CN114467754A - 一种获取银中杨非整倍体植株的方法 - Google Patents

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Abstract

一种获取银中杨非整倍体植株的方法，它涉及植物遗传育种领域。它涉及解决三倍体植株，尤其是三倍体银中杨无法获取部分染色体的加倍的问题。本发明采取处于单核靠边期的银中杨花粉进行诱导愈伤培养，进行花粉愈伤组织继代，获得愈伤组织，诱导出芽，获得不定芽分化苗，生根培养，土壤移栽。通过以上方法获得银中杨成苗，再进行根尖的压片实验观察即可筛选银中杨非整倍体株系。本发明方法极为方便快捷的获得了银中杨非整倍体植株，具有很强的可操作性，为杨树倍性育种提供了新的见解，并且对其他植物的非整倍体诱导也有重要的借鉴意义。本发明应用于杨树培养领域。

Description

一种获取银中杨非整倍体植株的方法
技术领域
本发明涉及植物遗传育种领域，具体涉及一种获取银中杨非整倍体植株的方法。
背景技术
多倍化是植物进化的一种重要方式，植物界中普遍存在着多倍体，大约1/3以上的被子植物经历过一次或数次多倍化事件(Masterson J.Stomatal size in fossilplants:evidence for polyploidy in majority of angiosperms.Science,1994,264:421-424)。染色体加倍可以增强植物的适应性和竞争力，对物种的进化具有重要的意义。自1937年Blackeslee和Avery利用秋水仙素诱导蔓陀罗四倍体获得成功后(Blakeslee AF,Dorothy Bergner A,Avery AG.Anew method of synthesizing pure-breeding typeswith extra chromosomal material in Datura.The American Naturalist,1936,70(728):255-257.)，多倍体育种得到了越来越广泛的应用。
杨树由于具有生长迅速、适应性强、易繁殖等优点，成为当今世界上主要的造林树种。Nilsson-Ehle在瑞典发现了个体巨大、叶片增大的三倍体欧洲山杨，并提出利用人工方式诱导林木和果树多倍体进行育种的设想(Nilsson-Ehle H.
Figure BDA0003518627050000011
eine in der naturgefundene gigasform von Populus tremula.Hereditas,1936,21:379-382)。Einspahr采用四倍体欧洲山杨与二倍体美洲山杨杂交获得了遗传增益显著的人工异源三倍体山杨，为美国杨树纸浆材新品种培育做出了贡献(Einspahr DW.Production and utilization oftriploid hybrid aspen.Iowa state journal of research,1984,58(4):401-409)。在杨树多倍体育种研究中，多以三倍体研究为主。这是因为四倍体及以上倍性杨树品种生长性状并无显著改善，甚至表现欠佳，仅可作为育种或研究材料使用。这些多倍体杨树的不足可能是由于染色体多倍化易引起细胞及细胞核的增大，从而增加了减数分裂及有丝分裂过程中产生非整倍体可能性，并导致表观遗传的不稳定性(Comai L.The advantages anddisadvantages of being polyploidy.Nature reviews genetics,2005,6:836-846)。由于三倍体杨树大、小孢子母细胞在减数分裂时易导致联会发生紊乱，从而严重影响育性。实际上，三倍体杨树的花粉具有一定比例的可育性。银中杨(Populus alba×P.berolinensis)为三倍体，我们通过FDA对花粉染色也证明，四分体阶段刚结束时，即单核靠边期之前，仍具有相当比例的花粉具有活性。
