CN102119661B

CN102119661B - 一种杨梅组织培养的方法

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Publication number: CN102119661B
Application number: CN2010106034484A
Authority: CN
Inventors: 谢小波; 戚行江; 求盈盈; 郑锡良; 项康华; 周鑫
Original assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2010-12-24
Filing date: 2010-12-24
Publication date: 2012-05-09
Anticipated expiration: 2030-12-24
Also published as: CN102119661A

Abstract

本发明公开了一种杨梅组织培养的方法，属于植物组织培养技术领域。该方法包括：（1）培养基的配制；（2）杨梅无菌苗的培养等步骤。本发明针对杨梅枝条的特点，提出了独突、高效的灭菌方法，使杨梅外植体污染率由改进前的80~90%降低为40~50%，从而成功建立起杨梅无菌苗的培养体系，有效突破了杨梅组织培养中外植体污染率高的技术障碍，为现行杨梅生产栽培品种的改良奠定了技术基础。本发明可在杨梅品种改良研究与优良品种的快速繁育中推广应用。

Description

一种杨梅组织培养的方法

技术领域

本发明涉及植物组织培养技术领域，尤其涉及一种杨梅组织培养的方法。

背景技术

杨梅（Myrica rubra Sieb. & Zucc.）是我国南方重要的果树树种，果实酸甜适口，风味独特。近年来，杨梅种植面积发展迅速，全国目前已超过20万ha，且效益显著，已成为部分山区农民的主要收入来源。但是，杨梅生产中严重存在着品种类型单一的局面，长期来推广的品种均来自于地方品种，或从优选的单株中繁殖而来。

组织培养及在其基础上建立的诱变技术体系，是果树开展高效育种与生产用种改良的重要平台。组织培养在品种改良中的主要优势有：1）可以为诱变处理提供广泛的材料来源，如腋芽、茎、叶和细胞等均可作为外植体；2）可以方便地进行大群体突变处理和突变体选择；3）可以快速繁殖突变体材料；4）在无菌条件下的培养过程有助于脱毒，使繁殖材料符合检疫要求。

有关杨梅组织培养目前仅有胚培养方面的报道（Asghar et al., 2005, Asian Journal of Plant Sciences, 4:356~360；谢小波等，2009，26：507~511），而以其它器官或组织为外植体的组织培养研究至今还没有报道。究其原因我们在预备试验中发现，杨梅的新叶、芽尖等对酒精、次氯酸钠、升汞等灭菌剂非常敏感，在灭菌过程中极易造成对外植体的伤害；而老的枝条往往很难灭菌，虽然不及新叶和芽尖敏感，但灭菌时间稍长也同样易遭伤害，而时间短了又导致污染。据统计按常规方法灭菌杨梅组织培养的污染率可高达80~90%，导致在生产中无法实施。因此，生产上迫切希望能有一种对外植体灭菌效果较好，组织培养污染率较低的杨梅组织培养的方法，以借此促进杨梅新品种的选育和生产品种更新的进程。

发明内容

本发明目的是，针对常规方法灭菌易导致杨梅组织培养的污染率高达80~90%，在生产中无法实施的难题，提出一种对外植体灭菌效果较好，组织培养污染率较低的杨梅组织培养的方法。

本发明目的通过以下技术方案来实现。

一种杨梅组织培养的方法，按如下步骤进行：

（1）培养基的配制，包括基本培养基和各阶段培养基的组分及各组分在每升培养基中所含重量为：

1）基本培养基：其中，初始诱导、芽伸长和增殖以WPM为基本培养基，该培养基中蔗糖为30 g/L，琼脂粉为6~7 g/L，pH为5.6~5.8；生根以1/2 MS为基本培养基，该培养基中蔗糖为20 g/L，琼脂粉为6 g/L，pH为5.6；

2）初始诱导培养基Y1：WPM+6-BA 0~0.1 mg/L+NAA 0~0.02 mg/L+PVP 0.8~1.0 g/L；

3）新芽伸长及增殖培养基Y2：WPM+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.4~0.5 mg/L+GA₃ 0.3~0.4 mg/L+PVP 0.8~1.0 g/L；

