CN112293257B - 一种秋水仙素诱导蝴蝶兰原球茎产生多倍体的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于多倍体育种技术领域，公开了一种秋水仙素诱导蝴蝶兰原球茎产生多倍体的方法，包括：将原球茎转接至含有0.05％的秋水仙素的1/2MS+1mg/l 6‑BA+0.2mg/l NAA+5g/l琼脂+20g/l蔗糖固体培养基中培养15天进行诱导处理；处理后用无菌水冲洗3‑4次，用滤纸吸干水分，转接在1/2MS+5g/l琼脂+20g/l蔗糖培养基中，继代培养2‑3次；多倍体鉴定：分别进行形态学观察、气孔鉴定和倍性鉴定；数据统计。本发明用不同浓度秋水仙素及不同处理时间对蝴蝶兰原球茎进行共培法加倍处理，为多倍体诱导培育花大色艳、观赏价值高的蝴蝶兰新品种奠定基础。

Description

一种秋水仙素诱导蝴蝶兰原球茎产生多倍体的方法

技术领域

本发明属于多倍体育种技术领域，尤其涉及一种秋水仙素诱导蝴蝶兰原球茎产生多倍体的方法。

背景技术

目前，蝴蝶兰为兰科蝴蝶兰属(Phalaenopsis)植物，花色繁多、形似蝴蝶，有“兰花皇后”的美誉。在花卉市场中，蝴蝶兰以花大色艳在花卉市场备受欢迎，栽培种主要为四倍体、三倍体和非整倍体，其中四倍体占绝大多数，可达82％，且多倍体常具有株型粗壮、叶花器官巨大、抗逆性强等优点，因此对蝴蝶兰进行多倍体育种诱导是蝴蝶兰育种的一个不可或缺的方式。兰花的组织培养技术较为成熟，因此兰花中大多采用组织培养结合加倍的方式进行多倍体诱导即离体加倍诱导。目前，兰花多倍体育种在石斛兰、蝴蝶兰、大花蕙兰等热带兰中的研究较多，兰花离体加倍常以种子、原球茎、丛生芽、茎段、嫩叶等分裂旺盛的器官为诱导对象，以秋水仙素、安磺灵等为诱导试剂，采用浸泡法、共培法、点滴法等方式诱导多倍体植株。研究表明，相比其他外植体，原球茎具有更高的繁殖系数，可产生大量植株，因此在离体加倍中大多选择原球茎为研究对象。蝴蝶兰原球茎诱导中，崔光荣等采用了浸泡法比较秋水仙素不同浓度及时间处理对原球茎的诱导效果，Astrid Aditya Putri等采用了50mg/l秋水仙素处理浸泡法10天比较了不同培养基对原球茎诱导的影响，此外Grlesbach等采用秋水仙素共培法诱导了蝴蝶兰原球茎，但仅有0.5mg/l、10天一个处理，并没有对秋水仙素的最适处理进行探讨。

通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：蝴蝶兰染色体加倍技术不稳定，加倍率较低，前人采用秋水仙素共培法诱导蝴蝶兰原球茎的研究中，并没有对秋水仙素的最适浓度和处理时间进行探讨。

解决以上问题及缺陷的难度为：秋水仙素共培法诱导原球茎时的浓度和处理时间需要掌握适度，过高会使得原球茎成活率过低，过低则会使得诱导率过低。

以上问题及缺陷的意义为：本发明采用不同浓度秋水仙素及不同处理时间对蝴蝶兰原球茎进行共培法加倍处理，以探讨秋水仙素诱导原球茎加倍的适宜条件，为蝴蝶兰多倍体诱导技术的改进以培育花大色艳、观赏价值高的蝴蝶兰新种质提供基础。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种秋水仙素诱导蝴蝶兰原球茎产生多倍体的方法。

