CN104304035B - 金边玉簪的组织培养快繁方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种金边玉簪的组织培养快繁方法，解决此品种分株繁殖速度较慢，增殖系数极低的生产问题，该方法包括以下的步骤：1)外植体的选择；2)外植体灭菌；3)外植体初代培养；4)增殖培养；5)壮苗培养；6)生根培养；7)移栽驯化。本发明以植株基部分化芽为外植体，以MS为基本培养基，利用萘乙酸(NAA)、6-苄氨基嘌呤(6BA)，吲哚丁酸(IBA)激素调节，建立金边玉簪再生体系的方法。该发明一个增殖继代周期为4-6周，增殖系数控制在4-6倍，且不受季节的影响，可极大提高种苗繁殖系数，为该品种的开发和利用提供科学、有效的繁殖方法，满足生产需求进行产业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种金边玉簪的组织培养快繁方法。
技术背景
金边玉簪为百合科、玉簪属多年生草本宿根花卉，花白色或紫色，耐寒、耐荫，在浓荫通风处生长茂盛，是园林中林下地被植物，岩石园等处的重要的绿化材料。引自美国的金边玉簪是近年来园林绿化的新品种，备受人们喜爱，其叶片质地厚、有黄边相嵌，白色的花朵带着香气，既是极好的园林景观花卉，又是极具开发前景的药用植物。由于金边玉簪种子繁殖后代性状易发生变化，又需要三年才能开花；此品种生长较慢，分株繁殖速度较慢，增殖系数极低，每年仅能增殖2-4倍，极大地影响金边玉簪的生产与应用，因此周年生产受阻。
发明内容
本发明以优化再生体系为目的，以保持遗传稳定性为核心，提供一种金边玉簪高效再生体系建立的方法，以解决现在金边玉簪种子繁殖变异大、分株繁殖速度慢、不能满足产业化需求的问题。
本发明的技术方案为：一种金边玉簪植株再生体系建立的方法，所述再生体系建立方法是通过植株侧芽为外植体，分化出不定芽，经增殖、壮苗、生根、移栽驯化方法培育出小植株,本发明方法提高无菌苗分化率，增殖速度快，生根率高，驯化成活率高，为保持金边玉簪原有优良属性及规模化生产提供可靠的技术，其特征在于包括以下几个步骤：
1)外植体的选择：春季，选择健康植株萌发出来的嫩芽，用锋利刀片切下；
2)外植体灭菌：切去叶片的2/3，先用自来水洗净后，加适量洗洁精自来水冲洗30-40分钟，用滤纸吸干；加入质量千分比浓度1‰氯化汞溶液，加2滴吐温20(Tween20)浸泡，量至没过外植体材料，摇晃，8-10分钟后倒掉消毒液，然后，用无菌水冲洗外植体材料3-5次，表面没有泡沫后，吸干；
3)初代培养：将消毒好的外植体切去边缘，插于基本培养基MS上，培养20-30天，培养室内为22-25℃，光14小时，黑暗10小时,光照强度为1800～2000勒克斯(Lux)，Lux为：照度的国际单位；
4)增殖培养：将初代培养外植体材料，转接于MS+NAA0.1+6BA2培养基上培养4-6周后，所述培养基构成为：基本培养基MS附加0.1mg/L萘乙酸(NAA)和2mg/L6-苄氨基嘌呤(6-BA),每个外植体萌发出4-8个小侧芽；切取新长出的侧芽，去叶片后插入增殖培养基中，若需大量繁殖，可进行重复培养；培养室内为22-25℃，光14小时，黑暗10小时，光照强度为1800～2000勒克斯(Lux)；
5)壮苗培养：将长到1-2cm长的丛生芽剪切后移入壮苗培养基基本培养基MS中，培养3-4周，无菌苗长到2-4cm高度即可转入生根培养基中，增殖培养中的较大的无菌苗可直接转入生根培养基中，培养室内22-25℃，光14小时，黑10小时，光照强度为1800～2000勒克斯(Lux)；
6)生根培养：将在壮苗培养基中无菌苗转接至生根培养基1/2MS+NAA0.5+IBA1+活性炭，所述培养基构成为：基本培养基MS培养基中大量元素含量减半，附加0.5mg/L萘乙酸(NAA)、1mg/L吲哚丁酸(IBA)和活性炭3000mg/L,于24-26℃，光12小时，黑12小时，光照强度为1800～2000勒克斯(Lux)，培养1-2周；
