CN114176008A - 一种羌活种子组培繁育方法 - Google Patents
一种羌活种子组培繁育方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于羌活种子组培繁育的培养基及羌活种子组培繁育方法。经试验验证，通过本发明羌活种子组培繁育方法得到的组培苗，移栽后的成活率达到了90％以上，为羌活的大量扩繁打下了坚实的基础，具备推广应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及植物组织培养领域，具体涉及一种羌活种子组培繁育方法。
背景技术
羌活(Notopterygium incisum Ting ex H.T.Chang)是伞形科(Umbelliferae)羌活属(Notopterygium)多年生草本植物，为我国特有。药典中记载羌活的药用部位是干燥根茎及根，主要化学成分有羌活醇、异欧前胡素等化合物，具有解表散寒，祛风除湿，止痛的功效，用于风寒感冒，头痛项强，风湿痹痛，肩背酸痛。羌活是许多著名成药的处方药材，其中解风寒的经典药物为九味羌活丸、祛风除湿的经典药物为羌活胜湿汤。由于羌活良好的药用功效，受到人们的喜爱，具有很好的市场价值。
羌活生长在高海拔的地区，产地寒冷阴湿，生态环境严酷，生长缓慢，种子发育不够完全，具有很长的休眠期。方子森等对甘肃的野生羌活进行多次野外实地调查，发现甘肃野生羌活自然条件下种子自然繁殖率仅为0.52％。同时研究发现羌活种子具有形态生理休眠，在自然条件下羌活种子可能需要两年才能萌发，而随着时间的延长，种子的生活力也随之下降，造成羌活在自然环境中繁殖困难。羌活也可以根茎繁殖，但是需要消耗大量药材且繁殖系数低，价格昂贵。
随着植物组织培养技术的发展，越来越多的植物在组织培养技术的支持下，实现了短时间内的大量扩繁。专利CN108719072A公开了一种羌活种子组培快速繁育技术，其就解决了羌活培育周期长，繁殖系数低的问题。但植物种子使用组培培养基栽培，由于根诱导率、成苗率、组培阶段长势等问题，往往在移栽后存活率低，最终无法实现植株的大量扩繁，该专利的羌活种子组培繁育技术，就只注重了培育周期、繁殖系数，由于没有更全面考虑到组培苗其他因素影响，使移栽后期羌活的扩繁面临巨大风险，为羌活的扩大生产带来了隐患。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种用于羌活种子组培繁育的培养基，它包括萌发培养基、丛生苗诱导培养基和根系诱导培养基；
所述萌发培养基是以MS培养基为基础培养基，添加有终浓度为0.1～4.2mg/L的植物生长调节剂、5～10g/L的琼脂和25～35g/L的蔗糖，pH值为5.5～6.0的培养基；
所述丛生苗诱导培养基是以1/2MS培养基为基础培养基，添加有终浓度为1～4.5mg/L的植物生长调节剂、5～10g/L的琼脂和25～35g/L的蔗糖，pH值为5.5～6.0的培养基；
所述根系诱导培养基是以1/2MS培养基为基础培养基，添加有终浓度为0.4～1mg/L的植物生长调节剂、5～10g/L的琼脂和15～25g/L的蔗糖，pH值为5.5～6.0的培养基。
进一步地，所述植物生长调节剂为6-苄基嘌呤(6-BA)、α-萘乙酸(NAA)、吲哚丁酸(IBA)、赤霉素(GA3)、2，4-表油菜素内酯(EBR)任意一种或多种。
更进一步地，所述萌发培养基是以MS培养基为基础培养基，添加有终浓度为1.0mg/L的6-苄基嘌呤(6-BA)、2.0mg/L的α-萘乙酸(NAA)、8g/L的琼脂和30g/L的蔗糖，pH值为5.8的培养基；
所述丛生苗诱导培养基是以1/2MS培养基为基础培养基，添加有终浓度为0.3～1mg/L的6-苄基嘌呤(6-BA)、0.6mg/L的吲哚丁酸(IBA)、0.2mg/L的赤霉素(GA3)、8g/L的琼脂和30g/L的蔗糖，pH值为5.8的培养基；
所述根系诱导培养基是以1/2MS培养基为基础培养基，添加有终浓度为0.6mg/L的吲哚丁酸(IBA)、8g/L的琼脂和20g/L的蔗糖，pH值为5.5～6.0的培养基。
进一步地，所述萌发培养基是以MS培养基为基础培养基，添加有终浓度为0.1mg/L的2，4-表油菜素内酯(EBR)、8g/L的琼脂和30g/L的蔗糖，pH值为5.8的培养基；
所述丛生苗诱导培养基是以1/2MS培养基为基础培养基，添加有终浓度为1.5mg/L的6-苄基嘌呤(6-BA)、2.0mg/L的α-萘乙酸(NAA)、0.6mg/L的吲哚丁酸(IBA)、0.2mg/L的赤霉素(GA3)、8g/L的琼脂和30g/L的蔗糖，pH值为5.8的培养基；
所述根系诱导培养基是以1/2MS培养基为基础培养基，添加有终浓度为0.6mg/L的吲哚丁酸(IBA)、0.2mg/L的α-萘乙酸(NAA)、8g/L的琼脂和20g/L的蔗糖，pH值为5.5～6.0的培养基。
进一步地，所述萌发培养基是以MS培养基为基础培养基，添加有终浓度为1.0mg/L的6-苄基嘌呤(6-BA)、3.0mg/L的α-萘乙酸(NAA)、0.2mg/L的赤霉素(GA3)、8g/L的琼脂和30g/L的蔗糖，pH值为5.8的培养基；
所述丛生苗诱导培养基是以1/2MS培养基为基础培养基，添加有终浓度为1.5mg/L的6-苄基嘌呤(6-BA)、0.6mg/L的吲哚丁酸(IBA)、0.2mg/L的赤霉素(GA3)、8g/L的琼脂和30g/L的蔗糖，pH值为5.8的培养基；
所述根系诱导培养基是以1/2MS培养基为基础培养基，添加有终浓度为0.6mg/L的吲哚丁酸(IBA)、0.2mg/L的α-萘乙酸(NAA)、8g/L的琼脂和20g/L的蔗糖，pH值为5.5～6.0的培养基。
进一步地，所述萌发培养基是以MS培养基为基础培养基，添加有终浓度为0.1mg/L的2，4-表油菜素内酯(EBR)、8g/L的琼脂和30g/L的蔗糖，pH值为5.8的培养基；
所述丛生苗诱导培养基是以1/2MS培养基为基础培养基，添加有终浓度为1.5mg/L的6-苄基嘌呤(6-BA)、0.6mg/L的吲哚丁酸(IBA)、0.2mg/L的赤霉素(GA3)、8g/L的琼脂和30g/L的蔗糖，pH值为5.8的培养基；
所述根系诱导培养基是以1/2MS培养基为基础培养基，添加有终浓度为0.6mg/L的吲哚丁酸(IBA)、0.2mg/L的α-萘乙酸(NAA)、8g/L的琼脂和20g/L的蔗糖，pH值为5.5～6.0的培养基。
本发明最后提供了一种羌活种子组培繁育方法，它是利用前述培养基栽培，具体步骤如下：
a、取羌活种子，在20～30℃湿沙中层积2～4个月，再在2～8℃湿沙中层积2～4个月，洗净后萌发1个月，取未萌发的饱满种子，剥除外种皮，洗净后消毒，得无菌种子
b、取无菌种子，切出伤口，接入萌发培养基中培养，得无菌苗；
c、取步骤b无菌苗，切除子叶，再转接入丛生苗诱导培养基中培养，得丛生苗；
d、取丛生苗分为单株，接入根系诱导培养基中培养，得羌活组培苗。
进一步地，步骤a所述洗净后消毒是用肥皂水浸泡1min，再用流水冲洗30min，最后用75％的乙醇浸泡20s，无菌水清洗后使用0.1％氯化汞浸泡9min，无菌水清洗后即可。
进一步地，步骤a所述萌发是在温度15℃，湿度75％，光照强为2200Lux，光照周期12h(光)/12h(暗)的条件下萌发1个月。
进一步地，所述层积3个月。
进一步地，步骤b所述伤口在种子边缘一侧。
进一步地，步骤d所述单株上保留2～4片叶子。
进一步地，所述培养的条件为：温度为23±2℃，光照强度为2500～3000Lux，光照周期为12h(光)/12h(暗)。
本发明所述1/2MS培养基是MS培养基配方中的大量元素减半，其余成分含量不变的培养基。
本发明所述MS培养基是植物组织中最常用的培养基之一，其配方组成为：
相较于现有技术，本发明具有以下显著效果：
1)使用经破眠后未萌发的羌活种子，提高了羌活种子的利用率，避免了资源浪费；
2)采取机械损伤处理种子的方法，使羌活种子在第4天开始有萌发，缩短了种子的发芽时间，提高了种子的萌发率；
3)优选的诱导种子萌发的培养基，将机械处理后的种子的萌发率提高到了70.48％；
4)不经过脱分化形成愈伤组织的培养过程，避免了愈伤组织生长过程中易产生变异苗的出现，保证了羌活优良性状的遗传稳定性；
5)优选的温度和光照可以保证羌活组培苗良好生长，提高羌活叶片光合作用，避免叶片褐化死亡现象的出现；
6)本发明的丛生苗诱导培养基可以有效诱导分化出丛生苗，无菌苗的繁殖系数最高为5.62；