本发明是这样实现的，一种秋水仙素诱导蝴蝶兰原球茎产生多倍体的方法，所述秋水仙素诱导蝴蝶兰原球茎产生多倍体的方法包括以下步骤：

步骤一，多倍体诱导：将原球茎转接至含秋水仙素的1/2MS+1mg/l6-BA+0.2mg/lNAA+5g/l琼脂+20g/l蔗糖固体培养基中进行加倍诱导处理。

步骤二，秋水仙素处理后用无菌水冲洗3-4次，用滤纸吸干水分，转接在1/2MS+5g/l琼脂+20g/l蔗糖培养基中，继代培养2-3次。使原球茎分化，长叶长根，长成组培苗。

步骤三，多倍体鉴定：分别进行形态学观察、气孔鉴定和倍性鉴定。

蝴蝶兰多倍体的形态、气孔特征区别于二倍体，因此，通过植株形态和气孔特征鉴定蝴蝶兰倍性可以作为间接指标。形态学鉴定是最基础、最简单的鉴定方式，主要通过植株的植株大小、株型、叶长、叶宽、叶片厚度、叶片颜色等形态初步鉴定植株的倍性。气孔鉴定则通过气孔大小/密度等初步鉴定植株的倍性。

倍性鉴定包括染色体计数(染色体制片)鉴定和流式细胞仪鉴定。染色体计数是最直接、最准确的鉴定方法，已广泛用于倍性鉴定，但其只能在小范围内应用且耗时耗力，大量鉴定植株倍性则采用流式细胞仪鉴定较好。以流式细胞仪倍性分析结果为标椎，统计变异株数量、计算变异率。以根尖细胞压片为辅助，进一步确定植株的倍性。

步骤四，数据统计：采用Excel2016做数据记录和数据分析，SPSS2.0进行方差分析，采用LSD多重比较方法，数据变动范围值均为所有处理数据值的标准差。

进一步，步骤一中，所述多倍体诱导处理的方法，包括：

(1)试验为两因素三水平，无菌条件下，将原球茎转接至含有浓度为0.05％、0.1％、0.2％秋水仙素的1/2MS+1mg/l 6-BA+0.2mg/l NAA+5g/l琼脂+20g/l蔗糖固体培养基中，分别处理5、10、15天；

(2)以不加秋水仙素的1/2MS+1mg/l 6-BA+0.2mg/l NAA+5g/l琼脂+20g/l蔗糖固体培养基为对照组，一共10个处理，每个处理重复五次。

进一步，步骤二中，所述继代培养的条件为：所述光照强度为2000lx，每日光照时间为12-14h，温度为(25±2)℃。

进一步，步骤三中，所述进行形态学观察的方法，包括：

植株分化成苗均有4片完全展开的叶片后，选取对照株和鉴定后成功加倍的变异株，各选择15株对植株长势、叶片大小、颜色等进行观察记录并对植株株高、叶片长宽进行测量比较。

进一步，步骤三中，所述进行气孔鉴定的方法，包括：

(I)使用无色透明指甲油，取加倍和未加倍植株各10株相同部位的叶片，在叶片下表皮涂抹一层无色透明指甲油。

(II)指甲油干后，用镊子撕取叶片下表皮，平铺在载玻片上，盖上盖玻片压平，在Leica倒置显微镜下观察并拍照。

(III)在10×10倍的显微镜下观察气孔的大小及单位面积内气孔的数量，并用Camera Measure随机测量10×40倍显微镜下30个气孔长度和宽度。

进一步，步骤三中，所述进行倍性鉴定的方法，包括：

(一)染色体压片分析

(1)待试管苗根尖长至1-2cm时，在上午9：00-11:00取试管苗根尖并用刀片去掉小于1cm的表皮。用0.002M 8-羟基喹啉预处理7-8h，蒸馏水洗净后用新配置的卡诺氏固定液固定24h。处理后保存在70％乙醇中。

(2)取已处理好的材料，蒸馏水洗2-3次，1mol/l盐酸常温处理5-6min，再在60℃恒温水浴中1mol/l盐酸处理7-8min，用蒸馏水洗2-3次后，在水中浸泡2-3h。

(3)切取根尖分生区部分置于载玻片上，用刀片切碎，滴1滴改良苯酚品红染液染色，盖上盖玻片，染色10min后，轻轻压片后迅速经过火焰6-7次，用带有橡皮的铅笔轻敲，使染色体分布均匀。

(4)在OLYMPUS DP73显微镜下观察，选择染色体分散较好的细胞进行拍照，统计染色体数目，对照株和变异株各统计10个区域确定染色体数目。

(二)流式细胞仪倍性分析

1)采用Sysmex CyStain UV Precise P试剂盒，以蝴蝶兰‘H-03’未加倍植株为对照，对秋水仙素处理后植株做倍性测定。

2)取待测植株新鲜叶片0.5cm²，置于培养皿中，取400ul萃取液滴加在叶片上，用刀片将叶片先横向纵向充分切碎。

3)2min后将切碎后的悬浮液用50um微孔滤膜过滤到样品管中，再加入1600ul DNA染液，避光染色2min后用德国Partec公司的型号为CY-S-3039的流式细胞仪进行分析，每个样品重复2次。

进一步，步骤(一)中，所述卡诺氏固定液按照体积比由无水乙醇：冰乙酸＝3:1组成。

结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明提供的秋水仙素诱导蝴蝶兰原球茎产生多倍体的方法，以蝴蝶兰杂交种‘H-03’(2n＝2x＝38)的原球茎为材料，采用共培法研究秋水仙素的诱导效果，秋水仙素浓度分别为0.05％、0.1％、0.2％，处理时间分别为5、10、15天。结果表明：浓度为0.05％的秋水仙素处理15天的效果最好，变异率为50％，存活率为30％；对处理后植株进行流式细胞仪鉴定和染色体压片分析发现变异株存在大量嵌合体；变异株与对照相比，形态特征表现为植株矮化、叶色加深、叶片表面粗糙、叶片变大、叶片偏短或偏圆等，部分植株表现出植株畸形或叶片扭曲；气孔观测表明，变异株气孔偏圆，单位面积气孔数减少，气孔增大，长、宽分别增长76.45％、38.99％。本发明结果为蝴蝶兰体细胞无性系变异新品种的培育提供了参考。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对本申请实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例提供的秋水仙素诱导蝴蝶兰原球茎产生多倍体的方法流程图。

图2是本发明实施例提供的秋水仙素处理浓度和时间对蝴蝶兰原球茎存活率的影响示意图。

图3A是本发明实施例提供的秋水仙素诱导蝴蝶兰多倍体形态比较中的对照株示意图。

图3B是本发明实施例提供的秋水仙素诱导蝴蝶兰多倍体形态比较中的变异株示意图。

图3C是本发明实施例提供的秋水仙素诱导蝴蝶兰多倍体形态比较中的变异株示意图。

图3D是本发明实施例提供的秋水仙素诱导蝴蝶兰多倍体形态比较中的对照和加倍后叶片对比示意图。

图4A是本发明实施例提供的秋水仙素诱导蝴蝶兰多倍体的气孔、保卫细胞比较中的对照株气孔(×10)示意图。

图4B是本发明实施例提供的秋水仙素诱导蝴蝶兰多倍体的气孔、保卫细胞比较中的变异株气孔(×10)示意图。

图4C是本发明实施例提供的秋水仙素诱导蝴蝶兰多倍体的气孔、保卫细胞比较中的对照株气孔(×40)示意图。

图4D是本发明实施例提供的秋水仙素诱导蝴蝶兰多倍体的气孔、保卫细胞比较中的变异株气孔(×40)示意图。

图5A是本发明实施例提供的秋水仙素诱导蝴蝶兰多倍体流式图和染色体图比较中的对照组植株出峰效果图。

图5B是本发明实施例提供的秋水仙素诱导蝴蝶兰多倍体流式图和染色体图比较中的变异株出峰效果图。

图5C是本发明实施例提供的秋水仙素诱导蝴蝶兰多倍体流式图和染色体图比较中的对照组植株染色体图(×60)示意图。

图5D是本发明实施例提供的秋水仙素诱导蝴蝶兰多倍体流式图和染色体图比较中的变异株染色体图(×60)示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种秋水仙素诱导蝴蝶兰原球茎产生多倍体的方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。

如图1所示，本发明实施例提供的秋水仙素诱导蝴蝶兰原球茎产生多倍体的方法包括以下步骤：

S101，多倍体诱导：将原球茎转接至含秋水仙素的1/2MS+1mg/l6-BA+0.2mg/l NAA+5g/l琼脂+20g/l蔗糖固体培养基中进行诱导处理。

S102，秋水仙素处理后用无菌水冲洗3-4次，用滤纸吸干水分，转接在1/2MS+5g/l琼脂+20g/l蔗糖培养基中，继代培养2-3次。

S103，多倍体鉴定：分别进行形态学观察、气孔鉴定和倍性鉴定。

S104，数据统计：采用Excel2016做数据记录和数据分析，SPSS2.0进行方差分析，采用LSD多重比较方法，数据变动范围值均为所有处理数据值的标准差。

下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步的描述。

本发明用不同浓度秋水仙素及不同处理时间对蝴蝶兰原球茎进行共培法加倍处理，探讨秋水仙素共培法处理原球茎的适宜浓度及处理时间，为多倍体诱导培育花大色艳、观赏价值高的蝴蝶兰新品种奠定基础。

1、材料与方法

1.1材料

试验材料为2019年通过杂交获得的蝴蝶兰杂交后代种子群体‘H-03’，以无菌播种30天萌发形成的原球茎为材料进行染色体加倍处理。试验在中国农业科学院蔬菜花卉研究所进行，母本‘1462’和父本‘1411’种植于温室，表型性状详见表1。

表1蝴蝶兰‘H-03’亲本基本表型

1.2方法

1.2.1多倍体诱导

试验为两因素三水平，无菌条件下，将原球茎转接至含有浓度为0.05％、0.1％、0.2％秋水仙素的1/2MS+1mg/l 6-BA+0.2mg/l NAA+5g/l琼脂+20g/l蔗糖固体培养基中，分别处理5、10、15天，以不加秋水仙素的1/2MS+1mg/l 6-BA+0.2mg/l NAA+5g/l琼脂+20g/l蔗糖固体培养基为对照组，一共10个处理，每个处理重复五次，各处理详见表1。秋水仙素处理后用无菌水冲洗3-4次，用滤纸吸干水分，转接在1/2MS+5g/l琼脂+20g/l蔗糖培养基中，继代培养2-3次。培养条件：光照强度为2000lx，每日光照时间：12-14h，温度：(25±2)℃，pH：5.8。

1.2.2多倍体鉴定

1.2.2.1形态学观察

植株分化成苗均有4片完全展开的叶片后，选取对照株和鉴定后成功加倍的变异株，各选择15株对植株长势、叶片大小、颜色等进行观察记录并对植株株高、叶片长宽进行测量比较。

1.2.2.2气孔鉴定

植株加倍后，加倍植株与未加倍植株的气孔有明显差距，因此气孔变化可作为加倍植株的初步鉴定标准。采用程强强等的方法(使用无色透明指甲油)，取加倍和未加倍植株各10株相同部位的叶片，在叶片下表皮涂抹一层无色透明指甲油，指甲油干后，用镊子撕取叶片下表皮，平铺在载玻片上，盖上盖玻片压平，在Leica倒置显微镜下观察并拍照。在10×10倍的显微镜下观察气孔的大小及单位面积内气孔的数量，并用Camera Measure随机测量10×40倍显微镜下30个气孔长度和宽度。

