。本申请针对现有苹果组培中褐化严重的问题，分别通过对外植体取材、外植体前处理、消毒时间、培养基成分、激素配比等多个途径进行技术方案的优化探索，最终有效防止了酚类物质氧化，较好预防了苹果褐化现象的发生，统计表明，可将褐化率降低到25%以下，解决了苹果组培褐化率高的难题，表现出较好的技术优势，也为提高苹果快速繁殖效率奠定了较好技术基础。

Description

一种防止苹果组培褐化和不定芽诱导的方法

技术领域

本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种防止苹果组培褐化和不定芽诱导的方法。

背景技术

苹果是我国主要栽培果树树种之一，其面积和产量均居世界首位，发展苹果产业，对增加农民收入、调整产业结构具有重要的意义。

苹果品种及类型众多，其中柱状苹果是一种特殊的矮生突变类型，其节间短、侧生分枝少，呈直立单干形，被认为是苹果超高密度栽培、集约化生产的最理想的株型。

柱状苹果中的“润太一号”品种是一种经过多年杂交选育的柱型苹果品种，由于其良好的树体特性和较高的产量在我国得到大面积推广。但种植过程中发现，润太一号苹果普遍感染多种病毒，进而严重影响苹果的品质和产量。而由于目前苹果生产中还没有能够有效防治果树病毒病的药剂，因此推广使用脱毒苗木是从源头上杜绝果树病毒病的重要措施，而高效稳定的脱毒体系是无毒苗木生产的关键。

由于组培脱毒快繁可在短时间内获得大量的优良苗木，因而是脱毒体系构建过程中常见和主要方法。但组培过程中发现，苹果在组培初代培养过程中极易发生褐变，使得初代培养成活率极低，从而限制了苹果优良组培苗的大量繁殖和生产，制约了苹果优良品种规模化、产业化的生产和推广。因此极有必要就现有组培过程中的这一缺陷进行技术攻关，以为苹果品种的推广种植奠定基础。

发明内容

本申请目的在于提供一种苹果组培用组合培养基及对应的苹果组培方法，从而缓解、克服现有苹果组培中褐化严重的缺陷问题。

本申请所采取的技术方案详述如下。

一种苹果组培用组合培养基，该组合培养基主要用于防止苹果组培褐化和不定芽诱导，包括初代组织培养基和不定芽诱导培养基，具体而言：

所述初代组织培养基配方为：MS培养基+蔗糖30g/L+琼脂6.5g/L+100 mg/L头孢噻肟（Cef）；或者为：MS培养基+蔗糖30g/L+琼脂6.5g/L+100 mg/L头孢噻肟（Cef）+5g/L PVP；

所述不定芽诱导培养基配方为：MS培养基+蔗糖30g/L +琼脂6.5g/L +3.0~4.0mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA，pH=5.6-5.8。

利用所述苹果组培用组合培养基的防止苹果组培褐化和不定芽诱导的方法，该方法主要用来培育形成脱毒苗，以柱状苹果润太一号为例，就该方法具体操作步骤介绍如下：

（1）选择外植体，并进行预处理

以柱状苹果润太一号为例，应于3-5月份在晴天15:00之前（以河南地区为例）选取无病虫害、生长健壮的当年抽生幼嫩枝条作为外植体；

所述外植体为带有腋芽的茎段，外植体规格一般为：长8~10cm、粗（直径）0.6-0.8cm左右，优选为带有1个或2个腋芽的茎段；

将外植体优选进行适当遮光处理后再剪取并进行后续清洁、灭菌处理，具体遮光处理方式为：将外植体置于外黄内黑的果袋（15×18cm）内进行遮光处理，套袋时先用手将纸袋撑开，使纸袋鼓起，然后将约10cm长当年抽生幼嫩枝条套入袋内，再将袋口收缩到枝条上，用一侧的封口丝扎住；遮光时间不超过14d，优选不超过7d；

