CN116334284A - 与谷子籽粒蛋白质含量性状相关的snp标记及其检测引物和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种与谷子籽粒蛋白质含量性状相关的SNP标记及其检测引物和应用，SNP标记为GPC‑09‑404标记，位于谷子第9染色体第51549836位，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。本发明提供的SNP标记，通过谷子自然群体表型鉴定，验证开发的SNP标记表型选择效率达到97.9％，可以快速、精准地检测谷子籽粒蛋白质含量的高低。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种与谷子籽粒蛋白质含量性状相关的SNP标记及其检测引物和应用。
背景技术
谷子是我国较早的栽培作物之一，具有抗旱、耐贫瘠和适应性强等特点，在亚洲和非洲国家广泛种植。谷子富含碳水化合物、维生素、脂肪、矿物质、叶酸，以及微量元素铜、锌、硒等。蛋白质是构成人体细胞结构的重要成分，是生命物质的基础，也是生命活动的承担着。人体所需的蛋白质主要来源于日常食物，在北方，谷子是人体蛋白质摄入的来源之一。不同品种的谷子蛋白质含量相差很大，有研究说谷子蛋白质平均含量是13.18％，高于小麦、水稻和高粱等粮食作物。而且谷子蛋白中的亮氨酸、色氨酸和蛋氨酸等人体必需氨基酸比例均衡，不仅可以调节睡眠，还可以降低患脂肪肝的风险。因此，高蛋白质谷子品种的筛选、鉴定和创新是谷子高品质育种的基础，对谷子育种具有重要意义。蛋白质含量受到农艺性状、土壤营养、生态区等各种因素的影响，更主要的是由遗传因素造成的差异。
单核苷酸多态性(singlenucleotide poltmorphism,SNP)是基因组水平上单个核苷酸碱基的变异引起的DNA序列多态性，其在基因组中数量多，分布广泛，遗传稳定性好。随着基因测序技术的发展和成本的降低，对不同个体同一基因或者基因片段进行直接测序和序列比较，就能确定碱基是否存在变异。因此，SNP检测有利于基因分型，适用于快速和规模化地筛查未知或已知SNP与某遗传性状的关系。
目前关于谷子数量性状相关的QTL定位和SNP标记研究主要集中于SSR标记的开发利用等途经，而利用群体自交系简并基因组测序检测多态性的SNP分子标记的开发应用研究尚未有报道。因此，开展谷子数量性状SNP分子标记的开发，并建立辅助选育体系，对于提高谷子品质，节约育种成本具有重要意义。
发明内容
为了解决现有技术存在的上述不足，本发明的目的是提供一种与谷子籽粒蛋白质含量性状相关的SNP标记及其检测引物和应用，可以对谷子籽粒蛋白含量进行良好分型，用于谷子籽粒蛋白形状的分子标记辅助育种。
本发明的第一个目的是提供一种与谷子籽粒蛋白质含量性状相关的SNP标记，该SNP标记为GPC-09-404标记，位于谷子第9染色体第51549836位，其核苷酸序列如下：
CAGCCGTGCCCGGCGAACCAGGACGCCGGCGCGTCG[A/C]TGCCG ACGTGCGCCTTCTCCAAGCCCTTCGCCGACGCCTCCTTCCAGGCGTCG TTGGGCAGCGACACGCTGCGCCTGGGCAAGGACGCCATC，该序列具体为
CAGCCGTGCCCGGCGAACCAGGACGCCGGCGCGTCGATGCCGACGTGCGCCTTCTCCAAGCCCTTCGCCGACGCCTCCTTCCAGGCGTCGTTGGGCAGCGACACGCTGCGCCTGGGCAAGGACGCCATC(SEQ ID NO.1)或
CAGCCGTGCCCGGCGAACCAGGACGCCGGCGCGTCGCTGCCGACGTGCGCCTTCTCCAAGCCCTTCGCCGACGCCTCCTTCCAGGCGTCGTTGGGCAGCGACACGCTGCGCCTGGGCAAGGACGCCATC(SEQ ID NO.2)
本发明的第二个目的是提供一种用于检测上述SNP标记的引物组合物，该引物组合物包括两对引物，分别如下：
第一对引物：
正向引物(PrimerX)：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’(SEQ ID NO.3)；
反向引物(通用引物)：5’-ACTGGTGCCCGCTCTTCC-3’(SEQ ID NO.4)；
第二对引物：
正向引物(PrimerY)：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’(SEQ ID NO.5)；
反向引物(通用引物)：5’-ACTGGTGCCCGCTCTTCC-3’(SEQ ID NO.4)。
本发明的第三个目的是提供一种检测谷子籽粒蛋白质含量的方法，包括以下步骤：
提取待测谷子样品的基因组DNA；
以提取的基因组DNA为模板，利用上述引物组合物对其进行PCR扩增，若扩增产物只检测到引物PrimerX对应的荧光信号，则检测位点为碱基A，判定待测谷子样品籽粒蛋白质含量为低蛋白；
若扩增产物只检测到引物PrimerY对应的荧光信号，则检测位点为碱基C，判定待测谷子样品籽粒蛋白质含量为高蛋白。
本发明利用基于KASP反应原理及材料的单碱基差异设计的标记能高通量对谷子材料进行检测。每个标记有三条引物组成，两条特异性引物5’端分别链接KASP反应试剂特定的荧光接头序列，一条通用引物，因此，只需检测扩增产物对应哪条特异性引物对应的荧光标记信号即可判断待测谷子样品籽粒蛋白质含量的高低。此处的高蛋白含量是谷子样品籽粒蛋白质含量高于现有技术中公开的谷子蛋白质的平均含量即高于13.18％，尤其是大于等于13.57％时记为高蛋白含量，而低于13.57％时记为低蛋白含量。
进一步，扩增体系包括：HiGeno 2x Probe Mix、SNP-Specific Primers、DNA模板和无菌水。
进一步，扩增程序为：程序1：95℃预变性10-15min，1个循环；
程序2：95℃变性20secs，61-55℃退火/延伸40secs，10个循环；
程序3：95℃变性20secs，55℃退火/延伸40secs，28-34个循环。
本发明的第四个目的是提供一种与谷子籽粒蛋白质含量性状相关的SNP标记在谷子籽粒蛋白质含量测定或分子筛选育种中的应用。
本发明的第五个目的是提供一种检测谷子籽粒蛋白质含量的方法在谷子分子筛选育种中的应用。
本发明的第六个目的是提供一种筛选或辅助筛选具有高/低籽粒蛋白质含量的性状的谷子的方法，包括：按照上述方法检测谷子籽粒蛋白质含量，然后根据检测结果筛选或辅助筛选具有高/低籽粒蛋白质含量的性状的谷子。
本发明的第七个目的是提供一种谷子育种方法，包括：将上述筛选得到的具有高籽粒蛋白质含量的性状的谷子作为育种材料进行育种。
本发明的第八个目的是提供一种检测谷子籽粒蛋白质含量的试剂盒，试剂盒包括上述引物组合物。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供的SNP标记，通过谷子自然群体表型鉴定，验证开发的SNP标记表型选择效率达到97.9％，可以快速、精准地检测谷子籽粒蛋白质含量的高低。本申请利用KASP技术对所开发的SNP标记进行基因分型，KASP技术流程中DNA的抽提、PCR体系构建和荧光信号检测等基本实现自动化，可实现96,384,1536孔板高通量检测，适用于大规模、高通量使用，同时可在分子标记辅助育种的早期进行筛选，减小育种群体规模，加快育种进程，为培育高品质谷子品种提供技术支持。
附图说明
图1为GPC-09-404标记在自然群体分型结果图。
具体实施方式
以下所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1：
一、引物设计
利用来自山西省不同地市的400份谷子作为试验材料，对其进行重测序，结合籽粒蛋白质含量相关表型数据，获得与之相关的SNP标记。本申请采用的400份谷子材料均来自山西作物种质资源库，采用的参考基因组是张谷，并通过采用DNAMAN软件和在线工具Primer3结合进行引物设计。每组引物有三条引物，其中有两条引物的5’端有荧光标记，具体引物如表1所示：
表1引物信息
| PrimerX | 5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’ |
| PrimerY | 5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’ |
| 通用引物 | 5’-ACTGGTGCCCGCTCTTCC-3’ |
二、样品检测
(1)DNA提取：采用简化CTAB法从谷子稻粒中提取基因组DNA；
(2)KASP反应：KASP反应测试在AQPTM基因分型系统又称等位基因特异的定量PCR基因分型系统(Allele-Specific Quantitative PCR based genotyping assay，AQP)下进行。在微孔反应板中加入20ng高质量的DNA样品，然后进行PCR扩增。DNA样品分干DNA和湿DNA，湿DNA和干DNA分别的反应体系见表2和表3。PCR扩增程序使用一组包括两个温度步骤的热循环条件，先进行预变性，然后在PCR基因扩增仪上进行热循环扩增，具体条件见表4。
表2湿DNA方法PCR反应体系各组分构成
表3干DNA方法PCR反应体系各组分构成
表4AQPTM基因分型系统PCR扩增热循环条件
当使用烘干NDA做模板时，预变性时间为15min，以便DNA可充分溶解。
三、荧光信号读取
PCR扩增循环结束后，在终点荧光模式下，利用荧光定量PCR仪或者读板机读取荧光信号值。
四、标记分型数据
根据上述检测方法(现以湿DNA法，96孔板为例)，用标记GPC-09-404对已知蛋白含量的谷子品种进行KASP初筛反应验证，结果如表5所示，籽粒蛋白含量高的均显示C，而蛋白质含量低的则显示A，证明了本发明对谷子籽粒蛋白质含量检测的准确性。
表5标记GPC-09-404初筛分型数据
由表5可知，400份样品中，检测效率达到97.9％，说明采用本发明提供的SNP标记及引物，可快速，准确地检测谷子籽粒蛋白质含量的高低。
五、自然群体的验证
为检测本发明提供的SNP标记的特异性和实用性，利用400份材料对SNP标记GPC-09-404进行自然群体验证。GPC-09-404标记在自然群体分型结果如图1所示(图中红色为高蛋白质含量的C，蓝色是低蛋白质含量的A)，可见，SNP标记GPC-09-404检测谷子籽粒蛋白质含量特异性较好，可快捷高效的用于鉴定谷子籽粒蛋白质含量的高低。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种与谷子籽粒蛋白质含量性状相关的SNP标记，其特征在于，所述SNP标记为GPC-09-404标记，位于谷子第9染色体第51549836位，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ IDNO.2所示。
2.用于检测权利要求1所述的SNP标记的引物组合物，其特征在于，包括PrimerX、PrimerY和通用引物，其序列如下：
PrimerX：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’；
PrimerY：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’；
通用引物：5’-ACTGGTGCCCGCTCTTCC-3’。
3.一种检测谷子籽粒蛋白质含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
提取待测谷子样品的基因组DNA；
以提取的基因组DNA为模板，利用权利要求2所述引物组合物对其进行PCR扩增，若扩增产物只检测到引物PrimerX对应的荧光信号，则检测位点为碱基A，判定待测谷子样品籽粒蛋白质含量为低蛋白；
若扩增产物只检测到引物PrimerY对应的荧光信号，则检测位点为碱基C，判定待测谷子样品籽粒蛋白质含量为高蛋白。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，PCR扩增体系包括：HiGeno2x Probe Mix、SNP-Specific Primers、DNA模板和无菌水。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，PCR扩增程序为：程序1：95℃预变性10-15min，1个循环；
程序2：95℃变性20secs，61-55℃退火/延伸40secs，10个循环；
程序3：95℃变性20secs，55℃退火/延伸40secs，28-34个循环。
6.权利要求1所述的与谷子籽粒蛋白质含量性状相关的SNP标记在谷子籽粒蛋白质含量测定或分子筛选育种中的应用。
7.权利要求3-5任一项所述的检测谷子籽粒蛋白质含量的方法在谷子分子筛选育种中的应用。
8.一种筛选或辅助筛选具有高/低籽粒蛋白质含量的性状的谷子的方法，其特征在于，包括：按照权利要求3-5任一项所述的方法检测谷子籽粒蛋白质含量，然后根据检测结果筛选或辅助筛选具有高/低籽粒蛋白质含量的性状的谷子。
9.一种谷子育种方法，其特征在于，包括：将权利要求8筛选得到的具有高籽粒蛋白质含量的性状的谷子作为育种材料进行育种。
10.一种检测谷子籽粒蛋白质含量的试剂盒，其特征在于，包括权利要求2所述引物组合物。
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- 2023-03-20 CN CN202310276652.7A patent/CN116334284A/zh active Pending
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