7)驯化移栽：待根长1-2cm时，将瓶苗移至过渡培养间，瓶膜稍敞开，但并不完全揭开，保持瓶内与室内环境一致，1-2天后，去掉瓶膜1天，调水温20-22℃，洗去无菌苗根部的培养基，移入含有珍珠岩：蛭石体积比2：1的基质中，在保湿保温条件下进行驯化培育，逐步降低湿度、温度，30天后，计算成活率。
本发明采用组织培养技术，建立其高效再生体系，能够保持原品种优良性状，快速提高繁殖速度，满足生产需求进行产业化生产。本发明从外植体选择、消毒方法、初代培养、增殖培养、壮苗培养、生根培养及驯化移栽方法，建立了一套完整的金边玉簪植株再生体系，确定了组培繁殖培养基配方，直接分化不定芽，不定芽分化率达100％，一代增殖系数为5.3,生根率达到90.12％，移栽成活率达92％以上。本发明以植株基部分化芽为外植体，以MS为基本培养基，利用萘乙酸(NAA)、6-苄氨基嘌呤(6BA)，吲哚丁酸(IBA)激素调节，建立金边玉簪再生体系的方法。该发明一个增殖继代周期为4-6周，增殖系数控制在4-6倍，且不受季节的影响，可极大提高种苗繁殖系数，为该品种的开发和利用提供科学、有效的繁殖方法，满足生产需求进行产业化生产。
附图说明
图1增殖培养示意图
图2壮苗培养示意图
图3生根培养示意图
图4移栽驯化示意图
具体实施方式：
本发明实施的条件：无菌接种室、无菌培养室、过渡培养室、温室。
本发明的实质是：新生植株保持健康母本的遗传性状，再生植株品质好，繁殖系数大。
一种金边玉簪植株再生体系建立的方法，通过植株侧芽为外植体，分化出不定芽，经增殖、壮苗、生根、移栽驯化方法培育出优良小植株，具体步骤如下：
1)外植体的选择：春季，选择健康植株萌发出来的嫩芽，用锋利刀片切下；
2)外植体灭菌：切去叶片的2/3，先用自来水洗净后，加适量洗洁精自来水冲洗30-40分钟，用滤纸吸干；加入质量千分比浓度1‰氯化汞溶液，加2滴吐温20(Tween20)浸泡，量至没过外植体材料，摇晃，8-10分钟后倒掉消毒液，然后，用无菌水冲洗外植体材料3-5次，表面没有泡沫后，吸干；
3)初代培养：将步骤2)消毒好的外植体切去边缘，插于基本培养基MS上，培养20-30天，培养室内为22-25℃，光14小时，黑暗10小时,光照强度为1800～2000勒克斯(Lux)，Lux为：照度的国际单位；
4)增殖培养：将步骤3)初代培养外植体材料，转接于MS+NAA0.1+6BA2培养基上培养4-6周后，每个外植体萌发出4-8个小侧芽；切取新长出的侧芽，去叶片后插入增殖培养基中，若需大量繁殖，可进行重复培养；培养室内为22-25℃，光14小时，黑暗10小时，光照强度为1800～2000勒克斯(Lux)；
5)壮苗培养：将步骤4)长到1-2cm长的丛生芽剪切后移入壮苗培养基基本培养基MS中，培养3-4周，无菌苗长到2-4cm高度即可转入生根培养基中，增殖培养中的较大的无菌苗可直接转入生根培养基中，培养室内22-25℃，光14小时，黑10小时，光照强度为1800～2000勒克斯(Lux)；
6)生根培养：将在壮苗培养基中无菌苗转接至生根培养基1/2MS+NAA0.5+IBA1+活性炭，于24-26℃，光12小时，黑12小时，光照强度为1800～2000勒克斯(Lux)，培养1-2周，培养基中加入活性炭，提供局部黑暗环境，缩短生根时间；
7)驯化移栽：待步骤6)根长1-2cm时，将瓶苗移至过渡培养间，瓶膜稍敞开，但并不完全揭开，保持瓶内与室内环境一致，1-2天后，去掉瓶膜1天。调水温20-22℃，洗去无菌苗根部的培养基，移入含有珍珠岩：蛭石体积比2：1的基质中，在保湿保温条件下进行驯化培育，逐步降低湿度、温度，30天后，计算成活率。
基本培养基(MS)中所述大量元素，由质量百分比浓度，1900mg/L的硝酸钾(KNO3)，440mg/L的氯化钙(CaCl2·2H2O)，370mg/L的硫酸镁(MgSO4·7H2O)，1650mg/L的硝酸铵(NH4NO3)，170mg/L的磷酸二氢钾(KH2PO4·H2O)组成，配制大量元素母液1L，10倍量，分别取19000mgKNO3、4400mgCaCl2·2H2O、3700mgMgSO4·7H2O、16500mgNH4NO3、1700mgKH2PO4·H2O，分别溶解后混合定容至1L，每配制1L培养基取大量元素母液100