4）生根培养基Y3：1/2 MS+IBA 0.5 mg/L，pH为5.6；

（2）杨梅无菌苗的培养：

1）外植体的选择及灭菌：以当年新生直径3~4 mm的杨梅枝条为外植体，剪去叶片、插入清水瓶中在室内养护1~2 d后，以自然水冲洗10~20 min，并将该枝条剪成2~3 cm的茎段；在超净工作台上先将茎段在其3倍体积的70%酒精中浸泡、摇动25~30 s；倒去酒精并用灭菌水冲洗2~3遍后，再在其3倍体积的0.1%升汞溶液中浸泡、摇动灭菌7~8 min，最后用无菌水冲洗5~7遍，并用灭菌剪刀将茎段两端各剪去1~2 mm组织后，备用；

2）初始诱导培养：将灭菌后外植体茎段按末端向下插入初始诱导培养基Y1中，在22~26 ℃、光强2000~3000 Lx、光照12 h/d条件下进行初始培养；培养3~5 d后将其中未污染的外植体茎段转接到新的Y1培养基中，并继续培养10~15 d至新芽长出；

3）新芽伸长培养：将长出新芽的外植体茎段剪去发黑端部后转插入Y2培养基中进行新芽伸长培养，在22~26 ℃、光强2000~3000 Lx、光照12 h/d条件下培养14~21 d，至新芽伸长到≧0.5 cm；

4）增殖培养：将步骤3）新芽剪下并转接到Y2培养基中，在22~26 ℃、光强2000~3000 Lx、光照12 h/d条件下进行增殖培养28~30 d，至新芽长出并伸长到1 cm以上；

5）生根培养：将步骤4）长至1 cm以上的新芽剪下，并剪去末端叶片后转接到生根培养基Y3，在22~26 ℃、光强2000~3000 Lx、光照12 h/d条件下培养，14~17 d后陆续长出新根即成杨梅组培苗。

本发明的有益效果是：

1）本发明提出的以当年新生直径3~4 mm的杨梅枝条为外植体，先用70%酒精浸泡25~30 s，再用0.1% HgCl₂溶液浸泡7~8 min的灭菌方法，由于上述的灭菌剂与相应的灭菌时间对杨梅新枝非常适宜，因此其灭菌效果较为理想，杨梅外植体污染率可由改进前的80~90%控制为40~50%，从而成功建立起杨梅无菌苗的培养体系，有效突破了以往我们在杨梅组织培养工作中外植体污染率高的技术障碍；

2）本发明建立的以无菌苗培养为核心的一种杨梅组织培养的方法，由于基本解决了外植体的污染难关，可以为促进杨梅新品种的选育和生产品种的更新奠定了技术基础。

3）从品种改良角度考虑，以杨梅胚以外的组织、器官为外植体的组织培养更有育种意义；本发明首次以当年新生直径3~4 mm的杨梅枝条为外植体，对以诱变技术为基础的杨梅高效品种改良平台建设具有非常重要的意义。

具体实施方式

通过以下实施例对本发明作进一步的详细说明，但本发明的内容并不局限于此。

6-BA：6-苄氨基嘌呤（6-Benzylaminopurine），鼎国生物技术有限责任公司提供；

NAA：α-萘乙酸（1-Naphthylacetic acid），鼎国生物技术有限责任公司提供；

GA₃：赤霉素（Gilberellic），鼎国生物技术有限责任公司提供，Genview分装；

IBA：吲哚-3-丁酸（Indole-3-Butyric acid）, 鼎国生物技术有限责任公司提供，国产；

PVP：聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpyrrolidone），上海生工生物技术有限公司提供，AMRSCO分装，在此用作防褐剂。

实施例1：（杨梅组织培养方法1）

1）基本培养基：其中，初始诱导、芽伸长和增殖以WPM为基本培养基，该培养基中蔗糖为30 g/L，琼脂粉为7 g/L，pH为5.6；生根以1/2 MS为基本培养基，该培养基中蔗糖为20 g/L，琼脂粉为6 g/L，pH为5.6；

所述的WPM培养基配方为：WPM培养基配方：大量元素：硝酸铵（NH₄NO₃）400 mg/L，硫酸钾（K₂SO₄）900 mg/L，磷酸二氢钾（KH₂PO₃）170 mg/L，硫酸镁（MgSO₄∙7H₂O）370 mg/L；钙盐：氯化钙（CaCl₂∙2H₂O）96 mg/L；四水合硝酸钙（Ca (NO₃)₂∙4H₂O）556 mg/L；微量元素：硼酸（H₃BO₃）6.2 mg/L，硫酸锰（MnSO₄∙4H₂O）22.5 mg/L，硫酸锌（ZnSO₄∙7H₂O）8.6 mg/L，钼酸钠（Na₂MoO₄∙2H₂O）0.25 mg/L，硫酸铜（CuSO₄∙5H₂O）0.25 mg/L；铁盐：乙二胺四乙酸二钠（Na₂-EDTA）37.3 mg/L，硫酸亚铁（FeSO₄∙7H₂O）27.8 mg/L；有机酸：肌醇100 mg/L，甘氨酸2 mg/L，盐酸硫胺素1 mg/L，盐酸吡哆醇0.5 mg/L，烟酸0.5 mg/L；

所述的1/2 MS培养基配方为：蔗糖20 g/L，琼脂粉6 g/L，pH为5.6，大量元素：硝酸铵（NH₄NO₃）825 mg/L，硝酸钾（KNO₃）850 mg/L，磷酸二氢钾（KH₂PO₃）85 mg/L，硫酸镁（MgSO₄∙7H₂O）185 mg/L；钙盐：氯化钙（CaCl₂∙2H₂O）220 mg/L；微量元素：碘化钾（KI）0.83 mg/L，硼酸（H₃BO₃）6.2 mg/L，硫酸锰（MnSO₄∙4H₂O）22.3 mg/L，硫酸锌（ZnSO₄∙7H₂O）8.6 mg/L，钼酸钠（Na₂MoO₄∙2H₂O）0.25 mg/L，硫酸铜（CuSO₄∙5H₂O）0.025 mg/L，氯化钴（CoCl₂∙6H₂O）0.025 mg/L；铁盐：乙二胺四乙酸二钠（Na₂-EDTA）37.3 mg/L,硫酸亚铁（FeSO₄∙7H₂O）27.8 mg/L；有机酸：肌醇100 mg/L，甘氨酸2 mg/L，盐酸硫胺素0.5 mg/L，盐酸吡哆醇0.5 mg/L，烟酸0.5 mg/L；

2）初始诱导培养基Y1：WPM+6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.02 mg/L+PVP0.8g/L；

3）新芽伸长及增殖培养基Y2：WPM+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.4 mg/L+GA₃ 0.4 mg/L+PVP 0.8 g/L；

4）生根培养基Y3：1/2 MS+IBA 0.5 mg/L，pH为5.6；

（2）杨梅无菌苗的培养：

1）外植体的选择及灭菌：以当年新生直径3~4 mm的杨梅枝条为外植体，剪去叶片、插入清水瓶中在室内养护1~2 d后，以自然水冲洗10~20 min，并将该枝条剪成2~3 cm的茎段；在超净工作台上先将茎段在其3倍体积的70%酒精中浸泡、摇动30 s；倒去酒精并用灭菌水冲洗3遍后，再在其3倍体积的0.1% HgCl₂溶液中浸泡、摇动灭菌7 min，最后用无菌水冲洗7遍，并用灭菌剪刀将茎段两端各剪去1~2 mm组织后，备用；

2）初始诱导培养：将灭菌后外植体茎段按末端向下插入初始诱导培养基Y1中，在22℃、光强3000 Lx、光照12 h/d条件下进行初始培养；培养3~5 d后将其中未污染的外植体茎段转接到新的Y1培养基中，并继续培养10 d至新芽长出；

3）新芽伸长培养：将长出新芽的外植体茎段剪去发黑端部后转插入到Y2培养基中进行新芽伸长培养，在22℃、光强3000 Lx、光照12 h/d条件下培养14 d，至新芽伸长到≧0.5 cm；

4）增殖培养：将步骤3）新芽剪下并转接到Y2培养基中，在22℃、光强3000 Lx、光照12 h/d条件下进行增殖培养28 d，至新芽长出并伸长到1 cm以上；

5）生根培养：将步骤4）长到1 cm以上的新芽剪下，并剪去未端叶片后转接到生根培养基Y3中，在22℃、光强3000 Lx、光照12 h/d条件下，培养14 d后陆续长出新根即成杨梅组培苗。

实施例2：（杨梅组织培养方法2）

本例中，步骤（1）培养基的配制：1）基本培养基：其中，WPM培养基中蔗糖为30 g/L，琼脂粉为6.5 g/L，pH为5.7；1/2 MS培养基中蔗糖为20 g/L，琼脂粉为6 g/L，pH为5.6；2）初始诱导培养基Y1：WPM+6-BA 0.05 mg/L+NAA 0.01 mg/L+PVP 0.9 g/L；3）新芽伸长及增殖培养基Y2：WPM+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.45 mg/L+GA₃ 0.35 mg/L+PVP 0.9 g/L；4）生根培养基Y3：1/2 MS+IBA 0.5 mg/L，pH为5.6；

步骤（2）杨梅无菌苗的培养：1）外植体的选择及灭菌：外植体茎段在70%酒精中浸泡、摇动28 s；再在0.1%HgCl₂溶液中浸泡、摇动灭菌7.5 min；2）初始诱导培养：在24℃、光强2500 Lx、光照12 h/d条件下培养13 d； 3）新芽伸长培养：在24℃、光强2500 Lx、光照12 h/d条件下培养17 d；4）增殖培养：在24℃、光强2500 Lx、光照12 h/d条件下培养29 d；5）生根培养：在24℃、光强2500 Lx、光照12 h/d条件下培养15 d；其余条件、工艺同于实施例1。

实施例3：（杨梅组织培养方法3）

本例中，步骤（1）培养基的配制：1）基本培养基：其中，WPM培养基中蔗糖为30 g/L，琼脂粉为6 g/L，pH为5.8；1/2 MS培养基中蔗糖为20 g/L，琼脂粉为6 g/L，pH为5.6；2）初始诱导培养基Y1：WPM+PVP 1.0 g/L；3）新芽伸长及增殖培养基Y2：WPM+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+GA₃ 0.3 mg/L+PVP 1.0 g/L；4）生根培养基Y3：1/2 MS+IBA 0.5 mg/L，pH为5.6；

步骤（2）杨梅无菌苗的培养：1）外植体的选择及灭菌：外植体茎段在70%酒精中浸泡、摇动25 s；再在0.1%HgCl₂溶液中浸泡、摇动灭菌8 min；2）初始诱导培养：在26℃、光强2000 Lx、光照12 h/d条件下培养15 d进行； 3）新芽伸长培养：在26℃、光强2000 Lx、光照12 h/d条件下培养21 d；4）增殖培养：在26℃、光强2000 Lx、光照12 h/d条件下培养30 d进行；5）生根培养：在26℃、光强2000 Lx、光照12 h/d条件下培养17 d；其余条件、工艺同于实施例1。

Claims

1.一种杨梅组织培养的方法，其特征在于按如下步骤进行：

(1)培养基的配制，包括基本培养基和各阶段培养基的组分及各组分在每升培养基中所含重量为：

1)基本培养基：其中，初始诱导、芽伸长和增殖以WPM为基本培养基，该培养基中蔗糖为30g/L，琼脂粉为6～7g/L，pH为5.6～5.8；生根以1/2MS为基本培养基，该培养基中蔗糖为20g/L，琼脂粉为6g/L，pH为5.6；