1.2.2.3倍性鉴定

1.2.2.3.1染色体压片分析

参考周建金、庄东红等的压片方法，待试管苗根尖长至1-2cm左右时，取试管苗根尖并用刀片去掉表皮(小于1cm)。用0.002M 8-羟基喹啉预处理7-8h，蒸馏水洗净后用新配置的卡诺氏固定液(无水乙醇：冰乙酸＝3:1)固定24h。处理后保存在70％乙醇中。取已处理好的材料，蒸馏水洗2-3次，1mol/l盐酸常温处理5-6min，再在60℃恒温水浴中1mol/l盐酸处理7-8min，用蒸馏水洗2-3次后，在水中浸泡2-3h。切取根尖分生区部分置于载玻片上，用刀片切碎，滴1滴改良苯酚品红染液染色，盖上盖玻片，染色10min后，轻轻压片后迅速经过火焰6-7次，用带有橡皮的铅笔轻敲，使染色体分布均匀。在OLYMPUS DP73显微镜下观察，选择染色体分散较好的细胞进行拍照，统计染色体数目，对照株和变异株各统计10个区域确定染色体数目。

1.2.2.3.2流式细胞仪倍性分析

采用Sysmex CyStain UV Precise P试剂盒，以蝴蝶兰‘H-03’未加倍植株为对照，对秋水仙素处理后植株做倍性测定。取待测植株新鲜叶片0.5cm²，置于培养皿中，取400ul萃取液滴加在叶片上，用刀片将叶片先横向纵向充分切碎。2min后将切碎后的悬浮液用50um微孔滤膜过滤到样品管中，再加入1600ul DNA染液，避光染色2min后用德国Partec公司的型号为CY-S-3039的流式细胞仪进行分析，每个样品重复2次。

1.2.2.4数据统计

采用Excel2016做数据记录和数据分析，SPSS2.0进行方差分析，采用LSD多重比较方法，表中数据变动范围值(±后)均为均值±标准差。

2、结果与分析

2.1不同处理秋水仙素处理诱导效果

不同秋水仙素浓度和处理时间对蝴蝶兰H-03原球茎影响差异较大，如图1所示，相同处理天数时，随着秋水仙素浓度升高，原球茎存活率逐渐下降；相同处理浓度时，随着处理天数的增加，原球茎存活率也呈下降趋势。0.05％秋水仙素共培处理对原球茎的伤害相对较小，存活率分别为30％、34.78％、64.71％；0.2％秋水仙素共培处理对原球茎伤害较大，存活率分别为14.29％、9.52％、5.94％。由表1可知，相同处理天数时，随着浓度的升高，变异率逐渐上升，但当处理时间为15天时，随着浓度升高，变异率下降；相同处理浓度时，随着处理天数增加，变异率呈上升趋势，但秋水仙素浓度为0.1％处理15天和浓度为0.2％处理15天时，变异率分别下降为31.25％和40％。由表1、图2可知，0.2％秋水仙素处理10天时，变异率最高为54.55％，但存活率较低，仅为9.52％；其次为0.2％秋水仙素处理5天或者0.05％秋水仙素处理10d变异率为50％，存活率分别为14.29％和30％。综上所述0.05％秋水仙素处理15天的效果最好，变异率为50％，存活率为30％，诱导效果最好。

2.2秋水仙素处理对植株形态的影响

秋水仙素处理后变异株与对照株有明显区别(见表2和图3)，主要表现出了植株矮化、叶色深绿、叶片表面粗糙、叶片变宽等性状(图3B)，部分植株还表现出畸形、叶片扭曲等现象(图3C)。从表3可以得到二倍体与四倍体长宽比分别为3.61，1.43，对照植株叶片狭长，与亲本相似呈现椭圆形，大部分变异株系叶片伸长受到抑制，叶片变短，而少数变异株新叶偏圆(图3D)，此外叶片数在变异株与对照株之间并没有明显差异，但株高、叶长、长宽比等分别与对照株相比有减少的趋势，减少了47.90％、40.71％、60.39％，叶宽有增加的趋势，增加了50.00％。