7)本发明的生根培养基对羌活组培苗生根有良好的诱导效果，其根诱导率达17.39％，根系健壮、发散，未生根的组培苗生长状况良好，部分继续分化出丛生苗。在培养过程中，羌活地上部分长势良好，且成苗率高达95％，经后期试验验证，通过本发明羌活种子组培繁育方法得到的组培苗，移栽后的成活率达到了95.83％，为羌活的大量扩繁打下了坚实的基础。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1羌活种子无菌萌发(a.在侧切情况下种子的无菌萌发；b.在横切情况下种子的无菌萌发；c.在纵切情况下种子的无菌萌发)
图2羌活组培苗的生长发育阶段(a.丛生芽诱导的初始生长状况；b.丛生芽在培养基中培养30d的生长情况；c.组培苗生根培养30d时的生长情况；d.组培苗炼苗移栽30d时的生长情况)
具体实施方式
本发明具体实施方式中使用的原料、试剂和设备均为已知产品；可通过市售购买获得。
实施例1羌活种子无菌萌发及快速繁育
步骤1，羌活种子前处理：羌活种子先在25℃下湿沙层积3个月，再在4℃下湿沙层积3个月后，将种子取出，用蒸馏水冲洗干净后，放在铺有滤纸的培养皿中，在温度为15℃，湿度为75％，光照强度为2200Lux，光照周期为12h(光)/12h(暗)的恒温光照培养箱中进行萌发实验。1个月后，收集未萌发的种子，均匀混合后，放在湿润的无菌滤纸上，其保存在4℃冰箱中。
步骤2，羌活种子外植体的选取与处理：选取健康的种子，先将种子的外种皮剥除，再用肥皂水浸泡1min，在流水下冲洗30min，备用；
步骤3，羌活种子消毒：将步骤2处理后的羌活种子，在无菌操作台上，先使用75％的乙醇浸泡消毒20s，再使用无菌水清洗2次，然后使用0.1％氯化汞浸泡消毒9min，再使用无菌水清洗6次，得到无菌种子；
步骤4，羌活种子的无菌萌发：将步骤3中得到的无菌种子放置在无菌滤纸上，用解剖刀将一侧边缘切出一条伤口，将损伤后的种子接入培养基中，所述萌发培养基包括：MS培养基、1.0mg/L 6-苄基嘌呤(6-BA)、2.0mg/Lα-萘乙酸(NAA)、8g/L琼脂、30g/L蔗糖；所述萌发培养基的培养条件为pH＝5.8，温度为23±2℃，光照强度为2500～3000Lux，光照周期为12h(光)/12h(暗)；
步骤5，无菌苗的丛生苗诱导：在无菌操作台中将步骤4中萌发的种子无菌苗，切除两边的子叶，将无菌苗转入丛生苗诱导培养基中，所述的丛生苗诱导培养基包括：1/2MS培养基、0.3mg/L 6-苄基嘌呤(6-BA)、0.6mg/L吲哚丁酸(IBA)、0.2mg/L赤霉素(GA3)、8g/L琼脂、30g/L蔗糖；所述萌发培养基的培养条件为pH＝5.8，温度为23±2℃，光照强度为2500～3000Lux，光照周期为12h(光)/12h(暗)；
步骤6，组培苗的生根诱导：在无菌操作台中将步骤5中无菌苗诱导出来的丛生苗分为单株(每一株保留3片叶子左右)，并将其接入根系诱导培养基中，所述根系诱导培养基包括：1/2MS培养基、0.6mg/L吲哚丁酸(IBA)、8g/L琼脂、20g/L蔗糖；所述萌发培养基的培养条件为pH＝5.8，温度为23±2℃，光照强度为2500～3000Lux，光照周期为12h(光)/12h(暗)；
实施例2羌活种子无菌萌发及快速繁育
步骤1，羌活种子前处理：羌活种子先在25℃下湿沙层积3个月，再在4℃下湿沙层积3个月后，将种子取出，用蒸馏水冲洗干净后，放在铺有滤纸的培养皿中，在温度为15℃，湿度为75％，光照强度为2200Lux，光照周期为12h(光)/12h(暗)的恒温光照培养箱中进行萌发实验。1个月后，收集未萌发的种子，均匀混合后，放在湿润的无菌滤纸上，其保存在4℃冰箱中。
步骤2，羌活种子外植体的选取与处理：选取健康的种子，先将种子的外种皮剥除，再用肥皂水浸泡1min，在流水下冲洗30min，备用；
步骤3，羌活种子消毒：将步骤2处理后的羌活种子，在无菌操作台上，先使用75％的乙醇浸泡消毒20s，再使用无菌水清洗2次，然后使用0.1％氯化汞浸泡消毒9min，再使用无菌水清洗6次，得到无菌种子；
步骤4，羌活种子的无菌萌发：将步骤3中得到的无菌种子放置在无菌滤纸上，用解剖刀沿着种子的腹缝线将种子切成两半，将种子接入培养基中，所述萌发培养基包括：MS培养基、1.0mg/L 6-苄基嘌呤(6-BA)、2.0mg/Lα-萘乙酸(NAA)、8g/L琼脂、30g/L蔗糖；所述萌发培养基的培养条件为pH＝5.8，温度为23±2℃，光照强度为2500～3000Lux，光照周期为12h(光)/12h(暗)；
步骤5，无菌苗的丛生苗诱导：在无菌操作台中将步骤4中萌发的种子无菌苗，切除两边的子叶，将无菌苗转入丛生苗诱导培养基中，所述的丛生苗诱导培养基包括：1/2MS培养基、0.5mg/L 6-苄基嘌呤(6-BA)、0.6mg/L吲哚丁酸(IBA)、0.2mg/L赤霉素(GA3)、8g/L琼脂、30g/L蔗糖；所述萌发培养基的培养条件为pH＝5.8，温度为23±2℃，光照强度为2500～3000Lux，光照周期为12h(光)/12h(暗)；
步骤6，组培苗的生根诱导：在无菌操作台中将步骤5中无菌苗诱导出来的丛生苗分为单株(每一株保留3片叶子左右)，并将其接入根系诱导培养基中，所述根系诱导培养基包括：1/2MS培养基、0.6mg/L吲哚丁酸(IBA)、8g/L琼脂、20g/L蔗糖；所述萌发培养基的培养条件为pH＝5.8，温度为23±2℃，光照强度为2500～3000Lux，光照周期为12h(光)/12h(暗)。
实施例3羌活种子无菌萌发及快速繁育
步骤1，羌活种子前处理：羌活种子先在25℃下湿沙层积3个月，再在4℃下湿沙层积3个月后，将种子取出，用蒸馏水冲洗干净后，放在铺有滤纸的培养皿中，在温度为15℃，湿度为75％，光照强度为2200Lux，光照周期为12h(光)/12h(暗)的恒温光照培养箱中进行萌发实验。1个月后，收集未萌发的种子，均匀混合后，放在湿润的无菌滤纸上，其保存在4℃冰箱中。
步骤2，羌活种子外植体的选取与处理：选取健康的种子，先将种子的外种皮剥除，再用肥皂水浸泡1min，在流水下冲洗30min，备用；
步骤3，羌活种子消毒：将步骤2处理后的羌活种子，在无菌操作台上，先使用75％的乙醇浸泡消毒20s，再使用无菌水清洗2次，然后使用0.1％氯化汞浸泡消毒9min，再使用无菌水清洗6次，得到无菌种子；
步骤4，羌活种子的无菌萌发：将步骤3中得到的无菌种子放置在无菌滤纸上，用解剖刀沿着垂直种子腹缝线的方向，将种子横向切成两半，将种子接入培养基中，所述萌发培养基包括：MS培养基、1.0mg/L 6-苄基嘌呤(6-BA)、2.0mg/Lα-萘乙酸(NAA)、8g/L琼脂、30g/L蔗糖；所述萌发培养基的培养条件为pH＝5.8，温度为23±2℃，光照强度为2500～3000Lux，光照周期为12h(光)/12h(暗)；
步骤5，无菌苗的丛生苗诱导：在无菌操作台中将步骤4中萌发的种子无菌苗，切除两边的子叶，将无菌苗转入丛生苗诱导培养基中，所述的丛生苗诱导培养基包括：1/2MS培养基、1.0mg/L 6-苄基嘌呤(6-BA)、0.6mg/L吲哚丁酸(IBA)、0.2mg/L赤霉素(GA3)、8g/L琼脂、30g/L蔗糖；所述萌发培养基的培养条件为pH＝5.8，温度为23±2℃，光照强度为2500～3000Lux，光照周期为12h(光)/12h(暗)；
步骤6，组培苗的生根诱导：在无菌操作台中将步骤5中无菌苗诱导出来的丛生苗分为单株(每一株保留3片叶子左右)，并将其接入根系诱导培养基中，所述根系诱导培养基包括：1/2MS培养基、0.6mg/L吲哚丁酸(IBA)、8g/L琼脂、20g/L蔗糖；所述萌发培养基的培养条件为pH＝5.8，温度为23±2℃，光照强度为2500～3000Lux，光照周期为12h(光)/12h(暗)；
实施例4羌活种子无菌萌发及快速繁育
步骤1，羌活种子前处理：羌活种子先在25℃下湿沙层积3个月，再在4℃下湿沙层积3个月后，将种子取出，用蒸馏水冲洗干净后，放在铺有滤纸的培养皿中，在温度为15℃，湿度为75％，光照强度为2200Lux，光照周期为12h(光)/12h(暗)的恒温光照培养箱中进行萌发实验。1个月后，收集未萌发的种子，均匀混合后，放在湿润的无菌滤纸上，其保存在4℃冰箱中。
步骤2，羌活种子外植体的选取与处理：选取健康的种子，先将种子的外种皮剥除，再用肥皂水浸泡1min，在流水下冲洗30min，备用；
步骤3，羌活种子消毒：将步骤2处理后的羌活种子，在无菌操作台上，先使用75％的乙醇浸泡消毒20s，再使用无菌水清洗2次，然后使用0.1％氯化汞浸泡消毒9min，再使用无菌水清洗6次，得到无菌种子；
步骤4，羌活种子的无菌萌发：将步骤3中得到的无菌种子放置在无菌滤纸上，用解剖刀将一侧边缘切出一条伤口，将损伤后的种子接入培养基中，所述萌发培养基包括：MS培养基、0.1mg/L 2，4-表油菜素内酯(EBR)、8g/L琼脂、30g/L蔗糖；所述萌发培养基的培养条件为pH＝5.8，温度为16±2℃，光照强度为2500～3000Lux，光照周期为12h(光)/12h(暗)；
步骤5，无菌苗的丛生苗培养：在无菌操作台中将步骤4中萌发的种子无菌苗，切除两边的子叶，将无菌苗转入丛生苗诱导培养基中，所述的丛生苗诱导培养基包括：1/2MS培养基、1.5mg/L 6-苄基嘌呤(6-BA)、0.6mg/L吲哚丁酸(IBA)、2.0mg/Lα-萘乙酸(NAA)、0.2mg/L赤霉素(GA3)、8g/L琼脂、30g/L蔗糖；所述萌发培养基的培养条件为pH＝5.8，温度为23±2℃，光照强度为2500～3000Lux，光照周期为12h(光)/12h(暗)；
步骤6，组培苗的生根诱导：在无菌操作台中将步骤5中无菌苗诱导出来的丛生苗分为单株(每一株保留3片叶子左右)，并将其接入根系诱导培养基中，所述根系诱导培养基包括：1/2MS培养基、0.6mg/L吲哚丁酸(IBA)、0.2mg/Lα-萘乙酸(NAA)、8g/L琼脂、20g/L蔗糖；所述萌发培养基的培养条件为pH＝5.8，温度为23±2℃，光照强度为2500～3000Lux，光照周期为12h(光)/12h(暗)；
实施例5羌活种子无菌萌发及快速繁育
步骤1，羌活种子前处理：羌活种子先在25℃下湿沙层积3个月，再在4℃下湿沙层积3个月后，将种子取出，用蒸馏水冲洗干净后，放在铺有滤纸的培养皿中，在温度为15℃，湿度为75％，光照强度为2200Lux，光照周期为12h(光)/12h(暗)的恒温光照培养箱中进行萌发实验。1个月后，收集未萌发的种子，均匀混合后，放在湿润的无菌滤纸上，其保存在4℃冰箱中
步骤2，羌活种子外植体的选取与处理：选取健康的种子，先将种子的外种皮剥除，再用肥皂水浸泡1min，在流水下冲洗30min，备用；
步骤3，羌活种子消毒：将步骤2处理后的羌活种子，在无菌操作台上，先使用75％的乙醇浸泡消毒20s，再使用无菌水清洗2次，然后使用0.1％氯化汞浸泡消毒9min，再使用无菌水清洗5次，得到无菌种子；
步骤4，羌活种子的无菌萌发：将步骤3中得到的无菌种子放置在无菌滤纸上，用解剖刀将一侧边缘切出一条伤口，将损伤后的种子接入培养基中，所述萌发培养基包括：MS培养基、1.0mg/L 6-苄基嘌呤(6-BA)、3.0mg/Lα-萘乙酸(NAA)、0.2mg/L赤霉素(GA3)、8g/L琼脂、30g/L蔗糖；所述萌发培养基的培养条件为pH＝5.8，温度为23±2℃，光照强度为2500～3000Lux，光照周期为12h(光)/12h(暗)；
步骤5，无菌苗的丛生苗诱导：在无菌操作台中将步骤4中萌发的种子无菌苗，切除两边的子叶，将无菌苗转入丛生苗诱导培养基中，所述的丛生苗诱导培养基包括：1/2MS培养基、1.5mg/L 6-苄基嘌呤(6-BA)、0.6mg/L吲哚丁酸(IBA)、0.2mg/L赤霉素(GA3)、8g/L琼脂、30g/L蔗糖；所述萌发培养基的培养条件为pH＝5.8，温度为23±2℃，光照强度为2500～3000Lux，光照周期为12h(光)/12h(暗)；
步骤6，组培苗的生根诱导：在无菌操作台中将步骤5中无菌苗诱导出来的丛生苗分为单株(每一株保留3片叶子左右)，并将其接入根系诱导培养基中，所述根系诱导培养基包括：1/2MS培养基、0.6mg/L吲哚丁酸(IBA)、0.2mg/Lα-萘乙酸(NAA)、8g/L琼脂、20g/L蔗糖；所述萌发培养基的培养条件为pH＝5.8，温度为23±2℃，光照强度为2500～3000Lux，光照周期为12h(光)/12h(暗)。
实施例6本发明羌活种子无菌萌发及快速繁育
步骤1，羌活种子前处理：羌活种子先在25℃下湿沙层积3个月，再在4℃下湿沙层积3个月后，将种子取出，用蒸馏水冲洗干净后，放在铺有滤纸的培养皿中，在温度为15℃，湿度为75％，光照强度为2200Lux，光照周期为12h(光)/12h(暗)的恒温光照培养箱中进行萌发实验。1个月后，收集未萌发的种子，均匀混合后，放在湿润的无菌滤纸上，其保存在4℃冰箱中；