所述的WPM基本培养基配方为：大量元素：硝酸铵NH₄NO₃ 400mg/L，硫酸钾K₂SO₄ 900mg/L，磷酸二氢钾KH₂PO₃ 170mg/L，硫酸镁MgSO₄·7H₂O370mg/L；钙盐：氯化钙CaCl₂·2H₂O 96mg/L；四水合硝酸钙Ca(NO₃)₂·4H₂O 556mg/L；微量元素：硼酸H₃BO₃ 6.2mg/L，硫酸锰MnSO₄·4H₂O 22.5mg/L，硫酸锌ZnSO₄·7H₂O 8.6mg/L，钼酸钠Na₂MoO₄·2H₂O 0.25mg/L，硫酸铜CuSO₄·5H₂O0.25mg/L；铁盐：乙二胺四乙酸二钠Na₂-EDTA 37.3mg/L，硫酸亚铁FeSO₄·7H₂O27.8mg/L；有机酸：肌醇100mg/L，甘氨酸2mg/L，盐酸硫胺素1mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，烟酸0.5mg/L；

所述的1/2MS基本培养基配方为：蔗糖20g/L，琼脂粉6g/L，pH为5.6，大量元素：硝酸铵NH₄NO₃ 825mg/L，硝酸钾KNO₃ 850mg/L，磷酸二氢钾KH₂PO₃85mg/L，硫酸镁MgSO₄·7H₂O 185mg/L；钙盐：氯化钙CaCl₂·2H₂O 220mg/L；微量元素：碘化钾KI 0.83mg/L，硼酸H₃BO₃ 6.2mg/L，硫酸锰MnSO₄·4H₂O 22.3mg/L，硫酸锌ZnSO₄·7H₂O 8.6mg/L，钼酸钠Na₂MoO₄·2H₂O 0.25mg/L，硫酸铜CuSO₄·5H₂O 0.025mg/L，氯化钴CoCl₂·6H₂O 0.025mg/L；铁盐：乙二胺四乙酸二钠Na₂-EDTA 37.3mg/L，硫酸亚铁FeSO₄·7H₂O 27.8mg/L；有机酸：肌醇100mg/L，甘氨酸2mg/L，盐酸硫胺素0.5mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，烟酸0.5mg/L；

2)初始诱导培养基Y1：WPM+6-BA 0～0.1mg/L+NAA 0～0.02mg/L+PVP0.8～1.0g/L；

3)新芽伸长及增殖培养基Y2：WPM+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.4～0.5mg/L+GA₃ 0.3～0.4mg/L+PVP 0.8～1.0g/L；

4)生根培养基Y3：1/2MS+IBA0.5mg/L，pH为5.6；

(2)杨梅无菌苗的培养：

1)外植体的选择及灭菌：以当年新生直径3～4mm的杨梅枝条为外植体，剪去叶片、插入清水瓶中在室内养护1～2d后，以自来水冲洗10～20min，并将该枝条剪成2～3cm的茎段；在超净工作台上先将茎段在其3倍体积的70％酒精中浸泡、摇动25～30s；倒去酒精并用灭菌水冲洗2～3遍后，再在其3倍体积的0.1％升汞溶液中浸泡、摇动灭菌7～8min，最后用无菌水冲洗5～7遍，并用灭菌剪刀将茎段两端各剪去1～2mm组织后，备用；

2)初始诱导培养：将灭菌后外植体茎段按末端向下插入初始诱导培养基Y1中，在22～26℃、光强2000～3000Lx、光照12h/d条件下进行初始培养；培养3～5d后将其中未污染的外植体茎段转接到新的Y1培养基中，并继续培养10～15d至新芽长出；

3)新芽伸长培养：将长出新芽的外植体茎段剪去发黑端部后转插入Y2培养基中进行新芽伸长培养，在22～26℃、光强2000～3000Lx、光照12h/d条件下培养14～21d，至新芽伸长到≥0.5cm；

4)增殖培养：将步骤3)新芽剪下并转接到Y2培养基中，在22～26℃、光强2000～3000Lx、光照12h/d条件下进行增殖培养28～30d，至新芽长出并伸长到1cm以上；

5)生根培养：将步骤4)长至1cm以上的新芽剪下，并剪去末端叶片后转接到生根培养基Y3，在22～26℃、光强2000～3000Lx、光照12h/d条件下培养，14～17d后陆续长出新根即成杨梅组培苗。