PT86391B - Metodo para a preparacao de moleculas de dna uteis na proteccao de plantas - Google Patents

Description

invento também se relaciona com o método para a preparação de um plasmídeo de DNA recombinante compreendendo a referida molécula de DNA e com a incorporação do DNA no genoma nuclear de uma planta.

processo de preparação da referida molécula de DNA recombinante consiste em se recuperar mRNA a partir duma fonte capaz de produzir o inibidor da tripsina, se separar o cDNA a partir do referido mRNA, e se seleccionar a partir do referido cDNA, um clone de cDNA tendo uma sequência que lhe permite codificar um inibidor da tripsina.

I

Este invento está relacionado com a protecção de plantas contra as suas pragas através da engenharia genética de plantas. Diz especialmente respeito à protecção de culturas de algodoeiro e de cereais através da transferência para as plantas de genes específicos codificadores da resistência a insectos, mas é também aplicável a outras culturas para as quais as pragas de campo e de produtos armazenados constituem um problema económico sério. Tais culturas incluem algodoeiro, milho, arroz, soja, cana sacarina, trigo, frutos, vegetais e vinhas. Em particular, este invento relaciona-se com genes para inibidores da tripsina derivados de plantas leguminosas, especialmente o inibidor da tripsina do feijão frade (CpTI).

As pragas de insectos de culturas provocam perdas médias entre 5 e 15% da produção agrícola anual. 0 valor monetário destas perdas foi estimado em vários biliões de dólares por ano e além disso há um gasto anual em pesticidas e em equipamento para aspersão e pulverização. Por exemplo a colheita do algodoeiro é altamente susceptível a certas pragas, incluindo insectos. Só nos Estados Unidos pelo menos 125 espécies de insectos causam danos económicos no algodoeiro. Os insecticidas do algodoeiro são responsáveis pela proporção maior de uso de insecticidas global, 1335 milhões de dólares (em 1985), que é equivalente a 31% dos gastos totais. Nos Estados Unidos as perdas anuais médias são de 500 milhões de dólares e além disso os plantadores gastam práticamente o mesmo em insecticidas e aplicação num esforço para manter as culturas rentáveis. Geralmente, as pragas que atacam na fase inicial afectam a produção enquanto que as que atacam nas fases mais tardias afectam a qualidade.

Um dos principais grupos de pragas do algodoeiro são as lagartas das capsulas do genero Heliothis (incluindo H. virescens,H.armigera e H. zea).As lagartas das cápsulas Heliothis infestam uma larga gama de famílias de plantas além do algodoeiro, elas atacam cereais tais como milho e sorgo, assim como outras culturas incluindo tabaco, feijoeiro, soja e girassol. Uma outra praga grave do algodoeiro é a lagarta rosada (Pectinophora gossypiella) que a nível mundial é a praga mais importante e nos países desenvolvidos pode destruir até 70% da cultura. Outras pragas graves são os gorgulhos das cápsulas (Anthonomus spp. incluindo A. grandis). As larvas de Heliothis, Pectinophora, e Anthonomus reduzem severamente as produções de algodão uma vez que se alimentam dos botões florais (gomos) e cápsulas, resultando na morte e esvazamento dos botões florais e cápsulas pequenas. Nas cápsulas maiores os fios mancham e definham. Um outro género de insectos que representa um problema sério no algodoeiro é o género Spodoptera incluindo £>. litura (lagarta da folha do arroz) e £>. littoralis (lagarta da folha do algodoeiro). Spodoptera é igualmente uma praga do milho, arroz, sorgo e tabaco.

Uma outra cultura importante em que os danos provocados por insectos reduz as produções é o milho. 0 gasto total mundial em insecticidas para usar no milho foi de 470 milhões de dólares em 1985. Só nos Estados Unidos, os danos causados por insectos calcula-se ser superior a 900 milhões de dólares anualmente. A lagarta da raiz do milho (Diabrotica spp.) é uma praga grave e nos Estados Unidos as perdas de produção foram calculadas em 10 - 30%. Uma outra praga destrutiva do milho nos Estados Unidos é o European corn borer (Ostrinia nubilalis) em que a primeira geração de borers se alimenta das folhas e pés, esgotando assim os nutrientes ás espigas. As perdas anuais derivadas do corn borer nos Estados Unidos para o período de 1970-75 foram calculadas em 310 milhões de dólares por ano. Uma outra praga importante do milho inclui Sitophilus oryzae (o gorgulho do arroz), a lagarta da espiga do milho (H. zea) que provoca prejuízos nos Estados Unidos entre 75 e 140 milhões de dólares anuais, o spotted stalt borer (Chilo suppressalis) e a lagarta da

folha (Agrotis spp) que também ataca o algodoeiro, tabaco e muitos vegetais.

Apesar da disponibilidade de uma larga gama de pesticidas químicos, as pragas de insectos permanecem como um problema grave. Muitos pesticidas tem as graves desvantagens de elevada toxicidade para os humanos e vida selvagem e fitotoxicidade relativamente alta. A resistência dos insectos aos pesticidas químicos é também um problema crescente .

Os produtores de plantas têm também tentado reduzir as perdas causadas pelo ataque de insectos através da incorporação de genes de resistência a insectos nas suas variedades em programas de produção convencional. A maior parte das plantas apresentam resistência à maior parte dos insectos, a resistência pode ser fisica ou quimica. Por exemplo, os pêlos nas folhas de muitas plantas podem impedir que pequenos insectos cheguem suficientemente perto da superfície para a roer. Noutros casos as plantas usam uma gama de substâncias químicas secundárias complexas para tornar os seus tecidos pouco atractivos ou tóxicos. Estes tipos de resistência estão provávelmente sob o controle de muitos genes e portanto são dificeis de explorar pelo produtor de plantas. Por vezes as variedades resistentes demonstraram uma depressão da produção, e portanto não eram economicamente viáveis. Isto é presumivelmente devido ao carácter específico da resistência aos insectos estar associado a outras características prejudiciais e não ser possível separar fácilmente os dois efeitos.

Os desenvolvimentos recentes na biotecnologia de plantas oferece agora a possibilidade de alargar o âmbito do melhoramento de plantas através da adição a germoplasmas existentes de genes codificadores de características específicas. Tem sido feita investigação, no isolamento e transferência de genes para resistência a herbicidas, re sistência a doenças, aspectos de qualidade de produto; e resistência a insectos.

Tem sido argumentado que as plantas resistentes a insectos através da engenharia genética terão várias vantagens relativamente à utilização de pesticidas químicos (para uma discussão ver uma publicação em Agrow /”1986 7 (29). Estas vantagens incluem:

a) protecção durante todo o ciclo vegetativo

b) os insectos são sempre tratados na fase mais sensivel

c) protecção independente do tempo

d) protecção de tecidos vegetais difíceis de tratar

e) só são expostos os insectos comedores de plantas

f) material confinado a tecidos vegetais

g) o factor activo é biodegradável e não tóxico

No entanto existem também vários possíveis factores limitantes:

1. Espécies de plantas boas para transferência

Apesar de este ser um factor chave, é provável que a tecnologia para transformar as principais culturas alimentares esteja dentro em breve bem estabelecida. A publicação recente sobre transformação de algodoeiro (UmbecK, P. Johnston, G., Barton, K„ , Swain, W., / 1987_7 Genetically transformed cotton (Gossypium hirsatum L.) plants. Bio/Technologgy 5., 263-266) e as reinvindicações para transformação de milho indicam que o grande investimento na pesquisa de transformação dará brevemente protocolos adequados .

2. Espectro de actividade contra pragas

Geralmente os insecticidas têm um espectro largo de actividade contra pragas de insectos. Os pesticidas biológicos incorporados nas culturas através de engenharia genética necessitariam de ter um espectro suficientemente largo de actividade para valer a pena o seu uso.

Têm sido entregues pedidos de patentes relativos ao uso do gene da proteína dos cristais de Bacillus thuringiensis (Bt) para produzir plantas resistentes aos insectos (Pedidos EPO 84306494.0 e 86300291.1). No entanto, no caso do pedido EPO 84306494.0, a especificação diz apenas gue hornworms do tabaco (Manduca sexta)alimentados com tecidos de callus de tabaco transformados contendo o gene de tamanho completo da proteína insecticida expressável em plantas verificou-se apresentarem sintomas atribuíveis à toxicidade da proteína dos cristal de B.thuringiensis¹¹. Não foi apresentada qualquer informação sobre os efeitos insecticidas de plantas contendo o gene. O pedido 86300291.1 não dá informação sobre os efeitos de um gene Bt nas plantas de tabaco transgénicas, mas novamente os resultados estão restringidos apenas a um insecto, a hornworm do tabaco.

Uma desvantagem potencial da inserção de Bt nas plantas para aumentar a resistência a insectos é que diferentes estirpes de bactérias fazem toxinas com diferentes especificidades. Isto deve significar que será necessário combinar vários genes Bt para tornar uma cultura resistente a um espectro suficientemente largo de pragas de insec tos .

3. Efeitos laterais negativos

Será importante que as plantas trangénicas contendo os genes de resistência a insectos não sofram qualquer alteração prejudicial da produção.

Tem havido alguma preocupação relativa aos possíveis efeitos sobre o ambiente pela incorporação de um gene de resistência a insectos em plantas de culturas de tal forma que as pragas sejam confrontadas contínuamente com um insecticida constitutivo. Pode ser argumentado que isto induziria a uma pressão selectiva muito alta sobre as pragas e apressaria o desenvolvimento de resistências. No entanto, uma oposição contra aquele argumento é que os inibidores da tripsina actuam directamente no sitio activo de uma das enzimas digestivas principais. As probabilidades de desenvolvimento de resistência por insectos através da mutação viável do sítio alvo parecem ser baixas. Provávelmente a resistência poderá ser criada apenas através de alterações múltiplas e complexas do metabolismo dos insectos de modo a que o inibidor deixasse de ser tóxico antes de poder causar danos.

Tem havido especulação considerável na literatura sugerindo que as plantas contêm uma variedade de proteínas que podem conferir resistência a agentes patogénicos ou insectos predadores através da inibição das suas enzimas digestivas ou outras (Ryan, C. A.[1983] Insect induced chemical signals regulating natural plant protection responses. Em Denno R. F. e McClure M. S. (eds). Variable Plants and Herbivores in Natural and Managed Systems, pág.43-60, Academic Press).

Foi anteriormente demonstrado que os inibidores da tripsina naturais presentes apenas numa fase particular do desenvolvimento da planta, nomeadamente a semente madura, podem apresentar uma toxicidade forte contra uma larga variedade de pragas de outras plantas quando incorporados em dietas artificiais. Supreendentemente, quando o gene de um inibidor da tripsina é transferido para uma outra espécie vegetal de modo a que seja expresso ao longo do desenvolvimento da planta, a resistência aos insectos das plantas transgénicas é aumentado significativamente. Assim deverá ser possivel transferir genes específicos codificadores de resistência a um espectro largo de pragas de insectos para genótipos de outro modo agronómicamente interessantes de plantas de culturas.

Evidência recente sugere que os inibidores de proteases são parte da interacção complexa entre o valor nutritivo e a fisiologia digestiva do insecto (Broadway, R.M., Duffey, S.S. Pearce, G., Ryan, C. A. /1986_7Plant proteinase inhibitors: A defense against herbivorous insects? Ent. Exp. Appl. 41, 33-38). No entanto, até agora não houve demonstração conclusiva de que os inibidores de proteases aumentem de facto a resistência a insectos quando expressos em plantas.

presente invento está relacionado com moléculas de DNA recombinante codificadoras de membros de um polipeptídeo de legumes inibidor da tripsina. Mais particularmente, o invento está relacionado com plasmídeos de DNA recombinante portador de sequências codificadoras dos genes inibidores da tripsina de Vigna unguiculata (feijão frade, também conhecido como black-eyed pea, black-eyed bean, Kaffir bean, Hindu cowpea e yard-long bean), a produção dos mesmos e seu uso para transferência da expressão do caracter inibidor da tripsina do feijão verde (CpTI) para outras espécies vegetais com a finalidade de aumentar a sua resistência a várias espécies de pragas de insectos.