表2秋水仙素诱导蝴蝶兰多倍体的形态指标比较

注：大写字母不同表示差异极显著(P＜0.01)

2.3气孔观察

从表3可以得到对照株与变异株气孔长宽比分别为0.72和0.91，对照株气孔为长圆形，变异株为近圆形。此外从图4表3可看出变异株的气孔长度、宽度、保卫细胞长度、宽度与对照株相比显著升高，单位面积内气孔数减少，气孔长、宽和长宽比分别增长76.45％、38.99％和26.39％。

表3秋水仙素所诱导蝴蝶兰变异株系气孔形态指标比较

注：大写字母不同表示差异极显著(P＜0.01)

Note:Difference uppercase letters indicate a significant difference(P<0.01)

2.4倍性鉴定

以对照株为对照，采用流式细胞仪和染色体压片两种方式对诱导后的变异株进行鉴定。染色体压片是最准确、直接的鉴定方法，流式细胞仪可大量鉴定植株倍性。经流式细胞仪鉴定可发现未经秋水仙素处理的植株基本为二倍体(如图5A)，因此自然条件下原球茎加倍时很难实现的，秋水仙素共培法处理后能够得到大量的变异株，但基本为嵌合体(如图5B)。。此外，由表4可知，处理时间相同时，随着浓度的升高，变异率逐渐上升，当处理时间为15d时，随着浓度升高，变异率下降；相同处理浓度时，随着处理天数增加，变异率呈上升趋势，但秋水仙素浓度为0.1％处理15d和浓度为0.2％处理15d时，变异率分别下降为31.25％和40％。由图1和表4结果可知，0.2％秋水仙素处理10d时，变异率最高为54.55％，但存活率较低，仅为9.52％；其次为0.2％秋水仙素处理5天或者0.05％秋水仙素处理10d变异率为50.00％，存活率分别为14.29％和30％。综上所述0.05％秋水仙素处理15d的效果最好，变异率为50％，存活率为30％，诱导效果最好。对对照株和经流式细胞仪筛选的变异株根尖染色体压片鉴定后可发现，对照株的细胞染色体数目为2n＝2X＝38(如图5C)，秋水仙素处理后，变异株的染色体数目发生了改变，变异株加倍细胞染色体数目为2n＝4X＝76(如图5D)，大部分的变异株根尖中仍然存在染色体数目为2n＝2X＝38的未加倍细胞。

表4秋水仙素处理浓度和时间对蝴蝶兰原球茎变异率的影响

3、结果

植物组织培养与染色体加倍技术相结合具有环境条件易控制、短时间内能获得大量变异植株等优点，且蝴蝶兰组织培养技术相当成熟，因此对蝴蝶兰离体加倍方式进行探索具有重要意义。离体加倍方式主要以秋水仙素处理原球茎、类原球茎诱导加倍的研究较多且诱导加倍效果较好，崔广荣等采用浸泡法诱导蝴蝶兰原球茎加倍的最佳处理为浓度低于0.1％，时间不超过3d。本发明采用共培法的最佳处理浓度为0.05％，也未超过0.1％；Grlesbach等采用0.5mg/l的秋水仙素共培法处理10d诱导蝴蝶兰原球茎可以获得多倍体，Sarinee等采用0.05％秋水仙素共培处理9d诱导原球茎得到了50％的四倍体，本发明秋水仙素0.05％处理15d、0.2％处理5d和10d均得到了不低于50％的变异株。此外，处理时间过长、浓度过高均会致使植株死亡，因此适宜的秋水仙素处理浓度和处理时间至关重要，浓度过高或时间过长都对植株有较大的伤害，极易造成植株死亡和植株畸形等问题。本发明中，当处理浓度为0.1％、0.2％，处理时间为15d时，变异率有所下降，因此共培法诱导蝴蝶兰原球茎多倍体时，处理时间不超过15d、处理浓度不超过0.1％较好。

