JP2949585B2 - 植物保護に有用なｄｎａ分子 - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、植物遺伝子工学による害虫からの植物の保
護に関する。更に詳しくは、本発明は昆虫耐性について
コードする特定遺伝子の植物中への導入によるワタ及び
穀類作物の保護に関するが、本発明は耕作地及び貯蔵所
の害虫が深刻な経済問題を発生させる他の作物にも適用
可能である。かかる作物としては、ワタ、トウモロコシ
（maize）、米、大豆、テンサイ、小麦、果実、野菜及
びブドウがある。特に本発明は、マメ科植物由来トリプ
シンインヒビター、特にササゲ（cowpea）トリプシンイ
ンヒビター（CpTI）の遺伝子に関する。 作物の昆虫害虫は、年間農業生産量を平均で５〜15％
減少させる。これらの損失金額は年間数＋億（米国）ド
ルと評価されており、しかも農薬並びに噴霧器及び散布
器に関して毎年経費がかかる。例えばワタ作物は昆虫等
のある種の害虫に対して非常に感受的である。米国だけ
でも、少なくとも125種の昆虫がワタに経済的損害を与
えている。ワタ用殺虫剤は殺虫剤総額13.35億ドル（198
5年度）のうち最大を占め、全経費の31％に相当する。
米国では、年間損失額は平均5.00億ドルに達し、しかも
耕作者は耕作地を良好に保つため殺虫剤及び面倒な散布
に関しほぼ同額の費用をかけている。害虫は種まきから
収穫に至るまでワタに害を及ぼす。一般に、早期の段階
で害を及ぼす害虫は収量に悪影響を与え、一方それ以後
の段階で害を及ぼす害虫は品質に悪影響を与える。 １つの主なワタ害虫群は、ヘリオチス（Heliothis）
属の蛾幼虫（bollworm）〔H.ビレセンス（H.virescen
s）、H.アルミラ（H.armigera）及びH.ゼア（H.zea）
等〕である。ヘリオチス属蛾幼虫はワタ以外にも様々な
科の植物に悪影響を与え、即ちそれらはトウモロコシ及
びモロコシ（Sorghum）のような多数の穀類、並びにタ
バコ、フェイセオルス（phaseolus）豆、大豆及びひま
わりのような他の作物に悪影響を与える。ワタに関する
他の深刻な害虫はワタキバガ幼虫（pink bollworm）
〔ペクチノホラ・ゴッシピエラ（Pectinophora gossypi
ella）〕であるが、これは世界中で最も重要な害虫であ
って、発展途上国においては70％以下の作物をだいなし
にしている。他の深刻な害虫は、メキシコワタミゾウム
シ（boll weevil）〔アントノマス・グランジス（Antho
nomus grandis）等のアントノマス種〕である。ヘリオ
チス、ペクチノホラ及びアントノマスの幼虫はワタ収量
を著しく低下させるが、その理由はそれらが未開花のワ
タ花（つぼみ）及びさやの中で摂食して、つぼみ及び小
さなさやを死滅させかつ抜け殻にするためである。さや
が大きくなるにつれて、リント（lint）は汚れて腐敗す
るようになる。ワタにおいて深刻な問題を与える昆虫属
は、スポドプテラ・リツラ（Spodoptera litura）〔コ
メネキリムシ（rice cutworm）又はフォール・アーミー
ワーム（fall armyworm）〕及びS.リットラリス（S.lit
toralis）〔ワタ葉食い虫（cotton leafworm）〕等のス
ポドプテラ属である。スポドプテラは、トウモロコシ、
米、モロコシ及びタバコの害虫でもある。 昆虫の害が収量を低下させている他の主な作物はトウ
モロコシである。トウモロコシ用の殺虫剤に関する全世
界の費用は1985年で4.70億ドルであった。米国だけで、
昆虫による損害は毎年9.00億ドル以上とみられている。
ハムシモドキ幼虫（corn rootworm）〔ジアブロチカ（D
iabrotica）種〕は深刻な害虫であって、米国における
収穫損失率は10〜30％と計算されていた。米国における
トウモロコシの他の害虫はアワノメイが（European cor
n borer）〔オストリニア・ヌビラリス（Ostrinia nubi
lalis）〕であって、穿孔虫の第一世代は葉及び茎を餌
にすることから、栄養物の穂を消失させてしまう。1970
−75年の米国におけるアワノメイガによる毎年の損害額
は、年間3.10億ドルと計算されている。トウモロコシに
おける他の重要な害虫としては、シトフィラス・オリザ
エ（Sitophilus oryzae）〔コクゾウ（rice weevi
l）〕、オオタバコガ幼虫（corn earworm）〔H.ゼア〕
（これは米国で毎年0.75〜1.40億ドルの損害を与え
る）、斑点茎穿孔虫（spotted stalk borer）〔チロ・
スプレッサリス（Chilo suppressalis）〕及びネキリム
シ〔アグロチス（Agrotis）種〕（ワタ、タバコ及び多
くの野菜にも害を与える）がある。 利用可能な様々な種類の化学的農薬があるにもかかわ
らず、昆虫害虫は深刻な問題を引き起こす。多くの農薬
は、ヒト及び野生動物に対して高毒性並びに比較的高い
植物毒性といった重大な欠点を有している。化学的農薬
に対する昆虫の耐性獲得も、次第に深刻化していく問題
となっている。 植物生産者は慣用的品種改良計画に従い昆虫耐性遺伝
子を変種虫に組込むことによって、昆虫の攻撃により発
生する損害を減少させる試みを行った。大多数の植物は
大半の昆虫に対して耐性を示すが、耐性は物理的でも化
学的であってもよい。例えば、多数の植物の葉毛は、小
さな昆虫が葉をかめるほど葉に十分近づくことを阻止し
うる。他の場合において、植物はそれらの組織を誘引性
のないものに又は毒性に換えるために様々な複合的二次
化学物質を利用している。これらのタイプの耐性は多数
の遺伝子のコントロール下にあるため、植物生産者が利
用することはむずかしい。多くの場合に耐性変種は収量
の低下を示すことから、経済的に実行不可能であった。
即ち、おそらく昆虫耐性の特異的特性が他の有害な特性
と関連しており、これら２つの特性を簡単には切離すこ
とができなかったからであろう。 植物生命工学における近年の発達は、特異的特性につ
いてコードする遺伝子を現存生殖質に加えることによっ
て、植物改良範囲を拡張しうる可能性を高めている。研
究は、除草剤耐性、病気耐性、品質面及び昆虫への耐性
に関する遺伝子の単離及び移入について行なわれてい
る。 遺伝子工学による昆虫耐性植物は化学的農薬使用の場
合にはないいくつかの利点を有することが明らかにされ
た（参考のため、アグロウ、1986年（29）の報告参
照）。これらの利点としては下記のものがある： ａ）季節的長期保護性 ｂ）昆虫は最も感受性の高い段階で通常処理される ｃ）天候に依存しない保護性 ｄ）植物組織の処理が困難な場合の保護性 ｅ）作物摂取昆虫のみが接触する ｆ）植物組織中に封入された物質 ｇ）活性因子は生物分解性かつ無毒性である しかしながら、いくつかの制限要因も存在する： 1.移入し易い植物種 これはキー要因であるが、主な食用作物を形質転換さ
せる技術は間もなく実用化されるであろう。ワタ形質転
換に関する最近の報告〔ウンベック・ピー、ジョンスト
ン・ジー，バートン・ケー，スウェイン・ダブル,1987
年、遺伝的形質転換ワタ（ゴシピウム・ヒルスツムL.）
植物，バイオ／テクノロジー，第５巻，第263ー266頁
（Umbeck,P.,Johnston,G,Barton,K.,Swain,W.,1987,Gen
etically transformed cotton（Gossypium hirsutum
L.）plant,Bio/Technology 5,263−266）〕及びトウモ
ロコシ形質転換の要求は、形質転換研究への多額の投資
が適切なプロトコールの開発を間もなく導くことを暗示
している。 2.害虫に対する活性スペクトル 一般に、殺虫剤は昆虫害虫に対して広域活性スペクト
ルを有する。遺伝子工学によって作物中に組込まれた生
物額的農薬は、それらの使用を価値のあるものにさせる
ために十分広い活性スペクトルを有していなければなら
ぬであろう。 昆虫耐性植物を生産させるバチルス・ツリンギエンシ
ス（Bacillus thuringiensis,Bt）結晶タンパク質遺伝
子に関する特許出願がなされた（欧州特許出願第843064
94.0号及び第86300291.1号明細書）。しかしながら、欧
州特許出願第84306494.0号の場合において、その明細書
は、植物発現性完全鎖長殺虫性タンパク質遺伝子を有す
る形質転換タバコカルス組織上で飼育されたタバコスズ
メガ幼虫（tobacco hornworm）〔マンズカ・セクスタ
（Manduca sexta）〕はB.スリンギエンシス結晶タンパ
ク質毒性に帰因する症状を示すことが観察されたことの
みを開示しているにすぎない。その遺伝子を有する植物
の殺虫効果に関する情報は示されていなかった。出願第
86300291.1号明細書は形質転換原性（transgenic）タバ
コ植物中のBt遺伝子の効果に関する情報を示している
が、データは１種の昆虫タバコスズメガ幼虫のみに限ら
れている。 昆虫耐性を高めるため植物中にBtを移入した場合に生
じうる１つの欠点は、異なる細菌株は異なる特異性を持
つ毒素を生産することである。このことは、昆虫害虫の
十分に広域なスペクトルに対して耐性のある作物を生産
するためには数種のBt遺伝子を組合せることが必要であ
ることを意味しているのであろう。 3.否定的副作用 昆虫耐性遺伝子を有する形質転換原性植物はいかなる
認知しうる程度の収量低下も起こさないことが重要であ
る。 害虫が継続的に“内在性（in−build）殺虫剤”と接
触するように昆虫耐性遺伝子を作物植物に組込みうる環
境効果に関して関心が集まっていた。これは害虫に対し
て非常に高い選択圧力を加えかつ耐性獲得を促進させて
いるからであろうと説明された。しかしながら、この説
明に反対する説は、トリプシンインイビターが主消化酵
素の活性部位に直接作用しているとするものである。標
的部位の生存可能な変異による昆虫における耐性獲得確
立は低いであろう。耐性は、インヒビターが損害を与え
る前に解毒されるような昆虫代謝系での複雑な多くの変
化をうけることによってのみ、おそらく獲得されるので
あろう。 病原体又は捕食昆虫の消化酵素又は他の酵素を阻害す
ることによりこれらに対する耐性を付与しうる様々なタ
ンパク質を植物が含んでいることを示唆する重要な推論
が文献に記載されている〔ライアン・シ・エー・（Rya
n,C.A.）,1983年、天然植物保護応答性を調節する昆虫
由来化学的シグナル，デンノ・アール・エフ＆マクルア
ー・エム・エス（Denno R.F.＆ McClaure M.S.）（編
集）、自然及び管理系における様々な植物及び草食動
物、第43−60頁、アカデミックプレス（Academic Pres
s）〕。 ある特定の植物成長段階、即ち成熟種子の段階にのみ
存在する天然トリプシンインヒビターは、人工飼料中に
配合された場合に、他の植物の様々な害虫に対して強い
毒性を示すことが、以前に発表された。驚くべきこと
に、トリプシンインヒビターに関する遺伝子が植物成長
の全段階にわたって発現するような方法で別の植物中に
移入された場合、形質転換原性植物の昆虫耐性が著しく
高まるのである。したがって、他の点では作物学上望ま
しい遺伝子型の作物植物中に、広域スペクトル昆虫害虫
に対する耐性についてコードする特定遺伝子を移入させ
ることが、可能とならねばならない。 最近の事実によれば、プロテアーゼインヒビターは植
物栄養価及び昆虫消機能間の複雑な相互関係の一部に関
与していることを示している〔ブロードウェイ・アール
・エム（Brodway,R.M），ダッフィ・エス・エス（Duffe
y,S.S.），ピアス・ジ（Pearce,G.）、ライアン・シー
・エー（Ryan,C.A.）,1986年，植物プロティナーゼイン
ヒビター；草食性昆虫からの防御?Ent.Exp.Appl.第41
巻、第33−38頁〕。しかしながら、現在までのところ、
プロテアーゼインヒビターが植物中で発現した場合に実
際に昆虫耐性を高めるという決定的な証拠はなかった。 本発明は、マメ科植物トリプシンインヒビターポリペ
プチドの構成部分についてコードする組換えDNA分子に
関する。更に詳しくは、本発明は、ビグナ・ウングイク
ラタ（Vigna unguiculata）〔ササゲ（cowpea）；その
名称以外にも黒目エンドウ（black−eyed pea）、黒目
豆（black−eyed bean）、カフィル豆（Kaffir bea
n）、ヒンズーササゲ（Hindu cowpea）及びヤード−ロ
ング豆（Yard−long bean）として知られる〕由来トリ
プシンインヒビター遺伝子についてのコード配列を有す
る組換えDNAプラスミド、その製法、及び様々な昆虫害
虫種に対する耐性を高める目的でササゲトリプシンイン
ヒビター（CpTI）発現性を他の植物種に移入するという
その用法に関する。 以前の実験では、V.ウングイクラタ種子に存在するCp
TI量がブルチド甲虫（bruchid beetle）の攻撃に対する
V.ウングイクラタの耐性と関連していることを立証して
いた〔ゲートハウス・エー・エム・アール（Gatehouse,
A.M.R.），ゲートハウス・ジェイ・エー（Gatehouse,J.