Experiências anteriores estabeleceram que a quantidade de CpTI presente em sementes se V. unguiculata está relacionada com a resistência de V. unguiculata ao ataque

pelo escaravelho bruchid (Gatehouse, A.M.R., Gatehouse, J. A., Dobie, P. , Kilminster, A. M. Boulter, D., /^-1979_7 Biochemical basis of insect resistance in Vigna unguiculata J. Sei. Food Agric. 30 , 948-958; Gatehouse, A. M. R. , Boulter, D., /”1983 7 Assessment of the antimetabolic effects of tripsin inhibitors from cowpea (Vigna unguiculata) and other legumes on development of the bruchid beetle Callosobruchus macalatus J. Sei. Food Agric. 34, 345-350 ). O uso dos inibidores da tripsina que ocorrem naturalmente em V. unguiculata para proteger plantas contra pragas de insectos invasores através de um método em que o insecto é confrontado com quantidades pesticidas eficazes de um ou mais dos inibidores da tripsina de V. unguiculata foi descrito na patente (J.S. nQ 4640836 (concedida em 3 de Fevereiro de 1987). Esta patente diz que CpTI purificado é activo contra as seguintes pragas de Lepidópteros: Heliothis virescens (lagarta dos botões do tobacoo), Spodoptera littoralis (lagarta da folha do algodoeiro), Chilo partellus (spotted stalk borer); Heliothis armigera (lagarta das cápsulas americana) e contra a praga do coléoptero Tribolium confusum (gorgulho da farinha). A informação publicada sobre os efeitos do CpTI contra pragas de insectos em estudos de dietas artificiais está resumido na Tabela 1. O presente invento proporciona moléculas de DNA que codificam a informação genética necessária à produção de CpTIs em organismos manipulados por engenharia genética.

Qualquer planta de cultura alterada por engenharia genética contendo o gene CpTI necessitará de ser segura para o homem e para o ambiente. Existem vários motivos para sugerir que o gene CpTI será seguro.

feijão frade é uma cultura alimentar em várias regiões do mundo (Singh, S. R., Rachie, K. O. / 1985_7 Cowpea research, production and utilization. Wiley). Apesar de normalmente cozinhada também pode ser comida crua.

I r

Ainda, no tubo digestivo humano(e também no de outros mamíferos), as proteínas podem ser fragmentadas por vários tipos diferentes de enzimas. CpTI é muito sensível à inactivação pela pepsina (A. Gatehouse, resultados não publicados) e dados preliminares obtidos com ensaio de alimentação de ratos indicaram que os ratos alimentados com dietas contendo um CpTI não apresentam aumento de peso reduzido (D. Boulter, resultados não publicados)

TABELA 1 Actividade artificial	insecticida de	CpTI em estudos de dieta
Insecto	Nome vulgar	Espécies de culturas atacadas	Referência
Pragas de Leptidópteros
Chilo partellus	Spotted Stalk Milho, sorgo Borer cana sacarina e arroz	US Patent 4.640.836
Heliothis armigera	Lagarta das cápsulas Americana	Algodoeiro, Feijoeiro, Milho e Sorgo	II
Heliothis virescens	Lagarta dos	Algodoeiro,	II
	botões do tabaco	Tabaco
Heliothis zea	Lagarta da espiga de	Milho, Algodoeiros, Feijo-	II

milho,Lagar- eiro e tabaco ta das cápsulas do algo-

doeiro
Spodoptera littoralis	Lagarta da fo- Algodoeiro, Talha do algodo- baco,Milho e eiro arroz	_ fi
Pragas de Coleópteros
Tribolium confusum	Gorgulho da A maior parte farinha das farinhas	II
Callosobruchus maculatus	Escaravelho do Feijão frade,	Gatehouse and
macu	feijão frade soja	Boulter 1983

principal objectivo do presente invento é proporcionar construções de plasmídeos recombinantes contendo sequências codificadoras completas dos genes CpTI dentro : de vectores que permitam a sua introdução em espécies de plantas alvo, que facilitem a selecção de plantas recombinantes e | que permitam a expressão do gene introduzido dentro daquelas i plantas, tais plantas sendo transformadas para terem uma maior ; resistência s pragas de insectos devido a presença do polipeptídeo CpTI nos seus tecidos.

O presente invento proporciona uma molécula de DNA que compreende um gene estrutural codificador de um inibidor da tripsina, de preferência um inibidor da tripsina derivado de um legume, em particular de V. unguiculata (inibidor da tripsina do feijão frade ou CpTI) ou de uma proteína tendo propriedades semelhantes às de CpTI e tendo um grau suficiente de homologia para ser geralmente aceite como membro da familia CpTI em critérios científicos normais.

Faz-se agora referência aos desenhos juntos em que:

i ι í | A Figura 1 mostra as sequências de aminoácidos dos inibidores de tripsina Bowman-Birk derivados do feijão frade.

A Figura 2 mostra as sequências de aminoácidos de CpTI fIV e sequências codificadoras possíveis previstas para as regiões mais adequadas para a especificação, de sondas de oligonucleotídeos sintéticos para cDNAs de CpTI;

A Figura 3 mostra a sequência de nucleotídeos da cadeia codificadora da inserção em pAGCl;

A Figura 4 mostra a estratégia para o isolamento de clones de cDNA de comprimento completo correspondendo a CpTl;

A Figura 5 mostra a estratégia para transformação de plantas do tabaco com a construção pUSSRc 3/2 no vector pROK2;

A Figura 6 mostra a sequência de nucleotídeos da cadeia codificadora da inserção em pUSSRc 3/2;

A Figura 7 mostra a sequência de nucleotídeos da cadeia codificadora da inserção em pUSSR d4/6;

A Figura 8 é uma análise por transferência Western da expressão de CpTI em tecido transformado de folha de N. tabacum; e

A Figura 9 é uma análise por transferência Southern da organização genómica das sequências transformadas em +5/5 e -2/8.

Os inibidores da tripsina tipo Bowman-Birk de V. unguiculata são codificados por uma familia de genes moderadamente repetitiva os quais são expressos em cotilédones do feijão frade como quatro iso-inibidores separáveis por cromatografia de permuta iónica. Os quatro inibidores têm actividades inibidoras da tripsina semalhantes conforme medido por ensaios de inactivação de enzimas in vitro :

	Total	fl	f II	flll	fIV
Actividade inibidora relativa	1,00	1,0 7	1,14	1,0 5	0,7

Ο principal iso-inibidor do feijão fra- j de é fIV. Estes genes têm homologia suficiente para dar hibri- | dação cruzada com sondas de cDNA de CpTI de tamanho completo ' em 0,45 M NaCl, 0,045 M citrato de Na (3xSCC) a 68°C. Na Figura 1 estão apresentados exemplos da sequência primária do iso-inibidor fIV (determinado por sequênciação de proteínas I t (Sammour, R.H.A. /”1985 7, tese de Ph.D., Universidade de j

Durham, U.K.) ou prevista a partir da sequenciação do cDNA de CpTI). Os outros membros da familia de polietídeos inibidores da tripsina de _V. unguiculata constituem variantes destas sequências em que a actividade inibidora de proteases não está reduzida.

A Figura 1 mostra o seguinte:

a) Iso-inibidor principal fIV de CpTI (O extremo amino bloqueado, resíduos internos 15 e 16 e o extremo carboxilo não poderem ser determinados).

b) Sequência prevista para o cDNA d4/6 de CpTI.

c) Sequência prevista para o cDNA c3/2 de CpTI.

As sequências estão apresentadas no código de uma única letra de Dayof (Atlas of Protein Seaquence and Structure, Vol.5, /“ 1972 7 Nat. Boimed. Res. Foundation, Washington D.C., USA).

Os genes dos inibidores da tripsina do feijão frade são expressos nos cotilédones durante a fase tardia da sua maturação. Portanto, as proteínas inibidoras

da tripsina do feijão frade têm de ser isoladas a partir de sementes em maturação. 0 grau invulgarmente elevado de ligação cruzada nestas proteínas torna-as fracamente antigénicas e métodos para a identificação e isolamento dos genes correspondentes que se baseiam no uso de anticorpos são, portanto, | ineficazes. A sequência de aminoácidos do principal inibidor da tripsina de_V. unguiculata foi usada para prever as possíveis sequências de nucleotídeos do seu RNA mensageiro. Quatro regiões deste polipeptídeo compreendem segmentos de quatro ou mais resíduos consecutivos cada um dos quais pode ser codificado por não mais de dois codões alternativos no RNA mensageiro. Verificou-se que tais regiões são adequadas à especificação de sondas de oligonucleotídeos de sequências mistas cobrindo todas as possibilidades e de tamanho suficiente para ser razoavelmente específico do gene em questão conforme indicado na Figura 2.

Deste modo isolou-se RNA poliadenilado purificado a partir de cotilédones na fase tardia de V. unguiculata .

Inicialmente o mRNA foi copiado em DNA | complementar numa reacção de transição reversa convencional.

A sintese da segunda cadeia foi efectuada no cDNA auto-iniciado (self-primed) usando o fragmento Klenow da DNA polimerase I. As ansas terminais no cDNA de cadeia dupla foram removidas por tratamento com nuclease SI e os extremos das moléculas reparados numa reacção de polimento com o fragmento Klenow.

Octanucleotídeos adaptadores sintéticos Bam Hl com a sequência 5¹-d(GGGATCCC) foram ligados aos ds cDNA polidos e extensivamente digeridos com Bst I (um isosquizómero de Bam Hl). 0 ds cDNA com adaptadores foi ligado, usando DNA ligase de T4,ao plasmídeo pBR322 que tinha sido préviamente linearizado com Bst I e parcialmente desfosfori-16-

lado por tratamento com fósfatase de intestino de vitela (para reduzir a auto-ligação dos extremos do vector).

Os produtos desta reacção de ligação foram usados para transformar a estirpe competente de E.coli 910 para resistência à ampicilina (esta característica é transportada pelo vector plasmídeo). Os recombinantes foram identificados pela sua sensibilidade à tetraciclina (o gene de resistência à tetraciclina do pBR322 sendo inactivado pela inserção de DNA no sítio Bam Hl).

Os recombinantes foram testados quanto a sequências CpTI por hibridação de colónias in situ de acordo com os processos de Grunstein e Hogness (Grunstein, M & Hogness, D.S. /~1975_7, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 72, 3961), “ , 32 com o oligonucleotídeo sintético misto marcado com p.

' -CCACCAAAAACATTG

G G G C (a segunda linha de bases refere-se às bases alternativas naquele oligonucleotídeo) correspondendo aos 16 14-meros alternativos complementares da sequência na região C da Figura 2. Esta sonda marcou positivamente cerca de 14% dos clones, alguns dos quais subsequentemente verificou-se não serem definitivamente derivados do mensageiro do inibidor da tripsina. 0 plasmídeo pAGCl contendo o clone positivo para o 14-mero, no entanto, foi identificado sem ambiguidade como contendo uma mensagem parcial de CpTI através da determinação da sequência de nucleotídeos da inserção no sítio Bam Hl após transferência para o vector virai M13mp9 e sequenciação usando o bem estabelecido processo didesoxi de terminação de cadeias em M13. A sequência de aminoácidos prevista a partir da única grelha de leitura aberta nesta inserção mostra con-17

siderável homologia com a principal sequência primária de CpTI e com as sequências primárias publicadas de inibidores da tripsina tipo Bowman-Birk de outros legumes (Shimokawa, Y. Abe, O., & Kuromizu, K. , / 1984 7 Phylogenetic relationship of legume double-headed proteinase inhibitors. Nature & Culture 11 , 39-45). A sequência mostrou uma homologia de 65% com a região correspondente da sequência publicada da sequência codificadora do gene SB1 da soja (Hammond, R.W., Foard, D.E. & Larkins, B.A., / 1984 7Molecular cloning and analysis of a gene coding for the Bowman-Birk protease inhibitor in soybean. J. Biol. Cham. 259, 9883-90).

O plasmídeo pAGCl contem sequências derivadas do mRNA de CpTI incluindo 183 pb da sequência codificadora, compreendendo a sequência mostrada na Figura 3. Esta sequência codifica a metade C-terminal de um CpTI. Este invento precisa de uma sequência codificadora completa de um CpTI e portanto preparou-se uma nova biblioteca usando um protocolo de clonagem de cDNA de alta eficácia e utilizando o oligonucleotídeo sintético e pAGCl como sondas como descrito abaixo e ilustrado na Figura 4.

O mRNA dos cotilédones do feijão frade foi codiado em cDNA por transcriptase reversa na presença do inibidor de RNase de placenta humana. A sintese da segunda cadeia foi efectuada com DNA polimerase I sem nucleases na presença de RNase H. Os extremos do cDNA de cadeia dupla foram tornados cegos pela digestão com DNA polimerase de T4. Os produtos da reacção foram ligados pelos extremos cegos ao plasmídeo pUC19 que tinha sido linearizado com a endonuclease de restrição Hinc II e desfosforilado com fosfatase de intestino de vitela. Esta mistura de ligação foi usada para transformar a estirpe competente de E. coli JM83 para resistência à ampicilina. Os recombinantes foram detectados como colónias brancas em placas de agar YT-Amp-BCIG e foram repi-18cados e cultivados em filtros de nitrocelulose em agar YT-Amp.

Um destes recombinantes, designado pUSSRc3/2, foi identificado como uma cópia quase de tamanho completo de uma sequência mensageira de CpTI por:

i)

Hibridação cruzada forte em hibridação de colónias in situ com a inserção Bam Hl de pAGCl ii) Hibridação cruzada fraca mas positiva do fragmento inserido com o 14-mero misto sintético iii) 0 tamanho da inserção em pUSSRc3/2 foi medido com

582 pb, comparado com o tamanho do mRNA de CpTI,medido a partir das transferências Northerm de RNA total de cotilédones do feijão frade testado com a inserção Bam Hl de pAGCl, de 550+50 nucleotídeos.

iv) A sequência do fragmento inserido foi determinada por processos de sequenciação química estabelecidos (Maxam, A.M. & Gilbert, W., /“19807 Sequencing end-labelled DNA with phase-specific chemical cleavages. Meth.

Enz. 65, 499-560 ). Ela foi totalmente homóloga da inserção em pAGCl ao longo do comprimento desta última. A sequência de aminoácidos prevista a partir da sua única longa grelha de leitura aberta mostrou um elevado grau de homologia com os inibidores da tripsina de legumes ao longo da região correspondente à proteína madura. A sequência estende-se alguns pares de bases 5'- até um codão em fase de iniciação da tradução ATG (metionina).

-190 plasmídeo pUSSRc3/2 contêm sequências derivadas de (quase) todo o mRNA de CpTI, incluindo toda a região codificadora do percursor e proteína madura e a região 3' não traduzida, compreendendo a sequência mostrada na Figura 6.

plsamídeo pUSSRd4/6 contêm toda a sequência codificadora de uma proteína madura de um iso-inibidor diferente mas não possui o codão iniciador da tradução natural ATG e portanto,uma quantidade desconhecida da sequência do peptídeo condutor.Ele compreende a sequência mostrada na Figura 7.

A sequência CpTI foi transferida do vector de clonagem em E. coli, pUC19, para um plasmídeo Ti de Agrobacterium tumefaciens, vector de transformação de plantas como descrito abaixo e na Figura 5.

plasmídeo pUSSRc3/2 foi digerido com as endonucleases de restrição, Sca I Alu I e Xmn I e o fragmento de 550 pb de comprimento com extremos cegos foi isolado a partir de uma separação electroforética em gel de poliacrilamida dos produtos de digestão. Este fragmento continha toda a sequência codificadora de CpTI, terminando 20 pb 5¹ relativamente ao codão de iniciação da tradução ATG e 92 pb 3' relativamente ao codão de terminação da tradução TAA. Este fragmento foi ligado através dos extremos cegos ao sítio Sma I do plasmídeo pRoK2.

O plasmídeo pRoK2 é um vector de sistema binário do plasmídeo Ti de Agrobacterium tunefaciens projectado e construído pelos Dr. M. Bevan e Dr. T. Kavanagh específicamente com a finalidade de permitir que sequências clonadas fossem transferidas e expressas constitutivamente em plantas. Foi obtido apartir de Bin 19 (Bevan,M.W. / 1984_7 Binary Agrobacterium vectors for plant transformation Nuc.

Acids Res. 12, 8 711-21) por inclusão entre as regiões delimitantes de T-DNA esquerda e direita de uma cassete de expressão compreendendo um fragmento de 800 pb do genoma do vírus do mosaico da couve-flor contendo o promotor do RNA 35S de CAMV e um fragmento de 250 pb do gene da nopalina sintetase do T-DNA de Agrobacterium contendo os seus sinais de terminação da transcrição e de poliadenilação do mRNA. Estes elementos foram incluídos no vector de expressão binário Ti, pRoKl (Baulcombe, D.C., Saunders, S.R., Bevan, M.V., Mayo, M.A.

& Harrison, B.D. /~1986~7 Expression of biologically active virai satellite RNA from the nuclear genome of transformed plants. Nature, 321, 446-9) apartir do qual pRoK2 difere principalmente por ter um sítio de clonagem poliadaptador entre os fragmentos promotor e terminador. Este poliadaptador inclui o sitio Sma I no qual foi inserido o fragmento de cDNA de CpTI. Estas sequências conferem iniciação constitutiva da transcrição 10 pb a montante da inserção e poliademilação do produto de transcrição 200 nucleotídeos a jusante da inserção, nas células vegetais transformadas.

As construções pRoK-CpTI foram clonadas em E. coli competente estirpe MC1022 e os transformantes foram seleccionados pela sua resistência à canamicina. A identidade das construções foi verificada pela análise de restrição de mini-preps de DNA de plasmídeo derivadas de clones individuais. O clone pRoK-CpTI+5 continha a inserção CpTI na orientação correcta para expressão do polipeptídeo CpTI,i.e.:

CaMV - PROM - 5' - CpTI - 3' - NOS - TERM o clone pRoK-CpTI-2 continha a inserção CpTI na orientação contrária, i.e.

CaMV - PROM - 3¹ - CpTI - 5

NOS - TERM

e serviu como testemunha.

As construções T-DNA (D/NOS-NEO/CAMV-PROM:CpTI:NOS-TERM/T-DNA (R) foram transferidas para plasmídeos Ti de Agrobacterium Tumefaciens num cruzamento triparental entre: Agrobacterium tumefaciens LBA440 4 portadora do plasmídeo Ti pAL4404, E. coii HB101 portadora de pRoK-CpTI+5 ou pRoK-CpTI-2 e E. coli HB101 portadora de plasmídeo de mobilização pRK2013.

Os transconjugantes foram seleccionados pela sua capacidade para crescerem a 30°C na presença de canamicina, estreptomicina e rifamicina em placas de agar minímo. Para assegurar a não contaminação com bactérias não resistentes, as colónias resistentes foram repicadas mais duas vezes para placas selectivas.

Agrobactérias portadoras dos plasmídeos Ti contendo CpTI+ 5 e CpTI-2 foram usadas para transformar discos de folhas de Nicotiana tabacum (cv. Samsun NN) e N.plumbaginifolia conforme ilustrado abaixo na Figura 5. Os transformantes foram seleccionados pela sua resistência à canamicina, conferida pelo gene NOS-NEO presente nas construções. As plantas transformadas foram regeneradas a partir de rebentos por transferência para um meio de agar indutor de raízes e contendo canamicina. As plantas com raízes foram crescidas em vasos de Perlite/terra composta numa estufa Sherer.

A resistência das plantas aos insectos foi testada inoculando as plantas individuais com larvas jovens de Heliothis virescens e medindo o grau de danos provocados nas plantas e o crescimento e sobrevivência dos insectos com o tempo. H. virescens foi usada uma vez que é uma praga comercialmente importante do algodoeiro e do tabaco nos Estados Unidos. Usaram-se larvas jovens com menos de 24 h de idade, 1-2 mm de comprimento.

nível de resistência ao ataque por insectos que foi determinado para as plantas transformadas com a construção CpTI mostra uma sobreposição considerável com o de plantas testemunha (Tabela 2). No entanto, numa base de plantas individuais, aproximadamente 1 em 5 dos transformantes CpTI+5 (N. tabacum +5/5, +5/21 e +5/D4; N. plumbaginifolia +5/T10 4 e + 5TIO9 em particular) mostraram um aumento nítido e consistente da resistência a danos causados por larvas de H. virescens e sobrevivência e desenvolvimento reduzidos dos insectos nas plantas (Tabela 4).

Foi demonstrado que estas plantas resistentes expressam uma proteína do tipo CpTI em ensaios de imunoligação ELISA. 0 anti-soro anti-CpTI foi produzido em coelhos e usado em processos convencionais de ELISA e imunoligação em pontos (dot-imunobinding) contra um extrato de material de folhas liofilizadas feito com 50mM Tris/HCL, pH 9,5, obtido de plantas CpTI+5 e CpTI-2, usando IgG de cabra anti-coelho ligado a beta-galactosidase ou a peroxidase de rábano silvestre como anti-corpo secundário e um substrato cromogénico adequado para medir a ligação de anticorpos. Os extractos das plantas resistentes têm todos niveis detectáveis de antigénio CpTI, enquanto que os das plantas testemunhas (CpTI-2) não têm. A actividade inibidora da tripsina foi demonstrada directamente em fracções de sulfato de amónio obtidas com extractos de folhas das plantas resistentes por ensaios de inibição da actividade da tripsina. O nível de actividade CpTI observada é comparável ao demonstrado como sendo anti-metabólico quando incorporado em dietas artificiais.

Uma grande proporção das plantas transformadas com o vector descrito conterão, estávelmente inserido no seu genoma, um fragmento de DNA contendo um gene CpTI e o gene marca NPTII.

Tabela 2 Resultados de bioensaios preliminares em plantas do tabaco transformadas

São apresentados as médias e desvios padrões das séries de plantas CpTI+5 e testemunhas e os resultados de plantas individuais mostrando claramente o aumento de resistência aos insectos . As cruzes entre parêntesis indicam um resultado que é melhor do que a média da testemunha mais do que lxS.D. /(+), p <0,159_7; l,96xS.D. /(++), p<0,025_7 e 2,58xS.D. /(+++), p <0,005_7.

Valores médios para 6 (N. tabacum) ou 2 (N. plumbaginifoba) avaliações independentes dos danos globais das plantas numa escala de 1 (danos mínimos) a 5 (danos extensivos).

Medida na terceira folha madura a partir do apex.

7 dias após infestação das plantas com 8 larvas recém-aparecidas.

Expresso como a quantidade equivalente de CpTI fIV purificado (usado como padrão) em ng/lOOul de extrato de folhas. Note-se que as ELISAs subestimam a quantidade absoluta do inibidor da tripsina (TI) presente, devido principalmente à fraca reactividade cruzada do anti-soro.

		U)	00	ΓΟ
	0	Φ	•	•
			00	kD
0		<0 Η >	+ 1	+1
Ό	Ρ	(0 Μ	ο	Η
Η		4-> Φ	•	•
4->	Εη	0 ί—1	CM	C0
		+>	CM
U-i 0)
S-i	ω	ω
	φ	Φ	«*—·»
0	>	44	00	00
·γ4		C	1	1
(3	Φ	Φ	ο	ο
(Q	r4	>		•s-»'
Η		•Η	ιη
Μ	Φ	>	•	•
	Ό	Φ	cm,	Η.
		>4	+	+
	οι	Λ	ιη	00
	ζ	Ό	•	•
		U)		C4

1		+
	m •	CM •
ο		ΙΟ

o co co

φ	Φ
Ό	Τ2 Φ
Ο	Ό
•Η	•Η Η
Φ	> Ε-ι
W	•Η
C	4-»
Μ

LH I
ο
R
kO.
+1	1
R
ιο
©1
•	•
Γ—|	r4
4-|	+ 1
σ>	ιη
•	•
r4	ΙΟ
ιη	ο
•	•
Γ-	ΟΠ
+1	+ 1
<Τ>	Ο
	•
>	r4
r4	γ—1
04	Γ-
•	•
γ4	γ4
+1	+1
r-4	CO
•	•
co	04
CM	Γ-
•	•
co	C0
Ή	+1
ιη
•	•
Γ—	m

rd	ιη	Γ*
σι	S	CM ιη
co	CM	1—1
1	1	•
		Q
		•
Η	σ>	ζ
σ>	00

ΙΓ)

C0 ο ο ΐ ί 1

ο	Η	Η
•	•	•
r4

Γ-	CM •	4***. φ	1
ΟΟ	Q	+	+
	ί—4
+ 1	ή
Η	ο	ο	ιη
•			•
Μ1	00	00	C0
CM	Η
		1	I
ΙΌ	Γ-	φ	ί
•	•	+	+
ο	r4
+ 1	Ή
ο	ιη
•	•
Μ*	C0	r-4	1------1
00	<η
•	•	+	+
ιη	γ4	+	+
γ4	Η ,	·—·
+	+
CM	00		<τ>
•	•	•	•
3	C0 ι-4	<0

	ΙΟ	Γ—
ιη	•	•
2	ο	ο
φ Q	+1	+1
00	00
	00	CM

111

Ο ΗC0 « ·· r4 CMγ4

Ο

r4 Η ti·

CM

Ο Ο • ·

Γ-Ι η

rf	Ίΰ φ
Q	44	44	Η		σ>
		tn	£	ο	ο
ιη	•	Φ	a	Α	Η
+		Ε-ι	υ	Ε-ι	Ρι

Isto foi confirmado pelos resultados de análise de segregação para a resistência à canamicina e experiências de transferências Southern.

As novas características fenótipicas adquiridas através da transformação devem ser herdadas de acordo com a genética mendeliana clássica. Espera-se que os transformantes iniciais sejam hemizigóticos em cada locus genético em que se deu a inserção e espera-se que os caracteres se comportem como dominantes mendelianos. Para validar a expressão estável das novas características, a progénie SI (primeira geração de plantas produzidas por auto-polinização) das plantas transformadas foi analisada quanto à resistência à canamicina e expressão de CpTI.

Podem ser usadas estratégias alternativas à descrita para se obter sequências codificadoras de CpTI, envolvendo todas ou algumas das seguintes variações:

i) Oligonucleotídeos sintéticos codificadores de outras regiões do polipeptídeo CpTI podem ser usados em adição ou em vez dos 14-meros mistos (região C) descritos ii) Clones de cDNA de tamanho parcial ou completo (ou oligonucleotídeos sintéticos) podem ser usados como sondas para se obter cópias das sequências genómicas que incluem membros da familia de genes CpTI derivados das bibliotecas de DNA genómico recombinante preparadas a partir do DNA genómico de V. unguiculata.

iii) As sequências primárias de CpTI podem ser usadas para especificar sequências de nucleotídeos obtidas por síntese quimica codificadoras de um membros da família

CpTI.

que se segue ilustra o presente invento:

(1) Isolamento de RNA poliadenilado

Colheram-se sementes de uma variedade comercial de feijão frade (Californian blade-eye) quando estas se aproximaram da maturidade. A testa e embriões foram removidos estérilmente dos cotilédones e estes últimos foram congelados em azoto líquido.

g de cotilédones congelados foram aquecidos até -20°C num tubo contendo 0,2 g de DTT, a que se adicionou 26 ml de 0 ,2 M Na borato, pH 9,0, 30mM EGTA, 1% de SDS a 100°C. A mistura foi combinada num Polytron a MK 5 durante 30 seg, depois incubada com 0,5 mg/mol de Proteinase K a 37°C durante 1 hora. Adicio nou-se 2 ml de 2 MKCL a 0°C e contrifugou-se a mistura. O sobrenadante foi feito 2 M relativamente a LiCl e o material insolúvel precipitado a 4°C durante a noite.

O precipitado foi sedimentado por centrifugação, lavado duas vezes com 25 ml de LiCl a 0°C, ressuspenso em 0,2 MKAc e precipitado com etanol.

Ressuspendeu-se o precipitado em 8 ml de 10mM Tris-HC1, pH 7,4, lmM EDTA e desproteinizou-se duas vezes com um volume igual de fenol/clorofórmio/álcool isoamílio (25:25:1). A fase aquosa final foi precipi· tada com etanol e o RNA uma vez mais precipitado com 0,2 M KAc antes do isolamento do RNA poliademilado por cromatografia em coluna de oligo (dT) -celulose como descrito por Aviv e Leder (Aviv, H. & Leder,P. / 1972-7 Purification of biologically active globin

-2 7-

mRNA by chromatography on oligothymidylic acid cellulose. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 69 , 1408-12) (2) Preparação de cDNA para clonagem

Empregam-se dois métodos alternativos de síntese de cDNA. O primeiro método deu uma sequência parcial de cDNA clonada em pAGCl e subesequentemente usada como sonda para as sequências do gene CpTI, enquanto que o segundo, método de alta eficácia, deu cDNAs de tamanho práticamente total. Uma vez que ambos os métodos são capazes de produzir sequências codificadoras de CpTI, são descritos ambos.

(3) Síntese de cDNA I

A transcrição reversa de 5ug de RNA poliA⁺ de cotilédone foi efectuada incubando numa mistura de reac3 ção contendo 50uCi de H-dCTP (50 Ci/mMol; Radiochemical Center, Amersham, UK) como marcador, dATP,dCTP, dGTP e dTTp, lmM de cada, 5mM DTT, 1 mg/ml de oligo (dT), 50 unidades de inibidor da ribonuclease derivado de placenta humana, 50mM Tris-HCL, pH 8,0, 10mM MgClz e 100 unidades/ml de transcriptase reversa de AMV a 42°C durante 2 h. A reacção foi parada e as cadeias separadas por aquecimento a 100°C durante 3 minutos e arrefecimento a 0°C. Removeram-se as proteínas desnaturadas por centrifugação.

(4) Síntese da segunda cadeia ul do sobrenadante da reacção de transcrição reversa foi incubado com 50ul de lOOmM Hepes, pH 6,9,

mM MgCl₂, 70mMKCl, 5mM DTT, dATP, dCTP, dGTP e dTTP, lmM de cada e 25 unidades do fragmento grande (Klenow) da DNA polimerase I a 15°C durante 4 h. A mistura de reacção foi extraída com fenol e clorofórmio e os produtos de alto peso molecular da reacção foram separados por cromatografia em coluna numa coluna de 10 ml de volume com Sephadex (marca registada) G-50-S em 10mM Tris-HCl pH 7,4, 50mM NaCl, lmM EDTA.

(5) Tratamento dos extremos do DNA de cadeia dupla para clonagem

A fracção do volume de exclusão da coluna acima foi acrescentada até ao volume de Iml contendo 0 ,3M NaCl,30mM NaAc pH 4,5, 3mM ZnCl₂ e incubada a 37°C durante 30 min. com 250 unidades de nuclease SI para remover as ansas terminais. Adicionou-se EDTA para 5mM e extraiu-se a mistura duas vezes com fenol e clorofórmio, precipitou-se com álcool e ressuspendeu-se em 20ul de 5omM Tris-HCl pH 7,8, 10mM MgCl₂, 10mM 2-mercaptoctanol, dATP, dCTP, dGTP e dTTP 0,25mM cada e incubou-se com 5 unidades de DNA polimerase (fragmento maior) a 15°C durante 30 min. para reparar os extremos.

Adaptadores Bam Hl sintéticos com a sequência

5'-d(GGGATCCC)/BCl7 foram fosforilados num volume de lOul contendo lug de adaptadores, 50mM Tris-HCl pH7,8 10mM MgCl₂, 10mM 2-mercaptoctanol, ImMATP e 11 unidades de polinucleotídeo cinase. Isto foi incubado a 25°C durante 4 h.

O cDNA de cadeia dupla polido e os adaptadores fosforilados foram misturados, o volume ajustado a

50ul com tampão de reacção para cinase e incubado com 5 unidade de DNA ligase de T4 a 15°C durante a noite.

A reacção de ligação do adaptador foi terminada por incubação a 80°C durante 5 min. O volume de reacção foi ajustado a 200ul contendo lOOmM Tris-HCl pH 7,4, 8mM MgCl₂ e incubado com 10 unidades da endonuclease de restrição Bst I a 37°C durante 8 horas.

A mistura de reacção foi desproteinizada por duas extracções com igual volume de fenol e duas vezes com um volume igual de clorofórmio antes da aplicação numa coluna de 10 ml de volume de leito contendo Sephadex G-50-S e eluição em 10mM Tris-HCl pH 7,4, 50mM NaCl, lmM EDTA. A fracção excluida desta coluna foi usada directamente para ligação ao plasmídeo vector.

(6) Clonagem em E, coli 910 usando pBR322 como vector

O plasmídeo pBR322 com super-enrolamento (GIBCO-BRL, Uxbridge, UK) foi linearizado por tratamento com a endonuclease Bst I e desfosforilado parcialmente por tratamento com a fosfatase alcalina de intestino de vitela (para reduzir a auto-ligação dos extremos do vector) de acordo com os protocolos estabelecidos.

As reacções de ligação individuais contendo aproximadamente 100ng de vector tratado e cerca de 50ng de cDNA de cadeia dupla com adaptadores em 20ul de 66mM Tris-HCl pH 7,6, 6,6mM MgCl₂, 10mM DTT, 0,5mM ATP foram incubadas com 2 unidades de DNA ligase de T4 a 15°C durante a noite.

Amostras de 3ul das misturas de ligação foram diluídas para um volume de 50ul com 0,1M CaCl₂ e usadas para transformar suspensões de 100ul de E. coli estirpe 910 tratada com CaCl^ (obtida do Prof. W. Bram mar, Depto. de Bioquímica da Universidade de Leicester, UK) de acordo com métodos convencionais.

Obtiveram-se cerca de 800 colónias resistentes à ampicilina (50ug/ml) por transformação. Réplicas des tas placas em placas de agar contendo ampicilina ou tetraciclina (50ug/ml) indicaram que cerca de 25% destas eram recombinantes resistentes à ampicilina e sensíveis à tetraciclina.

360 colónias recombinantes foram semeadas em filtros de nitrocelulose e guardadas a -80°C após ter-se preparado filtros réplica a partir deles como descrito por Hanahan, D. & Meselson, M. ( /”1980_7 Plasmid screening and high colony density. Gene 10 , 63-7) para despiste por hibridação in situ.

(7) Rastreio de recombinantes relativamente à sequência codificadora de CpTI

Uma vez que não se dispunha de uma única sonda com especificidade absoluta para sequências de cDNA de CpTI os clones portadores de tais sequências foram identificados com base numa série de testes baseados em:

i) a abundância esperada de mRNA de CpTI no RNA dos cotilédones ii) hibridação com um oligonucleotídeo 14-mero sintético misto complementar das possibilidades codificadoras da região C do polipeptídeo CpTI fIV

iii) o tamanho da sequência inserida sendo perto do previsto para cDNA de CpTI de tamanho completo iv) determinação directa da sequência inserida para assegurar que ela possui o potencial codificador para (parte de) um inibidor da tripsina

Os filtros de nitrocelulose tendo as colónias bacterianas a serem usadas para hibridação foram primeiro incubados em placas da agar contendo 250ug/ml de cloranfenicol durante 12-16 horas para permitir a amplificação do número de cópias da plasmídeo. Os filtros foram separados das placas e colocados, as colónias para cima, numa série de pilhas de papel Whatman 3MM embebido consecutivamente em : 10% SDS durante 3 min; 0,5M NaOH,l,5M NaCl durante 5 min; 1M Tris-HC1, pH 8,0, 1,5M NaCl durante 5 min e 3xSSC (lx SSC= 0,15MNaCl, 0,015M Na citrato) duas vezes durante 5 min. Os filtros foram secos ao ar e colocados durante 2 horas num forno sob vácuo.

Previu-se o mRNA de CpTI como moderadamente abundante no mRNA de cotilédones - o seu nível reflectindo mais ou menos o da proteína, i.e. na região de 1% do total. 2ug de RNA poliA⁺ dos cotilédones de feijão frade foi marcado radioactivamente por transcrição reversa na presença de 50uCi de P-dCTP (410Ci/mMol) como descrito em (3) acima. Os produtos de alto peso molecular da reacção foram recuperados de uma coluna de Sephadex G-50-S eluida com 10mM Tris-HCl, pH 7,4, lmM EDTA. O cDNA marcado com P foi pré-incubado em 10 ml de 3xSSC, 0,1% de SDS, albumina do soro bovino (BSA), polivinilpirrolidona (PVP) e Ficoll, 0,02% de cada, 250 ug/ml de DNA de esperma de salmão desnaturado e sonicado, lOOug/ml de poliadenosina a 65°C durante 1 hora. Os filtros foram pré-hibridados em

mudas de 3xSSC, 0,1% de SDS a 65°C durante 30 min. cada, depois em 3xSSC, 0,1% SDS, BSA, PVP e Ficoll, 0,0.2% de cada, 250ug/ml de DNA de esperma de salmão desnaturado e sonicado a 65°C durante 4 h. A sonda pré-tratada foi adicionada aos filtros escorridos e incubada a 65°C durante 16 h. Escorreram-se os filtros e lavaram-se com cerca de 2ml/cm de área de superfície de, sequenciadamente, 3xSSC, 0,1% SDS duas vezes durante 5 min à temperatura ambiente, 3xSSC, 0,1% SDS três vezes durante 40 min a 65°C, 2xSSc duas vezes durante 5 min à temperatura ambiente: depois foram secos e auto-radiografados por exposição a filme de raios X Fuji RX à temperatura ambiente durante 19 h.

Cerca de 30-40% das colónias deram um sinal auto-radiográfico com uma intensidade esperada se contivessem sequências que fossem moderada a altamente repetitivas na sonda.

Uma síntese de oligonucleotídeos mistos foi efectuada pela Genex Corporation de todas as 16 alternativas dos 14-meros: 5¹-dCC /A/G_7CA /^_A/G_7 AA /A/G_7 CA /~T/C 7 TG. A sequência foi verificada por processos convencionais de sequenciação por modificação química usando reacções específicas para T, T+C, C, A/C, A+G e G. Os oligonucleotídeos foram marcados radioactivamente nos seus extremos 5' por reacção com 32

P-ATP usando polinucleotídeo cinase em processos conhecidos.

Os filtros de nitrocelulose foram pré-incubados em 3xSSC, 0,1% SDS quatro vezes durante 30 min a 65°C, depois em 6xSSC, 0,1% SDS, BSA, PVP e Ficoll 0,02% de cada, lmM EDTA, 125ug/ml de DNA de esperma de salmão a 45°C durante 8 horas. Os filtros foram pré-hi-33-

bridados com os 14-meros marcados numa mistura semelhante a 37°C durante 21 h. Lavaram-se os filtros em 6xSSC, 0,1% SDS quatro vezes durante 10 min a 25°C, depois duas vezes durante 5 min a 39°C. Embeberam-se em 6xSSC, secaram-se e expuseram-se a filme Fuji-TX pré-exposto (pré-flash'¹) a -80°C com um écran intensificador Dupont Cronex durante 21 h. Cerca de 14% dos recombinantes foram nitidamente marcados acima do fundo.

O DNA de plasmídeo foi preparado a partir de culturas de 10 ml de 24 dos recombinantes que eram potencialmente positivos para cDNAde CpTI nos dois critérios anteriores. Os tamanhos das sequências de DNA inseridas nestes plasmídeos foram determinados a partir da migração dos fragmentos de restrição Bam Hl em electroforese de gel de agarose. As inserções variaram no tamanho entre cerca de 400 e 1800 pares de bases. Uma vez que não se esperava que o DNA de CpTI fosse maior do que cerca de 550 pb, os 4 clones contendo inserções não superiores a isto foram seleccionados para análise da sequência. As inserções Bam Hl destes clones foram transferidas para o sítio Bam Hl do vector bacteriofágico de cadeia simples M13mp9 e sequenciados pela terminação de cadeias didesoxi com

S-tio-dATP usando métodos bem estabelecidos. As sequências obtidas e os seus complementos foram examinados quanto ao potencial codificador para dar um produto homólogo da sequência primária de CpTI fIV de inibidores da tripsina tipo Bowman-Birk de outros legumes e quanto à homologia com a sequência publicada do gene do inibidor da tripsina tipo Bowman-Birk da soja (Hammond, R.W., Foarde, D.E., & Larkins, B. A. /1984 7 Molecular cloning and analysis of a gene coding for the Bowman-Birk protease inhibitor in soybean. J. Biol. Chem. 259, 9883-90).

plasmídeo pAGCl continha a sequência de cDNA parcial do CpTI atrás referida. 0 plasmídeo pUSSRall/7 continha uma sequência codificadora idêntica, sem 6 nucleotídeos do extremo 5¹. Os outros dois plasmídeos continham sequências não identificadas que não foram relacionadas com sequências codificadoras de CpTI.

(8) Sintese de cDNA de alta eficácia

Empregou-se um método melhorado de síntese de cDNA para se obter recombinantes contendo sequências codificadoras de CpTI completas. Este método tem maior probabilidade de produzir cDNAs de tamanho completo uma vez que não depende da iniciação de ansa terminal para a síntese da segunda cadeia e evita a necessidade de digestão com a nuclease SI.

5,4ug de mRNA de cotilédones de feijão frade foi incubado em 40iilde: 50mM Tris-HCl, pH 8,3; 10mM MgC^; 10mM DTT; 4mM Na pirofosfato; dAT P, dCTP, dGTP e dTTP l,25mM de cada; lOOug/ml de oligo (dT) 12-18;

120 unidades de transcriptase reversa de AMV; 40 unidades de inibidor de RNases de placenta humana e 2uCi de ^zP-dCTP (como marcador) a 43 C durante 80 minutos. A reacção foi parada por transferência para gelo fundente e tornando-a 20mM relativamente a EDTA, depois desproteinizada duas vezes por extracção com fenol/clorofórmio. Os ácidos nucleicos foram precipitados com etanol a partir da fase aquosa préviamente tornada 2M relativamente a acetato de amónio e lug/ul relativamente a glicogénio de ostra altamente purificado (como veículo). Os ácidos nucleicos sedimentados foram reprecipitados a partir de acetato de amónio 2M e resuspensos em 10ul de água.

Os produtos de síntese da primeira cadeia foram incubados em 35ul de volume total contendo: 20mM Tris-HC1, pH 7,5; lOOmM KC1; lOmM sulfato de amónio; 5mM MgCl₂; 0,15mM NAD; 50ug/ml de BSA sem nucleases; dATP, dCTP, dGTP e dTTP 40uM; 8,5 unidades/ml de RNase H de E. coli; 230 unidades/ml de DNA polimerase I; 10 unidades/ml de DNA ligase de E. coli a 12°C durante 1 hora depois a 22°C durante mais uma hora. A reacção foi parada e os produtos processados como para a reacção anterior. Para remover quaisquer projecções 3' na primeira cadeia, o cDNA de cadeia dupla foi incubado em 25ul de: 33mM Tris-acetato, pH7,9; 66mM KAc; 10mM MgAc; 0,5mM DTT; dTTP; 2,5 unidades de DNA polimerase de T4 a 12°C durante uma hora. Os produtos da reacção foram processados como atrás.

(9) Clonagem em E. coli JM83 usando pUC19 como vector

O plasmídeo super-enrolado pUC19 (GIBCO-BRL, Uxbridge, UK) foi linearizado por tratamento com a endonuclease de restrição Hinc II e desfosforilado por tratamento com fosfatase intestinal de vitela de acordo com protocolos estabelecidos.

As reacções de ligação dos extremos cegos contendo aproximadamente 100ng de vector tratado e cerca de 20ng de cDNA de cadeia dupla em 20ul de: 66mM Tris-HC1 pH 7,5; 6,6mM MgCl₂; 10mM DTT; 0,5mM ATP e 2 unidades de DNA ligase de T4 foram incubados a 4°C durante a noite. As reacções de ligação foram tornadas 2M para acetato de amónio e precipitadas com etanol. Elas forma redissolvidas em 10ul de 0,1M CaCl₂ e usadas para transformar lotes de 100ul de E. coli JM83 competente (obtidas do Dr. J Messing, Depto de Bioquímica, Universidade de Minesota, USA)

de acordo com métodos estabelecidos. Os recombinantes foram seleccionados como colónias brancas em placas de agar YT-BCIG-Ampicilina. 283 colónias recombinantes foram transferidas para filtros de nitrocelulose.

(10) Rastreio dos recombinantes para sequências codificadoras de CpTI

Nesta fase, a hibridação cruzada com a inserção de pAGCl e o oligonucleotídeo sintético de 14 meros foi considerado como sendo diagnóstico de uma sequência de cDNA de CpTI. O DNA dos clones recombinantes foi fixado aos filtros de nitrocelulose conforme descrito acima (Secção 7). A inserção de pAGCl foi isolada a partir da separação electroforética em géis de 2% de agarose dos fragmentos de restrição 32

Bam Hl de pAGCl e marcada com P-dCTP por nick-translation usando umkit de nick-translation comercial. Os 14-meros sintéticos foram marcados com P usando polinucleotídeo cinase conforme préviamente descrito. A hibridação com os filtros com colónias foi efectuada como anteriormente descrita, sendo a pressão final de lavagem 2xSSC, 65°C para a sonda da inserção de pAGCl e 6xSSC, 39°C para os oligonucleotídeos sintéticos.

O plasmídeo pUSSRc3/2 hibridou muito fortemente com a inserção pAGCl, menos fortemente com os 14-meros, enquanto que pUSSRd4/6 hibridou muito fortemente com os 14-meros e menos fortemente com a inserção de pACGl. O DNA de plasmídeo foi purificado a partir destes clones em gradientes de cloreto de césio e feitos os mapas de restrição de acordo com processos estabelecidos. A sequência de nucleotídeos dos fragmentos inseridos foi determinada por sequenciação

do DNA através de modificação química.

plasmídeo pUSSRc3/2 continha uma sequência de DNA aparentemente de tamanho completo para um iso-inibidor CpTI préviamente exemplificado por pAGCl. 0 plasmídeo pUSSRd4/6 continha uma sequência de cDNA contendo toda a sequência codificadora da proteína madura de um iso-inibidor CpTI diferente, mais estreitamente relacionado com o iso-inibidor fIV mas sem parte da sequência condutora 5'.

(11) Transferência de sequências de CpTI do pUSSRc3/2 para um vector de expressão BIN de Agrobacterium

Digeriu-se 10ug de DNA de pUSSRc3/2 com as endonucleases de restrição Alu I, Sca I e Xmn I em 33mM Tris-acetato, pH 7,8; 66mM KAc; lOmM MgAc; 4mM espermidina e 0,5mM DTT (tampão TA). O único fragmento de 552 pb gerado, contendo toda a sequência codificadora de CpTI, foi purificado a partir de uma separação electroforética num gel de 6% de acrilamida dos produtos da digestão. O plasmídeo vector pRoK2 (fornecido pelo Dr M. Bevan, Plant Breeding Institute, Cambridge, UK) foi linearizado com a endonuclease de restrição Sma I, desfosforilado com fosfatase de intestino de vitela e ligado pelos extremos cegos ao fragmento de 550 pb descrito atrás. A reacção de ligação foi usada directamente para transformar E.coli estirpe MC1022 (Dr M Bevan, como atrás) para resistência à canamicina (50ug/ml).

Preparou-se DNA de plasmídeo a partir de culturas de 10 ml de colónias individuais transformadas e analisou-se relativamente a possuir o fragmento inserido na orientação correcta ou não por mapeamento de res-

trição. Os clones com a inserção na orientação correcta, i.e. :

Promotor de CaMV-5' sequência codificadora de CpTI 3'- terminador NOS foram designados pRoKCpTI+(número do clone). Os da orientação errada, i.e.:

Promotor de CaMV-3' sequência codificadora de CpTI 5‘- terminador NOS foram designados pRoKCpTI-(número do clone).

(12) Transferência para Agrobacterium tumefaciens

Preparam-se culturas de 10 ml crescidas durante a noite de:

Agrobacterium tumefaciens estirpe LB4404 (Dr M. Bevan, como atrás) em caldo nutritivo + 500ug/ml de estreptomicina + lOOug/ml de rifamicina a 30°C

13. coli estirpe MC10 22 portadora de pRoKCpTI + 5 ou pRoKCpTI-2 em caldo L + 500ug/ml de canamicina a 3 7°C;

E. coli HB101 portadora de pRK2013 (Dr M. Bevan,como atrás) em caldo L + 500 ug/ml de estreptomicina + lOOug/ml de rifamicina a 37°C.

Agrobacterium, estirpe de mobilização e uma das estirpes contendo CpTI, 200ul de cada, foram misturadas, semeadas em placas de agar L e incubadas durante a noite a 30°C. As camadas de bactérias foram suspensas em 5 ml de Tris-HCl pH 7,0; 10mM MgCl₂ e semearam-se amostras em placas de agar mínimo contendo estreptomicina (500ug/ml) rifamicina (lOOug/ml) *

e canamicina (50 ug/ml) e incubaram-se a 30°C durante dois dias. A resistência das colónias aos três antibióticos foi assegurada semeando de novo colónias individuais em placad selectivas semelhantes mais duas vezes.

(13) Transferência do gene CpTI para Nicotiana tabacum e Nicotiana plumbaginifolia

Retiraram-se discos das folhas de plantas axénicas de N. tabacum (var samsun) e N. plumbaginifolia (uma variedade di-haplóide sem designação obtida originalmente do Institut National de Recherche Agronomique, Versailles, Paris, France) e incubaram-se com uma cultura crescida durante a noite de A. tumefaciens portadora de construções do plasmídeo Ti-RoKCpTI. Os discos foram secos e transferidos para placas de meio de regeneração de rebentos de acordo com processos publicados (Fraley, R.T., Rogers, S.G. Horsch, R.B., Sanders, P.,Flick, J., Adams, S., Bittner, M., Brond, L., Fink, C., Fry, J.E., Galluppi, G. , Goldberg, S., Hoffman, N.L., Woo, S., Expression of bacterial genes in plants cells /Í983_7 Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80 , 4083-7; Horsc, R.B., Fry, J.E., Hoffman, N.L., Eicholtz, D., Rogers, S. G., Fraley, R. T. / 1985_7 A simple and General method for transforming genes into plants. Science 227, 1229-31) na presença de carbenicilina (500ug/ml) e canamicina (lOOug/ml). Os esboços de rebentos resistentes à canamicina foram transferidos para meio indutor de raízes contendo carbenicilina e canamicina. Obtiveram-se réplicas de plantas individuais com raiz por cultura de rebentos. Plântulas com raizes bem estabelecidas foram envasadas em compost e Perlite 50:50 e crescidas numa câmara de crescimento Sherer com um regime de 16 horas de luz

por dia a 25°C.

As plantas pareceram ser fenotipicamente normais em termos de estado de crescimento, velocidade de crescimento, tempo de floração, viabilidade da semente

I etc., .(ver Tabela 3) .

Tabela 3 Características fenótipicas das plantas transformadas comparadas com as testemunhas não transformadas

Tempo médio da floração (dia)

Altura média da planta na floração (cm)

Viabilidade da semente ( % germinação )

Testemunha+5/5

4108

19,621,5

9399 (14) Bioensaios de resistência a insectos das plantas transformadas

As pupas de Heliothis virescens (f.) / Lep.; Noctuidre 7 a lagarta dos botões do tabaco ou dos botões do tomateiro, foram fornecidas pela USDA (Brownsvil

-41le, Texas, USA). Quando da chegada ao Reino Unido as culturas foram mantidas a 25°C com 13 horas de luz por dia. As fases larvares foram criadas numa dieta à base de agar contendo alfafa, farinha de. feijão, gérmen de trigo e vitaminas e minerais essenciais; os adultos foram mantidos numa solução de mel suplementado com vitaminas.

As plantas, cerca de 12 cm de altura no caso de N. tabacum e 8 cm no caso de N. plumbaginifolia, foram mantidas dentro de maternidades individuais fechadas dentro da câmara de crescimento. Estas foram infestadas com oito larvas de H. virescens com 12-24 horas de idade (oito verificou-se ser o número óptimo para sobrevivência larvar em plantas testemunhas nestas condições). Após 7 dias nas plantas, todas as larvas sobreviventes foram retiradas, anestesiadas em acetato de metilo, preservadas em fixador de Bovino e medidas. A danificação das plantas foi calculada por classificação das plantas numa escala arbitrária de 1-5 dos danos visíveis e medindo a área comida de uma folha específica (a terceira folha madura a partir do apex, geralmente a mais danificada). Os resultados desta experiência estão apresentados na tabela 2. Os resultados mostrando os niveis de CpTI e % de sobrevivência dos insectos numa base de plantas individuais estão apresentados na Tabela 4. As plantas que mostraram um nível moderado a elevado de resistência aos insectos (juntamente com algumas plantas testemunha) foram sujeitas a novos ciclos de infestação com larvas do primeiro ou do segundo instar.

Ensaios de alimentação com H. virescens em réplicas clonais de plantas

Transformantes de N. tabacum +5/5, +5/21 e -2/8 foram replicados através de segmentos de caule que foram enraizados em agar contendo canamicina em grupos de 8 a 16 plantas. Estas continuaram a crescer em terra composta até cerca de 12 cm de altura, depois foram inoculadas com 8 larvas de H. viruscens de aparecimento recente por planta em plantaria fechados conforme préviamente detalhado. Após 7 dias os insectos que sobreviveram foram removidos (excepto de algumas plantas que foram controladas durante um período mais longo) e a sobrevivência e crescimento dos insectos foram testados como anteriormente. A danificação das plantas foi calculada como a percentagem de superfície comida das folhas por análise de imagens de folhas específicas usando um analisador de imagens VIP e programas fornecidos por Sightsystems Lta. (Newbury, UK).

Os resultados estão resumidos na Tabela 5. As larvas de H. virescens estiveram sujeitas a uma mortalidade significativamente maior e crescimento significativamente mais reduzido nos transformantes que expressam +5/5 e +5/21. Estas plantas também sofreram menos danos que as testemunhas.

Tabela 4 Bioensaio para actividade insecticida de CpTI em plantas do tabaco transformadas contra H. virescens

São registadas apenas as plantas usadas em dois ensaios de alimentação + CpTI foi detectado usando um ensaio de imunoligação de pontos em proteínas solúveis extraídas a parI

tir de folhas que foram removidas antes da infestação. Os padrões foram CpTI purificado por afinidade em extratos de proteína testemunha^derivados de plantas não transformadas.

Φ A actividade inibidora da tripsina foi medida em extratos proteicos solúveis da folha, expressa em equivalente ug de CpTI purificada por afinidade por mg de proteína da folha. As folhas deste ensaio fo-

ram umas recentemente expandidas derivadas de plan-
tas	mais maduras (depois	do bioensaio).
Plantas	CpTI detectado	Actividade	% Sobrevivência
originais	,(ug/ml de proteína	inibidora da	dos insectos
	solúvel +)	tripsina -j-
-2/2	1		100
-2/4	1		87,5
-2/7	1		100
-2/8	1	1,7	87,5
+5/1	1,1		87,5
+5/3	1,3		100
+5/4	1		100
+5/5	9,6	9,9	37,5
+5/9	5,8		62,5
+5/11	3,8		62,5
+5/14	4,2		75 ,0
+5/19	2,5		62,5
+5/21	6,2	7,0	50
+5/23	1		100

44Tabela 5 Ensaios de Alimentação com Helithus virescens (*) - p<0,05; (**) ρ<ζ0,025; (***) p<^ 0 ,01

Parâmetro	-2 /8	+5/5	Significância
Sobrevivência dos insectos (%)	58,65	41,96	(*)
Tamanho médio dos sobreviventes (mm)	15,42	10 ,57	(***)
Peso de insectos vivos/planta (mg)	236,4	63,9	(#**)
Área de folha comida (%)	52,3	21,1	(***)
	-2/8	+5/21
Sobrevivência dos insectos (%)	86,36	72,73	(**)
Tamanho médio dos sobreviventes (mm)	12,50	10 ,54	(***)
Peso de insectos vivos/planta (mg)	193,5	10 9 ,8	(***)
Área de folha comida (%)	49 ,6	30 ,1	(***)

(15) Ensaios de alimentação com outras pragas de insectos

Efectuaram-se ensaios de alimentação para testar o efeito do gene CpTI no tabaco (+5/5) contra uma série de outras importantes pragas de insectos do algodoeiro e cereais:

a) Heliothis zea

Pupas de H. zea foram obtidas do Glasshouse Research Institute (Littlehampton) e USDA (Brownsville, Texas, USA) e mantidas como descrito para H. virescens. Replicas clonais de +5/5 e -2/8 foram infestadas com 8 i

larvas recém aparecidas ( <(24 h de idade) por planta e o bioensaio efectuado como atrás.

Nos primeiros ensaios, apenas 16/192 larvas sobreviveram nas plantas testemunhas (cf. 10/224 em +5/5) o número médio de sobreviventes por planta sendo muito perto de zero para serem úteis. No entanto, usando plantas ligeiramente mais jovens (6 cm de altura) a sobrevivência nas testemunhas atingiu 30% e puderam ser feitas comparações significativas /Tabela 6_7. As plantas expressando CpTI foram claramente mais resistentes ao ataque e sobrevivência de H. zea.

b) Spodoptera littoralis

Pupas de í>. littoralis foram obtidas de May & Baker Ltd., Ongar Research Station, Essex, O. K. e mantidas como descrito para H. virescens. Replicas clonais de +5/5 e -2/8 foram infestadas com 8 larvas recém-aparecidas ( ¢12 h de idade) e o bioensaio conduzido como atrás. A danificação das plantas foi mais evidente nas folhas mais baixas nesta espécie de insecto e portanto foi desta região que se retiraram as folhas para análise de imagem. Como se mostra na Tabela 7, as plantas expressando CpTI mostraram-se novamente mais resistentes ao ataque e sobrevivência de larvas jovens de £3. littoralis.

Tabela 6 Ensaio de alimentação de +5/5 com Heliothis zea

(*) - p(0 ,05;	(n.s.)	- não	significativo
Parâmetro	-2/8	+5/5	Significância
Sobrevivência de insectos (%)	30 ,0	17,70	(*)
Tamanho médio dos sobreviventes (mm)	10 ,38	9,29	(n.s.)
Peso dos insectos vivos/plant (mg)	51,4	32,2	(n.s.)
Área da folha comida (%)	41,61	13,31	(n.s.)

Tabela 7 Ensaio de alimentação de +5/5 com Spodoptera littoralis (*) - ρ<ζ0,0 5; (***) p/0,0 25; (n.s.) - não significativo

Parâmetro

-2/8 + 5/5

Significância

Sobrevivência de insectos (%)

61,25

43,75 (*)

Tamanho médio dos sobreviventes (mm) 14,39

14,70 (n.s.)

Peso dos insectos vivos/planta (mg) 323,5 265,1 (n.s.)

Área de folha comida (%)

27,24 10 ,40 (***)

Pode ter interesse que apesar de não haver diferença significativa entre os tamanhos médios dos insectos sobreviventes parece haver uma diferença marcada na distribuição dos tamanhos. Nas plantas testemunhas a distribuição dos tamanhos parece ser contínua enquanto que em +5/5s foi bimodal, com tamanhos modais considerávelmente mais pequenos ou muito maiores do que a média. Considerámos isto como os primeiros a sucumbi rem aos efeitos antimetabólicos do CpTI, enquanto que os últimos podem ter atingido um tamanho suficiente (nalguns casos talvez através de canibalismo) para serem capazes de suportar os seus efeitos.

c) Manduca sexta

Os ovos de M. sexta foram fornecidos pelo Dr. S. Reynolds (School of Biological Sciences, University of Bath, UK). A progénie SI resistente à canamicina de plantas +5/5 e -2/8 foi infestada com 4 larvas recém-aparecidas (menos de 24 h de idade) e o bioensaio foi efectuado como atrás.

As larvas de M. sexta são considerávelmente maiores do que as dos outros Lepidópteros testados e provocaram rápidamente uma grande destruição das plantas testemunhas. Por esta razão foi necessário reduzir o número de insectos usados por planta e em vez de se medir os danos de uma folha específica, foi necessário calcular os danos totais da planta. As plantas expressando CpTI mostraram ter uma maior resistência a esta espécie de praga (Tabela 8).

«Μ

-48Tabela 8 Ensaio de alimentação de +5/5 com Manduca sexta (*) -p^0,0 5; (***) - p<^0,01

Parâmetro	-2/8	+5/5	Significância
Sobrevivência dos insectos (%)	82,14	64,29	(***)
Tamanho médio dos sobreviventes (mm)	26 ,68	22,72	(*)
Peso dos insectos vivos/planta (g)	1,00	0 ,46	(***)
Planta comida (%)	80 ,10	60 ,45	(***)

(16) Determinação da expressão de CpTI em plantas transformadas

Os métodos para estudar a expressão de CpTI em tecidos vegetais transformados dependeram de várias técnicas de reacção cruzada imune usando anti-soro anti-CpTI ou de ensaios directos in vitro da actividade inibidora da tripsina.

a) Preparação de anti-soro de coelho anti CpTI

Soro contendo anti-corpos primários anti-CpTI foi produzido em coelhos. Usou-se glutaraldeído para fazer a ligação cruzada de CpTI a albumina do soro de coelho (RSA). Injectaram-se os coelhos com 500ul de CpTI-RSA suspenso em 500ul de Adjuvante Completo de Freund. Administraram-se mais quatro injecções, com intervalos semanais aproximados, de 500ul de CpTI-RSA suspenso em 500ul de Adjuvante Completo de Freund. Finalmente, administraram-se injecções de memória de 0,5 mg de CpTI não modificado em tampão fosfato sali no e três semanas mais tarde administrou-se 0,25 mg de CpTI-RSA antes da colheita do soro imune.