步骤2，羌活种子外植体的选取与处理：选取健康的种子，先将种子的外种皮剥除，再用肥皂水浸泡1min，在流水下冲洗30min，备用；
步骤3，羌活种子消毒：将步骤2处理后的羌活种子，在无菌操作台上，先使用75％的乙醇浸泡消毒20s，再使用无菌水清洗2次，然后使用0.1％氯化汞浸泡消毒9min，再使用无菌水清洗5次，得到无菌种子；
步骤4，羌活种子的无菌萌发：将步骤3中得到的无菌种子放置在无菌滤纸上，用解剖刀将一侧边缘切出一条伤口，将损伤后的种子接入培养基中，所述萌发培养基包括：MS培养基、0.1mg/L 2，4-表油菜素内酯(EBR)、8g/L琼脂、30g/L蔗糖；所述萌发培养基的培养条件为pH＝5.8，温度为23±2℃，光照强度为2500～3000Lux，光照周期为12h(光)/12h(暗)；
步骤5，无菌苗的丛生苗诱导：在无菌操作台中将步骤4中萌发的种子无菌苗，切除两边的子叶，将无菌苗转入丛生苗诱导培养基中，所述的丛生苗诱导培养基包括：1/2MS培养基、1.5mg/L 6-苄基嘌呤(6-BA)、0.6mg/L吲哚丁酸(IBA)、0.2mg/L赤霉素(GA3)、8g/L琼脂、30g/L蔗糖；所述萌发培养基的培养条件为pH＝5.8，温度为23±2℃，光照强度为2500～3000Lux，光照周期为12h(光)/12h(暗)；
步骤6，组培苗的生根诱导：在无菌操作台中将步骤5中无菌苗诱导出来的丛生苗分为单株(每一株保留3片叶子左右)，并将其接入根系诱导培养基中，所述根系诱导培养基包括：1/2MS培养基、0.6mg/L吲哚丁酸(IBA)、0.2mg/Lα-萘乙酸(NAA)、8g/L琼脂、20g/L蔗糖；所述萌发培养基的培养条件为pH＝5.8，温度为23±2℃，光照强度为2500～3000Lux，光照周期为12h(光)/12h(暗)。
以下通过试验例说明本发明的有益效果：
试验例1本发明组培繁育培养结果
1、实施例1的组培培养结果
回收滤纸上未萌发的羌活种子，通过解剖刀将一侧边缘切一条伤口的方式，在接入培养基的第3天开始有种子从切口处萌发，第1周的发芽率达到30.48％，第2周的萌发率达到最大，为40.95％。在丛生芽诱导培养基中获得的羌活丛生苗，其单次培养的增殖系数平均可达4.76。
经分株后羌活幼苗在生根培养基中壮苗生根培养，其根诱导率达15.16％，根系健壮、发散，未生根的组培苗生长状况良好，部分继续分化出丛生苗。
2、实施例2的组培培养结果
回收滤纸上未萌发的羌活种子，用解剖刀沿着种子腹缝线将种子切成两半，在接入培养基的第3天开始有种子从切口处萌发，第1周的发芽率达到15.24％，第2周的萌发率达到最大为19.05％。在丛生芽诱导培养基中获得的羌活丛生苗，其单次培养的增殖系数平均可达3.94。
经分株后羌活幼苗在生根培养基中壮苗生根培养，其根诱导率达15.16％，根系健壮、发散，未生根的组培苗生长状况良好，部分继续分化出丛生苗。
3、实施例3的组培培养结果
回收滤纸上未萌发的羌活种子，通过解剖刀垂直种子腹缝线的方向，将种子横向切成两半，在接入培养基的第3天开始有种子从切口处萌发，第1周的发芽率达到13.81％，第2周的萌发率达到最大，为16.19％。在丛生芽诱导培养基中获得的羌活丛生苗，其单次培养的增殖系数平均可达2.42。
经分株后羌活幼苗在生根培养基中壮苗生根培养，其根诱导率达15.16％，根系健壮、发散，未生根的组培苗生长状况良好，部分继续分化出丛生苗。
4、实施例4的组培培养结果
回收滤纸上未萌发的羌活种子，通过解剖刀将一侧边缘切一条伤口的方式，在接入培养基的第3天开始有种子从切口处萌发，第1周的发芽率为70.48％。在丛生芽诱导培养基中获得的羌活丛生苗，其单次培养的增殖系数平均可达5.06。
经分株后羌活幼苗在生根培养基中壮苗生根培养，其根诱导率达17.39％，根系健壮、发散，未生根的组培苗生长状况良好，部分继续分化出丛生苗。
5、实施例5的组培培养结果
回收滤纸上未萌发的羌活种子，通过解剖刀将一侧边缘切一条伤口的方式，在接入培养基的第3天就有种子从切口处萌发，第1周的发芽率为65.72％。在丛生苗诱导培养基中获得羌活丛生苗，其单次培养的增殖系数平均可达5.62。
