CN111321213B - 皮肤美白能力基因检测引物组合及其应用 - Google Patents

皮肤美白能力基因检测引物组合及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基因分型技术领域，具体涉及一种皮肤美白能力基因检测引物组合及其应用，包括检测人基因组的10个皮肤美白能力基因的12个SNP位点的多重PCR扩增引物组和单碱基延伸引物组。每个SNP位点分别设计一对多重PCR扩增引物和一个单碱基延伸引物，全部位点被设计到一个反应中，可同时检测。本发明建立了一种高效检测皮肤美白能力基因的SNP分型方法，可以在同一时间完成多个SNP位点的分子生物学基因分型，检测灵敏度好、准确率高、成本低、实用性强，可用于检测影响皮肤美白能力的遗传因素，进行皮肤美白能力的综合评价，有助于推动美容行业个体化服务的发展。

Description

皮肤美白能力基因检测引物组合及其应用
技术领域
本发明涉及基因分型技术领域，具体涉及皮肤美白能力基因检测引物组合及其应用。
背景技术
爱美之心，人皆有之。爱美是人之天性，现代人对美的追求已经达到了一个前所未有的高度，正所谓“一白遮三丑”，人们对于美白的追求就像人类对光明的追求一样从未停止，皮肤美白已经成为皮肤护理的重要组成部分。根据360营销学院出品的《化妆品行业报告》显示，中国人群使用的所有化妆品中，用于美白祛斑的化妆品占了40.4％，接近一半的份额，已成为化妆品的第一大种类，而祛痘、保湿、防晒、抗衰老产品则分别占19.7％、8.7％、7.5％、6.1％。且2018年和2017年相比美白产品的流量增长了81.3％，美白一直是皮肤护理的重中之重。
紫外线照射、黑色素合成以及维生素C的吸收作为影响皮肤美白的重要因素，是人们为达到皮肤美白目的进行的护理工作主要切入点。人体皮肤受到紫外线照射后，会激活黑素母细胞，形成酪氨酸酶，黑色素合成加速，随着新细胞的不断更新推移到皮肤表面，面部太阳斑和雀斑的形成增加，导致皮肤暗沉粗糙。当皮肤受到外界刺激时，会导致过多的黑色素合成，新陈代谢减缓，不能及时的代谢掉多余的黑色素，造成黑色素沉淀积累。维生素C能抑制酪氨酸酶的活性，阻断黑色素生成，保护皮肤不受紫外线伤害，将已经形成的黑色素还原成无色的黑色素前质，并改善皮肤暗沉的效果，而维生素C的吸收不足，也会导致皮肤暗沉加重。
皮肤的美白状态由于人类遗传信息的不同会存在一定的差异，有明显的遗传倾向和个体差异，同时后天的环境因素、饮食习惯也起到了重要的作用，内在遗传因素和外在环境因素共同决定了一个人的皮肤美白状态。通过检测皮肤美白能力基因可以提早获知自身的遗传信息，为选择合适的护肤方案和护肤品进行科学的指导，制备合理的护肤方案从而有效的减少肤色变黑、暗沉、色斑出现，达到皮肤美白的效果。针对每个人遗传信息的差异，护肤方案和护肤品选择存在巨大的差异，使用不当会降低皮肤护理效果，甚至可能对皮肤造成不良的影响，所以个人护肤需要一个科学的指导。例如某人抗紫外线损害能力较弱，那么在日常生活中就应该更注重防晒措施，比如涂抹防晒霜和避免太阳直射等；而如果黑色素合成能力较强，那么这个人可以选择含有曲酸、胶原肽成分的护肤品，可以起到抑制酪氨酸酶的合成，减少黑色素的形成，达到美白的效果。所以，不同的肤质，需要针对性的使用不同的护肤品，只有做到对症下药，才能起到事半功倍的护肤效果。
人类遗传学、分子生物学、基因组学和生物信息学的研究进展已充分说明皮肤美白能力由单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)影响。专利(201910480054.5)公开了一种快速检测遗传性皮肤美白能力基因的方法，该发明专利通过检测两个与皮肤美白相关的基因位点，分别是MC1R基因的rs1805007位点和OCA2基因的rs1800414位点，根据这两个SNP位点的基因型来判断皮肤在基因方面的美白能力，该专利选择的检测的位点太少，只检测了调控黑色素合成基因(MC1R)和酪氨酸(黑色素前体)转运蛋白基因(OCA2)，而黑色素沉着调节基因(HERC2)、酪氨酸酶合成基因(TYR)等都没有检测，检测位点覆盖面不够全面，无法真实的反映出人体先天的皮肤美白能力。专利(201811276285.6)公开了一种人类肤质快速检测组合引物及其应用，其中检测皮肤美白的相关基因位点只有三个，但是采用的是PCR荧光定量(HRM法)测定，该方法虽然操作简单，但是无法同时检测大量的SNP位点，且检测时间较长，特异性低。专利(201810839262.5)公开了一种基于肤色相关基因检测制定个性化护肤方案的方法，其中检测的的皮肤美白相关基因有22个，虽然检测的基因很多，相对较为全面，但是有一些检测基因和皮肤美白能力并不符合，例如钙调素基因(CaM)、兜甲蛋白基因(LOR)等，而且只公布了检测基因而没有具体的检测位点，实施例中没有检测的方法和检测结果说明，也没有阐述如何根据不同的基因检测结果制定个性化护肤方案。