A.），ドビー・ピー（Dobie,P.），キルミンスター・エ
ー・エム（Kilminster,A.M.），ボルター・デー（Boult
er,D.）,1979年，ビグナ・ウングイクラタにおける昆虫
耐性の生化学的基礎，ジャーナル・オブ・サイエンス・
オブ・フード・アンド・アグリカルチャー（Journal of
Science of Foodand Agriculture），第30巻，第948−
958頁；ゲートハウス・エー・エム・アール，ボルター
・デー,1983年，ブルチド甲虫カロソブルチュス・マカ
ラタス（Callosobruchus macalatus）の成長に対するサ
サゲ（ビグナ・ウングイクラタ）及び他のマメ科植物由
来トリプシンインヒビターの代謝拮抗作用の評価，ジャ
ーナル・オブ・サイエンス・オブ・フード・アンド・ア
グリカルチャー，第34巻，第345−350頁〕。V.ウングイ
クラタ由来の１種以上のトチプシンインヒビターの殺虫
有効量を昆虫に接触せしめる方法によって侵襲昆虫害虫
から植物を保護するという、V.ウングイクラタ中に天然
に存在するトリプシンインヒビターの用法は、米国特許
第4.640.836号明細書（1987年２月３日付許諾）に記載
されている。その特許明細書は、精製CpTIが以下の鱗翅
類害虫：即ち、ヘリオチス・ビレセンス（Heliothis vi
rescens）〔オオタバコガ幼虫〕；チロ・パルテルス（C
hilo partellus）〔斑点茎穿孔虫〕；ヘリオチス・アル
ミゲラ（Heliothis armigera）〔アメリカ蛾幼虫（Amer
ican bollworm）；及び鞘翅類害虫トリボリム・コンフ
サム（Tribolium confusum）〔フラワー甲虫（flour be
etle）〕に対して活性であると報告している。人工飼料
実験において昆虫害虫に対するCpTIの効果に関して公表
された情報は第１表で要約されている。本発明は、遺伝
子工学生物中においてCpTIの生産のために必要な遺伝情
報についてコードするDNA分子を提供する。 CpTI遺伝子を有するいずれの遺伝子工学作物植物も、
ヒト及び環境に対して安全でなければならない。CpTI遺
伝子は安全であることを示すいくつかの理由がある。 サザゲは世界の数か所における主食用作物である〔シ
ング・エス・アール，ラチー・ケー・オー,1985年，カ
ウピー・リサーチ，生産及び利用，ウィリー（Singh,S.
R.,Rachie,K.O.,1985,Cowpea research,production and
utilization,Wiley）〕。通常料理されるが、それは生
のままで食べることもできる。 更に、ヒト消化管（及び他の哺乳動物の消化管）にお
いて、タンパク質は数種の異なるタイプの酵素によって
分解される。CpTIペプシンによる不活性化に対して非常
に感受的であり（エー・ゲートハウス、未公表の結
果）、ラット給餌実験の予備データではCpTI含有食で飼
育されたラットが体重増加量を低下させないことを示し
た（デー・ボルター，未公表の結果）。 本発明の主目的は、標的植物種への移入を可能にし、
組換え植物の選択を容易化しかつそれら植物に移入され
た遺伝子の発現を可能にする、ベクター中にCpTI遺伝子
の完全コード配列を有する組換えプラスミド構造体を提
供することであって、かかる植物は組織内のCpTIポリペ
ブチドの存在によって昆虫害虫に対し高い耐性を有する
ように転換される。 本発明は、トリプシンインヒビター、好ましくはマメ
科植物、特にV.ウングイクラタ由来のトリプシンインヒ
ビター（ササゲトリプシンインヒビター又はCpTI）、又
はCpTIの性質に似た性質を有しかつ一般的化学基準によ
るとCpTI群の一つとして通常許容される十分程度の相同
性を有するタンパク質についてコードする構造遺伝子を
含んでなるDNA分子を提供する。 V.ウングイクラタのボーマン−バーグ（Bowman−Bir
k）型トリプシンインヒビターは、イオン交換クロマト
グラフィーにより分離可能な４種の異性体インヒビター
としてササゲ子葉中で発現せしめられる遺伝子の中位反
復群によってコードされている。４種すべての異性体イ
ンヒビターは、インビトロ酵素不活性化アッセイで調べ
た場合に、同様のトリプシン阻害活性を有している： ササゲの主な異性体インヒビターはf IVである。これ
らの遺伝子は、0.45M NaCl,0.045Mクエン酸ナトリウム
（３×SCC）中68℃においてCpTI完全鎖長cDNAプローブ
と交差ハイブリッド形式しうるに十分な相同性を有して
いる。〔タンパク質配列決定により明らかにされ（サモ
ア・アール・エッチ・エー（Sammour,R.H.A.）,1985
年，博士論文，ダーハム（Durham）大学，英国）、又は
CpTIcDNA配列決定により予測された〕f IV異性体インヒ
ビター一時配列の例は、第１図に示されている。V.ウン
グイラクタ類トリプシンインヒビターポリペプチドの他
の例は、プロテアーゼ阻害活性が失われていないこれら
配列の変異体である。 第１図は下記配列を示している： ａ） CpTI f IV異性体インヒビター（保護アミノ末
端、内部残基15、16番目及びカルボキシ末端は決定でき
なかった） ｂ） CpTI cDNA d4/6予想配列 ｃ） CpTI cDNA c3/2予想配列 配列はデイオフ（Dayof）〔タンパク質配列及び構造
の図解，第５巻,1972年，ナショナル・バイオメディカ
ル・リサーチ・ファンデーション（Nat.Biomed.Res.Fou
ndation），ワシントンD.C.,USA〕の単一文字コードで
示されている。 ササゲのトリプシンインヒビター遺伝子は、成熟過程
の終期に子葉中で発現せしめられる。したがって、ササ
ゲトリプトン阻害タンパク質は、成熟種子から単離され
ねばならない。これらのタンパク質における異常に高い
交差反応性はそれらを抗原性の乏しいものにしているた
め、後退の使用に依存した対応遺伝子の同定及び単離方
法は利用しえない。V.ウングイクラタ由来の主トリプシ
ン阻害剤のアミノ酸配列は、そのメッセンジャーRNAの
ヌクレオチド配列を予測するために利用された。このポ
リペプチドの４つの領域は、各残基がメッセンジャーRN
Aで２種以下の選択的コドンによりコードされうる、４
種以上の連続残基の連鎖からなる。このような領域は、
第２図に示されているように、すべてのコード可能性を
網羅しかつ問題の遺伝子に対して適度に特異的であるた
めに十分な鎖長をもつ混合配列オリゴヌクレオチドプロ
ーブの特定化にとって適切であることが判明した。 このようにして、V.ウングイクラタの“終期”子葉か
ら精製されたポリアデニル化RNAが単離された。 最初に、mRNAは慣用的逆転写反応によって相補的DNA
に複製される。二次鎖合成は、DNAポリメラーゼＩのク
レノウ断片を用いて、自己プライミングされる（self−
Primed）cDNA上で行なわれた。二重鎖cDNA中の末端ルー
プはS1ヌクレアーゼとの処理で除かれ、その分子末端は
クレノウ断片との“ポリッシング（polishing）”反応
により修復された。 配列５′−ｄ（GGGATCCC）の合成オクタヌクレオチド
BamH Iリンカーはポリッシングされたds（二重鎖）cDNA
と結合せしめられ、Bst I〔BamH Iのイソ制限酵素（iso
schizomer）〕で広範囲に消化された。結合したds cDNA
は、Bst Iで予め直鎖化されかつ（ベクター末端の自己
結合性を低下させるために）子牛腸ホスファターゼとの
処理により部分的に脱リン酸化されたプラスミドpBR322
に、T4 DNAリガーゼを用いて結合せしめられた。 この結合反応の生成物は、コンピテント大腸菌（Esch
erichia coli）株910をアンピシリン耐性（この特性は
プラスミドベクターによる）に形質転換させるために用
いられた。組換え体はテトラサイクリンに対する感受性
によって同定された（pBR322のテトラサイクリン耐性遺
伝子はBamH I部位へのDNA挿入により不活性化され
た）。 組換え体は、グランシュタイン及びホグネス〔グラン
シュタイン・エム及びホグネス・デー・エス,1975年，
プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オ
ブ・サイエンスUSA,第72巻，第3961頁（Grunstein,M＆H
ogness,D.S.,1975,Proceeding of National Academy of
Science USA 72,3961）〕の操作法に従い、第２図の領
域Ｃの配列に対して相補的な16種の14量体に相当する混
合された32P標識合成ヌクレオチド （２列目の塩基は上記ヌクレオチドにおいて代替塩基を
表わす）との現場での（in situ）コロニーハイブリッ
ド形成により、CpTI配列に関してスクリーリングされ
た。このプローブは約14％のみのクローンを標識したこ
とから、クローンの一部はトリプシンインヒビターメッ
セージから得られたものでないことが明確に示された。
しかしながら、プラスミドpAGC1含有の14量体陽性クロ
ーンは、ウィルスベクターM13mp9への導入後におけるBa
mH I部位中の挿入物のヌクレオチド配列決定及び確立さ
れたM13ジデオキシ鎖終結法を用いる配列決定により、
部分的CpTIメッセージを有していることが明らかに確認
された。この挿入物における唯一の長鎖オープン読取枠
から予測されるアミノ酸配列は、主CpTI一次配列及び他
のマメ化植物ボーマン−バーク型トリプシンインヒビタ
ーに関して公表された一次配列〔シモカワ・ワイ（Shim
okawa,Y.），アベ・オー（Abe,O.）及びクロミズ・ケー
（Kuromizu,K.）,1984年，マメ科植物二重ヘッド化（do
uble−headed）プロティナーゼインヒビター，ネーチャ
ー＆カルチャー（Nature ＆ Culture），第11巻，第39
−45頁〕と顕著な相同性を示している。その配列は、大
豆SB1遺伝子コード配列に関する公表配列の対応領域と6
5％の相同性を示した〔ハモンド・アール・ダブル（Ham
mond,R.W.）フォード・デー・イー（Foard,D.E.）及び
ラーキンス・ビー・エー（Larkins,B.A.）,1984年，大
豆のボーマン−バークプロテアーゼインヒビターについ
てコードする遺伝子の分子クローニング及び分析、ジャ
ーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Journa
l of Biological Chemistry），第259巻、第9883−90
頁〕。 プラスミドpAGC1は、第３図に示された配列からなる
コード配列183bpを含むCpTImRNAから得られる配列を有
している。この配列はCpTIのＣ末端側の半分についてコ
ードする。本発明でCpTIの完全コード配列を必要とする
ため、高効率cDNAクローニングプロトコールを用い、し
かも以下で概説されかつ第４図に示されたオリゴヌクレ
オチド及びpAGC1双方をプローブとして用いて、新しい
ライブラリーが作成された。 ササゲ子葉mRNAは、ヒト胎盤RNアーゼインヒビターの
存在下流転写酵素によってcDNAに複製された。二次鎖合
成は、RNアーゼＨの存在下無ヌクレアーゼDNAポリメラ
ーゼＩにより行なわれた。二重鎖cDNAの末端は、T4 DNA
ポリメラーゼ消化によりフラッシュ末端化された。反応
生成物は、制限エンドヌクレアーゼHinc IIで直鎖化さ
れかつ子牛腸ホスファターゼで脱リン酸化されたプラス
ミドpUC19にブラント末端結合された。この結合混合物
は、コンピテント大腸菌株JM83をアンピシリン耐性に形
質転換させるために用いられた。組換え体はYT−Amp−B
CIG寒天プレート上において白色コロニーとして検出さ
れ、選択されて、YT−Amp寒天上の複製ニトロセルロー
スフィルターにて増殖せしめられた。 pUSSRc3/2と命名されたこれら組換え体の一つは、以
下の事項によって、CpTIメッセージ配列の（ほぼ）完全
鎖長複製として確認された： ｉ） pAGC1のBamH I挿入物との現場コロニーハイブリ
ッド形成における強い交差ハイブリッド形成性 ii） 合成混合14量体に対する挿入断片の弱いけれども
陽性の交差ハイブリッド形成性 iii） pUSSRc3/2における挿入物の大きさは、pAGC1 Ba
mH I挿入物でプローブ処理されたササゲ子葉全RNAのノ
ザンブロット法により測定したところ、CpTI mRNAの大
きさ550±50ヌクレオチドと比較し、582bpと測定され
た。 iv） 挿入断片の配列は、確立された化学的配列決定法
〔マキサム・エー・エム（Maxam,A.M.）及びギルバート
・ダブル（Gilbert,W.）,1980年，相特異性化学的切断
による末端標識DNAの配列決定，メソッズ・イン・エン
ザイモロジー（Methods in Enzymology），第65巻，第4
99−560頁〕により決定された。その配列はpAGCの挿入
部に対してその鎖長全体にわたり完全に相同的であっ
た。その唯一の長鎖オープン読取枠から予測されるアミ
ノ酸配列は、成熟タンパク質に対応する領域全体にわた
り、マメ科トリプシン阻害剤に対して高度の相同性を示
した。その配列は、同相ATG−（メチオニン）−翻訳開
始コドンの５′側に数個の塩基対を延長させている。 プラスミドpUSSRc3/2は、第６図に示された配列を含
んでなる、プレカーサー（precursor）、成熟タンパク
質及び３′非翻訳領域の完全コード配列を含む、（ほと
んど）すべてのCpTI mRNAから誘導される配列を有して
いる。 プラスミドpUSSRd4/6は、異なる異性体インヒビター
の成熟タンパク質の完全コード配列を有しているが、天
然翻訳開始ATGコドンを欠く結果未知量のリーダーペプ
チド配列を欠いている。これは第７図に示された配列を
含んでなる。 CpTI配列は、大腸菌クローニングベクターpUC19か
ら、以下及び第５図で概説される植物質転換ベクターた
るアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacter
ium tumefaciens）Tiプラスミドに移された。 プラスミドpUSSRc3/2は制限エンドヌクレアーゼSca
I、Alu I及びXmn Iで消化され、ブラント末端化された5
50bpの長鎖断片が消化生成物のポリアクリルアミドゲル
電気泳動分離によって単離された。この断片は、完全Cp
TIコード配列、ATG翻訳開始コドンの５′側に集結20bp
及びTAA翻訳終結コドンの３′側に92bpを有していた。
この断片は、プラスミドpRok2のSma I部位とブラント末
端結合された。 プラスミドpRok2は、クローンcDNA配列が植物中に移
入されかつ構造的に発現されることを可能にする目的で
特にエム・ベバン（M.Bevan）博士及びテー・カバナフ
（T.Kavanagh）博士により発案されかつ組立てられたア
グロバクテリウム・ツメファシエンスTiプラスミド二成
分系ベクターである。（なお、「構造的に発現」とは、
遺伝子が植物のあらゆる部分において発現し、この発現
が植物の発育を通して行われることを意味する。）これ
は、翻訳終結シグナル及びmRNAポリアデニル化シグナル
を含むアグロバクテリウムＴ−DNAノパリンシンターゼ
遺伝子の250bp断片及びカリフラワーモザイクウィルス
（CaMV）35S RNAプロモータを有するCaMVゲノムの800bp
断片からなる発現カセットの左右Ｔ−DNAボーダー領域
間への挿入によって、Bin19〔ベバン・エム・ダブル,19
84年，植物形質転換用の二成分系アグロバクテリウムベ
クター、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic
Acids Research），第12巻、第8711−21頁〕から誘導さ
れた。これらの成分は二成分系Ti発現ベクターpRok1
〔バールカンベ・デー・シー（Baulcombe,D.C.）サンダ
ース・エス・アール（Saunders,S.R.），ベバン・エム
・ブイ，マヨ−エム・エー（Mayo,M.A.）及びハリソン
・ビー・デー（Harrison,B.D.）,1986年，形質転換植物
の核ゲノム由来成分学的活性ウィルスサテライトRNAの
発現，ネーチャー（Nature），第321巻，第446−９頁〕
に組込まれたが、pRok2はそれと比較してプロモーター
及びターミネーター断片間にポリリンカークローニング
部位を有している点で主に異なっている。このポリリン
カーはSma I部位を有しており、CpTIcDNA断片はその部
位に挿入された。これらの配列は、形質転換植物細胞中
において、挿入物の10bp上流に構成性翻訳開始部位及び
挿入物の200ヌクレオチド下流に転写ポリアデニル化部
位を与える。 pRok−CpTI構造体はコンピテント大腸菌株MC1022に組
込まれてクローニングされ、形質転換体はそれらのカナ
マイシン耐性によって選択された。構成体の同一は、各
クローンからのプラスミドDNA小試料（mini−prep）の
制限分析によって確認された。クローンpRok−CpTI＋５
は、CpTIポリペプチド発現のために下記のように正しい
向きでCpTI挿入物を有していた： CaMV−PROM−５′−CpTI−３′−NOS−TERM クローンpRok−CpTI−２は下記のように逆方向でCpTI
挿入物を有しており、コントロールとして機能した： CaMV−PROM−３′CpTI−５′−NOS−TERM Ｔ−DNA（Ｌ）/NOS−NEO/CAMV−PROM:CpTI:NOS−TERM
/T−DNA（Ｒ）構造体は、TiプラスミドpAL4404を有する
アグロバクテリウム・ツメファシエンスLBA4404、pRok
−CpTI＋５もしくはpRok−CpTI−２を有する大腸菌HB10
1及び移動性プラスミドpRk2013を有する大腸菌HB101間
の三種親細胞融合体中のアグロバクテリウム・ツメファ
シエンスTiプラスミドに導入された。 トランス接合個体は、最小寒天プレート中カナマイシ
ン，ストレプトマイシン及びリフアマイシン存在化30℃
で増殖しうる能力によって選択された。非耐性細菌の不
存在を確実化するため、耐性コロニーは２回以上選択プ
レート上で線状接種された。 Tiプラスミド含有CpTI＋５及びCpTI−２を有するアグ
ロバクテリアは、下記及び第５図で説明されるようなニ
コチアナ・タバクム（Nicotiana tabacum）〔cv.サムス
ン（Samsun）NN〕及びN.プルムバギニホリア（N.plumba
ginifolia）の葉片を形質転換させるために用いられ
た。形質転換体は、構造体中のNOS−NEO遺伝子から付与
されたカナマイシン耐性によって選択された。形質転換
植物は、根誘導性カナマイシン含有寒天培地に移すこと
により、小苗状（shootlet）から再生された。根付いた
植物は、シェラー（Sherer）栽培室内のパーライト／培
養土ポット中で成長せしめられた。 植物の昆虫耐性は、ヘリオチス・ビレセンスの幼虫を
各植物に寄生させて、植物に生じる損傷の程度並びに経
時的な昆虫の成長性及び生存性を調べることにより試験
した。H.ビレセンスは、米国においてワタ及びタバコ双
方の産業上重要な害虫であることから使用された。生後
24時間以内の体長１〜2mmの幼虫が用いられた。 CpTI＋５構造体で形質転換された植物に関して調べら
れた昆虫からの攻撃に対する耐性レベルは、コントロー
ル植物の場合とほどんど同様である（第２表）。しかし
ながら、個々の植物に関しては、５例のCpTI＋５形質転
換体（特に、N.タバクム＋5/5、＋5/21、＋5/D4;N.プル
ムバギニホリア＋5/T104及び＋5/T109）のうち約１つ
が、H.ビレセンス幼虫による損傷に対する耐性に関して
明確かつ一貫した増加傾向を示し、しかも植物において
昆虫の生存性及び成長性を低下させた（第４表）。 これらの耐性植物は、免疫結合ELISAアッセイにおい
てCpTI様タンパク質を発現していることが証明された。
抗CpTI抗血清はウサギから産生され、二次抗体たる市販
β−ガラクトシダーゼもしくは西洋ワサビペルオキシダ
ーゼ結合ヤギ抗ウサギIgG及び抗体結合量測定用に適し
た発色性気質を用いたCpTI＋５及びCpTI−２植物由来凍
結乾燥葉物質のpH9.5の50mMトリス/HClに抽出物に対す
る確立したELISA及びドット免疫結合法において使用さ
れた。すべての耐性植物からの抽出物がその中に検出可
能レベルのCpTI抗原を含有していたが、一方コントロー
ル（CpTI−２）植物からの抽出物は含有していない。ト
リプシン阻害性は、トリプシン活性阻害アッセイによっ
て、耐性植物からの葉抽出物硫酸アンモニウム分画中で
直接証明された。観察されたCpTI活性レベルは、人工飼
料中に配合された場合代謝拮抗性であることが証明され
たレベルと匹敵する。 １ ６例（N.タバクム）及び２例（N.プルムバギホリ
ア）の植物に対する全損傷を１（最少の損傷）〜５（広
範囲の損傷）の尺度で個々に評価した場合の平均値 ２ 頂部から３番目の成熟葉における測定 ３ 出生したばかりの８匹の幼虫が植物を侵襲したとき
から７日目 ４ 精製CpTI f IV（標準）ng当量数/100μｌ葉抽出物
として表示。ELISA法は主に抗血清の低い交差反応性の
故に存在するトリプシン阻害剤（TI）の絶対量を過小評
価していることに注意せよ。 前記ベクターで形質転換された植物の大部分は、それ
らのゲノム中に安定的に挿入されたCpTI遺伝子及びNPTI
Iマーカー遺伝子双方を有するDNA断片を含有するように
なるであろう。このことは、カナマイシン耐性に関する
分離分析及びサザンサンブロット実験の結果から確認さ
れた。 形質転換によって獲得された新しい表現型特性は、古
典的なメンデル遺伝学に従い当然遺伝される。最初の形
質転換体は挿入が起きた各遺伝子座において半接合状態
であると予想され、特性はメンデルの優性形質として発
現することが期待される。新しい特性の安定的発現を確
認するために、形質転換植物のS1（自家受粉により発生
した植物の第一世代）継代物がカナマイシン耐性及びCp
TI発現に関して分析された。 上記方法に対するもう１つの方法はCpTIコード配列を
得るために、下記変更選択肢の一部又は全部を組入れて
用いることができた。 ｉ） CpTIポリペプチドの他の領域についてコードする
合成オリゴヌクレオチドが、前記混合14量体（領域Ｃ）
に加えて又はその代わりに用いることができた。 ii） 部分的又は完全鎖長cDNAクローン（又は合成オリ
ゴヌクレオチド）は、V.ウングイクラタゲノムDNAから
製造された組換えゲノムDNAライブラリーからのCpTI遺
伝子群のうちいずれかを含むゲノム配列の複製を得るた
めのプローブとして使用することができた。 iii） CpTI一次配列は、CpTI群のいずれかについてコ
ードする化学的合成ヌクレオチド配列を特定化させるた
めに使用することができた。 以下では、本発明について説明している。 （１）ポリアデニル化RNAの単離 種子を成熟に近づいている市販の様々なササゲ〔カリ
フォルニア人黒目（Californian black−eye）〕から採
取した。種皮及び胚を子葉から無菌的に取除き、後者を
液体窒素中で凍結した。 凍結子葉10gをDDT 0.2g含有試験管中で−20℃まで加
温し、そこに100℃でpH9.0の30mM EDTA、１％SDS含有0.
2Mホウ酸ナトリウム26mlを加えた。混合物をMk5ポリト
ロン（Polytron）中で30秒間混合し、次いで37℃で１時
間プロティナーゼK0.5mg/mlと共にインキュベートし
た。2M KCl 2mlを０℃で加え、混合物を遠心含離した。
上澄を2M LiClとし、不溶性物質を４℃で一夜沈殿させ
た。 沈殿物を遠心含離によりペレット化し、０℃において
LiCl 25mlで２回洗浄し、0.2M酢酸カリウムに再懸濁
し、エタノールに沈殿させた。 沈殿物をpH7.4の10mMトリスHCl、1mM EDTA 8mlに再懸
濁し、同量のフェノール／クロロホルム／イソアミルア
ルコール（25:25:1）で２回タンパク質除去した。最終
水相をエタノール沈殿させ、RNAをアビブ及びレーダー
〔アビブ・エッチ（Aviv,H.）及びレーダー・ピー（Led
er,P.）,1972年，オリゴチミジル酸セルロースでのクロ
マトグラフィーによる生物学的活性グロビンmRNAの精
製、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー
・オブ・サイエンスUSA,第69巻，第1408−12頁〕により
記載されているオリゴ（dT）−セルロースカラムクロマ
トグラフィーによるポリアデニル化RNAの単離前に0.2M
酢酸カリウムから更に１回沈殿させた。 （２）クローニング用cDNAの製造 ２つの択一的なcDNA合成法が用いたれた。第一の方法
ではpAGC1中でクローニングされかつしかる後CpTI遺伝
子配列用のプローブとして使用される部分的cDNA配列を
製造したが、一方第二の高効率法ではほぼ完全鎖長のcD
NAを製造した。両方法とも配列についてコードするCpTI
を製造しうるため、いずれも記載されている。前者の方
法が最初に詳述されている。 （３）cDNAIの合成 子葉ポリＡ＋RNA 5μｇの逆転写は、トレーサーとし
ての50μCi3H−dCTP〔50μCi/mM;ラジオケミカル・セン
トレ（Radiochemical Centre），アメルシャム（Amersh
am），英国〕、各1mMのdATP、dCTP、dGTP及びdTTP、5mM
DTT、1mg/mlオリゴ（dT）、50単位ヒト胎盤リボヌクレ
アーゼインヒビター、pH8.0の50mMトリスHCl、10mM MgC
l2並びに100単位/mlAMV逆転写酵素を含有した反応混合
中42℃で２時間インキュベートすることにより行なわれ
た。反応を終了させ、100℃で３分間加熱しかつ０℃で
冷却することにより鎖を分離した。変性タンパク質を遠
心分離により除去した。 （４）二次鎖合成 逆転写反応上澄45μｌをpH6.9の100mM HEPES、20mM M
gCl2、70mM KCl、5mM DTT、各1mMのdATP、DCTP、dGTP及
びdTTP並びに25単位DNAポリメラーゼＩ大（クレノウ）
断片の50μｌと共に15度で４時間インキュベートした。
反応混合物をフェノール及びクロロホルムで抽出し、高
分子両反応生成物をpH7.4の10mMトリスHCk、50mM NaC
l、1mM EDTA含有の10ml層容量セファデックス（商標
名）Ｇ−50−Ｓカラム上でのカラムクロマトグラフィー
により分離した。 （５）クローニング用二重鎖DNA末端の処理 上記カラムからの溶出分画を0.3M NaCl、30mM NaAc p
H4.5、3mM ZnCl2含有の1ml容器に調製し、S1ヌクレアー
ゼ250単位と共に37℃で30分間インキュベートして、末
端ループを除去した。EDTA5mMまで加え、混合物をフェ
ノール及びクロロホルムで２回抽出し、アルコール沈殿
させ、50mMトリスHCl pH7.8、10mM MgCl2、10mM 2−メ
ルカプトエタノール、各0.25mM dATP、dCTP、dGTP及びd
TTPの20μｌに再懸濁し、DNAポリメラーゼ大断片５単位
で15℃で30分間インキュベートして、末端を修復した。 配列５′−ｄ（GGGATCCC）の合成BamH Iリンカー〔BC
L〕を１μｇリンカー、50mMトリスHCl、pH7.8、10mM Mg
Cl2、10mM 2−メルカプトエタノール、1mM ATP及び11単
位ポリヌクレオチドキナーゼ含有の10μｌ容量中で加リ
ン酸反応させた。これを25℃で４時間インキュベートし
た。 “ポリッシングされた”二重鎖cDNA及びキナーゼ処理
されたリンカーを混合し、容量をキナーゼ反応緩衝液で
50μｌに調整し、T4DNAリガーゼ５単位と共に15℃で一
夜インキュベートした。 リンカー結合反応を80℃で５分間のインキュベートに
よって終結させた。反応容量を100mMトリスHCl pH7.4、
8mM MgCl2含有の200μｌに調整し、制限エンドヌクレア
ーゼBst I 10単位と共に37℃で８時間インキュベートし
た。 反応混合物は、セファデックスＧ−50−Ｓの10ml層容
量カラムに供し10mMトリスHClpH7.4、50mM NaCl、1mM E
DTAで溶出させる前に同量のフェノールで２回及び同量
のクロロホルムで２回抽出することによってタンパク質
を除去した。このカラムからの溶出分画をベクタープラ
スミドへの結合用に直接使用した。 （６）ベクターとしてpBR322を用い、大腸菌910に組込
むクローニング 超らせんプラスミドpBR322〔ギブコ（GIBCO）−BRL,
アクスブリッジ（Uxbridge），英国〕を制限エンドヌク
レアーゼBst Iとの処理で直鎖化し、確立されたプロト
コールに従い（ベクター末端の自己結合性を低下させる
ために）子牛腸アルカリホスファターゼとの処理により
部分的に脱リン酸化した。 66mMトリスHCl pH7.6、6.6mM MgCl2、10mM DTT、0.5m
M ATPの20μｌ中に処理済ベクター約100ng及び“リンカ
ー結合”二重鎖cDNA約50ngを含有する個々の結合反応液
をT4 DNAリガーゼ２単位と共に15℃で一夜インキュベー
トした。 結合用混合物の３μｌアリコートを0.1M CaCl2で50μ
ｌ容量まで希釈し、標準的方法に従い〔ダブル・ブラマ
ー教授（Prof.W.Brammar），生化学部，ライセスター
（Leicester）大学，英国から入手した〕CaCl2処理大腸
菌株910、バッチ100μｌを形質転換させるために用い
た。 アンピシリン耐性コロニー約800個（50μg/ml）を１
回の形質転換当たりで得た。アンピシリン又はテトラサ
イクリン（50μg/ml）含有寒天プレート上でこれらを複
製培養したところ、これらの一部25％がアンピシリン耐
性テトラサイクリン感受性組換え体であった。 組換えコロニー360個をニトロセルロースフィルター
上で培養し、現場ハイブリット形成によるスクリーニン
グ用にレプリカフィルターがハナハン・デー（Hanahan,
D.）及びメセルソン・エム（Meselson,M.）〔1980年，
プラスミドスクリーニング及び高コロニー密度，ジーン
（Gene），第10巻，第63−７頁〕による記載に従いそれ
から調製された後、−80℃で貯蔵した。 （７）CpTIコード配列に関する組換え体のクリーニング CpTI cDNA配列としての絶対的特異性をもつシグナル
プロープは入手できなかったため、かかる配列を有する
クローンが下記に関する一連の試験に基づき同定され
た： ｉ） 子葉RNA中で予想されるCpTI mRNAの豊富性 ii） CpTI f IVポリペプチドのＣ領域のコード可能部
分と相補的な混合合成14量体オリゴヌクレオチドとのハ
イブリッド形成 iii） 完全鎖長CpTI cDNAに関して予想される場合とほ
ぼ同様の挿入配列の大きさ iV） トリプシンインヒビター（の一部）に関するコー
ド部分を有していることを確認するための挿入配列の直
接的決定ハイブリッド形成のために用いられる細菌コロ
ニーを担持したニトロセルロースフィルターを最初にク
ロラムフェニルコール250μg/ml含有寒天プレート上で1
2〜16時間インキュベートし、プラスミド複製数を増幅
させた。フィルターをプレートから取出し、連続的に３
分間15％SDS;5分間0.5M NaOH、1.5M NaCl;5分間1Mトリ
スHCl、pH8.0、1.5M NaCl及び５分間で２回３×SSC（１
×SSC＝0.15M NaCl、0.015Mクエン酸ナトリウム）に浸
漬されたワットマン（Whatman）3MM紙の一連のパッド上
にコロニーが上にくるようにしておいた。フィルターを
風乾し、減圧オーブン中80℃で２時間ベーキング（baki
ng）した。 CpTI mRNAは、子葉mRNA中で適度に豊富に存在してい
るが、その量はタンパク質量を多少なりとも反映してい
ることから全量の１％を占めていると予想された。ササ
ゲ子葉ポリＡ＋RNA2μｇを前記（３）で記載したように
32P−dCTP 50μCi（410Ci/mM）の存在下逆転写によって
放射性同意元素標識した。高分子量反応生成物を、pH7.
4の10mMトリスHCl、1mM EDTA中でのセファデックスＧ−
50−Ｓカラム操作により回収した。32P−標識cDNAを、
３×SSC、0.1％SDS、各0.02％の牛血清アルブミン（BS
A）、ポリビニルピロリドン（PVP）及びフィコール（Fi
coll）、250μg/ml超音波処理変性サケ精子DNA、100μg
/mlポリアデノシンの10ml中65℃で１時間前インキュベ
ートした。フィルターを３×SSC、0.1％SDS中これを４
回交換して各々65℃で30分間、次いで３×SSC、0.1％SD
S、各0.02％のBSA、PVP及びフィコール、250μg/ml超音
波処理変性サケ精子DNA中65℃で４時間前ハイブリッド
形成させた。全処理プローブを脱水されたフィルターに
加え、65℃で16時間インキュベートした。フィルターを
脱水し、表面積1cm当り約2mlの３×SSC、0.1％SDSで２
回室温で５分間、３×SSC、0.1％SDSで３回65℃で40分
間、２×SScで２回室温で５分間連続的に洗浄し、次い
で乾燥し、室温で19時間フジ（Fuji）RX X線フィルムに
露出させて写真撮影した。 コロニーの一部30〜40％は、それらがプローブ中で中
度〜高度の反復性のある配列を有している場合に予想さ
れるオートラジオグラフシグナル強度を示した。 混合オリゴヌクレオチドの慣例的な合成が、ジェネッ
クス社（Genex Corporation）により全部で16種の14量
体： ５′−dCC〔A/G〕CA〔A/G〕AA〔A/G〕CA〔T/C〕TGに関
して行なわれた。配列は、Ｔ、Ｔ＋Ｃ＋Ｃ、Ａ＞Ｃ、Ａ
＋Ｇ及びＧに関して特異的な反応を用いる確立された化
学的修飾配列決定法により調べた。オリゴヌクレオチド
は、確立された方法でポリヌクレオチドキナーゼを用
い、32P−ATPとの反応により５′末端において放射性同
位元素標識された。 ニトロセルロースフィルターを３×SSC、0.1％SDS中
で４回65℃で３分間、次いで６×SSC、0.1％SDS、各0.0
2％のBSA、PVP及びフィコール、1mM EDTA、125μg/mlサ
ケ精子DNA中45℃で８時間前インキュベートした。フィ
ルターを同様の混合物中37℃で21時間標識14量体とハイ
ブリット形成させた。フィルターを６×SSC、0.1％SDS
で４回25℃で10分間、次いで２回39℃で５分間洗浄し
た。それらを６×SSCで洗浄し、乾燥し、単一デュポン
・クロネックス（Dupont Cronex）増強スクリーンで21
時間前−80℃において前フラッシュをあびたフジTXフィ
ルムに露出させた。組換え体の一部14％がバックグラウ
ンド上で明らかに標識されていた。 プラスミドDNAは、前記２つの基準によれば陽性のCpT
I cDNAである24種の組換え体培養物10mlから製造した。
これらプラスミド中に挿入されたDNA配列の大きさは、
アガロースゲル電気泳動におけるBamH I制限断片の移動
性から決定された。挿入物は約400〜1800塩基対の大き
さであった。CpTI cDNAは約550bp以下と予想されていた
ため、鎖長がそれ以下の挿入物を有する４個のクローン
を配列分析によって選択した。これらクローンのBamH I
挿入物を一本鎖バクテリオファージベクターM13mp9のBa
mH I部位に導入し、確立された方法を用いてて、35S−
チオ−dATPでジオキシ鎖終結させることにより配列決定
した。得られた配列及びそれらの相補物は、CpTI f IV
の一次配列、他のマメ化植物ボーマン−バーク型トリプ
シンインヒビターの一次配列と相同的な生成物を生成し
うるコード能力、及び公表された大豆ボーマン−バーク
トリプシン組成害剤遺伝子配列〔ハモンド・アール・ダ
ブル（Hammond,R.W.），フォード・デー・イー（Foard
e,D.E.）及びラーキンス・ビー・エー（Larkins,B.
A.）,1984年，大豆ボーマン−バークプロテアーゼイン
ヒビターについてコードする遺伝子の分子クローニング
及び分析，ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミス
トリー，第259巻，第9883−90頁〕との相同性に関して
試験された。 プラスミドpAGC1は上記CpTIの部分的cDNA配列を有し
ていた。プラスミドpUSSRa11/7は同一のコード配列を有
していたが、５′末端において更に６個のヌクレオチド
を欠いていた。他の２つのプラスミドは、CpTIコード配
列とは無関係の未確認配列を有していた。 （８）高能率cDNA合成 cDNA改良合成法が、完全CpTIコード配列をもつ組換え
体を得るために用いられた。この方法は完全鎖長cDNAを
製造する可能性が高い。その理由は、二次鎖合成の末端
ループプライミングには依存せず、しかもS1ヌクレアー
ゼ消化の必要性も不要であるからである。 ササゲ子葉mRNA 5.4μｇを50mMトリスHCl,pH8.3;10mM
MgCl2;10mM DTT;4mMピロリン酸ナトリウム；各1.25mM
のdATP、dCTP、dGTP及びdTTP;100μg/mlオリゴ（dT） 1
2−18;120単離AMV逆転写酵素;40単位ヒト胎盤RNアーゼ
インヒビター及び２μCi32P−dCTP（トレーサ）の40μ
ｌ中43℃で80分間インキュベートした。反応液を溶解氷
に移しかつEDTA 20mMとすることにより反応停止させ、
次いでフェノール／クロロホルム抽出によって２回タン
パク質除去した。核酸を、酢酸アンモニウムで2Mかつ高
度精製カキ（oyster）グリコーゲン（担体として）で１
μg/μｌに予め調製された水相からエタノール沈殿させ
た。ペレット化された核酸を2M酢酸アンモニウムから際
沈殿させ、水10μｌに再懸濁させた。 一次鎖合成生成物を、20mMトリスHCl,pH7.5;100mM KC
l;10mM硫酸アンモニウム;5mM MgCl2;0.15mM NAD;50μg/
ml無ヌクレアーゼBSA;40μM dATP、dCTP、dGTP及びdTT
P;8.5単位/ml大腸菌RNアーゼH;230単位/mlDNAポリメラ
ーゼI;10単位/ml大腸菌DNAリガーゼ含有の全容量35μｌ
中で12℃１時間次いで22℃で更に１時間インキュベート
した。反応を終了させ、生成物を前記反応と同様に処理
した。一次鎖において残存する３′突出部分を除去し、
二重鎖cDNAを33mMトリス酢酸;pH7.9;66mM酢酸カリウム;
10mM酢酸マグネシウム;0.5mM DTT;dTTP;2.5単位T4 DNA
ポリメラーゼの25μｌ中12℃で１時間インキュベートし
た。反応生成物を上記のように処理した。 （９）ベクターとしてpUC19を用い大腸菌JM83に組込む
クローニング 超らせんプラスミドpUC19（ギブコ−BRL,アクスブリ
ッジ，英国）を確立されたプロトコールに従い、制限エ
ンドヌクレアーゼHinc IIとの処理で直鎖化し、子牛腸
ホスファターゼとの処理で脱リン酸化した。 66mMトリスHCl,pH7.5;6.6mM MgCl;10mM DTT;0.5mM AT
P及び２単位T4 DNAリガーゼの20μｌ中処理ベクター約1
00ng及び二重鎖cDNA約20ngを含有したブラント末端結合
反応液を４℃で一夜インキュベートした。結合反応液を
酢酸アンモニウム2Mに調製し、エタノール沈殿させた。
それらを0.1M CaCl210μｌに再溶解し、確立された方法
に従いコンピテント大腸菌JM83〔ジェイ・メッシング博
士（Dr.J.Messing），生化学部，ミネソタ大学，米国か
ら入手した〕バッチ100μｌを形質転換させるために用
いた。組換え体をYT−BCIG−アンピシリン−寒天プレー
ト上で白色コロニーとして選択した。283個の組換え体
コロニーをニトロセルロースフィルター上でレプリカ培
養した。 （10）CpTIコード配列に関する組換え体のスクリーニン
グ この段階において、pAGC1挿入物及び合成14量体オリ
ゴヌクレオチド双方との交差ハイブリッド形成は、CpTI
cDNA配列識別上の特徴をなすと考えられた。組換えク
ローン由来DNAを上記（セクション７）のようにニトロ
セルロースフィルターに固定した。pAGC1挿入物をpAGC1
のBamH I制限断片の２％アガロースゲル電気泳動分離に
よって単離し、市販ニック−トランスレーション（nick
−translation）キットを用いてニックトランスレーシ
ョンにより32P−dCTPで標識した。合成14量体を前記の
ようにポリオヌクレオチドキナーゼを用いて32P−標識
化させた。コロニーフィルターとのハイブリッド形成は
前記のように行なったが、厳重さを要する最後の洗浄は
pAGC1挿入物プローブの場合が65℃で２×SSC、合成オリ
ゴヌクレオチドの場合が39℃で６×SSCにより行なわれ
た。 プラスミドpUSSRc3/2はpAGC1挿入物と非常に強くかつ
14量体とはそれよりも弱くハイブリッド形成したが、一
方pUSSRd4/6は14量体と非常に強くかつpAGC1挿入物とは
それよりも弱くハイブリッド形成した。プラスミドDNA
を塩化セシウム勾配下これらのクローンから精製し、確
立した操作法に従い制限地図を作成した。挿入断片のヌ
クレオチド配列を化学的装飾DNA配列決定法により調べ
た。 プラスミドpUSSRc3/2は、pAGC1で前記例示されたCpTI
異性体インヒビターに関する事実上完全鎖長のcDNA配列
を有していた。プラスミドpUSSRd4/6は、５′−リーダ
ー配列の一部を欠く異性体インヒビターf IVと一層関連
した別のCpTI異性低インヒビターの成熟タンパク質に関
する完全コード配列有したcDNA配列を含んでいた。 （11）アグロバクテリウムBIN発現ベクター中へのpUSSR
c3/2 CpTI配列の導入 pUSSRc3/2 DNA 10μｇを33mMトリス酢酸,pH7.8;66mM
酢酸カリウム;10mM酢酸マグネシウム;4mMスペルミジン
及び0.5mM DTT（TA緩衝液）中制限エンドヌクレアーゼA
lu I、Sca I及びXmn Iで消化した。完全CpTIコード配列
を有する生成した唯一の552bp断片を消化物の６％アク
リルアミドゲル電気泳動分離により精製した。ベクター
プラスミドpBok〔エム・ベバン博士（Dr.M.Bevan），プ
ラント・ブリーディング・インスティテュート（Plant
Breeding Institute）ケンブリッジ，英国から提供され
た〕を制限エンドヌクレアーゼSma Iで直鎖化し、子牛
腸ホスファターゼで脱リン酸化し、上記550bp断片にブ
ラント末端結合させた。結合反応物は、大腸菌株MC1022
（上記エム・ベバン博士）をカナマイシン（50μg/ml）
耐性に形質転換させるために直接使用した。 プラスミドDNAを各形質転換コロニー培養物10mlから
調製し、制限地図作成により挿入断片の独自性及び向き
についての分析した。正しい向きをもつ挿入物のクロー
ン、即ち CaMVプロモーター−５′CpTIコード配列３′−NOSタ
ーミネーターは pRokCpTI＋（クローンNo.）と命名された。誤った向き
をもつクローン、即ち： CaMVプロモーター−３′CpTIコード配列５′−NOSタ
ーミネーターは pRokCpTI−（クローンNo.）と命名された。 （12）アグロバクテリウム・ツメファシエンスへの導入 下記の一夜培養物10mlを調製した： 30℃における栄養ブロス＋ストレプトマイシン500μg
/ml＋リファマイシン100μg/ml中のアグロバクテリウム
・ツメファシエンス株LB4404（上記エム・ベバン博
士）； 37℃におけるＬ−ブロス＋カナマイシン50μg/ml中の
pRockCpTI＋５又はpRokCpTI−２を有する大腸菌株MC102
2; 37℃におけるＬ−ブロス＋ストレブトマイシン500μg
/ml＋リファマイシン100μg/ml中のpRK2013（上記エム
・ベバン博士）を有する大腸菌HHB101。 各200μｌのアグロバクテリウム起動性（mobilizin
g）株及びCpTI含有株の１種を混合し、Ｌ−寒天プレー
ト上で培養し、30℃で一夜インキュベートした。細菌培
養物をpH7.0のトリスHCl、10mM MgCl2の5ml中に懸濁
し、その一部をストレプトマイシン（500μg/ml）、リ
ファマイシン（100μg/ml）及びカナマイシン（50μg/m
l）含有最小寒天プレート上で培養し、30℃で２日間イ
ンキュベートした。これら３種の抗生物質に対するコロ
ニーの耐性は、同様の選択プレート上で更に２回各コロ
ニーを再培養することによって一層強固にされた。 （13）ニコチアナ・タバクム及びニコチアナ・プルムバ
ギニホリアへのCpTI遺伝子の導入 葉片を、純培養N,タバクム〔変種（var.）サムスン〕
及びN.プルムバギニホリア〔インスティテュト・ナショ
ナル・デ・レシェルシェ・アグロノミク（Institut Nat
ional de Recherche Agronomique），ヴェルサイユ，パ
リ，フランスから得られた名称のない二ゲノム性半数体
変種〕植物の葉から打ち抜き、Ti−RokCpTIプラスミド
構造体を有するA.ツメファシエンスの一夜培養物と共に
インキュベートした。葉片をカルベニシリン（500μg/m
l）及びカナマイシン（100μg/ml）の存在下公知の方法
に従い苗条再生培地プレート上に乾燥ブロットし、移し
替えた〔フレリー・アール・テー（Fraley,R.T.），ロ
ジャース・エス・ジー（Rogers,S.G.）、ホーシュ・ア
ール・ビー（Horsch,R.B.）．サンダース・ピー（Sande
rs,P.），フリック・ジェイ（Flick,J.），アダムス・
エス（Adams,S.），ビットナー・エム（Bittner,M.），
ブロント・エル（Brond,L.），フィンク・シー（Fink,
C.），フライ・ジェイ・イー（Fry,J.E.），ガルッピ・
ジー（Galluppi,G.），ゴールドバーグ・エス（Goldber
g,S.），ホフマン・エヌ・エル（Hoffman,N.L.），ウー
・エス（Woo,S.），植物細胞中における細菌遺伝子の発
現,1983年，プロシーディング・オブ・ナショナル・ア
カデミー・オブ・サイエンスUSA,第80巻，第4803−７
頁；ホーシュ・アール・ビー（Horsch,R.B.），フライ
・ジェイ・イー，ホフマン・エヌ・エル，アイヒホルツ
・デー（Eichholtz,D.）ロジャース・エス・ジー，フリ
ーリー・アール・テー,1985年，遺伝子を植物中に組込
んで形質転換させるための簡単かつ一般的な方法，サイ
エンス（Science），第227巻，第1229−31頁〕。カナマ
イシン耐性小苗条をカルベニシリン及びカナマイシン含
有の根誘導培地に移した。個々の根付いた植物の複製を
苗条栽培により得た。十分に根付いた小植物を50:50培
養土及びパーライト中に植え、日光下25℃で16時間シェ
ラー栽培室内で成長させた。 植物は、成長性、成長率、開花時間、種子生育性等の
表現型に関して正常であった（第３表参照）。 （14）形質転換植物の昆虫耐性に関するバイオアッセイ ヘリオチス・ビレセンス（f.）〔鱗翅類；ノクツイダ
エ（Noctuidae）〕のさなぎ、即ちオオタバコガ幼虫又
はトマト食い虫（tomato budworm）USDA〔ブラウンスビ
ル（Brownsville），テキサス，米国〕から入手した。
英国到着時、飼育物は１日の日光照射時間13時間で25℃
において維持されていた。幼虫段階ではアルファルフ
ァ、インゲンマメ肉、小麦麦芽並びに必須のビタミン類
及び無機物類含有の寒天基礎飼料で飼育され、成虫段階
ではビタミン補充ハチミツ溶液で飼育された。 N.タバクムの場合には約12cm長及びN.プルムバギニホ
リアの場合には約8cm長の植物が、栽培室中の個々の密
閉された植物育生所内に植えられた。これらに、生後12
〜24時間のH.ビレセンス幼虫８匹を寄生させた（これら
の条件下におけるコントロール植物上で幼虫生存性に関
して、８匹というのは最適数であることが発明した）。
植物上で７日目に、すべての生存幼虫を取除き、酢酸メ
チルで麻酔し、ブーアン（Bouin's）固定液で保存し、
測定した。植物に対する損傷は、視覚上の損傷に関して
任意的な１〜５の段階に植物をランク付けし、かつ特定
の葉（頂部から３番目の成熟葉，通常最も損傷が大き
い）において食べられた範囲を測定することによって評
価した。この実験結果は第２表に示されている。個々の
植物においてCpTI量及び昆虫生存率％を示すデータは第
４表に示されている。 昆虫に対して中度〜高度の耐性を示す植物（数本のコ
ントロール植物と共に）、第一令又は第二令の幼虫で侵
襲される次の実験で使用した。 クローン複製植物におけるH.ビレセンスでの摂食実験 N.タバクム形質転換体＋5/5、＋5/21及び−2/8をさし
木により複製し、カナマイシン含有寒天中各群８〜16本
の植物を根付かせた。これらを約12cm長となるまで培養
土中で成長させ、次いで前述のように密閉された植物育
生所内で植物１本につき出生したばかりの８匹のH.ビレ
センス幼虫を寄生させた。７日後生存昆虫を取り除き
（但し、長期間にわたりモニターされている数本の植物
を除く）、昆虫生存数及び成長性を前記のように調べ
た。植物に対する損傷は、サイトシステムズ社（Sights
ystems Ltd.,ニューベリー，英国）市販の“VIP"画像ア
ナライザー及びソフトウェアを用いる特定葉の画像分析
により、食べられた葉の％として評価した。 結果は第５表に要約されている。H.ビレセンス幼虫
は、CpTI発現形質転換体＋5/5及び＋5/21上において著
しく高い死亡率及び著しい低い成長率を示した。これら
の植物は又、コントロールほど損傷をうけていなかっ
た。 （15）他の昆虫害虫による摂食実験 摂食実験は、ワタ及び穀類において重要な他のいくつ
かの昆虫害虫に対するタバコ（＋5/5）中のCpTI遺伝子
の効果を調べるために行なわれた。 （ａ）ヘリオチス・ゼア H.ゼアの幼虫をグラスハウス・クロップス・リサーチ
・インスティテュート（Glasshouse Crops Research In
stitute）〔リトルハンプトン（Littlehampton）〕及び
USDA（ブラウンスビル，テキサス，米国）から入手し、
H.ビレセンスに関して記載したように飼育した。クロー
ン複製物＋5/5及び−2/8に植物１本当たり８匹の生まれ
たばかりの幼虫（生後24時間以内）を寄生させ、上記の
ようにバイオアッセイを行なった。 初期実験では、192例中16例のみの幼虫がコントロー
ル植物において生存しており（cf.＋5/5では224例中10
例）、植物１本当たりの平均生存数は有効な０にほぼ近
かった。しかしながら、やや若い植物（6cm長）を用い
た場合において、コントロール群の生存率は30％に達し
ており、有意義な比較をすることができた（第６図
表）。CpTI発現植物は、H.ゼアによる攻撃及びその生育
に対してより高い耐性を明らかに示した。 （ｂ）スポドピテラ・リットラリス S.リットラリス幼虫をメイ＆ベーカー社（May ＆ Bak
er Ltd.），オンガー・リサーチ・ステーション（Onger
Research Station），エセック，英国から入手し、H.