蝴蝶兰多倍体在形态特征等方面的变化与前人研究结果基本一致，形态方面均表现出了株高下降、植株粗壮、生长缓慢、叶色深绿、叶片表面粗壮等表型性状，此外，对照植株具有叶片偏狭长，变异株叶片具有偏短或偏圆的特点，其结果与Chung等的研究结果一致；变异株系的气孔特征均表现为气孔增大，单位面积内气孔数减少，此外对照株气孔接近于长圆形，变异株气孔接近于圆形，研究结果与唐娅梅等的结果一致。蝴蝶兰多倍体的形态、气孔特征区别于二倍体，因此，植株形态和气孔特征可以作为鉴定蝴蝶兰倍性的间接指标。

共培法诱导多倍体具有诱导率较高且污染率低的优点，但经常伴随着嵌合体的产生。本发明通过比较秋水仙素共培法诱导原球茎多倍体的适宜浓度和时间，获得最佳组合处理并得到了一定数量的变异株，但变异株系多为嵌合体，这样的嵌合体在育种难以直接利用。本发明结果与杨丽娟[37]等的研究结果一致，其采用秋水仙素浸泡法和共培法两种方式诱导大花蕙兰原球茎染色体加倍，结果显示共培法效果较好，污染率低但嵌合体较多。原因可能是秋水仙素与原球茎并未均匀接触，因此产生了大量的嵌合体。叶绍明等在对根状茎变异部位进行切割分离时发现提早分离可有效防止嵌合体的产生，Chen等采用水平切割原球茎结合组培的方式得到了大量的多倍体植株，Grosso等通过流式细胞仪对诱导后的原球茎进行早期筛选的方式获得多倍体。因此，在共培法诱导后，采用切割和流式细胞仪等方式分离嵌合体选择纯合体是可以尝试的一种方式。

本发明以蝴蝶兰杂交种子‘H-03’原球茎为材料，采用秋水仙素共培法诱导染色体加倍，并根据诱导后组培苗形态、气孔特征和流式细胞仪分析、染色体压片结果进行多倍性的鉴定。结果表明0.05％秋水仙素共培处理15天综合诱导效果最好，可得到50％的变异株，且变异株形态和气孔特征均发生了明显的改变。本试验探究了秋水仙素共培法诱导原球茎多倍体的适宜处理时间和浓度，得到了一定数量的变异株系，为进一步鉴定稳定多倍体株系，培育出观赏价值高的蝴蝶兰新种质提供了基础。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种秋水仙素诱导蝴蝶兰原球茎产生多倍体的方法，其特征在于，所述秋水仙素诱导蝴蝶兰原球茎产生多倍体的方法包括以下步骤：

多倍体诱导：将原球茎转接至含秋水仙素的固体培养基中进行诱导处理；

将经秋水仙素处理的原球茎转接在培养基中，继代培养；

多倍体鉴定：对所得的原球茎分别进行形态学观察、气孔鉴定和倍性鉴定；

对获得的数据进行统计和分析，所述分析包括进行方差分析和采用LSD多重比较方法，其中数据变动范围值均为所有处理数据值的标准差；

所述多倍体诱导处理的方法，包括：

(1)试验为两因素三水平，无菌条件下，将原球茎转接至含有浓度为0.05％、0.1％、0.2％秋水仙素的1/2MS+1mg/l 6-BA+0.2mg/l NAA+5g/l琼脂+20g/l蔗糖固体培养基中，分别处理5、10、15天；

(2)以不加秋水仙素的1/2MS+1mg/l 6-BA+0.2mg/lNAA+5g/l琼脂+20g/l蔗糖固体培养基为对照组，一共10个处理，每个处理重复五次。

2.如权利要求1所述的秋水仙素诱导蝴蝶兰原球茎产生多倍体的方法，其特征在于，继代培养的条件为：所述光照强度为2000lx，每日光照时间为12-14h，温度为25±2℃，pH为5.8。