因此，提供皮肤美白能力基因检测引物组合及其应用具有重要的现实意义。
发明内容
有鉴于此，本发明提供皮肤美白能力基因检测引物组合及其应用。本发明利用MassARRAY核酸质谱分析系统对皮肤美白能力基因的SNP位点进行分子生物学基因分型，根据基因分型结果对个体的皮肤美白能力进行综合评价，以期用于精准护肤管理。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了检测皮肤美白能力的引物组合，包括检测抗紫外线损害能力(抗太阳斑生成能力、抗雀斑生成能力)的引物组和/或检测抗晒黑能力(抗黑色素合成能力、维生素C吸收能力)的引物组；
(1)、所述检测抗紫外线损害能力的引物组包括检测抗紫外线损害能力的多重PCR扩增引物组和检测抗紫外线损害能力的单碱基延伸引物组；
所述检测抗紫外线损害能力的多重PCR扩增引物组具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
(I)、具有SEQ ID No.1～2、3～4、5～6、7～8、9～10、11～12任一组所示的核苷酸序列；
(II)、具有SEQ ID No.1～2、3～4、5～6、7～8、9～10、11～12所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；
(III)、与SEQ ID No.1～2、3～4、5～6、7～8、9～10、11～12所示的核苷酸序列具有至少80％序列一致性的序列；
(IV)、如(I)、(II)或(III)所示序列的互补序列；
所述检测抗紫外线损害能力的单碱基延伸引物组具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
(V)、具有SEQ ID No.25～30任一项所示的核苷酸序列；
(VI)、具有SEQ ID No.25～30所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；
(VII)、与SEQ ID No.25～30所示的核苷酸序列具有至少80％序列一致性的序列；
(VIII)、如(V)、(VI)或(VII)所示序列的互补序列；
(2)、所述检测抗晒黑能力的引物组包括检测抗晒黑能力的多重PCR扩增引物组和检测抗晒黑能力的单碱基延伸引物组；
所述检测抗晒黑能力的多重PCR扩增引物组具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
(IX)、具有SEQ ID No.13～14、15～16、17～18、19～20、21～22、23～24任一组所示的核苷酸序列；
(X)、具有SEQ ID No.13～14、15～16、17～18、19～20、21～22、23～24任一组所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；
(XI)、与SEQ ID No.13～14、15～16、17～18、19～20、21～22、23～24任一组所示的核苷酸序列具有至少80％序列一致性的序列；
(XII)、如(IX)、(X)或(XI)所示序列的互补序列；
所述检测抗晒黑能力的单碱基延伸引物组具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
(XIII)、具有SEQ ID No.31～36任一项所示的核苷酸序列；
(XIV)、具有SEQ ID No.31～36任一项所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；
(XV)、与SEQ ID No.31～36任一项所示的核苷酸序列具有至少80％序列一致性的序列；
(XVI)、如(XIII)、(XIV)或(XV)所示序列的互补序列。
在本发明的一些具体实施方案中，所述引物组合中所述检测抗紫外线损害能力的多重PCR扩增引物组、所述检测抗紫外线损害能力的单碱基延伸引物组、所述检测抗晒黑能力的多重PCR扩增引物组、所述检测抗晒黑能力的单碱基延伸引物组的摩尔比为(8.76～9.12)：(18.9～28.4)：(8.77～8.97)：(24.3～36.5)。
在上述研究的基础上，本发明还提供了所述的引物组合在制备检测皮肤抗紫外线损害能力和/或抗晒黑能力的试剂盒中的应用。
本发明还提供了所述的引物组合在制备检测皮肤美白能力的试剂和/或试剂盒中的应用。
此外，本发明还提供了检测试剂，包括所述的引物组合。
本发明还提供了试剂盒，包括所述的引物组合或所述的检测试剂。
在上述研究的基础上，本发明还提供了所述的引物组合、所述的检测试剂或所述的试剂盒在检测皮肤美白能力基因或皮肤美白能力中的应用。
本发明还提供了皮肤美白能力基因的检测方法，包括如下步骤：
步骤1、获得待测样品的核酸；
步骤2、以步骤1提取的核酸为模板，分别采用如权利要求1或2所述的引物组合中的引物进行多重PCR扩增和单碱基延伸，对SNP位点进行基因分型；
步骤3、根据所述基因分型的结果获得检测结果。
在本发明的一些具体实施方案中，步骤3中所述根据所述基因分型的结果获得检测结果为：
在本发明的一些具体实施方案中，所述根据所述基因分型的结果获得检测结果的标准为：SNP位点基因型对表型的影响为“强”的计1分，“一般”的计0分，“弱”的计-1分，各SNP位点得分相加得到最终得分；并根据最终得分判断抗紫外线损害能力和/或抗晒黑能力：
最终得分≥1：“强”；
最终得分＝0：“一般”；
最终得分≤-1：“弱”。
本发明运用MassARRAY核酸质谱分析系统进行皮肤美白能力基因的SNP分型检测，该检测结合多重PCR技术、MassARRAY iPLEX单碱基延伸技术和基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱分析质谱技术(MALDI-TOF-MS)进行分型检测。通过对包含SNP位点的DNA片段进行PCR扩增，再利用特异性延伸引物进行单碱基延伸反应。由于多态性位点碱基不同，延伸产物的末端碱基也不同，导致延伸后的产物分子量出现差异，因此由SNP多态性引起的碱基差异通过分子量的差异而体现。该检测具有通量大、灵敏度高、出错率低、成本低、可避免交叉污染的优势。通过检测分子量来分辨碱基差异，不涉及荧光标记、凝胶电泳等，准确率高。可同时检测10个基因的12个SNP位点，且位点涵盖与皮肤美白能力直接相关的抗太阳斑能力、抗雀斑能力、黑色素合成能力、维生素C吸收能力，检测内容为目前最全面。通过皮肤美白能力基因检测，用以综合评价皮肤先天的美白能力，从而为外部护肤方案提供科学依据，可以更加有效的减缓皮肤暗沉、色斑的出现，保持皮肤美丽、白皙。由此，更具针对性的皮肤美白能力基因检测能够帮助人们更好的了解自身遗传因素，更深层次了解皮肤问题的根源，为实现皮肤美白提供科学的指导。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示飞行时间质谱分析质谱技术(MALDI-TOF-MS)实验流程图；
图2示rs1800414位点UCSC Genome Bioinformatics验证图；
图3示rs1800414位点MassARRAY核酸质谱分析系统结果峰图；
图4示rs1800414位点MassARRAY核酸质谱分析系统结果散点图；
图5示实施例4中样本1受检者脸部照片；
图6示实施例4中样本2受检者脸部照片。
具体实施方式
本发明公开了皮肤美白能力基因检测引物组合及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供一种皮肤美白能力基因检测引物组合及其应用，包括人基因组DNA的10个皮肤美白能力基因的12个SNP位点的多重PCR扩增引物组和单碱基延伸引物组。
进一步的，所述的人基因组DNA的10个皮肤美白能力基因为干扰素调节因子4(Interferon regulatory factor 4,IRF4)基因、黑皮质素1受体(Melanocortin1receptor,MC1R)基因、锌指蛋白basonuclin-2(Zinc finger protein basonuclin-2,BNC2)基因、酪氨酸酶(Tyrosinase,TYR)基因、包含E3泛素蛋白连接酶2的HECT和RLD域(HECT and RLD domain containing E3 ubiquitin protein ligase 2,HERC2)基因、核受体共激活子6(Nuclear receptor coactivator 6,NCOA6)基因、OCA2黑素体跨膜蛋白(OCA2melanosomal transmembrane protein,OCA2)基因、溶质载体家族45成员2(Solutecarrier family 45member 2,SLC45A2)基因、溶质载体家族24成员5(Solute carrierfamily 24member 5,SLC24A5)基因、溶质载体家族23成员1(Solute carrier family23member 1,SLC23A1)基因。
进一步的，所述的10个皮肤美白能力基因的12个SNP位点为rs12203592、rs11547464、rs2228479、rs1805009、rs2153271、rs1042602、rs12913832、rs4911442、rs1800414、rs16891982、rs1426654、rs33972313(表1)。
进一步的，所述多重PCR扩增引物组和单碱基延伸引物组检测皮肤美白能力包括检测抗紫外线损害能力(抗太阳斑生成能力、抗雀斑生成能力)和抗晒黑能力(抗黑色素合成能力、维生素C吸收能力)。
表1 基因SNP位点
进一步的，所述检测抗紫外线损害能力(抗太阳斑生成能力、抗雀斑生成能力)包括检测抗紫外线损害能力(抗太阳斑生成能力、抗雀斑生成能力)基因SNP位点的多重PCR扩增引物组包含引物Y1～Y12，所述多重PCR扩增引物组的序列如SEQ ID No.1～12所示，包括IRF4基因rs12203592位点上游引物Y1和下游引物Y2，序列信息如SEQ ID No.1～2所示；包括MC1R基因rs11547464位点上游引物Y3和下游引物Y4，序列信息如SEQ ID No.3～4所示；包括MC1R基因rs2228479位点上游引物Y5和下游引物Y6，序列信息如SEQ ID No.5～6所示；包括MC1R基因rs1805009位点上游引物Y7和下游引物Y8，序列信息如SEQ ID No.7～8所示；包括BNC2基因rs2153271位点上游引物Y9和下游引物Y10，序列信息如SEQ ID No.9～10所示；包括TYR基因rs1042602位点上游引物Y11和下游引物Y12，序列信息如SEQ ID No.11～12所示。
所述单碱基延伸引物组T1～T6，所述单碱基延伸引物组的序列如SEQ ID No.25～30所示，包括IRF4基因rs12203592位点单碱基延伸引物T1，序列信息如SEQ ID No.25所示；包括MC1R基因rs11547464位点单碱基延伸引物T2，序列信息如SEQ ID No.26所示；包括MC1R基因rs2228479位点单碱基延伸引物T3，序列信息如SEQ ID No.27所示；包括MC1R基因rs1805009位点单碱基延伸引物T4，序列信息如SEQ ID No.28所示；包括BNC2基因rs2153271位点单碱基延伸引物T5，序列信息如SEQ ID No.29所示；包括TYR基因rs1042602位点单碱基延伸引物T6，序列信息如SEQ ID No.30所示。
所述检测抗晒黑能力(抗黑色素合成能力、维生素C吸收能力)包括检测抗晒黑能力(抗黑色素合成能力、维生素C吸收能力)基因SNP位点的多重PCR扩增引物组Y13～Y24，所述多重PCR扩增引物组的序列如SEQ ID No.13～24所示，包括HERC2基因rs12913832位点上游引物Y13和下游引物Y14，序列信息如SEQ ID No.13～14所示；包括NCOA6基因rs4911442位点上游引物Y15和下游引物Y16，序列信息如SEQ ID No.15～16所示；包括OCA2基因rs1800414位点上游引物Y17和下游引物Y18，序列信息如SEQ ID No.17～18所示；包括SLC45A2基因rs16891982位点上游引物Y19和下游引物Y20，序列信息如SEQ ID No.19～20所示；包括SLC24A5基因rs1426654位点上游引物Y21和下游引物Y22，序列信息如SEQ IDNo.21～22所示；包括SLC23A1基因rs33972313位点上游引物Y23和下游引物Y24，序列信息如SEQ ID No.23～24所示。
所述单碱基延伸引物组T7～T12，所述单碱基延伸引物组的序列如SEQ ID No.31～36所示，包括HERC2基因rs12913832位点T7，序列信息如SEQ ID No.31所示；包括NCOA6基因rs4911442位点T8，序列信息如SEQ ID No.32所示；包括OCA2基因rs1800414位点T9，序列信息如SEQ ID No.33所示；包括SLC45A2基因rs16891982位点T10，序列信息如SEQ IDNo.34所示；包括SLC24A5基因rs1426654位点T11，序列信息如SEQ ID No.35所示；包括SLC23A1基因rs33972313位点T12，序列信息如SEQ ID No.36所示。
本发明专利运用MassARRAY核酸质谱分析系统进行皮肤美白能力基因的SNP分型检测，具有灵敏度高、时间灵活、出错概率低、成本低、避免交叉污染的优势，能够在同一时间内检测多个SNP位点，可迅速读取遗传信息，更适合批量化和低成本的检测服务。近年来基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱分析质谱技术(MALDI-TOF-MS)也逐渐成为业内研究的热点，成为技术的发展趋势。相关技术人员可通过此种技术的使用方法设计本发明所述多重PCR扩增引物组和单碱基延伸引物组用于皮肤美白能力基因的检测服务。
本发明通过对皮肤美白能力基因的多重PCR扩增引物组和单碱基延伸引物组进行特异性设计，同时对10个基因的12个SNP位点进行检测，成本低、准确度高、时间短，可检测与皮肤美白能力直接相关的抗紫外线损害能力(抗太阳斑生成能力、抗雀斑生成能力)和抗晒黑能力(抗黑色素合成能力、维生素C吸收能力)的遗传信息，根据分子生物学基因分型结果对个体的皮肤美白能力进行综合评价，以期用于精准护肤管理。本发明公布的多重PCR扩增引物组和单碱基延伸引物组组合是目前为止检测效果最好、检测项目最全的皮肤美白能力基因检测多重PCR扩增引物组和单碱基延伸引物组组合。
本发明提供的皮肤美白能力基因检测引物组合及其应用中所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
一种皮肤美白能力基因检测引物组合及其应用，包括检测人基因组的10个皮肤美白能力基因的12个SNP位点的多重PCR扩增引物组和单碱基延伸引物组(表2)。每个SNP位点分别设计一对多重PCR扩增引物和一个单碱基延伸引物，全部位点被设计到一个反应中，可同时检测。所述多重PCR扩增引物组和单碱基延伸引物组用于MassARRAY核酸质谱分析系统，该系统可用于高灵敏度和高精确度地快速分析核酸样本，检测准确率≥99.9％。本发明建立了一种高效的综合评价皮肤美白能力基因的SNP分型方法，可以在同一时间完成多个SNP位点的分子生物学基因分型，检测灵敏度好、准确率高、成本低、实用性强，可用于检测影响皮肤美白能力的遗传因素，有助于推动美容行业个体化服务的开展。
步骤1：合成所需SNP位点的多重PCR扩增引物组和单碱基延伸引物组。
步骤2：提取人口腔拭子样本DNA，进行PCR扩增。
步骤3：采用基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱分析质谱技术(MALDI-TOF-MS)进行样本DNA检测，确定样本SNP位点基因型。
步骤4：依据SNP位点基因型检测结果，综合评价皮肤美白能力的遗传信息，给出结果解读。
表2多重PCR扩增引物和单碱基延伸引物序列
实施例2样本检测
为验证本发明的用于检测皮肤美白能力基因SNP位点的多重PCR扩增引物组和单碱基延伸引物组设计的准确性和实用性，本实施例采集了30个口腔拭子样本进行检测，具体内容如下：
1、引物设计：
根据SNP位点序列信息，利用Agena公司设计软件Assay Design Suite V2.0设计待测SNP位点的多重PCR扩增引物及单碱基延伸引物，将10个基因的12个SNP位点的多重PCR扩增引物组和单碱基延伸引物组设计到一个反应(WELL)中，并用UCSC Genome Bioinformatics进行验证。
设计软件引物组合质量值结果显示本发明公布的引物组合质量良好(表3)。
经在线软件UCSC Genome Bioinformatics进行验证，本发明公布的引物组合扩增片段满足唯一或者每条扩增序列包含检测位点的要求，特异性良好(附图3)。
多重PCR扩增引物组和单碱基延伸引物组交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
表3引物组合质量值
/>