As dificuldades encontradas na indução deste anti-soro indicaram que CpTI é um antigénio fraco. Deve ser lembrado que os anticorpos foram produzidos contra CpTI total, do qual o iso-inibidor codificado por pUSSRc 3/2 é apenas uma fracção. Os locais antigénicos mais prováveis nos inibidores ocorrem nas regiões variáveis dos polipeptídeos e portanto não se sabe qual a proporção de anticorpos que irão de facto reagir cruzadamente com o produto do gene CpTI introduzido. Provávelmente estes métodos subestimam a quantidade de um único iso-inibidor CpTI quando se usa CpTI total como padrão.

b) Preparação de extratos proteicos de tecidos vegetais

Os estratos proteicos brutos para algumas das ELISAs iniciais e para ensaios de imunotransferência de pontos foram preparados a partir de folhas em crescimento, a partir de raízes lavadas e a partir de desecções de caule. Estes foram removidos, congelados em ar líquido, triturados até se reduzir a pó e liofilizados. Extrairam-se durante a noite a 4°C a 40ug peso seco/ml de 50mM Tris-HCl, pH 9,5 num tambor rotativo. ELISAs, ensaios in vitro de inibidor da tripsina e transferências Western subsequentes foram efectuados em fracções precipitadas com sulfato de amónio. Colheram-se folhas congelaram-se e trituraram-se como atrás. Foram logo de seguida extraídas durante a noite a 4°C em 50mM Tris-HCl, pH 9,5; lmM DTT a 1 mg peso seco/ 2,7ul.O material insolúvel foi sedimentado por centrifugação e o sobrenadante, 1 ml, foi precipitado com sulfato de amónio para 95% de saturação a 4°C durante a noite .

A proteína precipitada foi sedimentada, ressuspensa em 400ul de tampão de extracção e dialisada contra 50mM Tris-HCl, pH 9,5. As concentrações proteicas foram determinadas usando o ensaio para proteínas de Bradford (Bradford, M.M. /”1976 7 A rapid and sensitive method for the quantification of milligram quantities of protein utilising the principie of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72 , 248-54).

c) Ensaios de imunosorvente ligado a enzimas (ELISA)

A expressão de CpTI foi medida por ELISA de extratos de folhas derivados de plantas transformadas usando um Kit de ELISA comercial com anticorpos secundários ligados a peroxidase. Os resultados destes ensaios foram suficientes para permitir identificação qualitativa de plantas com expressão alta mas considerados quantitativamente pouco seguros, devido à fraca antigenicidade de CpTI e aos níveis baixos de proteína encontrados nas placas de ELISA.

d) Ensaios in vitro do inibidor da tripsina

A actividade inibidora da tripsina nas amostras foi determinada usando -N-benzoil-DL-arginino-p-nitroanileto HC1 (ΒΑΡΝΑ) como substrato baseado no método de Erlanger, et al. (Erlanger, B. F., Kakowsky, N., Cohen, W. /”1961 7 The preparation and properties of two new chromogenic substrates of trypsin. Arch. Biochem. Biophys. 95 , 271-278) O nível de actividade CpTI determinado por este método foi muito superior ao indicado por ELISA (Tabela 2)- muito mais de acordo com o que se esperava tendo em conta a actividade biológica observada. Este método de ensaio foi, no entanto, também sujeito a interferência incontrolávelmente variável.

e) Ensaios de proteína por imunotransferência de pontos (dot-immunoblot)

Extractos de tecidos contendo 5 ug de proteínas foram ligados a filtros de nitrocelulose e sujeitos ao ensaio de imunoligação de pontos como descrito por Jahn, R. Schiebler, W., Greengard, P. ( / 1984 7 A quantitative dotimmunobinding assay for proteins using nitrocellulose membrane filters. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81 , 1684-87), usando anticorpos de peru anti125

-coelho marcados com I. Padrões de quantidades conhecidas de CpTI purificado foram aplicados conjuntamente com 5ug de extratos de tabaco não transformado. Após auto-radiografia fez-se quantificação por contagem de cintilação dos pontos individuais ou por scanning do auto-radiograma com um densitómetro integrador de laser LKB Ultrascan.

Os resultados usando este método foram muito reprodutíveis. 0 nivel calculado de cerca de 0,9% da proteína total como sendo CpTI em +5/5 é ainda provávelmente uma subestimação devido à fraca reactividade cruzada do anticorpo.

Os níveis de expressão de CpTI em folhas jovens e velhas , tecidos do caule e da raiz foram calculados por este método. Nesta experiência particular um nível elevado de fundo devido à ligação inespecífica dos anticorpos limitou o nível de detecção seguro a cerca de 18 mg por amostra (0,4% de proteína) e contribuiu para um cálculo invulgarmente baixo do nível de expressão em folhas jovens de +5/5s. Os resultados (Tabela 9)

no entanto demonstraram claramente que:

a quantidade relativa de CpTI decresce à medida que as folhas amadurecem;

CpTI está presente nos caules de plantas transformadas ;

é expresso numa proporção ainda mais alta de proteína total nas raízes.

Tabela 9 Expressão de CpTI em percentagem de proteína solúvel em diferentes extratos de tecidos vegetais.

	Folha jovem	Folha madura	Caule	Raiz
+5/5	0,6	0,4	0,6	1,0
-2/8	0,4	0,4	0,4	0,4
Testemunha	0,4	0,4	0,4	0,4

f) Transferência Western

A presença de CpTI em plantas de tabaco transformadas foi também confirmada por transferência Western. Extratos de proteína solúvel precipitados com sulfato de amónio e obtidos de folhas jovens de plantas+5/5 e -2/8 migraram numa electroforese em gel de 17% poliacrilamida -SDS em condições não redutoras. CpTI puri-53-

ficado em coluna de afinidade com tripsina e proteína solúvel extraída de sementes de feijão-frade Tvu2027 correram em simultâneo como padrões. A transferência Western foi efectuada como descrito por Towbin et al, (Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J., /”1979_7 Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets. Procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 76,4350-4) A transferência (Figura 9) mostra que existem bandas de material que dá reacção cruzada com os anticorpos contra CpTI nas folhas de +5/5s que não estão presentes em -2/8s e que estas bandas correspondem a bandas principais de CpTI na semente do feijão frade.

A Figura 9 mostra o seguinte:

A) CpTI purificado por afinidade

B) Extrato de sementes de feijão frade TVu2027

C) Tecido da folha de -2/8

D) Tecido da folha de +5/5 (17) Análise genética dos transformantes

a) Análise da segregação da resistência à canamicina

As plantas transformadas originais de N. tabacum formaram sementes por autopolinização. As sementes maduras foram colhidas e guardadas em garrafas fechadas herméticamente a 4°C. Esterilizou-se a superfície das sementes em 20% Chloros e puseram-se as sementes a germinar em 0,8% de agar contendo sais de meio Murashige e Skoog 0 ,5 x e 200ug/ml de canamicina na cama-54-

ra de crescimento.

Entre as sementes germinadas da geração SI distinguiram-se claramente quatro tipo de fenótipos:

Sementes não viáveis que não germinaram

Resistentes à canamicina - que cresceram bem em 200 ug/ml de canamicina, desenvolvendo sistemas radiculares altamente ramificados e verdadeiras folhas verdes saudáveis.

Sementes sensíveis à canamicina mas que as raízes não desenvolveram ramos, não se desenvolveram verdadeiras folhas e os cotilédones tornaram-se branqueados.

Sementes com resistência intermédia germinaram e continuaram a desenvolver verdadeiras folhas mas o sistema radicular era nitidamente menos ramificado do que o das sementes germinadas totalmente resistentes (particularmente evidente quando se puxaram as sementes germinadas do agar) e observou-se algumas zonas branqueadas nas folhas.

A viabilidade das sementes de plantas transformadas era elevada, pelo menos tão elevada com as de N. tabacum ( var-Samsum) não transformadas germinadas em condições semelhantes mas excluindo a canamicina.

Os resultados resumidos na Tabela 10 demonstram que a resistência à canamicina se comporta como um carácter mendeliano simples, presente em um ou dois loci nas plantas testadas, dando origem a taxas de segregação baseadas na genética mendeliana clássica 3:1 ou 9:3:3:1. O caracter é geralmente dominante, conforme esperado, mas parece ser de penetrância variável. Assim, o aparecimento de fenótipos intermediá-

rios nalgumas das plantas de dois loci indica que alguns dos loci exercem um efeito fenótipico muito mais forte do que outros. Note-se que as plantas parentais -2/2 e +5/19 não foram propagadas a este nível de selecção (que é duas vezes a concentração de canamicina inicialmente usada) e de facto a linha -2/2 perdeu-se em cultura contínua em lOOug/ml de canamicina. Uma vez que apenas um ou dois loci estão envolvidos, as plantas homozigóticas foram identificadas na geração S2.

Tabela 10

Análise da segregação da resistência à canamicina na geração SI de plantas de N-tabacum transformadas.

/”* 7Em nenhum dos casos 02 excede o valor crítico

I

-56ο CL.

Eu

tn

$ ρ

Φ -P p

Φ -P P

Φ -P Ρ

Φ +> P

tn 4J

Φ P P

Φ •P P

3 P

Ρ 'Φ

δ 0 rd

Φ 44 P

tp 0

Φ

w

p

0

0

0

0

0

P

o

o

O

A

-P

0

0

0

tp

ip

ip

<Ρ

Ή

0

IP

tp

44

•rd

C

rd

tp

tp

ip

z

z

z

3

•H

ρ

z

ε

s

tn

tn

tn

tn

[fl

tn

tn

tn

rtí

Φ

tn

-P

3

á

d

3

•rd

3

d

õ

•H

•r|

4-1

3

d

O

Q

f)

f)

ϋ

□

0

y

y

0

y

y

P

Q

Φ

0

Q

0

0

Ô

0

0

0

0

υ

υ

c

0

0

g

rd

H

i—1

rd

rd

rd

rd

rd

1—1

rd

rd

<(D Q 4J ítfl

tp

l—1

CM

rd

rd

A

rd

rd

CM

rd

rd

rd

CM

to cl· .—i n

rd

rd

tn φ

G) rd

*

CM

00

r-

rd

LO

O

σ

co

00

00

00

Ρ Φ

σ>

LO

00

CD

o

ιο

to

cr>

σ>

Kf

4*

CM

03

tn

CM

CM

LO

co

in

o

CM

Γ~·

LO

CM

rd

rd

O

00

rd

Ό-

•k

k.

•k

•k

•k

•k

*»

·»

Ρ Φ

··

A

o

rd

o

rd

o

rd

00

o

O

O

ra tí Q.

o

CM

0

rd

2 SP

o

rd

(C >

rd

φ Φ

• ·

• ·

•rd M

• ·

A θ'

X-k.

Q. C

co

Φ

co

rd

rd

co

rd

rd

rd

in Ό

• ·

rd

Π3 p

+

d·

U Φ

• ·

X Φ

co

co

co

co

CO

CO

cn

00

CO

00

rd

4-J

ω

CO

Φ Φ

+

+

rd

tn tn

+

É-ι tn

σ>

cr>

<φ φ

σ>

k»_X

P c

*—*

P

0

ttti

Φ

O

£d

(0

Φ

00

LO

co

σ

LO

LO

o

o

00

R

LO

CM

(Ti

σ>

<5ϊ

(Ti

(Ti

(Ti

σ>

Q

o

σ>

Φ

cn

(Ti

A

A

P

Φ

θ'

φ

4->

tn •Η tn

(D •Ρ d

A

Φ > •A

A Φ •ri >

rú -p § rd cu

cn	r~	00	co	σ	rd	140	rd	00	t O
kO	LO	LO	co	LO	L£>	00	Γ*	LO	LO
rd			CM

LO

CM

Γ*· <T»	<£>	co		IH	CM	CM	CO	00
rd	rd		rd	CM	rd	CM	CM	140

•^«tfLo^^^oouo co 00 CM LO

I—I

CO

Π0 t-j co

	in	CTi	A	00
A	A	rd	CM	CM
tn	140	LO	140	140
+	+	+	+	+

-2/2 8 68 - 14 91 1:3 2,747 1 locus fraco;requere cópias para resistência neste nível de selecção -2/7 1 24 - 65 99 3:1 0 ,173 1 locus forte

-2/8 14 59 90 63 94 5:6:5 2,577 2 loci fracos; >2 cópias-resistente; 2 cópias-intermédio; 2 cópias-57-

b) Hereditaridade do fenótipo de resistência aos insectos

Dez dos elementos da progénie SI de +5/5 resistentes à canamicina (designados +5/5 /”1 7 All-20) foram testados no bioensaio contra SU littoralis (ver Tabela 11) após o que foram cultivados e auto-fertilizados para dar semente S2. Esta semente foi germinada em agar MS1/2 contendo 200ug/ml de canamicina. As sementes S2 de 4/10 das plantas testadas não mostraram segregação do fenótipo de resistência à canamicina dando origem a taxas de segregação baseadas nas previsões para aquele tamanho de amostra. É interessante que as 4 plantas homozigóticas foram classificadas em 1°, 22, 32 e 52 em termos de resistência aos insectos no bioensaio.

c) Transferências Southern

Isolou-se DNA genómico de alto peso molecular a partir de folhas recentemente amadurecidas das plantas transgénicas através de processos convencionais. 10ug de DNA genómico foi degerido durante a noite a 37°C com Eco RI e Hind III 40 unidades de cada e os fragmentos de restrição foram separados por electroforese em géis de 1% de agarose. Para se conseguir fragmentos marcadores e reconstruções do número de cópias, uma mistura de pRoKCpTI+5 e pRoKCpTI-2 numa proporção de 5:1 foi digerida com Eco RI e Hind III. Plasmídeo cortado equivalente a 1,5 e 20 cópias das

Tabela 11

Ensaio de alimentação de plantas SI (+5/5 / 1 /) com S_. littoralis (*) -p^0,05; (**) - p < 0 ,0 25 .