3.如权利要求1所述的秋水仙素诱导蝴蝶兰原球茎产生多倍体的方法，其特征在于，秋水仙素处理后用无菌水冲洗原球茎3-4次，用滤纸吸干水分，并将其转接在1/2MS+5g/l琼脂+20g/l蔗糖培养基中，继代培养2-3次。

4.如权利要求1所述的秋水仙素诱导蝴蝶兰原球茎产生多倍体的方法，其特征在于，所述形态学观察包括：植株分化成苗均有4片完全展开的叶片后，选取对照株和鉴定后成功加倍的变异株各15株，对植株长势、叶片大小、颜色等进行观察记录并对植株株高、叶片长宽进行测量比较。

5.如权利要求1所述的秋水仙素诱导蝴蝶兰原球茎产生多倍体的方法，其特征在于，所述气孔鉴定包括：

(I)使用无色透明指甲油，取加倍和未加倍植株各10株相同部位的叶片，在叶片下表皮涂抹一层无色透明指甲油；

(II)指甲油干后，用镊子撕取叶片下表皮，平铺在载玻片上，盖上盖玻片压平，在Leica倒置显微镜下观察并拍照；

(III)在10×10倍的显微镜下观察气孔的大小及单位面积内气孔的数量，并用CameraMeasure随机测量10×40倍显微镜下30个气孔长度和宽度。

6.如权利要求1所述的秋水仙素诱导蝴蝶兰原球茎产生多倍体的方法，其特征在于，所述倍性鉴定包括：

(一)染色体压片分析

(1)待试管苗根尖长至1-2cm时，在取试管苗根尖并用刀片去掉表皮；用0.002M8-羟基喹啉预处理7-8h，蒸馏水洗净后用新配置的卡诺氏固定液固定24h；处理后保存在70％乙醇中；

(2)取已处理好的材料，蒸馏水洗，盐酸常温处理，再在恒温水浴中盐酸处理，用蒸馏水洗后，在水中浸泡；

(3)切取根尖分生区部分置于载玻片上，用刀片切碎，滴1滴改良苯酚品红染液染色，盖上盖玻片，染色10min后，轻轻压片后迅速经过火焰6-7次，用带有橡皮的铅笔轻敲，使染色体分布均匀；

(4)在OLYMPUSDP73显微镜下观察，选择染色体分散较好的细胞进行拍照，统计染色体数目，对照株和变异株各统计10个区域确定染色体数目；

(二)流式细胞仪倍性分析

1)采用Sysmex CyStain UV Precise P试剂盒，以蝴蝶兰‘H-03’未加倍植株为对照，对秋水仙素处理后植株做倍性测定；

2)取待测植株新鲜叶片0.5cm 2，置于培养皿中，取400ulCystain UV PrecisePNucleiExtractionBuffer萃取液滴加在叶片上，用刀片将叶片先横向纵向充分切碎；

3)2min后将切碎后的悬浮液用50um微孔滤膜过滤到样品管中，再加入1600ulCystainUV Precise P Staining Buffer染液，避光染色2min后用德国Partec公司的型号为CY-S-3039的流式细胞仪进行分析，每个样品重复2次。

7.如权利要求6所述的秋水仙素诱导蝴蝶兰原球茎产生多倍体的方法，其特征在于，(一)中卡诺氏固定液由无水乙醇：冰乙酸＝3:1组成。

8.如权利要求6所述的秋水仙素诱导蝴蝶兰原球茎产生多倍体的方法，其特征在于，取已处理好的材料，蒸馏水洗2-3次，1mol/l盐酸常温处理5-6min，再在60℃恒温水浴中1mol/l盐酸处理7-8min，用蒸馏水洗2-3次后，在水中浸泡2-3h。

9.如权利要求1所述的秋水仙素诱导蝴蝶兰原球茎产生多倍体的方法，其特征在于，所述数据统计和分析包括进行方差分析和采用LSD多重比较方法，其中数据变动范围值均为所有均值±标准差。

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