利用植物的花粉或花药进行离体培养，可以获得单倍体(Haploid)或双单倍体(Double haploid)植株，又称为花粉植株。通常情况下，单倍体杨树在后期生长过程中会产生染色体自然加倍现象，即成为二倍体(双单倍体)植株。根据我们实验室对移栽三年后的单倍体植株检测结果表明，全部的植株已转变为双单倍体植株。由于双单倍体植株存在基因纯合特点，是研究遗传变异及基因组测序的理想材料。
以往的杨树倍性育种研究通常是利用人工手段诱导染色体组的加倍，即整倍体育种，如诱导三倍体、四倍体、五倍体、六倍体等，但通常情况下四倍体及以上倍性的杨树生长性状表现不佳。如果能够诱导部分染色体的加倍，而并非染色体组的加倍，可能会更容易获得具有优良生长性状的杨树变异个体。
三倍体植物配子形成过程中，联会的紊乱会导致三倍体植物产生含有多种染色体组合类型的花粉，美国明尼苏达大学的陈昌斌(Changbin Chen)教授称之为染色体重排现象。许多发生染色体重排后的孢子含有多余的染色体但非整倍的染色体组，因此在理论上讲，如果能将这样的活性孢子细胞经人工诱导形成非整倍体植株后，将创造出性状变异率极其丰富的植物品种。如果一个具活性的小孢子含有一组染色体(1N)外加一条多余的染色体，诱导该小孢子细胞发育成非整倍体(N+1)植株，通过染色体自然加倍后，该植株将形成2(N+1)的核型。而增加的染色体，将为植物的表型带来新的变化。
发明内容
本发明的目的是为了解决三倍体植株，尤其是三倍体银中杨无法获取部分染色体的加倍的问题，而提供一种获取银中杨非整倍体植株的方法。
本发明的一种获取银中杨非整倍体植株的方法，它是按照以下步骤进行的：
步骤一、采取处于单核靠边期的银中杨花粉，进行诱导愈伤培养，暗培养一周，获得花粉愈伤组织，培养温度为24℃，诱导愈伤培养中的愈伤培养基为MS+2.0mM 2,4-D+0.5mM KT+30g/L蔗糖+3g/L琼脂；
步骤二、将上一步进行愈伤组织继代培养，每8～12天继代一次，继代培养采取暗培养，将培养得到的愈伤组织，诱导出芽；愈伤组织继代培养中的继代培养基为MS+2.0mg/L2,4-D+0.5mg/L KT+30g/L蔗糖+3g/L琼脂；诱导出芽的培养基为MS+0.8mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+0.5mg/L TDZ+30g/L糖+3g/L琼脂；
步骤三、上一步诱导出芽后，进行成苗培养，成苗培养的培养基为MS+0.8mg/L6-BA+0.1mg/L NAA+30g/L糖+3g/L琼脂+1.0mg/L GA3；
步骤四、进行成苗继代培养，得不定芽分化苗；成苗继代培养基为MS+0.06mg/L6-BA+0.02mg/L NAA+25g/L蔗糖+3g/L琼脂；
步骤五、将不定芽分化苗进行生根培养，培养42～50天后进行土壤移栽；生根培养中生根培养基为MS+0.1mg/L NAA+25g/L蔗糖+3g/L琼脂。
进一步地，步骤一中银中杨花粉是采取银中杨花枝进行水培处理得到的。
进一步地，步骤一中银中杨花粉是采取银中杨花枝进行水培处理得到的，具体为：将采回的银中杨花枝插入清水中并置于正常光照下进行水培，每隔3天将花枝底部剪除0.5cm并换水，定期观察花粉发育情况，即得银中杨花粉。
进一步地，步骤一中在初春采取处于单核靠边期的银中杨花粉。
进一步地，不定芽分化苗进行生根培养前，对待移栽土壤进行杀菌处理。
进一步地，步骤一至步骤四操作是在无菌环境下进行的。
进一步地，步骤五中将长成0.5～1.5cm的不定芽分化苗进行生根培养。
本发明的一种获取银中杨非整倍体植株的方法得到的银中杨。
本发明采取三倍体杨树银中杨(Populus alba×P.berolinensis)具有可育性的单核靠边期花粉，进行花药培养及愈伤组织诱导，利用染色体重排及单倍体植物诱导加倍的原理，进行杨树单倍体和非整倍体育种，以期获得银中杨非整倍体(N+1)植株，再将植株种植培育待其染色体自然加倍后获得2(N+1)核型新株系。这将为杨树遗传变异研究以及新品种的选育带来新的际遇。