ビレセンスに関して記載したように飼育した。クローン
複製物＋5/5及び−2/8に生まれたての８匹の幼虫（生後
12時間以内）を寄生させ、上記のようにバイオアッセイ
を行なった。植物に対する損傷は、この昆虫種の場合に
下部の葉において一層明らかであったため、画像分析用
にこの、部分から葉を摂取した。第７表で示したよう
に、CpTI発現植物はS.リットラリスの幼虫による攻撃及
びその生育に対してより耐性の高いことが判明した。 生存昆虫の平均体長間には有意差がなかったものの、
体長の分布には著しい差異がみられたことは重要であろ
う。コントロール植物の場合に体長分布は連続的であっ
たが、一方＋5/5の場合にはそれは二極化しており、各
極の体長は平均より著しく小さいか又は大きなものであ
った。我々は、このことに関して、前者はCpTIの代謝拮
抗作用に屈服したものであり、一方後者はその作用に抵
抗しうるに十分な体長に達したためである（おそらく、
いくつかのケースにおいては共食いによる）、と考え
た。 （ｃ）マンズカ・セクスタ M.セクスタの卵は、エス・レイノルズ博士（Dr.S.Rey
molds）〔生物科学校（School of biological Sciene
s），バス（Bath）大学，バス，英国〕から入手した。
＋5/5及び−2/8植物のカナマイシン耐性S1継代物に生ま
れたばかりの４匹の幼虫（生後24時間以内）を寄生さ
せ、上記のようにバイオアッセイを行なった。 M.セクスタ幼虫は試験された他の鱗翅類よりも著しく
大きく、コントロール植物に対して多大な損傷を急速に
及ぼす。かかる理由から、植物１本当たりに用いられる
昆虫数を減少させることが必要であり、しかも特定の葉
に対する損傷を調べるよりむしろ植物全体の損傷を評価
することが必要であった。CpTI発現植物は、この害虫種
に対して高い耐性を有することが発明した（第８表）。 （16）形質転換植物におけるCpTI発現量の測定 形質転換植物組織におけるCpTI発現性の実験方法は、
抗CpTI抗血清を用いる各種の免疫交差反応技術又は直接
的インビトロリプシン阻害活性アッセイのいずれかに依
存していた。 （ａ）ウサギ抗CpTI抗血清の製造 一次抗CpTI抗体含有血清をウサギから製造した。CpTI
はウサギ血清アルブミン（RSA）とグルタルアルデヒド
交差結合した。ウサギに、フロイント完全アジュバント
500μｌに懸濁されたCpTI−RSA 500μｌを注射した。フ
ロイント不完全アジュバント500μｌに懸濁されたCpTI
−RSA 500μｌを約１週間毎に更に４回注射した。最後
に、リン酸緩衝液中の未修正CpTI 0.5mg及び３週間後に
おけるCpTI−RSA 0.25mgの追加免疫注射を免疫血清回収
前に行なった。 この抗血清を産生する際に生じる問題は、CpTIが抗原
性に乏しいということであった。抗体は全CpTIに対し産
生され、全CpTIの中ではpUSSRc3/2でコードされた異性
体インヒビターのみが機能する、ということに注意しな
ければならない。インヒビター上で最も可能性の高い抗
原部位はポリペプチドの可変領域に存在することから、
抗体の何％が導入されたCpTI遺伝子生成物と事実上交差
反応するのかはわからないのである。したがって、これ
らの方法では標準として全CpTIを用いた場合に単一のCp
TI異性体インヒビター量を過小評価しがちである。 （ｂ）植物組織タンパク室抽出物の調製 一部の初期ELSA及びドット免疫のブロットのために、
粗タンパク質抽出物を成長中の若葉、洗浄された根及び
茎部分から調製した。これらを取出し、液体空気で凍結
し、粉末化し、凍結乾燥した。それらを回転ホイール上
pH9.5の50mMトリスHCl 1mlにつき乾燥重量40μｇの割合
で４℃にて一夜抽出した。次のELISA、インビトロトリ
プシンインヒビターアッセイ及びウェスターンブロット
を硫酸アンモニウム沈殿分画について行なった。葉を採
取し、凍結し、上記のように粉末化した。それらを４℃
で一夜pH9.5の50mMトリスHCl,1mM DTT中湿潤重量1mg/2.
7μｌの割合で直ちに抽出した。不活性物質を遠心分離
によりペレット化し、上澄1mlを95％飽和以下の硫酸ア
ンモニウムにより４℃で一夜沈殿させた。沈殿タンパク
質をペレット化し、抽出緩衝液400μｌに再懸濁し、pH
9.5の50mMトリスHClに対して透析した。タンパク質濃度
はブラッドフォードタンパク質アッセイにより調べた
〔ブラッドフォード・エム・エム（Bradford,M.M.）,19
76年，タンパク質−色素結合原理を用いたタンパク質mg
量の高速高感度定量方法，アナライティカル・バイオケ
ミストリー（Analytical Biochemistry），第72巻，第2
48−54頁〕。 （ｃ）酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA） CpTI発現量は、市販ペルオキシダーゼ結合二次抗体EL
ISAキットを用いて、形質転換植物からの葉抽出物のELI
SAにより測定した。これらのアッセイ結果は、高発現性
植物の定性的確認を可能ならしめるに十分であったが、
CpTIの乏しい抗原性及びELISAプレートと結合しうるタ
ンパク質が低量であることに起因して定量的にはむしろ
信頼できないと思われた。 （ｄ）インビトロトリプシンインヒビターアッセイ 試料のトリプシン阻害活性は、アーランガーらの方法
に従い基質としてＮ−ベンゾイル−DL−アルギニン−ｐ
−ニトロアリニドHCl（BAPNA）を用いて測定した〔アー
ランガー・ビー・エフ（Erlanger,B.F.）、カコフスキ
ー・エヌ（Kakowsky,N.）、コーエン・ダブル（Cohen,
W.）,1961年，トリプシンの２種の新規な発色気質の製
造及び性質，アーチブス・オブ・バイオケミストリー・
アンド・バイオフィジクス（Archives of Biochemhistr
y and Biophysics），第95巻，第271−278頁〕。この方
法で測定されたCpTI活性レベルは、ELISAで示されたレ
ベルよりも著しく高く（第２表）、即ち観察された生物
学的活性に相当すると思われるレベルと一致して著しく
高いものであった。しかしながら、このアッセイも制御
不可能な変動干渉をうけた。 （ｅ）タンパク質ドット免疫ブロットアッセイ タンパク質５μｇ含有組織抽出物をニトロセルロース
フィルターに結合させ、125I−ロバ抗ウサギ抗体を用い
てジャン・アール（Jahn,R.）、シーブラー・ダブル（S
chiedler,W.）、グリーンガード・ピー（Greengard,
P.）〔1984年，ニトロセルロース膜フィルターを用いる
タンパク質用定量ドット免疫結合アッセイ，プロシーデ
ィング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエ
ンスUSA,第81巻，第1684−87頁〕により記載されたドッ
ト免疫結合アッセイに供した。既知量の精製起CpTI標準
を非形質転換タバコ抽出物５μｇ中で同時に供した。オ
ートラジオグラフィー後、定量は各“ドット”のシンチ
レーションカウント又はLKBウルトラスキャン（Ultrasc
an）積算レーザー濃度計でのオートラジオグラフの走査
により行なわれた。 この方法を用いた結果は全く再現可能であった。＋5/
5においてCpTIとして評価された全タンパク質中約0.9％
というレベルは、抗体の低交差反応性の故に、おそらく
まだ過小評価されているであろう。 若及び老葉、茎並びに根組織におけるCpTI発現レベル
はこの方法で調べた。この詳細な実験において、高レベ
ルの“バックグラウンド”非特異的抗体結合性は、信頼
検出レベルを約18mg/試料（タンパク質0.4％）に限定
し、かつ＋5/5の若葉における発現レベルの著しく低い
評価の原因をなしていた。しかしながら、結果（第９
表）は下記のことを明らかに証明している： CpTIの相対量は葉の成熟に伴い低下する； CpTIは形質転換植物の茎に存在する； CpTIは根の全タンパク質中更に高率で発現せしめられ
る。 （ｆ）ウェスターンブロット 形質転換タバコ植物中におけるCpTIの存在もウェスタ
ーンブロットにより確認された。＋5/5及び−2/8植物の
若葉からの硫酸ナトリウム沈殿可溶性タンパク質を非還
元条件下17％ポリアクリルアミド−SDSゲル電気泳動に
より処理した。トリプトシンアフィニティーカラム精製
CpTI及びササゲTvu2027の種子から抽出された可溶性タ
ンパク質を標準として同時に処理した。ウェスタンーン
ブロットはトービンらにより記載されているように実施
した〔トービン・エッチ（Towbin,H.），ステヘリン・
テー（Staehelin,T.），ゴードン・ジェイ（Gordon,
J.）,1979年，ポリアクリルアミドゲルからニトロセル
ロース紙へのタンパク質電気泳動移動，操作及びいくつ
かの用法，プロシーディング・オブ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンスUSA,第76巻，第4350−４
頁〕。ブロット（第９図）は、−2/8には存在せず＋5/5
の葉中に存在するCpTI抗体交差反応性物質のバンドが出
現し、これらのバンドがササゲ種子中のCpTIの主バンド
と一致することを示している。 第９図は以下のものを示している： Ａ）アフィニティー精製CpTI Ｂ）ササゲTVu2027の種子抽出物 Ｃ）−2/8葉組織 Ｄ）＋5/5葉組織 （17）形質転換体の遺伝子分析 （ａ）カナマイシン耐性の分離分析 原N.タバクム形質転換植物は自家受粉種子を発生する
ことができた。成熟種子を回収し、気密ボトル中４℃で
貯蔵した。種子を20％“クロロス（Chloros）”中で表
面殺菌し、栽培室中0.5×ムラシゲ（Murashige）及びス
クッグ（Skoog）培地及びカナマイシン200μg/ml含有の
0.8％寒天上で発芽させた。 ４つのタイプの下記表現型は苗のS1世代間において明
確に区別することができた： 非生存性−発芽しえない種子； カナマイシン耐性−カナマイシン200μg/ml上で良好
に成長し、高度に分岐した根系及び“健常”な緑色真葉
を形成した； カナマイシン感受性−種子は発芽するが、但し根は分
岐せず、真葉は適度には生育せず、かつ子葉は白色化し
た； 中間耐性−種子は発芽して真葉を形成するが、但し根
系は十分に耐性の苗ほどは明らかに分岐せず（特に苗が
寒天から引き抜かれた場合に明らかである）、かつ若干
的に白色化した葉が観察された； 形質転換植物からの種子の生育力は、無カナマイシン
であること以外は同様の条件下で発芽した非形質転換N.