2、样本采集：
选取30个口腔拭子样本进行DNA提取，并记录受检者年龄、性别、皮肤状态等信息(表5)。其中皮肤状态评价方法为：对30个口腔拭子样本对应的受试者进行脸部拍照，由10名皮肤检测技术人员对照片皮肤状态按项目进行打分，分值1～9分。项目得分相加取平均值，然后取10名技术人员分数的平均值，结果取整数，最终确定该受检者皮肤状态评分，分数越高皮肤状态越好。
表4皮肤状态评分标准
表5样本采集信息
/>
/>
3、口腔拭子DNA提取：
利用美基基因的核酸提取纯化试剂盒进行口腔拭子DNA提取，按说明书在BufferBW1中加入一定量的无水乙醇。把口腔拭子采集头剪下放入2mL的EP管中，加入400mLBuffer ATL和20μL的Proteinase K，转移拭子至2mL离心管中，去除一部分拭子柄。55℃振荡温育15～30分钟。加入25μL Magpure和600μL Buffer GXP2至离心管中。转移250～300μL上清液至装有磁珠/GXP2的离心管中，颠倒混匀15～30次，室温放置5～8分钟，其间颠倒混匀数次。转移至磁力架上吸附2分钟，吸弃或倒弃溶液。加入500μL Buffer BW1，涡旋混匀15秒打散磁珠。转移至磁力架上吸附1分钟，吸弃或倒弃溶液。加入700μL 75％乙醇，涡旋混匀15秒打散磁珠。转移至磁力架上吸附1分钟，吸弃或倒弃溶液。加入700μL 75％乙醇，涡旋混匀15秒打散磁珠。转移至磁力架上吸附1分钟，吸弃或倒弃溶液。短暂离心，吸尽残液，空气干燥10～15分钟去除乙醇。加入30～100μL Elution Buffer至离心管中，55℃振荡温育5～10分钟。转移至磁力架上吸附3～5分钟，把DNA转移至新的离心管中，用超微量分光光度计对DNA溶液进行质检，质检合格的DNA取体积30μL，转移至上样用384孔板中于-20℃储存备用。
基因组DNA质检标准为DNA总量≥0.5μg，浓度≥15ng/μL，纯度OD260/280 1.7～2.1，无蛋白、RNA污染，完整性达到条带清晰，分子量大于10Kb，无明显降解。
表6样本DNA质检结果
/>
4、PCR扩增反应：
采用多重PCR技术，在384孔板中进行，每个反应体系总体积5μL。
A.在一个新的1.5ml EP管中配制PCR反应体系溶液，反应体系采用384孔板，设置38％的试剂损耗。
表7 PCR反应体系溶液
B.使用多通道加样器，调节加样体积为4μL，在384孔板的每个加样孔中加入PCR反应体系溶液。该384孔板即为PCR反应板。
C.取出已经制备好的DNA样本384孔板，使用多通道加样器，调节加样体积为1μL，这样每个5μL的PCR反应体系中包含模板DNA20～50ng,Hotstar Taq 0.5U，每条扩增引物0.5pmol，0.1μl的25mM dNTPs。
D.在PCR仪上设定如下反应条件进行PCR扩增。
表8 PCR扩增反应循环参数
5、PCR扩增产物碱性磷酸酶处理：
A.在PCR反应结束后，将PCR扩增产物使用SAP(shrimp alkaline phosphatase，虾碱性磷酸酶)处理，以去除体系中游离的dNTPs。
B.配制碱性磷酸酶处理反应SAP Mix体系溶液，反应体系采用384孔板，设置38％的试剂损耗。
表9 SAP Mix体系溶液
C.使用多通道加样器，调节加样体积为2μL，将SAP Mix加入384孔板。对于每个碱性磷酸酶处理反应孔，反应体系总体积为7μL，其中PCR产物5μL，SAP混合液2μL。
D.将384孔板放置在PCR仪上，设定如下反应条件进行碱性磷酸酶处理。
表10碱性磷酸酶处理循环参数
6、单碱基延伸反应：
A.在碱性磷酸酶处理结束后，进行单碱基延伸反应，反应体系总体积9μL。
B.配制单碱基延伸反应液EXTEND Mix体系溶液，反应体系采用384孔板，设置38％的试剂损耗。
表11 EXTEND Mix体系溶液
C.使用多通道加样器，调节加样体积为2μL，将EXTEND Mix对应加入384孔板。对于每个反应孔，单碱基延伸反应体系包含SAP处理后PCR产物7μL及EXTEND Mix液2μL(其中各延伸反应引物混合物0.94μL，iPLEX enzyme 0.041μL，延伸混合物0.2μL)。
D.将384孔板放置在PCR仪上，设定如下PCR反应条件进行单碱基延伸反应。
表12单碱基延伸反应循环参数
7、树脂纯化：
A.将反应产物(共9ul)稀释3倍，使用树脂进行脱盐，将脱盐处理后的样品点在样品靶上，自然结晶。