Parâmetro	Testemunha	+5/5/ 1J
Sobrevivência dos	insectos (%)	45 ,00	30 ,00
Tamanho médio dos (mm)	sobreviventes	23,38	18,42
Peso dos insectos	vivos/planta (g)	3,37	0 ,94
Área da folha comida (%)	70,32	42,35

Significância (*) (*) (*) (**) sequências transferidas por genóforo de Nicotiana por 10ug de DNA de Nicotiana foram sujeitos a electroforese conjuntamente. O DNA foi transferido por transferência Southern para filtros de nitrocelulo32 se e despistado com pRoKCpTI+5 marcado P-dCTP por nick-translation. Faz-se lavagem com pressão elevada em 0,5xSSC, 0,1% de SDS a 68° antes da auto-radiografia. A origem das bandas importantes nos auto-radiogramas das plantas +5/5 e -2/8 está indicada na Figura 10 em que (A) mostra os sítios de restrição de diagnóstico nas construções pRoKCpTI+5 e pRoKCpTI-2 e (B) é um auto-radiograma de uma transferência Southern.

Pode-se resumir as conclusões principais como:

i) Todas as plantas testadas contêm pelo menos uma cópia não rearranjada da construção promotor CaMV35S promotor-CpTI-NOS, conforme indicado pela

presença das bandas de 480 Kp e 1200 Kp na +5s e das bandas de 610 e 10 70 Kp na -2s.

ii) Todas contêm múltiplas cópias da inserção do gene (ver abaixo) iii) A maior parte das cópias estão presentes em ar- ranjos tandem cabeça com cauda - dando origem a uma banda de 2570 Kp. Esta inserção de repetições em tandem justifica a diferença entre o número de cópias do gene e o número de loci genéticos .

iV) Bandas que sugiram fortemente rearranjos internos dentro das construções são invulgares, mas identificáveis nalgumas plantas (e.g. 5/8, Figura 11)

V) As bandas de peso molecular mais elevado são provávelmente o resultado de:

a) digestão incompleta

b) fragmentos de extremos migrando para o DNA do hospedeiro

c) rearranjos de genes

d) transferência do plasmídeo Ti

d) Número de cópias dos genes

O número de cópias foi calculado por integração de scans densitométricos de laser das transferências Southern e das transferências de pontos do DNA genómico usando como padrões as reconstruções de números de cópias de DNA genómico em plasmídeos. Os resultados estão apresentados na Tabela 12. Note-se que não há correlação entre o número de cópias e a expressão de CpTI (e portanto, resistência a insectos). A natureza do sítio em que se deu a inserção é presumivelmente mais importante.

Tabela 12 N2 de cópias de inserções nas plantas transformadas n.d. - não determinado

Planta	Cópias de inserção por genophore
de transferências Southern	de transferencia de pontos
+5/1	36	42
+5/2	16	17
+5/3	n.d.	n.d.
+5/5	3	5
+5/6	n.d.	n.d.
+5/7	7	11
+5/8	17	22
+5/9	8	8
+5/4	2	7
+5/15	2	2
+5/19	9	12
+5/21	n.d.	n.d.
+5/23	13	13
-2/2	n.d.	3
-2/7	3	6
-2/8	7	13

REIVINDICAÇÕES

Claims (10)

1. REIVINDICAÇÕES

   15. - Método para a preparação de uma molécula de DNA recombinante que compreende um gene estrutural codificador de um inibidor da tripsina, caracterizado por compreender a recuperação de mRNA a partir de uma fonte capaz de produzir o inibidor da tripsina, a preparação de cDNA a partir do referido mRNA, e a selecção a partir do referido cDNA de um clone de cDNA tendo uma sequência que lhe permite codificar um inibidor da tripsina.
2. 2^. - Método de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por se preparar uma molécula de DNA em que o gene estrutural codifica um inibidor da tripsina derivado de um legume.

   35. - Método de acordo com a reinvindicação 1 caracterizado por se preparar uma molécula de DNA em que o gene estrutural codifica um inibidor da tripsina derivado de Vigna unguiculata (inibidor da tripsina de cowpea ou CpTI) ou uma proteína tendo propriedades semelhantes às de CpTI e/ou tendo um grau de homologia substancial com o referido inibidor.

   45. - Método de acordo com a reivindicação 2 ou 3 caracterizado por se preparar uma molécula de DNA que foi derivada de Vigna unguiculata.

   55. - Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 ou 4 caracterizado por se preparar uma molécula de DNA em que o gene estrutural tem uma cadeia codi-62- ficadora tendo a sequência de bases apresentada nas bases 234 a 476 apresentada a seguir ou um seu fragmento.

   GATGGCAAACATAGTACTATTATTTGATTTGTAATATGTACATAAAGAGCAGTGAGACTA AGCCAATAACATCAGAAAATAAAAACTCAGGTACATTGACATTTATTCACCTTACACTGC

   I _; AAAAACAAAAAACTCTCAAGTTTGAAAACAAGATGATGGTGCTAAAGGTGTGTGTGCTGG

   TACTTTTCCTTGTAGGGGTTACTACTGCAGCCATGGATTTGAACCACCTCGGAAGTAATC ATCATGATGACTCAAGCGATGAACCTTCTGAGTCTTCAGAACCATGCTGCGATTCATGCA TCTGCACTAAATCAATACCTCCTCAATGCCATTGTACAGATATCAGGTTGAATTCGTGTC ACTCGGCTTGCAAATCCTGCATGTGTACACGATCAATGCCAGGCAAGTGTCGTTGCCTTG ACATTGCTGATTTCTGTTACAAACCTTGCAAGTCCAGGGATGAAGATGATGAGTAAGAAA AAGGAAGATGAAGTCTCTCTCAGATGAATAAAGCCCTTGAGTTTTGTTTGTTGTGTAAGG GAAGACAGAATAAAAGTTGGAATAAAAGCTAGTGCTGTTCATC
3. 6^. - Método de acordo com a reivindicação 3 ou 4 caracterizado por se preparar uma molécula de DNA em que o gene estrutural tem uma cadeia codificadora tendo a sequência de bases como se mostra nas bases 79 a 332 apresentada a seguir ou um seu fragmento.

   GATGCACACCAAGCCCGAGCCTTCTGGGGACTTGTAGTGCTAGCTTGAAGGTGTCTGAGG ¹ TAGGTCAAGTCATCAAAAGTGGTGATCATCATGAAGCAACTGATGAGCCCTCTGAATCTT

   CAGAAGCATGCTGTGATCGTAGCGAATGCACAAAATCAATACCTCCTCAATGCCGCTGTT CAGACGTAAGGCTCAATTCGTGCCATTCAGCTTGCAAATCATGTGCCTGCACATTTTCCA TTCCTGCACAGTGTTTTTGTGGTGACATAAACGACTCCTGCTATAAACCTTGCAAGTCCT CCAGTCATGATGATGATGACTGGGATAAGTAAYGAACAAGTTTAATGTAAGCTCTCTCTA AATGGATGAAGCCCTTTCGGGCTTTGTTCGTTGTGTAATGAGATCAATAAACTTTGAATA AAAGCTCTTGTTTTCGTGCC
4. 7â. - Método de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 6 caracterizado por se preparar uma molécula de DNA em que o gene estrutural codifica uma proteína tendo uma sequência de aminoácidos apresentada a seguir

   a) (H₂N) -?SGDHHQDFTDEPSE??EACCDQCECTKSIPPÇ2CRCSDVRLNSCHSACKSCACTFSIPAQCF

   CGDINDFCYKPCKSDSHDD???-(COOH)

   b) (H₂N) - SGDHHEATDEPSESSEACCDRCECTKSIPPQCRCSDVRLNSCHSACKSCACTFSIPAQCFC

   GDINDSCYKPCKSSSHDDDDWDK - (COOH)

   c) (H₂N) - SNHHDDSSDEPSESSEPCCDSCICTKSIPPQCHCTDIRLNSCHSACKSCMCTRSMPGKCRC

   LDIADFCYKPCKSRDEDDE - (COOH) ou uma proteína equivalente a ela em actividade imunológica ou biológica, incluindo formas modificadas da proteína.
5. 8a. - Método de acordo com a reivindicação 5 caracterizado por se preparar uma molécula de DNA de acordo com a reivindicação 5 tendo sequência de bases adicional nos extremos 5' e 3' da cadeia codificadora como se mostra a seguir:

   GATGGCAAACATAGTACTATTATTTGATTTGTAATATGTACATAAAGAGCAGTGAGACTA AGCCAATAACATCAGAAAATAAAAACTCAGGTACATTGACATTTATTCACCTTACACTGC AAAAACAAAAAACTCTCAAGTTTGAAAACAAGATGATGGTGCTAAAGGTGTGTGTGCTGG TACTTTTCCTTGTAGGGGTTACTACTGCAGCCATGGATTTGAACCACCTCGGAAGTAATC ATCATGATGACTCAAGCGATGAACCTTCTGAGTCTTCAGAACCATGCTGCGATTCATGCA TCTGCACTAAATCAATACCTCCTCAATGCCATTGTACAGATATCAGGTTGAATTCGTGTC ACTCGGCTTGCAAATCCTGCATGTGTACACGATCAATGCCAGGCAAGTGTCGTTGCCTTG ACATTGCTGATTTCTGTTACAAACCTTGCAAGTCCAGGGATGAAGATGATGAGTAAGAAA AAGGAAGATGAAGTCTCTCTCAGATGAATAAAGCCCTTGAGTTTTGTTTGTTGTGTAAGG GAAGACAGAATAAAAGTTGGAATAAAAGCTAGTGCTGTTCATC
6. 9a. - Método de acordo com a reivindicação 6 caracterizado por se preparar uma molécula de DNA de acordo com a reivindicação 6 tendo sequências de bases adicionais nos extremos 5¹ e 3¹ da cadeia codificadora como se mostra a seguir:

   GATGCACACCAAGCCCGAGCCTTCTGGGGACTTGTAGTGCTAGCTTGAAGGTGTCTGAGG

   TAGGTCAAGTCATCAAAAGTGGTGATCATCATGAAGCAACTGATGAGCCCTCTGAATCTT

   CAGAAGCATGCTGTGATCGTAGCGAATGCACAAAATCAATACCTCCTCAATGCCGCTGTT

   CAGACGTAAGGCTCAATTCGTGCCATTCAGCTTGCAAATCATGTGCCTGCACATTTTCCA TTCCTGCACAGTGTTTTTGTGGTGACATAAACGACTCCTGCTATAAACCTTGCAAGTCCT CCAGTCATGATGATGATGACTGGGATAAGTAAYGAACAAGTTTAATGTAAGCTCTCTCTA AATGGATGAAGCCCTTTCGGGCTTTGTTCGTTGTGTAATGAGATCAATAAACTTTGAATA AAAGCTCTTGTTTTCGTGCC
7. 10â. - Método para a preparação de um plasmídeo de DNA recombinante caracterizado por se inserir uma molécula de DNA obtida de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9 num DNA vector.
8. 11a. _ Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por se preparar um plasmídeo de DNA recombinante em que o DNA vector deriva de um plasmídeo TI de Agrobacterium tumefaciens.
9. 12â. - Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por se preparar um plasmídeo de DNA recombinante em que o plasmídeo Ti tem um fragmento promotor e um fragmento terminador da transcrição incluídos entre as regiões delimitantes direita e esquerda do T-DNA e o fragmento CpTI está inserido entre os fragmentos promotor e terminador.
10. 13^. _ Método para produzir uma planta modificada, caracterizado por compreender a incorporação num genoma nuclear do DNA de uma planta obtido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9.

    -6514â. - Método para produzir plantas contendo o gene CpTI e sendo capazes de o expressar, caracterizado por compreender a transformação de tecidos ou células vegetais com um plasmídeo recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 12, a selecção dos tecidos ou células vegetais transformados e a reconstituição das plantas a partir de tais tecidos ou células transformados.