タバクム（変異サムスム）からの種子と比べて少なくと
も同じ程度に高かった。 第10表に要約された結果は、カナマイシン耐性が単純
なメンデルの法則に従い発現し、試験植物中１又は２の
遺伝子座に存在し、かつ古典的メンデルの法則によると
3:1又は9:3:3:1の分離比であることを証明した。その特
性は予想されるように通常優性であるが、可変的浸透度
をもつようである。したがって、二遺伝子座植物の一部
における中間表現型の出現は、一部の遺伝子座が他の場
合よりも非常に強い表現型効果を発揮していることを示
している。親植物−2/2及び＋5/19はこの選択レベル
（最初に適用されたカナマイシン濃度の２倍）では成長
しないであろうし、実際にも−2/2系はカナマイシン100
μg/ml上での連続栽培時に消失したことに注意せよ。１
又は２の遺伝子座のみが含まれている場合に、ホモ接合
植物がS2世代で確認可能であった。（ｂ）昆虫耐性表現型の遺伝 ＋5/5のカナマイシン耐性S1継代物（＋5/5〔１〕A11
−20と呼ばれる）10例をS.リットラリスに対するバイオ
アッセイで試験し（第11表参照）、しかる後それらを成
長させて、自家受精S2種子を発生させた。この種子はカ
ナマイシン200μg/mlを含有した1/2のMS寒天上で発芽し
た。10例中の植物からのS2種子は試験されたカナマイシ
ン耐性表現型に関して分離を示さず、かかる試料の大き
さから予想される分離比を示した。面白いことに、この
４例のホモ接合植物はバイオアッセイで昆虫耐性に関し
て１番目、２番目、３番目及び５番目にランク付けされ
た。 （ｃ）サザンブロット 高分子量ゲノムDNAを標準的操作により形質転換原性
植物の成熟したばかりの葉から単離した。ゲノムDNA10
μｇを37℃で一夜EcoR I及びHind III各40単位により消
化し、制限断片を１％アガロースゲル上での電気泳動に
より分離した。“マーカー”断片を用意しかつコピー数
再組換えをするために、比率5:1のpRokCpTI＋５及びpRo
kCpTI−２の混合物をEcoR I及びHind IIIで消化した。
ニコチアナDNA 10μｇ当りのニコチアナ遺伝子団体（ge
nophore）につき導入配列コピー数1,5及び20に相当する
制限プラスミドを同時に処理した。DNAをニトロセルロ
ースフィルターに“サザン”導入し、ニックトランスレ
ーションされた32P−dCTP標識pRokCpTI＋５でプローブ
処理した。高度の厳重性を要する洗浄は、オートラジオ
グラフィー前に0.5×SSC、0.1％SDS中68℃で行なった。
植物＋5/5及び−2/8のオートラジオグラフ上における重
要なバンド源は第９図に示されているが、そこにおいて
（Ａ）はpRokCpTI＋５及びpRokCpTI−２構造中の特徴的
制限部位を示してあり、（Ｂ）はサザンブロットのオー
トラジオである。 主な結論は下記のように要約される： ｉ） 試験されたすべての植物は、−５における480kp
及び1200バンド、並びに−２における610kp及び1070kp
バンドの存在から示されるように、CaMV35Sプロモータ
ー−CpTI−NOSターミネーター構造体の少なくも１つの
未再配列コピーを有している。 ii） すべてが複数の遺伝子挿入物コピーを有している
（以下参照）。 iii） 大多数のコピーは、2570kpバンドを生じる“頭
−尾（head to tail）”タンデム（tandem）配列中に存
在している。このタンデム的繰返しとしての挿入が、遺
伝子コピー数及び遺伝子座数間の差異の原因をなしてい
る。 iv） 構造体中での内部再配列を強く示唆するバンドは
共通して存在するものではないが、数種の植物において
は認識可能である（例えば、5/8）。 ｖ） 高分子量バンドはおそらく以下の結果による： ａ）不完全消化 ｂ）宿主DNA中への“末端断片”流入 ｃ）遺伝子再配列 ｄ）Tiプラスミドの導入 （ｄ）遺伝子コピー数 コピー数は、標準としてプラスミドDNAゲノムコピー
数再組換え体を用い、サザンブロット及びゲノムDNAド
ットブロットの積算レーザー濃度測定スキャンによって
調べた。結果は第12表に示されている。コピー数及びCp
TI発現性（及び、ひいては昆虫耐性）間には相関々係の
ないことが注目される。挿入が生じた部位の性質がおそ
らくもっと重要なのであろう。
護に関する。更に詳しくは、本発明は昆虫耐性について
コードする特定遺伝子の植物中への導入によるワタ及び
穀類作物の保護に関するが、本発明は耕作地及び貯蔵所
の害虫が深刻な経済問題を発生させる他の作物にも適用
可能である。かかる作物としては、ワタ、トウモロコシ
（maize）、米、大豆、テンサイ、小麦、果実、野菜及
びブドウがある。特に本発明は、マメ科植物由来トリプ
シンインヒビター、特にササゲ（cowpea）トリプシンイ
ンヒビター（CpTI）の遺伝子に関する。 作物の昆虫害虫は、年間農業生産量を平均で５〜15％
減少させる。これらの損失金額は年間数＋億（米国）ド
ルと評価されており、しかも農薬並びに噴霧器及び散布
器に関して毎年経費がかかる。例えばワタ作物は昆虫等
のある種の害虫に対して非常に感受的である。米国だけ
でも、少なくとも125種の昆虫がワタに経済的損害を与
えている。ワタ用殺虫剤は殺虫剤総額13.35億ドル（198
5年度）のうち最大を占め、全経費の31％に相当する。
米国では、年間損失額は平均5.00億ドルに達し、しかも
耕作者は耕作地を良好に保つため殺虫剤及び面倒な散布
に関しほぼ同額の費用をかけている。害虫は種まきから
収穫に至るまでワタに害を及ぼす。一般に、早期の段階
で害を及ぼす害虫は収量に悪影響を与え、一方それ以後
の段階で害を及ぼす害虫は品質に悪影響を与える。 １つの主なワタ害虫群は、ヘリオチス（Heliothis）
属の蛾幼虫（bollworm）〔H.ビレセンス（H.virescen
s）、H.アルミラ（H.armigera）及びH.ゼア（H.zea）
等〕である。ヘリオチス属蛾幼虫はワタ以外にも様々な
科の植物に悪影響を与え、即ちそれらはトウモロコシ及
びモロコシ（Sorghum）のような多数の穀類、並びにタ
バコ、フェイセオルス（phaseolus）豆、大豆及びひま
わりのような他の作物に悪影響を与える。ワタに関する
他の深刻な害虫はワタキバガ幼虫（pink bollworm）
〔ペクチノホラ・ゴッシピエラ（Pectinophora gossypi
ella）〕であるが、これは世界中で最も重要な害虫であ
って、発展途上国においては70％以下の作物をだいなし
にしている。他の深刻な害虫は、メキシコワタミゾウム
シ（boll weevil）〔アントノマス・グランジス（Antho
nomus grandis）等のアントノマス種〕である。ヘリオ
チス、ペクチノホラ及びアントノマスの幼虫はワタ収量
を著しく低下させるが、その理由はそれらが未開花のワ
タ花（つぼみ）及びさやの中で摂食して、つぼみ及び小
さなさやを死滅させかつ抜け殻にするためである。さや
が大きくなるにつれて、リント（lint）は汚れて腐敗す
るようになる。ワタにおいて深刻な問題を与える昆虫属
は、スポドプテラ・リツラ（Spodoptera litura）〔コ
メネキリムシ（rice cutworm）又はフォール・アーミー
ワーム（fall armyworm）〕及びS.リットラリス（S.lit
toralis）〔ワタ葉食い虫（cotton leafworm）〕等のス
ポドプテラ属である。スポドプテラは、トウモロコシ、
米、モロコシ及びタバコの害虫でもある。 昆虫の害が収量を低下させている他の主な作物はトウ
モロコシである。トウモロコシ用の殺虫剤に関する全世
界の費用は1985年で4.70億ドルであった。米国だけで、
昆虫による損害は毎年9.00億ドル以上とみられている。
ハムシモドキ幼虫（corn rootworm）〔ジアブロチカ（D
iabrotica）種〕は深刻な害虫であって、米国における
収穫損失率は10〜30％と計算されていた。米国における
トウモロコシの他の害虫はアワノメイが（European cor
n borer）〔オストリニア・ヌビラリス（Ostrinia nubi
lalis）〕であって、穿孔虫の第一世代は葉及び茎を餌
にすることから、栄養物の穂を消失させてしまう。1970
−75年の米国におけるアワノメイガによる毎年の損害額
は、年間3.10億ドルと計算されている。トウモロコシに
おける他の重要な害虫としては、シトフィラス・オリザ
エ（Sitophilus oryzae）〔コクゾウ（rice weevi
l）〕、オオタバコガ幼虫（corn earworm）〔H.ゼア〕
（これは米国で毎年0.75〜1.40億ドルの損害を与え
る）、斑点茎穿孔虫（spotted stalk borer）〔チロ・
スプレッサリス（Chilo suppressalis）〕及びネキリム
シ〔アグロチス（Agrotis）種〕（ワタ、タバコ及び多
くの野菜にも害を与える）がある。 利用可能な様々な種類の化学的農薬があるにもかかわ
らず、昆虫害虫は深刻な問題を引き起こす。多くの農薬
は、ヒト及び野生動物に対して高毒性並びに比較的高い
植物毒性といった重大な欠点を有している。化学的農薬
に対する昆虫の耐性獲得も、次第に深刻化していく問題
となっている。 植物生産者は慣用的品種改良計画に従い昆虫耐性遺伝
子を変種虫に組込むことによって、昆虫の攻撃により発
生する損害を減少させる試みを行った。大多数の植物は
大半の昆虫に対して耐性を示すが、耐性は物理的でも化
学的であってもよい。例えば、多数の植物の葉毛は、小
さな昆虫が葉をかめるほど葉に十分近づくことを阻止し
うる。他の場合において、植物はそれらの組織を誘引性
のないものに又は毒性に換えるために様々な複合的二次
化学物質を利用している。これらのタイプの耐性は多数
の遺伝子のコントロール下にあるため、植物生産者が利
用することはむずかしい。多くの場合に耐性変種は収量
の低下を示すことから、経済的に実行不可能であった。
即ち、おそらく昆虫耐性の特異的特性が他の有害な特性
と関連しており、これら２つの特性を簡単には切離すこ
とができなかったからであろう。 植物生命工学における近年の発達は、特異的特性につ
いてコードする遺伝子を現存生殖質に加えることによっ
て、植物改良範囲を拡張しうる可能性を高めている。研
究は、除草剤耐性、病気耐性、品質面及び昆虫への耐性
に関する遺伝子の単離及び移入について行なわれてい
る。 遺伝子工学による昆虫耐性植物は化学的農薬使用の場
合にはないいくつかの利点を有することが明らかにされ
た（参考のため、アグロウ、1986年（29）の報告参
照）。これらの利点としては下記のものがある： ａ）季節的長期保護性 ｂ）昆虫は最も感受性の高い段階で通常処理される ｃ）天候に依存しない保護性 ｄ）植物組織の処理が困難な場合の保護性 ｅ）作物摂取昆虫のみが接触する ｆ）植物組織中に封入された物質 ｇ）活性因子は生物分解性かつ無毒性である しかしながら、いくつかの制限要因も存在する： 1.移入し易い植物種 これはキー要因であるが、主な食用作物を形質転換さ
せる技術は間もなく実用化されるであろう。ワタ形質転
換に関する最近の報告〔ウンベック・ピー、ジョンスト
ン・ジー，バートン・ケー，スウェイン・ダブル,1987
年、遺伝的形質転換ワタ（ゴシピウム・ヒルスツムL.）
植物，バイオ／テクノロジー，第５巻，第263ー266頁
（Umbeck,P.,Johnston,G,Barton,K.,Swain,W.,1987,Gen
etically transformed cotton（Gossypium hirsutum
L.）plant,Bio/Technology 5,263−266）〕及びトウモ
ロコシ形質転換の要求は、形質転換研究への多額の投資
が適切なプロトコールの開発を間もなく導くことを暗示
している。 2.害虫に対する活性スペクトル 一般に、殺虫剤は昆虫害虫に対して広域活性スペクト
ルを有する。遺伝子工学によって作物中に組込まれた生
物額的農薬は、それらの使用を価値のあるものにさせる
ために十分広い活性スペクトルを有していなければなら
ぬであろう。 昆虫耐性植物を生産させるバチルス・ツリンギエンシ
ス（Bacillus thuringiensis,Bt）結晶タンパク質遺伝
子に関する特許出願がなされた（欧州特許出願第843064
94.0号及び第86300291.1号明細書）。しかしながら、欧
州特許出願第84306494.0号の場合において、その明細書
は、植物発現性完全鎖長殺虫性タンパク質遺伝子を有す
る形質転換タバコカルス組織上で飼育されたタバコスズ
メガ幼虫（tobacco hornworm）〔マンズカ・セクスタ
（Manduca sexta）〕はB.スリンギエンシス結晶タンパ