经分株后羌活幼苗在生根培养基中壮苗生根培养，其根诱导率达17.39％，根系健壮、发散，未生根的组培苗生长状况良好，部分继续分化出丛生苗。
6、实施例6的组培培养及组培苗移栽后栽培结果
选取健康的羌活种子，消毒灭菌处理后，采用侧切的方式，萌发最佳培养基为MS+0.1mg/L EBR+30g/L蔗糖+8g/L琼脂中培养7d，萌发率为70.48％。在传统萌发方式下羌活的胚根最先突破种皮，随后子叶突破种皮；而在本次培育中，子叶最先从有伤口的地方生长出来(参见图1a，其中图1b和图1c为横切和纵切，用于和侧切比较)，随后胚根才从胚乳中脱离。无菌苗培养10d后，可转入丛生芽诱导培养基中诱导丛生芽，在培养基1/2MS+1.5mg/L6-BA+0.6mg/LIBA+0.2mg/LGA3+30g/L蔗糖+8g/L琼脂中培养30d。在丛生芽培养过程中可以发现，子叶逐渐枯萎死亡，无菌苗基部膨大形成愈伤组织，丛生芽渐渐从基部生长出来，初始生长时，组培苗幼嫩且柔弱，叶片蜷缩、细小且无法看出叶形(图2a)，随着培养时间的延长，茎伸长，叶片开始伸展，明显可以观察到叶脉，叶片边缘缺刻状，浅裂至羽状深裂(图2b)，其单次培养的增殖系数平均为5.62。选取长势较好的组培苗，转入最佳生根培养基1/2MS+0.6mg/LIBA+0.2mg/L NAA+20g/L蔗糖+8g/L琼脂中进行生根诱导，培养周期为30d。在转入生根培养基中，大约12d左右，组培苗开始生根，在最初生根的过程中，根系数量比较多，但是生长比较缓慢，根系粗短，随着培养时间的延长部分根系伸长，越靠近地上部分根越粗，远离地上部分的根系则最细(图2c)，其根诱导率达17.39％。在生根的过程中伴随着地上部分的长高和新的幼芽的长出，组培苗的成苗率为95％。培养周期最短为70d，即可进行炼苗移栽。选取长势较好，根系生长状况良好的组培苗进行炼苗移栽，炼苗移栽的土选用荷兰进口的泥炭土，在移栽前用营养液1/2MS+0.4mg/L NAA+0.4g/L多菌灵拌土，将组培苗移入装有泥炭土的育苗盘后，用营养液1/2MS+0.4mg/L NAA+0.4g/L多菌灵将土浇透，随后放在光照培养箱中培养，培养箱的温度为18±2℃，光照周期为12h(光)/12h(暗)，光照强度为2500～3000Lux。在炼苗移栽的过程中，土壤水分不能太多，且应该注意观察染菌情况，当土壤或者组培苗出现染菌时，可喷施浓度为0.4g/L的多菌灵杀菌。组培苗移入土中后，随着培养时间的延长，茎伸长、变粗，叶片伸展并且变得厚实，扒开土壤会发现有新的幼芽从土壤中长出(图2d)。炼苗移栽周期为30d，炼苗移栽的成活率为95.83％。
综上，本发明羌活种子组培繁育方法，使用经破眠后未萌发的羌活种子，提高了羌活种子的利用率，避免了资源浪费；采取机械损伤处理种子，缩短了种子的发芽时间，提高了种子的萌发率；在萌发培养基中培养，萌发率提高到了70％以上；在丛生苗诱导培养基可以有效诱导分化出丛生苗，无菌苗的繁殖系数提高到了5以上；在生根培养基中培养，根诱导率提高到17％以上，根系健壮、发散，未生根的组培苗生长状况良好，部分继续分化出丛生苗。在培养过程中，羌活地上部分长势良好，且成苗率高达95％，经后期试验验证，通过本发明羌活种子组培繁育方法得到的组培苗，移栽后的成活率达到了90％以上，为羌活的大量扩繁打下了坚实的基础，具备推广应用价值。
Claims (10)
1.一种用于羌活种子组培繁育的培养基，其特征在于：它包括萌发培养基、丛生苗诱导培养基和根系诱导培养基；
所述萌发培养基是以MS培养基为基础培养基，添加有终浓度为0.1～4.2mg/L的植物生长调节剂、5～10g/L的琼脂和25～35g/L的蔗糖，pH值为5.5～6.0的培养基；
所述丛生苗诱导培养基是以1/2MS培养基为基础培养基，添加有终浓度为1～4.5mg/L的植物生长调节剂、5～10g/L的琼脂和25～35g/L的蔗糖，pH值为5.5～6.0的培养基；
所述根系诱导培养基是以1/2MS培养基为基础培养基，添加有终浓度为0.4～1mg/L的植物生长调节剂、5～10g/L的琼脂和15～25g/L的蔗糖，pH值为5.5～6.0的培养基。
2.根据权利要求1所述培养基，其特征在于：所述植物生长调节剂为6-苄基嘌呤、α-萘乙酸、吲哚丁酸、赤霉素、2，4-表油菜素内酯中的任意一种或多种。