B.将Clean Resin树脂平铺到6mg的树脂板中。
C.加16μL水到延伸产物的对应孔内。
D.将干燥后的树脂倒入延伸产物板中，封膜，低速垂直旋转30min，使树脂与反应物充分接触。
E.离心使树脂沉入孔底部。
8、芯片点样：
启动MassARRAY Nanodispenser RS1000点样仪，将树脂纯化后的延伸产物移至384孔SpectroCHIP(Sequenom)芯片上。
9、质谱检测：
将点样后的SpectroCHIP芯片使用MassARRAY Analyzer System分析，检测结果使用TYPER 4.0软件(sequenom)分型并输出结果。
实施例3引物对比
运用本发明设计的多重PCR扩增引物组和单碱基延伸引物组与普通多重PCR扩增引物组和单碱基延伸引物组(表13)分别检测口腔拭子DNA样本，样本提取和检测的具体实施方法和步骤如上述实施例1和实施例2，结果数据如表14。
表13普通多重PCR扩增引物和单碱基延伸引物序列
/>
本对比实验检测结果数据显示本发明设计的多重PCR扩增引物组和单碱基延伸引物组比普通多重PCR扩增引物组和单碱基延伸引物组更适用于皮肤美白能力基因SNP位点检测(表14)。本发明设计的多重PCR扩增引物组和单碱基延伸引物组的阳性检出率为100％，远超过普通多重PCR扩增引物组和单碱基延伸引物组，实现了实验目的。
表14本发明与普通引物组合检测结果数据对比
/>
实施例4检测结果统计和解读
针对实施例3中已进行检测的30个口腔拭子样本10个皮肤美白基因的12个SNP位点的检测结果进行统计(表15)，并依据检测结果解读标准(表16)进行SNP位点分子生物学基因分型结果解读(表17，18)，综合评价受检者皮肤美白能力的遗传信息，用于指导精准护肤管理。
表15 SNP位点检测结果
/>
/>
表15显示，本发明用于检测皮肤美白能力的10个基因的12个SNP位点分子生物学基因分型结果均能通过本发明公布的检测方法获得。检测结果纯合基因型为相同字母重复，如“AA”；两个不同字母，如“AG”，表示杂合基因型“AG”或“GA”，“D”表示该单个碱基为“del”(删除)，“--”表示未检出。
表16检测结果解读标准
/>
综合评价结果确定方法为：SNP位点基因型对表型的影响为“强”的计1分，“一般”的计0分，“弱”的计-1分，各SNP位点得分相加得到最终得分。并根据最终得分判断各项目能力“强”(最终得分≥1)、“一般”(最终得分＝0)、“弱”(最终得分≤-1)。
最终结论总体美白能力评定方法为：根据各项目能力“强”、“一般”和“弱”评级，通过“强+强＝强，强+一般＝强，强+弱＝一般，一般+一般＝一般，一般+弱＝弱，弱+弱＝弱”确定，其中“强+一般＝强”与“一般+强＝强”结果一致。
通过本发明公布的多重PCR扩增引物组和单碱基延伸引物组检测皮肤美白能力，最终得到样本1的皮肤美白能力综合评价结果(表17)。结果表明，该样本抗紫外线损害能力(抗太阳斑生成能力、抗雀斑生成能力)一般，在紫外线的照射下，皮肤细胞的色素合成较快，使面部皮肤的太阳斑和雀斑生成增加；抗晒黑能力(抗黑色素合成能力、维生素C吸收能力)强，能够正常抑制皮肤细胞黑色素的合成并促进皮肤细胞吸收维生素C，减少皮肤暗沉、变黑等情况的发生。通过观察，样本1实际面部状态与检测结果相符，呈现健康白皙的肤色和健康的肤质。最终结论为样本1的皮肤总体美白能力强，但也应注意进行日常护肤保养，做好防晒，增强皮肤抵御紫外线的能力。
表17样本1检测结果统计和解读
/>
通过本发明公布的多重PCR扩增引物组和单碱基延伸引物组检测皮肤美白能力，最终得到样本2的皮肤美白能力综合评价结果(表18)。结果表明，该样本皮肤抗紫外线损害能力(抗太阳斑生成能力、抗雀斑生成能力)强，皮肤受到紫外线照射后，能抑制色素合成加速，从而减少面部太阳斑和雀斑的生成；抗晒黑能力(抗黑色素合成能力、维生素C吸收能力)强，能够正常抑制皮肤细胞黑色素的合成并促进皮肤细胞吸收维生素C，减少皮肤暗沉、变黑等情况的发生。通过观察，样本2实际面部状态与检测结果相符，呈现健康的肤质状态和白皙的皮肤。最终结论为样本2的皮肤总体美白能力强，但也不能粗心大意，还需每天坚持涂抹防晒霜，注意美白护肤。
表18样本2检测结果统计和解读
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 广州市普森生物科技有限公司
<120> 皮肤美白能力基因检测引物组合及其应用