ml；微量元素由体积百分比浓度为22.3mg/L的硫酸锰(MnSO4·4H2O)，6.2mg/L的硼酸(H3BO3)，8.6mg/L的硫酸锌(ZnSO4·7H2O)，0.25mg/L的钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)，0.025mg/L的硫酸铜(CuSO4·5H2O)，0.025mg/L的氯化钴(CoCl2·6H2O)，0.83mg/L的碘化钾(KI)组成，配制微量元素母液1L，100倍量，分别取2230mgMnSO4·4H2O、620mgH3BO3，860mgZnSO4·7H2O，25mgNa2MoO4·2H2O，2.5mgCuSO4·5H2O，2.5mgCoCl2·6H2O，83mgKI，分别溶解后混合定容至1L，每配制1L培养基取微量元母液10ml；铁盐由质量百分比浓度为27.8mg/L的硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)和质量百分比浓度为37.3mg/L的乙二胺四乙酸二钠(Na2·EDTA·2H2O)螯合后的溶液(EDTA-Fe)组成，配制铁盐母液1L，分别取2780mgFeSO4·7H2O、3730mgNa2·EDTA·2H2O，分别加热溶解，混合后再煮沸约20分钟，冷却后定容至1L，每配制1L培养基取铁盐溶液10ml；有机物由质量百分比浓度为0.5mg/L的烟酸，0.5mg/L的盐酸吡哆醇，0.4mg/L的盐酸硫胺素，2mg/L的甘氨酸，100mg/L的肌醇组成，配制有机物母液1L，分别取50mg的烟酸，50mg的盐酸吡哆醇，40mg的盐酸硫胺素，200mg的甘氨酸，10000mg的肌醇，分别溶解，混合后定容至1L，每配制1L培养基取有机物母液10ml；蔗糖30g/L，琼脂粉5g/L，pH值5.8～6.2。
如图1所示，培养20-30天。培养室内为22-25℃，光14小时，黑暗10小时,光照强度为1800～2000勒克斯(Lux)，不定芽分化率达100％。
如图2所示，丛生芽剪切后移入壮苗培养基基本培养基MS中，培养3-4周，培养室内22-25℃，光14小时，黑10小时，光照强度为1800～2000勒克斯(Lux)，一代增殖系数为5.3。
如图3所示，在壮苗培养基中无菌苗转接至生根培养基1/2MS+NAA0.5+IBA1+活性炭，于24-26℃，光12小时，黑12小时，光照强度为1800～2000勒克斯(Lux)，培养1-2周，生根率达到90.12％。
如图4所示，在珍珠岩：蛭石体积比2：1的基质中，在保湿保温条件下进行驯化培育，逐步降低湿度、温度，30天后，移栽成活率达92％以上。
如图1、图2、图3、图4所示，本发明从外植体选择、消毒方法、初代培养、增殖培养、壮苗培养、生根培养及驯化移栽方法，建立了一套完整的金边玉簪植株再生体系，确定了组培繁殖培养基配方，直接分化不定芽，不定芽分化率达100％，一代增殖系数为5.3,生根率达到90.12％，移栽成活率达92％以上。
Claims (2)
1.一种金边玉簪的组织培养快繁方法，其特征是：包括以下几个步骤：
1)外植体的选择：春季，选择健康植株萌发出来的嫩芽，用锋利刀片切下；
2)外植体灭菌：切去叶片的2/3，先用自来水洗净后，加适量洗洁精自来水冲洗30-40分钟，用滤纸吸干；加入质量千分比浓度1‰氯化汞溶液，加2滴吐温20(Tween20)浸泡，量至没过外植体材料，摇晃，8-10分钟后倒掉消毒液，然后，用无菌水冲洗外植体材料3-5次，表面没有泡沫后，吸干；
3)初代培养：将消毒好的外植体切去边缘，插于基本培养基MS上，培养20-30天，培养室内为22-25℃，光14小时，黑暗10小时,光照强度为1800～2000勒克斯(Lux)，Lux为：照度的国际单位；
4)增殖培养：将初代培养外植体材料，转接于MS+NAA0.1+6BA2培养基上培养4-6周后，所述培养基构成为：基本培养基MS附加0.1mg/L萘乙酸(NAA)和2mg/L6-苄氨基嘌呤(6-BA),每个外植体萌发出4-8个小侧芽；切取新长出的侧芽，去叶片后插入增殖培养基中，若需大量繁殖，进行重复培养；培养室内为22-25℃，光14小时，黑暗10小时，光照强度为1800～2000勒克斯(Lux)；