3.根据权利要求2所述培养基，其特征在于：所述萌发培养基是以MS培养基为基础培养基，添加有终浓度为1.0mg/L的6-苄基嘌呤、2.0mg/L的α-萘乙酸、8g/L的琼脂和30g/L的蔗糖，pH值为5.8的培养基；
所述丛生苗诱导培养基是以1/2MS培养基为基础培养基，添加有终浓度为0.3～1mg/L的6-苄基嘌呤、0.6mg/L的吲哚丁酸、0.2mg/L的赤霉素、8g/L的琼脂和30g/L的蔗糖，pH值为5.8的培养基；
所述根系诱导培养基是以1/2MS培养基为基础培养基，添加有终浓度为0.6mg/L的吲哚丁酸、8g/L的琼脂和20g/L的蔗糖，pH值为5.5～6.0的培养基。
4.根据权利要求2所述培养基，其特征在于：所述萌发培养基是以MS培养基为基础培养基，添加有终浓度为0.1mg/L的2，4-表油菜素内酯、8g/L的琼脂和30g/L的蔗糖，pH值为5.8的培养基；
所述丛生苗诱导培养基是以1/2MS培养基为基础培养基，添加有终浓度为1.5mg/L的6-苄基嘌呤、2.0mg/L的α-萘乙酸、0.6mg/L的吲哚丁酸、0.2mg/L的赤霉素、8g/L的琼脂和30g/L的蔗糖，pH值为5.8的培养基；
所述根系诱导培养基是以1/2MS培养基为基础培养基，添加有终浓度为0.6mg/L的吲哚丁酸、0.2mg/L的α-萘乙酸、8g/L的琼脂和20g/L的蔗糖，pH值为5.5～6.0的培养基。
5.根据权利要求2所述培养基，其特征在于：所述萌发培养基是以MS培养基为基础培养基，添加有终浓度为1.0mg/L的6-苄基嘌呤、3.0mg/L的α-萘乙酸、0.2mg/L的赤霉素、8g/L的琼脂和30g/L的蔗糖，pH值为5.8的培养基；
所述丛生苗诱导培养基是以1/2MS培养基为基础培养基，添加有终浓度为1.5mg/L的6-苄基嘌呤、0.6mg/L的吲哚丁酸、0.2mg/L的赤霉素、8g/L的琼脂和30g/L的蔗糖，pH值为5.8的培养基；
所述根系诱导培养基是以1/2MS培养基为基础培养基，添加有终浓度为0.6mg/L的吲哚丁酸、0.2mg/L的α-萘乙酸、8g/L的琼脂和20g/L的蔗糖，pH值为5.5～6.0的培养基。
6.根据权利要求2所述培养基，其特征在于：所述萌发培养基是以MS培养基为基础培养基，添加有终浓度为0.1mg/L的2，4-表油菜素内酯、8g/L的琼脂和30g/L的蔗糖，pH值为5.8的培养基；
所述丛生苗诱导培养基是以1/2MS培养基为基础培养基，添加有终浓度为1.5mg/L的6-苄基嘌呤、0.6mg/L的吲哚丁酸、0.2mg/L的赤霉素、8g/L的琼脂和30g/L的蔗糖，pH值为5.8的培养基；
所述根系诱导培养基是以1/2MS培养基为基础培养基，添加有终浓度为0.6mg/L的吲哚丁酸、0.2mg/L的α-萘乙酸、8g/L的琼脂和20g/L的蔗糖，pH值为5.5～6.0的培养基。
7.一种羌活种子组培繁育方法，其特征在于：它是利用权利要求1～6任意一项所述培养基栽培，具体步骤如下：
a、取羌活种子，在20～30℃湿沙中层积2～4个月，再在2～8℃湿沙中层积2～4个月，洗净后萌发1～2个月，取未萌发的饱满种子，剥除外种皮，洗净后消毒，得无菌种子
b、取无菌种子，切出伤口，接入萌发培养基中培养，得无菌苗；
c、取步骤b无菌苗，切除子叶，再转接入丛生苗诱导培养基中培养，得丛生苗；
d、取丛生苗分为单株，接入根系诱导培养基中培养，得羌活组培苗。
8.根据权利要求7所述羌活种子组培繁育方法，其特征在于：步骤a所述洗净后消毒是用肥皂水浸泡1min，再用流水冲洗30min，最后用75％的乙醇浸泡20s，无菌水清洗后使用0.1％氯化汞浸泡9min，无菌水清洗后即可；所述萌发是在温度15℃，湿度75％，光照强为2200Lux，光照周期12h(光)/12h(暗)的条件下萌发1个月；所述层积3个月。
9.根据权利要求7所述羌活种子组培繁育方法，其特征在于：步骤b所述伤口在种子边缘一侧；步骤d所述单株上保留2～4片叶子。
10.根据权利要求7所述羌活种子组培繁育方法，其特征在于：所述培养的条件为：温度为23±2℃，光照强度为2500～3000Lux，光照周期为12h(光)/12h(暗)。
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