将外植体剪取后依次进行清洁、杀菌、无菌水冲洗处理，具体而言：

将外植体首先用洗洁精清洗5～10 min，以对外植体表面进行初步清洁，然后流水冲洗12 h以上，确保冲洗干净；

然后将外植体先用75%酒精消毒1 min以进行初步杀菌，初步杀菌后用无菌水冲洗2-3次，接着用0.1% HgCl₂+1.2%吐温20溶剂浸泡7~9min（优选8min）进行消毒处理；

最后用无菌水冲洗5～7次冲洗干净备用；

（2）初代诱导培养

将步骤（1）中消毒灭菌后外植体接种入初代组织培养基中，温度26±2℃，光照强度2500～2800 lx、光照周期14h/10h条件下培养60天进行初代诱导培养，以促进萌芽形成叶片；

（3）诱导形成不定芽

取步骤（2）初代诱导培养展开的第2-4个叶片，在叶片的背面沿着主叶脉并垂直于叶面横切，形成规格、大小一致叶片，将叶片接种到不定芽诱导培养基中先暗培养（温度26±2℃）14天，再正常条件下（温度26±2℃，光照强度2500～2800 lx、光照周期14h/10h）进行不定芽诱导培养。

本申请在设计相关技术方案过程中，发明人认为：降低光照可降低酚类化合物含量和氧化酶的活性，因此，对于外植体进行适当时间的遮光处理对于降低组培过程中褐化率是有益处的；而外植体灭菌消毒过程中，消毒时间的长短会对外植体活力具有直接影响，因此，在保证植物较低的污染率前提下，选择合适的消毒时间对降低外植体的褐化率和提高初代培养的成活率也很重要；另一方面，头孢噻肟在组培中常被用来抑制细菌的生长，也有研究表明一定浓度的头孢噻肟可以抑制植物的生长，同时对于促进外植体细胞分裂也有一定的作用，综合这些因素，本申请选用100mg/L头孢噻肟，从而达到预防褐化的效果。

总之，本申请针对现有苹果组培中褐化严重的问题，分别通过对外植体取材、外植体前处理、消毒时间、培养基成分、激素配比等多个途径进行技术方案的优化探索，最终有效防止了酚类物质氧化，较好预防了苹果褐化现象的发生。已有研究表明，木本植物在组织培养过程中，一般褐化率在40%～80%之间，严重时褐化率可达到100%，而本申请通过综合改进后可以将褐化率降低到25%以下。解决了苹果组培褐化率高的难题，表现出较好的技术优势，也为提高苹果快速繁殖效率奠定了较好技术基础。

总体而言，本申请通过对苹果组织培养的各个阶段操作方式进行改进探讨，有效降低了组培初期的褐化率，解决了苹果组培褐化率高的难题，且相关操作易于实现，生产成本较为低廉，短期内可获得大量组培材料，可为生产优质无病毒苗木、建立高效的遗传转化体系奠定良好的技术基础。

附图说明

图1为遮光处理对外植体褐化的影响对比效果图，图中从左至右分别为A、B、C，其中A为不遮光处理，B为遮光7d处理，C为遮光14d处理；

图2为不同腋芽数量（也即不同茎段长度）对无菌体系构建的影响，图中从左至右分别为A、B、C，其中A为1个腋芽，B 为2个腋芽，C 为3个腋芽；

图3为不同外源添加物对无菌体系构建的影响，图中从左至右分别为A、B、C，其中A为MS+100 mg/L Cef，B为MS+5 g/L PVP，C为MS+100 mg/L Cef+5g/L PVP；

图4为不同6-BA浓度对叶片不定芽的诱导情况对比，图中从左至右、从上至下分别A、B、C、D、E，其中A为2.0 mg/L 6-BA，B为3.0 mg/L 6-BA，C为4.0 mg/L 6-BA，D为5.0 mg/L6-BA，E为6.0 mg/L 6-BA。

具体实施方式

下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明。

实施例

以柱状苹果润太一号的脱毒苗组培体系构建为例，就本申请降低苹果组培中的褐化率方法介绍如下。

（1）选择外植体，并进行预处理

以柱状苹果润太一号为例，于3-5月份在晴天15:00之前（此时间针对河南地区，其他地区可根据苹果生长习性适当调整）选取无病虫害、生长健壮的当年抽生幼嫩枝条作为外植体（长8-10cm, 粗度0.6-8cm）；将外植体置于外黄内黑的果袋（15×18cm）内进行遮光处理，套袋时先用手将纸袋撑开，使纸袋鼓起，然后将约10cm长当年抽生幼嫩枝条套入袋内，再将袋口收缩到枝条上，用一侧的封口丝扎住；遮光时间不超过14d，优选不超过7d；

所述外植体为带有腋芽的茎段；

将遮光处理后的外植体剪取后进行后续清洁、灭菌处理。

将遮光处理后外植体依次进行清洁、杀菌、无菌水冲洗处理，具体而言：

将外植体首先用洗洁精清洗8min左右，以对外植体表面进行初步清洁，然后流水冲洗12 h，确保冲洗干净；

然后超净工作台上将外植体先用75%酒精消毒1 min以进行初步杀菌，初步杀菌后用无菌水冲洗3次，接着用0.1% HgCl₂+1.2%吐温20溶剂浸泡进行消毒处理；最后用无菌水冲洗6次冲洗干净备用。

（2）初代诱导培养

所述初代组织培养基配方为：MS培养基+蔗糖30g/L+琼脂6.5g/L+100 mg/L 头孢噻肟。

（3）诱导形成不定芽

取步骤（2）初代诱导培养中展开大小一致的叶片（第2~4片），在叶片的背面沿着主叶脉并垂直于叶面横切3刀，形成规格、大小一致碎叶，将碎叶接种到不定芽诱导培养基中先暗培养（温度26±2℃）14天，再正常条件下（温度26±2℃，光照强度2500～2800 lx、光照周期14h/10h）进行不定芽诱导培养。

所述不定芽诱导培养基配方为：MS培养基+蔗糖30g/L +琼脂6.5g/L +4.0 mg/L6-BA+0.5 mg/L NAA，pH=5.6-5.8。

观察不定芽诱导情况并统计记录不定芽的诱导率。

结合整体组培过程，就不同影响因素对最终褐化率影响情况简要介绍如下。

（一）光照（遮光处理）对外植体褐化影响

发明人认为：降低光照可降低酚类化合物含量和氧化酶的活性，因此，对于外植体进行适当时间的遮光处理对于降低组培过程中褐化率是有益处的；而为确定遮光处理的合适时间，将外植体置于外黄内黑的牛皮纸袋内分别遮光预处理0d、7d、14d，然后按照前述操作进行组培培养，并就部分指标统计列表如下。

需要解释和说明的是，统计光照对外植体褐化影响时，步骤（1）的消毒时间为8min，外植体茎段上腋芽数量为2个；另一方面，组培时仅进行初代诱导培养60天，不包括后续不定芽诱导，具体统计结果如下表1所示（表中萌芽率即为初代诱导培养后腋芽萌发率）（部分培养效果对比如图1所示）。

表1，不同光照时间对外植体褐化的影响

注：表中a、b、c等标识仅是数据统计标识需要，不具有特殊含义。

结合图1的部分对比效果及对上表数据结果进行分析可以看出，在自然光照下（即不进行遮光处理操作时）外植体污染率达到了100%（部分原因也在于，遮光处理过程中阻挡了外来杂菌感染的可能性），而适当遮光处理后，外植体污染率、褐化率均有明显下降，同时萌芽率也有明显提升，但过长时间的遮光处理显然对外植体活力有一定影响，因此，遮光处理时间显然也不宜过长。

（二）外植体规格对最终褐化率影响

以茎段上腋芽数量作为外植体规格的评价指标，分别设置外植体茎段上腋芽数量为1、2、3个作为对照，然后进行接种和萌芽诱导。

需要解释和说明的是，统计外植体规格对褐化影响时，首先对外植体进行遮光处理7d，然后依据腋芽数量需求，对遮光处理后外植体进行适当分切；另一方面，组培过程中，步骤（1）的消毒时间为8min，组培时仅进行初代诱导培养60天，不包括后续不定芽诱导，具体统计结果如下表2所示（表中萌芽率即为初代诱导培养后腋芽萌发率）（部分培养效果对比图如图2所示）。

表2 不同外植体规格对褐化的影响

注：表中a、b、ab等标识仅是数据统计标识需要，不具有特殊含义。

结合图2培养效果及对上表数据结果进行分析可以看出，1个腋芽和2个腋芽的茎段的污染率分别是30%和36.67%，以3个腋芽的茎段的污染率达到了46.67%，与1个腋芽为外植体的处理呈显著性差异，三个处理间的褐化率均在20%和26.67%之间。即：随着腋芽个数的增加，污染率呈明显上升趋势，但褐化率基本保持稳定，但考虑最终萌芽效果而言，腋芽数量为1或2个均可。这一结果部分程度上表明，遮光处理后褐化率得到了稳定降低，但过多腋芽数量提高了杂菌感染可能性，因此应适当控制腋芽数量。

（三）消毒时间对褐化的影响

由于外植体灭菌消毒过程中，消毒时间的长短会对外植体活力具有直接影响，因此，在保证植物较低的污染率前提下，选择合适的消毒时间对降低外植体的褐化率和提高初代培养的成活率也很重要。为确定较为合适的浸泡消毒处理时间，步骤（1）中在浸泡消毒时，分别浸泡消毒6、7、8、9min作为对照，来考察不同消毒时间的影响效果。

需要解释和说明的是，统计消毒时间对褐化影响时，首先对外植体进行遮光处理7d，外植体腋芽数量均为2个；另一方面，组培过程中仅进行初代诱导培养60天，不包括后续不定芽诱导，具体统计结果如下表3所示（表中萌芽率即为初代诱导培养后腋芽萌发率）。

表3，不同消毒时间对外植体褐化的影响

注：表中a、b、c、d等标识仅是数据统计标识需要，不具有特殊含义。

从上表结果可以看出，褐化率随着消毒时间的增加而增加，消毒时间为6 min时褐化率最低，消毒时间为9 min时褐化率最高，达到了43.33%，但污染率则呈与此相反现象。而考虑萌芽效果时，消毒时间8min最为合适。

（四）初代培养基中不同添加物对褐化影响

现有技术中，PVP是一种常用的预防褐化的附加物，但该物质对于苹果组培是否适用则是存在一定不确定性的，为此，在前述初代培养基基础上，发明人设计了不同的初代培养基类型，以考察不同附加物对褐化影响情况。

需要解释和说明的是，统计初代培养基中附加物对褐化影响时，首先对外植体进行遮光处理7d，外植体腋芽数量均为2个，消毒时间为8min；另一方面，组培过程中仅进行初代诱导培养60天，不包括后续不定芽诱导。

不同初代培养基类型对最终褐化影响结果如下表4所示（表中萌芽率即为初代诱导培养后腋芽萌发率）（部分培养效果对比如图3所示）。

表4，不同初代培养基（不同培养基附加物）对外植体褐化的影响（培养基中均含有蔗糖30g/L+琼脂6.5g/L）

结合图3培养效果对比及上表统计结果可以看出，单独使用PVP时对于降低苹果组培的褐化率并不具有明显效果，而培养基中含有适量Cef时，对于降低褐化率和提高萌芽率的效果均较为显著。

（五）不定芽诱导培养基中不同激素含量对不定芽诱导率影响

在前述不定芽诱导培养基基础上，发明人对于6-BA使用浓度设定了不同数值（NAA浓度同前述不定芽培养基中浓度，即均为0.5mg/L），以确定不定芽诱导形成时最佳的激素配方组合。

需要解释和说明的是，统计不定芽诱导培养基诱导率时，首先对外植体进行遮光处理7d，外植体腋芽数量均为2个，消毒时间为8min。

不同诱导培养基类型对最终不定芽诱导影响结果如下表5所示（部分培养效果对比如图4所示）。

表5，不同诱导培养基（不同6-BA浓度）对苹果叶片不定芽诱导的影响（培养基中均含有0.5mg/L NAA）

结合图4的培养效果对比及上表统计结果可以看出，随着6-BA使用浓度的升高，诱导率呈现先上升后下降的趋势，以诱导率作为最终评价指标而言，不定芽诱导培养基中6-BA浓度显然是4mg/L最为合适。

Claims

1.一种苹果组培用组合培养基，其特征在于，该组合培养基主要用于防止苹果组培褐化和不定芽诱导，包括初代组织培养基和不定芽诱导培养基，具体而言：

所述初代组织培养基配方为：MS培养基+蔗糖30g/L+琼脂6.5g/L+100 mg/L头孢噻肟；或者为：MS培养基+蔗糖30g/L+琼脂6.5g/L+100 mg/L头孢噻肟+5g/L PVP；

所述不定芽诱导培养基配方为：MS培养基+蔗糖30g/L +琼脂6.5g/L +3.0~4.0 mg/L6-BA+0.5 mg/L NAA，pH=5.6-5.8；

所述苹果品种为柱状苹果润太一号。

2.利用权利要求1所述苹果组培用组合培养基的防止苹果组培褐化和不定芽诱导的方法，其特征在于，所述苹果品种为柱状苹果润太一号，该方法用来培育形成无菌苗，具体包括如下步骤：

（1）选择外植体，并进行预处理

选取无病虫害、生长健壮的幼嫩枝条作为外植体；所述外植体为带有腋芽的茎段；

将外植体进行遮光处理后再剪取并进行后续清洁、灭菌处理，具体遮光处理方式为：将外植体置于内部黑色的纸袋内遮光处理不超过14d；

将外植体依次进行清洁、杀菌、无菌水冲洗处理后备用；

（2）初代诱导培养

将步骤（1）中消毒灭菌后外植体接种入初代组织培养基中，进行初代诱导培养，以促进萌芽形成叶片；

（3）诱导形成不定芽

取步骤（2）初代诱导培养中展开叶片，在叶片的背面沿着主叶脉并垂直于叶面横切，形成规格、大小一致碎叶，将碎叶接种到不定芽诱导培养基中先暗培养，再正常条件下进行不定芽诱导培养。

3.如权利要求2所述防止苹果组培褐化和不定芽诱导的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述外植体为带有1个或2个腋芽的茎段。

4.如权利要求2所述防止苹果组培褐化和不定芽诱导的方法，其特征在于，步骤（1）中，遮光处理不超过7d。

5.如权利要求2所述防止苹果组培褐化和不定芽诱导的方法，其特征在于，步骤（1）中，对外植体进行清洁、杀菌、无菌水冲洗处理的具体方式为：

将外植体首先用洗洁精清洗5～10 min，以对外植体表面进行初步清洁，然后流水冲洗12 h以上；

然后将外植体先用75%酒精消毒1 min以进行初步杀菌，初步杀菌后用无菌水冲洗2-3次，接着用0.1% HgCl₂+1.2%吐温20溶剂浸泡7~9min进行消毒处理；

最后用无菌水冲洗5～7次冲洗干净。

6.如权利要求2所述防止苹果组培褐化和不定芽诱导的方法，其特征在于，步骤（2）中培养条件为：温度26±2℃，光照强度2500～2800 lx、光照周期14h/10h。

7.如权利要求2所述防止苹果组培褐化和不定芽诱导的方法，其特征在于，步骤（3）中，先暗培养14天。