本发明包含以下有益效果：
1、本发明借助于染色体重排理论，通过银中杨的花药培养获得染色体重排的变异植株，这是诱导部分染色体的加倍，而并非染色体组的加倍，会更容易获得具有优良生长性状的杨树变异个体。
2、本发明的成功的产生丰富的银中杨性状变异群体，并为林木倍性育种研究提供新的思路。
3、本发明方法采取三倍体杨树银中杨的单核靠边期花粉进行花药培养及愈伤组织诱导，操作较为简单、周期短、效率高，诱导当年即可进一步繁殖出大量多倍体苗木，显著缩短育种周期，提高育种效率。
4、本发明方法可推广性好。对于不同的杨树种质，甚至其他树种，均可借鉴本发明方法高效诱导多倍体，并且诱导率高，有效推动林木多倍体育种技术进步。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的实验原材料银中杨kmer分析图片；
图2为本发明实施例1提供的银中杨花粉单核靠边期观察图片；
图3为本发明实施例1提供的银中杨诱导非整倍体植株时的花药愈伤组织培养图片；
图4为本发明实施例1提供的银中杨诱导非整倍体植株时的培苗生根培养图片；
图5为本发明实施例1提供的银中杨诱导非整倍体植株时的组培苗土壤移栽图片；
图6为本发明实施例1提供的银中杨非整倍体植株根尖压片对比观察图片；
图7为本发明实施例1提供的银中杨非整倍体与正常植株叶型对比观察图片。
具体实施方式
本领域的普通技术人员可以理解，上述各实施方式是实现本发明的具体实施例，而在实际应用中，可以在形式上和细节上对其作各种改变，而不偏离本发明的精神和范围。
除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解的含义一致。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面将详细叙述清楚说明本发明所揭示内容的精神，任何所属技术领域技术人员在了解本发明内容的实施例后，当可由本发明内容所教示的技术，加以改变及修饰，其并不脱离本发明内容的精神与范围。
本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，但并不作为对本发明的限定。
实施例1：
本实施例的一种银中杨非整倍体植株获得的方法，具体包括以下步骤：
(1)初春时节，采取银中杨花枝进行水培处理(将采回的花枝插入清水中并置于正常光照下进行水培，每隔3天用枝剪将花枝底部剪除0.5cm并换水，以保持其水分运输正常)，定期观察花粉发育情况，采取处于单核靠边期的银中杨花粉，进行诱导愈伤培养，培养基为MS+2.0mM 2,4-D+0.5mM KT+30g/L蔗糖+3g/L琼脂。暗培养一周，获得花粉愈伤组织，组培室温度为24℃。
(2)进行花粉愈伤组织继代，扩大愈伤组织数量，继代培养基MS+2.0mg/L 2,4-D+0.5mg/L KT+30g/L蔗糖+3g/L琼脂。大约每10天左右继代一次，继续采取暗培养。经过2个月左右的继代培养之后，获得足够量的愈伤组织。然后进行诱导出芽。培养基为MS+0.8mg/L6-BA+0.1mg/L NAA+0.5mg/L TDZ+30g/L糖+3g/L琼脂。
(3)然后，通过改变培养基促使芽点成苗，培养基为MS+0.8mg/L 6-BA+0.1mg/LNAA+30g/L糖+3g/L琼脂+1.0mg/L GA3。
(4)为了进一步扩繁，成苗继代培养基为MS+0.06mg/L 6-BA+0.02mg/L NAA+25g/L蔗糖+3g/L琼脂。可获得大量的不定芽分化苗。
(5)将1cm左右的不定芽导入生根培养MS+0.1mg/L NAA+25g/L蔗糖+3g/L琼脂，大约培养四周左右，可见明显的根系。大约七周之后可进行生根苗的土壤移栽。
(6)为了防止病菌感染，移栽前必须进行土壤高温灭菌(图2A)。移栽成活后，定期喷洒多菌灵等药剂，以防止细菌、真菌等感染。
(7)用根尖压片实验检测非整倍体株系。对于非整倍体株系，采用了荧光定量PCR方法来确定染色体的个数，也可通过基因组重测序法进行检测。
如图1所示，为了验证实验材料的准确性，对银中杨基因组进行重测序，将reads打碎成17bp片段进行k-mer分析，依据k-mer分布获得银中杨杂合度及倍性信息。图1显示，银中杨具有明显的杂合峰，具有杂种的特征，同时显示倍性为三倍体。
如图2所示，对银中杨花粉单核靠边期进行观察，A，明场下观察花粉，红色箭头未成熟花粉，黑色箭头表示花药壁组织；B，暗场下观察FDA染色后的花粉粒，红色箭头表示为FDA染色后的花粉，黑色箭头表示为FDA染色后的花药壁细胞。由于FDA只能染活细胞，有活性的花粉及花药壁细胞均能显绿色荧光；C，暗场下观察DAPI染色后的花粉粒，红色箭头表示为DAPI染色后的核；图2说明此阶段的花粉可以用来进行诱导单倍体。
如图6所示，以组培苗根尖为材料，进行染色体数目观察。左图(A)为正常银中杨，右图(B)为花粉植株。通过多次观察确认，发现正常银中杨的染色体数目非常接近于57，而花粉植株染色体数目统计为46条左右。这说明我们已经利用染色体重排理论获得了非整倍体植株。
如图7所示，左图为正常银中杨叶片；右图为非整倍体(2N+6)银中杨叶片。两种株系在叶形、背部绒毛特征等方面差异不大。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (8)

1.一种获取银中杨非整倍体植株的方法，其特征在于它是按照以下步骤进行的：
步骤一、采取处于单核靠边期的银中杨花粉，进行诱导愈伤培养，暗培养一周，获得花粉愈伤组织，培养温度为24℃，诱导愈伤培养中的愈伤培养基为MS+2.0mM 2,4-D+0.5mM KT+30g/L蔗糖+3g/L琼脂；
步骤二、将上一步进行愈伤组织继代培养，每8～12天继代一次，继代培养采取暗培养，将培养得到的愈伤组织，诱导出芽；愈伤组织继代培养中的继代培养基为MS+2.0mg/L2,4-D+0.5mg/L KT+30g/L蔗糖+3g/L琼脂；诱导出芽的培养基为MS+0.8mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+0.5mg/L TDZ+30g/L糖+3g/L琼脂；
步骤三、上一步诱导出芽后，进行成苗培养，成苗培养的培养基为MS+0.8mg/L6-BA+0.1mg/L NAA+30g/L糖+3g/L琼脂+1.0mg/L GA3；
步骤四、进行成苗继代培养，得不定芽分化苗；成苗继代培养基为MS+0.06mg/L6-BA+0.02mg/L NAA+25g/L蔗糖+3g/L琼脂；
步骤五、将不定芽分化苗进行生根培养，培养42～50天后进行土壤移栽；生根培养中生根培养基为MS+0.1mg/L NAA+25g/L蔗糖+3g/L琼脂。
2.根据权利要求1所述的一种获取银中杨非整倍体植株的方法，其特征在于步骤一中银中杨花粉是采取银中杨花枝进行水培处理得到的。
3.根据权利要求1或2所述的一种获取银中杨非整倍体植株的方法，其特征在于步骤一中银中杨花粉是采取银中杨花枝进行水培处理得到的，具体为：将采回的银中杨花枝插入清水中并置于正常光照下进行水培，每隔3天将花枝底部剪除0.5cm并换水，定期观察花粉发育情况，即得银中杨花粉。
4.根据权利要求1所述的一种获取银中杨非整倍体植株的方法，其特征在于步骤一中在初春采取处于单核靠边期的银中杨花粉。
5.根据权利要求1所述的一种获取银中杨非整倍体植株的方法，其特征在于不定芽分化苗进行生根培养前，对待移栽土壤进行杀菌处理。
6.根据权利要求1所述的一种获取银中杨非整倍体植株的方法，其特征在于步骤一至步骤四操作是在无菌环境下进行的。
7.根据权利要求1所述的一种获取银中杨非整倍体植株的方法，其特征在于步骤五中将长成0.5～1.5cm的不定芽分化苗进行生根培养。
8.如权利要求1所述的一种获取银中杨非整倍体植株的方法得到的银中杨。
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