<130> MP1933997
<160> 72
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
acgttggatg gtttcatcca ctttggtggg 30
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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acgttggatg gtcatatggc taaacctggc 30
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<212> DNA
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<213> 人工序列(Artificial sequence)
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ggggcagtac cacaggggaa ttt 23
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 71
acgttggatg tgtcaaggtc aggacatagc 30
<210> 72
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 72
tagcagagca gccaca 16

Claims (7)

1.检测皮肤美白能力的引物组合，其特征在于，包括检测抗紫外线损害能力的引物组和检测抗晒黑能力的引物组；
（1）、所述检测抗紫外线损害能力的引物组包括检测抗紫外线损害能力的多重PCR扩增引物组和检测抗紫外线损害能力的单碱基延伸引物组；
所述检测抗紫外线损害能力的多重PCR扩增引物组为SEQ ID No.1~2、3~4、5~6、7~8、9~10、11~12所示的核苷酸序列；
所述检测抗紫外线损害能力的单碱基延伸引物组为SEQ ID No.25~30所示的核苷酸序列；
（2）、所述检测抗晒黑能力的引物组包括检测抗晒黑能力的多重PCR扩增引物组和检测抗晒黑能力的单碱基延伸引物组；
所述检测抗晒黑能力的多重PCR扩增引物组为SEQ ID No.13~14、15~16、17~18、19~20、21~22、23~24所示的核苷酸序列；
所述检测抗晒黑能力的单碱基延伸引物组为SEQ ID No.31~36所示的核苷酸序列；
所述引物组合中所述检测抗紫外线损害能力的多重PCR扩增引物组、所述检测抗紫外线损害能力的单碱基延伸引物组、所述检测抗晒黑能力的多重PCR扩增引物组、所述检测抗晒黑能力的单碱基延伸引物组的摩尔比为（8.76~9.12）：（18.9~28.4）：（8.77~8.97）：（24.3~36.5）。
2.如权利要求1所述的引物组合在制备检测皮肤抗紫外线损害能力和抗晒黑能力的试剂盒中的应用。
3.如权利要求1所述的引物组合在制备检测皮肤美白能力的试剂和/或试剂盒中的应用。
4.检测试剂，其特征在于，包括如权利要求1所述的引物组合。
5.试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的引物组合或如权利要求4所述的检测试剂。
6.如权利要求1所述的引物组合、如权利要求4所述的检测试剂或如权利要求5所述的试剂盒在非疾病诊断目的的检测皮肤美白能力基因或皮肤美白能力中的应用。
7.非疾病诊断目的的皮肤美白能力基因的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1、获得待测样品的核酸；
步骤2、以步骤1提取的核酸为模板，分别采用如权利要求1所述的引物组合中的引物进行多重PCR扩增和单碱基延伸，对SNP位点进行基因分型；
步骤3、根据所述基因分型的结果获得检测结果；
步骤3中所述根据所述基因分型的结果获得检测结果为：
；
所述根据所述基因分型的结果获得检测结果的标准为：SNP位点基因型对表型的影响为“强”的计1分，“一般”的计0分，“弱”的计-1分，各SNP位点得分相加得到最终得分；并根据最终得分判断抗紫外线损害能力和抗晒黑能力：
最终得分≥1：“强”；
最终得分=0：“一般”；
最终得分≤-1：“弱”。
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