5)壮苗培养：将长到1-2cm长的丛生芽剪切后移入壮苗培养基基本培养基MS中，培养3-4周，无菌苗长到2-4cm高度即转入生根培养基中，增殖培养中的较大的无菌苗直接转入生根培养基中，培养室内22-25℃，光14小时，黑10小时，光照强度为1800～2000勒克斯(Lux)；
6)生根培养：将在壮苗培养基中无菌苗转接至生根培养基1/2MS+NAA0.5+IBA1+活性炭，所述培养基构成为：基本培养基MS培养基中大量元素含量减半，附加0.5mg/L萘乙酸(NAA)、1mg/L吲哚丁酸(IBA)和活性炭3000mg/L,于24-26℃，光12小时，黑12小时，光照强度为1800～2000勒克斯(Lux)，培养1-2周；
7)驯化移栽：待根长1-2cm时，将瓶苗移至过渡培养间，瓶膜稍敞开，但并不完全揭开，保持瓶内与室内环境一致，1-2天后，去掉瓶膜1天，调水温20-22℃，洗去无菌苗根部的培养基，移入含有珍珠岩：蛭石体积比2：1的基质中，在保湿保温条件下进行驯化培育，逐步降低湿度、温度，30天后，计算成活率。
2.根据权利要求1所述的一种金边玉簪的组织培养快繁方法，其特征是：基本培养基MS中所述大量元素，由质量百分比浓度，1900mg/L的硝酸钾(KNO3)，440mg/L的氯化钙(CaCl2·2H2O)，370mg/L的硫酸镁(MgSO4·7H2O)，1650mg/L的硝酸铵(NH4NO3)，170mg/L的磷酸二氢钾(KH2PO4·H2O)组成，配制大量元素母液1L，10倍量，分别取19000mgKNO3、4400mgCaCl2·2H2O、3700mgMgSO4·7H2O、16500mgNH4NO3、1700mgKH2PO4·H2O，分别溶解后混合定容至1L，每配制1L培养基取大量元素母液100ml；微量元素由体积百分比浓度为22.3mg/L的硫酸锰(MnSO4·4H2O)，6.2mg/L的硼酸(H3BO3)，8.6mg/L的硫酸锌(ZnSO4·7H2O)，0.25mg/L的钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)，0.025mg/L的硫酸铜(CuSO4·5H2O)，0.025mg/L的氯化钴(CoCl2·6H2O)，0.83mg/L的碘化钾(KI)组成，配制微量元素母液1L，100倍量，分别取2230mgMnSO4·4H2O、620mgH3BO3，860mgZnSO4·7H2O，25mgNa2MoO4·2H2O，2.5mgCuSO4·5H2O，2.5mgCoCl2·6H2O，83mgKI，分别溶解后混合定容至1L，每配制1L培养基取微量元母液10ml；铁盐由质量百分比浓度为27.8mg/L的硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)和质量百分比浓度为37.3mg/L的乙二胺四乙酸二钠(Na2·EDTA·2H2O)螯合后的溶液(EDTA-Fe)组成，配制铁盐母液1L，分别取2780mgFeSO4·7H2O、3730mgNa2·EDTA·2H2O，分别加热溶解，混合后再煮沸约20分钟，冷却后定容至1L，每配制1L培养基取铁盐溶液10ml；有机物由质量百分比浓度为0.5mg/L的烟酸，0.5mg/L的盐酸吡哆醇，0.4mg/L的盐酸硫胺素，2mg/L的甘氨酸，100mg/L的肌醇组成，配制有机物母液1L，分别取50mg的烟酸，50mg的盐酸吡哆醇，40mg的盐酸硫胺素，200mg的甘氨酸，10000mg的肌醇，分别溶解，混合后定容至1L，每配制1L培养基取有机物母液10ml；蔗糖30g/L，琼脂粉5g/L，pH值5.8～6.2。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20160615 Termination date: 20191114 |
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |