CN107130034B - 一种利用ssr标记鉴定平欧杂种榛品种的方法 - Google Patents

一种利用ssr标记鉴定平欧杂种榛品种的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用SSR标记鉴定平欧杂种榛品种的方法，采用SSR标记结合毛细管电泳技术，建立了基于4对EST‑SSR标记的平欧杂种榛品种鉴定方法，首次发表了目前国内普遍引种的43个平欧杂种榛品种(品系)的SSR扩增数据，为未知品种的鉴定提供了可比对的数据结果，为平欧杂种榛的品种鉴定提供了一种共显性、重复性好、位点特异性强、扩增条带数字化，并且通用、便捷、有效的方法。

Description

一种利用SSR标记鉴定平欧杂种榛品种的方法
技术领域
本发明涉及一种平欧杂种榛品种鉴定技术，尤其涉及一种利用SSR标记鉴定平欧杂种榛品种的方法。
背景技术
平欧杂种榛(Corylus heterophylla Fisch.×Corylus avellana L.)是20世纪80年代国内专家利用我国平榛(C.heterophylla Fisch.)和国外欧洲榛(C.avellana L.)种间杂交获得的种间杂交后代，迄今30多年来，先后审定和筛选了10余个品种和20余个优良品系，具有果大、丰产、出仁率高、果仁饱满、适应性强等特点，被广泛引种至全国各地，目前，平欧杂种榛主栽品种(品系)的区域化布局已初步形成，全国栽培面积近90万亩。
随着平欧杂种榛产业的迅速发展，在科研和产业方面存在一些问题亟待解决：首先，杂交育种是榛子种质创新的主要手段，现有平欧杂种榛品种(品系)在加工性能方面仍然存在缺陷，尚缺乏南方干热地区和北方高寒地区适生的优良品种，以现有品种(品系)为母本的第二代平欧杂种榛的选育迫切需要开展；现有平欧杂种榛品种(品系)筛选自多个母本和父本的混合后代群体，品种(品系)间的亲缘关系非常复杂，杂交亲本的选择既要掌握品种(品系)的表型性状，还要充分了解其遗传基础。其次，生产上平欧杂种榛苗木的品种混杂和同物异名问题尤为普遍，混杂品种或是适应性较差，或是与授粉品种不亲和，均导致了种植者蒙受巨大的经济损失。
现有技术中，有以下鉴定方法：
表观性状鉴定：
依靠坚果外观结合树体性状进行辨别，如坚果大小、性状、颜色、外观条纹；种仁形状、颜色、脱皮性；树势、枝干开张角度、分枝特性；枝条颜色、皮孔、茸毛；叶片大小、形状、颜色；果苞长短、形状、开张情况；叶芽形状、颜色、鳞片；雌花颜色、雌蕊数量；雄花序葇荑花序数、形状、颜色，等。
分子标记技术：
RAPD技术：
刘振盼等利用RAPD标记技术，对辽宁8个杂交榛子主栽品种进行指纹分析。从60个10碱基随机引物中筛选重复性好的3个引物OPF05、OPG01、OPH07，选取7个条带作为品种鉴别的RAPD标记，以此构建榛子优良品种的指纹图谱。
ISSR技术：
陈新等采用ISSR分子标记的方法，对达维、辽榛3号等17个平欧杂种榛主栽品种(系)进行了遗传关系研究。从60条ISSR引物中筛选出7条进行电泳分析，结果显示：7条ISSR引物共获得58条谱带，可将所有样品完全分开，当遗传相似性阈值为0.687时可将样品分成3个类群：第Ⅰ类群14个品种(系)可分成4个亚类，第Ⅱ类群1个品种，第Ⅲ类群2个品系。样品间的遗传相似性系数为0.448-0.879。群体的有效等位基因数、基因多样度、Shannon信息指数分别为1.6751、0.3701和0.5308。
AFLP技术：
马庆华等以达维等10个主栽品种为试材进行AFLP分析，从64对引物中筛选出15对多态性强的PstⅠ/MseⅠ引物，共获得1739条谱带，平均多态带比率97.94％；平欧杂种榛主栽品种的相似性系数为0.7556-0.8543，阈值为0.8398时可分成4个AFLP群，其中，玉坠(84-310)、辽榛4号(85-41)和平欧69号(84-69)单独为1群，其他品种为1群；样品的有效等位基因数、基因多样度、Shannon信息指数分别为1.3921、0.2482和0.3957，具有较高的遗传多样性，研究获得的特征条带可用于平欧杂种榛主栽品种的快速鉴别。
上述现有技术至少存在以下缺点：
表观性状鉴定法鉴别品种周期长且季节性强，而且受栽培因素的影响，不同地区的树体发育和坚果外观存在一定差异，从而影响了对表型性状的判断。
分子标记技术具有准确、高效、重复性强的优点，是研究植物遗传多样性、亲缘关系和品种鉴定最常用的方法，目前，国内学者先后采用RAPD、ISSR和AFLP技术在平欧杂种榛品种(品系)的遗传关系方面进行过研究，初步报道了平欧杂种榛群体的遗传多样性，但上述方法在品种鉴定方面具有下列一种或几种缺陷：
(1)RAPD、ISSR和AFLP标记均为显性标记，扩增片段数量多，且易存在假阳性片段，导致鉴定准确性降低；
(2)样品间的差异以扩增条带的相对位置及其产生的聚类图进行区分，条带大小没有数字化；
(3)涉及的平欧杂种榛品种(品系)数量有限；
(4)品种鉴定的方法在不同实验室和不同批次实验中存在差异，或依赖对照品种，方法不具有通用性和便捷性。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用SSR标记鉴定平欧杂种榛品种的方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明是一种利用SSR标记鉴定平欧杂种榛品种的方法，采用SSR标记对平欧杂种榛进行品种鉴定，并为平欧杂种榛未知品种提供可比对的SSR标记数据。
由上述本发明提供的技术方案可以看出，本发明实施例提供的利用SSR标记鉴定平欧杂种榛品种的方法，采用SSR标记结合毛细管电泳技术，建立了基于4对EST-SSR标记的平欧杂种榛品种鉴定方法，首次发表了目前国内普遍引种的43个平欧杂种榛品种(品系)的SSR扩增数据，为未知品种的鉴定提供了可比对的数据结果，为平欧杂种榛的品种鉴定提供了一种共显性、重复性好、位点特异性强、扩增条带数字化，并且通用、便捷、有效的方法。
附图说明
图1a、图1b、图1c、图1d分别为本发明实施例中四对EST-SSR引物对24号样品(平欧48)进行扩增的毛细管电泳图。
图2为本发明实施例中采用12对SSR引物进行扩增，基于遗传距离的平欧杂种榛聚类分析图。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。
本发明的利用SSR标记鉴定平欧杂种榛品种的方法，其较佳的具体实施方式是：
采用SSR标记对平欧杂种榛进行品种鉴定，并为平欧杂种榛未知品种提供的可比对的SSR标记数据。
具体采用以下表2中的CAF-2、CAF-3、CAF-12和CAF-13四对EST-SSR引物对表3中的43个平欧杂种榛品种进行鉴定。
下面对本发明实施例作进一步地详细描述。
SSR标记具有共显性、多态性高、重复性好、位点特异性强等优势，因其引物使用具有种属特异性，需要借鉴近缘种或进行引物开发；相比基因组SSR，EST-SSR具有较高的转移扩增能力和潜在的基因功能。在前期工作中，课题组基于平欧杂种榛(达维)雌蕊不同亲和性组合、授粉后不同时期的转录组测序数据，开发了12对EST-SSR标记，本发明选用上述课题组已开发的EST-SSR引物结合毛细管电泳分析，以本单位收集的目前国内普遍引种的43个平欧杂种榛品种(品系)为试材，建立了一种利用4对EST-SSR标记的，共显性、重复性好、位点特异性强、扩增条带数字化，并且通用、便捷的平欧杂种榛品种鉴定方法。
具体实施例：
1材料与方法
1.1实验材料
试验样品于2015年6月采自北京市延庆区旧县镇，中国林业科学研究院林业研究所榛子种质资源圃。采集的叶片样品为健康、幼嫩的叶片，采样后置于冰盒中带回试验室，于-80℃下保存备用。样品的序号、名称和育种代号列于表1，其中“*”号标注的16份样品是目前推广面积最大的主栽品种(品系)。
表1平欧杂种榛品种(品系)及其育种代号
Figure BDA0001306213560000041
1.2实验方法
1.2.1基因组DNA的提取与检测：
采用改良CTAB法提取样品DNA，使用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性，使用紫外分光光度计检测DNA的纯度与浓度，最后用ddH2O将DNA统一稀释到10ng/μL备用。
1.2.2PCR扩增：
PCR反应体系(20.0μL)：ddH2O 14.8μL，dNTP 0.4μL，Buffer 2.0μL，F-primer 0.3μL(20.0μM)，R-primer 0.3μL(20.0μM)，DNA 2.0μL，Taq 0.2μL，在正向引物上进行荧光标记；PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，54-58℃复性35s，72℃延伸40s，共35个循环，72℃延伸3min；试验所用引物，为课题组前期根据达维雌蕊不同授粉时期的转录组数据自行开发的部分多态性引物，以三碱基重复引物为主，12对引物序列及其退火温度等信息列于表2中。
1.2.3毛细管电泳方法：
将甲酰胺与分子量内标按100:1的体积比混匀后，取9.0μL加入上样板中，再加入1.0μL稀释10倍的PCR产物，然后使用3730XL测序仪进行毛细管电泳，利用Genemarker中的Fragment(Plant)片段分析软件对测序仪得到的原始数据进行分析，将各泳道内分子量内标的位置与各样品峰值的位置做比较分析，得到片段大小。
1.3数据统计分析
1.3.1数据处理方法将每个样品在各个SSR位点的片段大小，按照Convert 1.31软件要求的格式录入到EXCEL中，使用Convert 1.31软件转化成POPGENE 32软件所要求格式，再使用POPGENE 32软件进行统计分析。
1.3.2数据统计分析使用POPGENE 32软件计算基因型频率(Allele Frequency)和遗传距离(Genetic Distance)；PIC值通过POPGENE 32软件计算出的基因型频率，再通过PIC-Calc软件计算；基于遗传距离，使用NTSYS pc 2.11F软件，采用UPGMA法对样品进行聚类分析，构建系统发育树。
表2 EST-SSR引物及其扩增信息
Figure BDA0001306213560000051
Figure BDA0001306213560000061
2结果与分析
2.1 EST-SSR引物扩增效果评价
经PCR扩增和毛细管电泳分析，12对多态性EST-SSR引物在43份样品中的扩增情况列于表2。不同引物扩增片段大小的变化范围存在差异，为6～24bp不等；43份样品产生的等位基因数为3～9条，平均为4.67条；不同引物在样品中的PIC值范围是0.3800～0.7839，平均为0.5113，其中引物CAF-2、CAF-13、CAF-3、CAF-6、CAF-10和CAF-14的6对引物的PIC值高于0.500，引物多态性较强。样品的PIC值和等位基因数间不存在正相关关系，如引物CAF-1的等位基因数为6，但其PIC值仅为0.3945，而等位基因数为3的引物CAF-6，其PIC值为0.5620，这与扩增样品的遗传背景有关。
图1a、图1b、图1c、图1d分别展示了引物CAF-2、CAF-3、CAF-12和CAF-13在24号样品(平欧48)上的扩增效果。
2.2平欧杂种榛品种的亲缘关系分析
使用上述12对EST-SSR引物在43个样品中的扩增结果，计算平欧杂种榛品种(品系)间的遗传距离，绘制出图2所示的聚类图。供试样品被上述12对引物一一分开，当遗传距离节点在0.72时，可将供试样品分为两个大类(图2)，Ⅰ大类包含41份样品平欧杂种榛品种(品系)，Ⅱ大类包含1980年杂交的2份样品，即辽榛5号(80-4)和辽榛6号(80-13)。当遗传距离节点在0.56时，可进一步将Ⅰ大类样品分成4个亚类：Ⅰ-a亚类又分成两个组，Ⅰ-a①中包含主栽品种达维、玉坠、魁香、辽榛3号和辽榛7号等在内的10个品种(品系)，其中平欧3和平欧7亲缘关系最近，遗传距离仅为0.0303；Ⅰ-a②中包含薄壳红、辽榛2号、4号、8号、9号等18个品种(品系)，其中薄壳红和平欧62，平欧30和平欧48的亲缘关系最近，遗传距离分别为0.0286和0.0345；Ⅰ-b亚类也分成两个组，Ⅰ-b①中包含平欧10等3个品系，Ⅰ-b②中包含平欧545等7个品系；Ⅰ-c中包含2个品系(平欧88和平欧415)，Ⅰ-d中仅包含1个品系平欧140。在Ⅰ大类中，包含1981-1985年杂交的后代，在进一步的分组分析中，未发现聚类结果与杂交年份、坚果特性、适应性以及植物学性状等一致的规律。上述结果表明，平欧杂种榛品种(品系)间的亲缘关系较为复杂，可能与平欧杂种榛复杂的亲本来源有关。
2.3平欧杂种榛品种(品系)的分子鉴定
为对平欧杂种榛品种(品系)进行分子鉴定，依据12对EST-SSR引物的PIC值(表2)，从高到低依次对单对引物的扩增结果进行分析，比对其等位基因型。单独使用引物CAF-2(PIC＝0.7839)时，仅能区分辽榛3号、5号等7个品种(品系)；引物CAF-2与CAF-13(PIC＝0.6522)组合使用，可进一步区分达维、薄壳红、辽榛1号等17个品种(品系)；当引物CAF-2、CAF-3(PIC＝0.5841)和CAF-13组合使用时，可区分除平欧3和平欧7、平欧30和平欧48以外的39个品种(品系)；进一步对上述2组4个品种(品系)的等位基因型进行分析，发现上述样品在使用引物CAF-12(PIC＝0.4469)扩增时，具有不同的等位基因型；综上所述，供试43个平欧杂种榛品种(品系)可以通过4对EST-SSR引物组合进行鉴别，而对于主栽的16个品种(品系)可通过引物CAF-2与CAF-13的组合进行鉴别。表3列出了43个平欧杂种榛品种(品系)利用引物CAF-2、CAF-3、CAF-12和CAF-13扩增时的等位基因型和具体的扩增片段大小，未知品种的鉴定可根据扩增片段的大小进行比对，该研究结果为平欧杂种榛的品种鉴定提供了便捷、有效的方法。
表3四对EST-SSR引物对43个平欧杂种榛品种(品系)的品种鉴定
Figure BDA0001306213560000071
Figure BDA0001306213560000081
2.3本发明技术方案带来的有益效果
平欧杂种榛是我国第一代通过平榛和欧洲榛种间杂交获得的杂交后代，从资源的遗传基础看，受当年育种条件的限制，杂交采用了5株平榛优良单株为母本，10株欧洲榛品种优良实生后代(意大利种源)的混合花粉为父本，通过连续6年的杂交，从2000多株杂交后代中，经多次选择和淘汰形成了现有的群体，导致群体内存在较高的遗传变异；另外，随着第二代平欧杂种榛的选育，今后将陆续推出更多新品种(品系)，也将会使该群体的复杂程度日益加深。从品种的引种和推广情况看，苗木的品种混杂和同物异名问题尤为普遍，在16个主栽品种(品系)中经常存在混杂苗木，而常规鉴定方法存在技术缺陷和时效性差的问题，导致种植者蒙受经济损失，苗木纠纷也屡有发生。因此，急需构建便捷、高效的平欧杂种榛品种鉴定技术，为平欧杂种榛的资源保存、育种创新和生产推广服务。
分子标记技术具有准确、高效、重复性强的优点，基于分子标记的品种鉴定技术目前已在多种蔬菜、水果、食用菌的经济植物中得到应用。在基于分子标记的品种鉴定方法中，扩增条带的识别和记录是检验鉴定技术效率的重要指标。RAPD、ISSR、AFLP和SRAP等分子标记获得的图谱条带复杂，重复性和稳定性相对不高，任何片段的存在或缺失都会导致样本在不同批次、不同实验室的试验结果出现误差，SSR标记相比其他类型分子标记，不仅具有共显性、多态性高、重复性好、位点特异性强等优势，而且其带型简单，易于统计分析和判断，更适于品种的分子鉴定和指纹图谱的建立。分子标记的扩增产物需要进行电泳分离以读取数据，普通聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)分离效率较低，相比而言，毛细管电泳技术是分子标记方法进行品种鉴定的有效呈现形式，具有高通量、分辨率高、数据准确的优点，借助分子量内标，可在不同批次的样品间进行比较，无需参照品种和分子量标准，大大提高了样品鉴定的效率和准确性。
在群体遗传多样性、亲缘关系和图谱构建等研究中，分子标记引物的筛选和使用，除考虑引物的PIC值外，还要结合标记的基因组覆盖度、灵敏度和重复性等因素。在品种分子鉴定研究中，引物筛选的最终目标是将所有样品完全分开，选用引物的数量与鉴定群体的样品数量和样品间的亲缘关系密切相关，如在本发明中，2对SSR引物即可区分16个平欧杂种榛主栽品种(品系)，而对所有样品进行区分则需要4对引物才可实现；PIC值高的引物具有较高的分辨效率，但不一定适用于所有样品，对于某些亲缘关系较近的样品则需要使用较多的引物进行分析，从而判断是否存在同物异名现象，本发明中，平欧3和平欧7、平欧30和平欧48的亲缘关系较近，在12对候选引物中，仅CAF-12能够区分上述4个品系，而其并不具备较高的PIC值。
本发明采用SSR标记结合毛细管电泳技术，建立了基于4对EST-SSR标记的平欧杂种榛品种鉴定方法，首次发表了目前国内普遍引种的43个平欧杂种榛品种(品系)的SSR扩增数据，为未知品种的鉴定提供了可比对的数据结果，为平欧杂种榛的品种鉴定提供了通用、便捷、有效的方法。
前文提到，SSR标记具有共显性、多态性高、重复性好、位点特异性强等优势，其引物使用具有种属特异性，获得引物的方法可以借鉴近缘种或进行引物开发。因此，榛属植物的SSR标记引物理论上将会很多，可以用于平欧杂种榛品种鉴定的引物也会有很多，也就是说其他SSR引物组合也可以达到对本发明中所用的43个平欧杂种榛品种(品系)进行鉴定的效果。其他SSR引物组合的筛选和品种鉴定的实验方法与本发明基本相同，均可在本发明的启发下得到。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。

Claims (1)

1.一种利用SSR标记鉴定平欧杂种榛品种的方法，其特征在于，采用SSR标记对平欧杂种榛进行品种鉴定，并为平欧杂种榛未知品种提供的可比对的SSR标记数据；
采用以下的CAF-2、CAF-3、CAF-12和CAF-13四对EST-SSR引物对表3中的43个平欧杂种榛品种进行鉴定：
Figure FDA0002558132190000011
表3 四对EST-SSR引物对43个平欧杂种榛品种的品种鉴定
Figure FDA0002558132190000012
Figure FDA0002558132190000021
。
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