ク質毒性に帰因する症状を示すことが観察されたことの
みを開示しているにすぎない。その遺伝子を有する植物
の殺虫効果に関する情報は示されていなかった。出願第
86300291.1号明細書は形質転換原性（transgenic）タバ
コ植物中のBt遺伝子の効果に関する情報を示している
が、データは１種の昆虫タバコスズメガ幼虫のみに限ら
れている。 昆虫耐性を高めるため植物中にBtを移入した場合に生
じうる１つの欠点は、異なる細菌株は異なる特異性を持
つ毒素を生産することである。このことは、昆虫害虫の
十分に広域なスペクトルに対して耐性のある作物を生産
するためには数種のBt遺伝子を組合せることが必要であ
ることを意味しているのであろう。 3.否定的副作用 昆虫耐性遺伝子を有する形質転換原性植物はいかなる
認知しうる程度の収量低下も起こさないことが重要であ
る。 害虫が継続的に“内在性（in−build）殺虫剤”と接
触するように昆虫耐性遺伝子を作物植物に組込みうる環
境効果に関して関心が集まっていた。これは害虫に対し
て非常に高い選択圧力を加えかつ耐性獲得を促進させて
いるからであろうと説明された。しかしながら、この説
明に反対する説は、トリプシンインイビターが主消化酵
素の活性部位に直接作用しているとするものである。標
的部位の生存可能な変異による昆虫における耐性獲得確
立は低いであろう。耐性は、インヒビターが損害を与え
る前に解毒されるような昆虫代謝系での複雑な多くの変
化をうけることによってのみ、おそらく獲得されるので
あろう。 病原体又は捕食昆虫の消化酵素又は他の酵素を阻害す
ることによりこれらに対する耐性を付与しうる様々なタ
ンパク質を植物が含んでいることを示唆する重要な推論
が文献に記載されている〔ライアン・シ・エー・（Rya
n,C.A.）,1983年、天然植物保護応答性を調節する昆虫
由来化学的シグナル，デンノ・アール・エフ＆マクルア
ー・エム・エス（Denno R.F.＆ McClaure M.S.）（編
集）、自然及び管理系における様々な植物及び草食動
物、第43−60頁、アカデミックプレス（Academic Pres
s）〕。 ある特定の植物成長段階、即ち成熟種子の段階にのみ
存在する天然トリプシンインヒビターは、人工飼料中に
配合された場合に、他の植物の様々な害虫に対して強い
毒性を示すことが、以前に発表された。驚くべきこと
に、トリプシンインヒビターに関する遺伝子が植物成長
の全段階にわたって発現するような方法で別の植物中に
移入された場合、形質転換原性植物の昆虫耐性が著しく
高まるのである。したがって、他の点では作物学上望ま
しい遺伝子型の作物植物中に、広域スペクトル昆虫害虫
に対する耐性についてコードする特定遺伝子を移入させ
ることが、可能とならねばならない。 最近の事実によれば、プロテアーゼインヒビターは植
物栄養価及び昆虫消機能間の複雑な相互関係の一部に関
与していることを示している〔ブロードウェイ・アール
・エム（Brodway,R.M），ダッフィ・エス・エス（Duffe
y,S.S.），ピアス・ジ（Pearce,G.）、ライアン・シー
・エー（Ryan,C.A.）,1986年，植物プロティナーゼイン
ヒビター；草食性昆虫からの防御?Ent.Exp.Appl.第41
巻、第33−38頁〕。しかしながら、現在までのところ、
プロテアーゼインヒビターが植物中で発現した場合に実
際に昆虫耐性を高めるという決定的な証拠はなかった。 本発明は、マメ科植物トリプシンインヒビターポリペ
プチドの構成部分についてコードする組換えDNA分子に
関する。更に詳しくは、本発明は、ビグナ・ウングイク
ラタ（Vigna unguiculata）〔ササゲ（cowpea）；その
名称以外にも黒目エンドウ（black−eyed pea）、黒目
豆（black−eyed bean）、カフィル豆（Kaffir bea
n）、ヒンズーササゲ（Hindu cowpea）及びヤード−ロ
ング豆（Yard−long bean）として知られる〕由来トリ
プシンインヒビター遺伝子についてのコード配列を有す
る組換えDNAプラスミド、その製法、及び様々な昆虫害
虫種に対する耐性を高める目的でササゲトリプシンイン
ヒビター（CpTI）発現性を他の植物種に移入するという
その用法に関する。 以前の実験では、V.ウングイクラタ種子に存在するCp
TI量がブルチド甲虫（bruchid beetle）の攻撃に対する
V.ウングイクラタの耐性と関連していることを立証して
いた〔ゲートハウス・エー・エム・アール（Gatehouse,
A.M.R.），ゲートハウス・ジェイ・エー（Gatehouse,J.
A.），ドビー・ピー（Dobie,P.），キルミンスター・エ
ー・エム（Kilminster,A.M.），ボルター・デー（Boult
er,D.）,1979年，ビグナ・ウングイクラタにおける昆虫
耐性の生化学的基礎，ジャーナル・オブ・サイエンス・
オブ・フード・アンド・アグリカルチャー（Journal of
Science of Foodand Agriculture），第30巻，第948−
958頁；ゲートハウス・エー・エム・アール，ボルター
・デー,1983年，ブルチド甲虫カロソブルチュス・マカ
ラタス（Callosobruchus macalatus）の成長に対するサ
サゲ（ビグナ・ウングイクラタ）及び他のマメ科植物由
来トリプシンインヒビターの代謝拮抗作用の評価，ジャ
ーナル・オブ・サイエンス・オブ・フード・アンド・ア
グリカルチャー，第34巻，第345−350頁〕。V.ウングイ
クラタ由来の１種以上のトチプシンインヒビターの殺虫
有効量を昆虫に接触せしめる方法によって侵襲昆虫害虫
から植物を保護するという、V.ウングイクラタ中に天然
に存在するトリプシンインヒビターの用法は、米国特許
第4.640.836号明細書（1987年２月３日付許諾）に記載
されている。その特許明細書は、精製CpTIが以下の鱗翅
類害虫：即ち、ヘリオチス・ビレセンス（Heliothis vi
rescens）〔オオタバコガ幼虫〕；チロ・パルテルス（C
hilo partellus）〔斑点茎穿孔虫〕；ヘリオチス・アル
ミゲラ（Heliothis armigera）〔アメリカ蛾幼虫（Amer
ican bollworm）；及び鞘翅類害虫トリボリム・コンフ
サム（Tribolium confusum）〔フラワー甲虫（flour be
etle）〕に対して活性であると報告している。人工飼料
実験において昆虫害虫に対するCpTIの効果に関して公表
された情報は第１表で要約されている。本発明は、遺伝
子工学生物中においてCpTIの生産のために必要な遺伝情
報についてコードするDNA分子を提供する。 CpTI遺伝子を有するいずれの遺伝子工学作物植物も、
ヒト及び環境に対して安全でなければならない。CpTI遺
伝子は安全であることを示すいくつかの理由がある。 サザゲは世界の数か所における主食用作物である〔シ
ング・エス・アール，ラチー・ケー・オー,1985年，カ
ウピー・リサーチ，生産及び利用，ウィリー（Singh,S.
R.,Rachie,K.O.,1985,Cowpea research,production and
utilization,Wiley）〕。通常料理されるが、それは生
のままで食べることもできる。 更に、ヒト消化管（及び他の哺乳動物の消化管）にお
いて、タンパク質は数種の異なるタイプの酵素によって
分解される。CpTIペプシンによる不活性化に対して非常
に感受的であり（エー・ゲートハウス、未公表の結
果）、ラット給餌実験の予備データではCpTI含有食で飼
育されたラットが体重増加量を低下させないことを示し
た（デー・ボルター，未公表の結果）。 本発明の主目的は、標的植物種への移入を可能にし、
組換え植物の選択を容易化しかつそれら植物に移入され
た遺伝子の発現を可能にする、ベクター中にCpTI遺伝子
の完全コード配列を有する組換えプラスミド構造体を提
供することであって、かかる植物は組織内のCpTIポリペ
ブチドの存在によって昆虫害虫に対し高い耐性を有する
ように転換される。 本発明は、トリプシンインヒビター、好ましくはマメ
科植物、特にV.ウングイクラタ由来のトリプシンインヒ
ビター（ササゲトリプシンインヒビター又はCpTI）、又
はCpTIの性質に似た性質を有しかつ一般的化学基準によ
るとCpTI群の一つとして通常許容される十分程度の相同
性を有するタンパク質についてコードする構造遺伝子を
含んでなるDNA分子を提供する。 V.ウングイクラタのボーマン−バーグ（Bowman−Bir
k）型トリプシンインヒビターは、イオン交換クロマト
グラフィーにより分離可能な４種の異性体インヒビター
としてササゲ子葉中で発現せしめられる遺伝子の中位反
復群によってコードされている。４種すべての異性体イ
ンヒビターは、インビトロ酵素不活性化アッセイで調べ
た場合に、同様のトリプシン阻害活性を有している： ササゲの主な異性体インヒビターはf IVである。これ
らの遺伝子は、0.45M NaCl,0.045Mクエン酸ナトリウム
（３×SCC）中68℃においてCpTI完全鎖長cDNAプローブ
と交差ハイブリッド形式しうるに十分な相同性を有して
いる。〔タンパク質配列決定により明らかにされ（サモ
ア・アール・エッチ・エー（Sammour,R.H.A.）,1985
年，博士論文，ダーハム（Durham）大学，英国）、又は
CpTIcDNA配列決定により予測された〕f IV異性体インヒ
ビター一時配列の例は、第１図に示されている。V.ウン
グイラクタ類トリプシンインヒビターポリペプチドの他
の例は、プロテアーゼ阻害活性が失われていないこれら
配列の変異体である。 第１図は下記配列を示している： ａ） CpTI f IV異性体インヒビター（保護アミノ末
端、内部残基15、16番目及びカルボキシ末端は決定でき
なかった） ｂ） CpTI cDNA d4/6予想配列 ｃ） CpTI cDNA c3/2予想配列 配列はデイオフ（Dayof）〔タンパク質配列及び構造
の図解，第５巻,1972年，ナショナル・バイオメディカ
ル・リサーチ・ファンデーション（Nat.Biomed.Res.Fou
ndation），ワシントンD.C.,USA〕の単一文字コードで
示されている。 ササゲのトリプシンインヒビター遺伝子は、成熟過程
の終期に子葉中で発現せしめられる。したがって、ササ
ゲトリプトン阻害タンパク質は、成熟種子から単離され
ねばならない。これらのタンパク質における異常に高い
交差反応性はそれらを抗原性の乏しいものにしているた
め、後退の使用に依存した対応遺伝子の同定及び単離方
法は利用しえない。V.ウングイクラタ由来の主トリプシ
ン阻害剤のアミノ酸配列は、そのメッセンジャーRNAの
ヌクレオチド配列を予測するために利用された。このポ
リペプチドの４つの領域は、各残基がメッセンジャーRN
Aで２種以下の選択的コドンによりコードされうる、４
種以上の連続残基の連鎖からなる。このような領域は、
第２図に示されているように、すべてのコード可能性を
網羅しかつ問題の遺伝子に対して適度に特異的であるた
めに十分な鎖長をもつ混合配列オリゴヌクレオチドプロ
ーブの特定化にとって適切であることが判明した。 このようにして、V.ウングイクラタの“終期”子葉か
ら精製されたポリアデニル化RNAが単離された。 最初に、mRNAは慣用的逆転写反応によって相補的DNA
に複製される。二次鎖合成は、DNAポリメラーゼＩのク
レノウ断片を用いて、自己プライミングされる（self−
Primed）cDNA上で行なわれた。二重鎖cDNA中の末端ルー
プはS1ヌクレアーゼとの処理で除かれ、その分子末端は
クレノウ断片との“ポリッシング（polishing）”反応
により修復された。 配列５′−ｄ（GGGATCCC）の合成オクタヌクレオチド
BamH Iリンカーはポリッシングされたds（二重鎖）cDNA
と結合せしめられ、Bst I〔BamH Iのイソ制限酵素（iso
schizomer）〕で広範囲に消化された。結合したds cDNA
は、Bst Iで予め直鎖化されかつ（ベクター末端の自己
結合性を低下させるために）子牛腸ホスファターゼとの
処理により部分的に脱リン酸化されたプラスミドpBR322
に、T4 DNAリガーゼを用いて結合せしめられた。 この結合反応の生成物は、コンピテント大腸菌（Esch
erichia coli）株910をアンピシリン耐性（この特性は
プラスミドベクターによる）に形質転換させるために用
いられた。組換え体はテトラサイクリンに対する感受性
によって同定された（pBR322のテトラサイクリン耐性遺
伝子はBamH I部位へのDNA挿入により不活性化され
た）。 組換え体は、グランシュタイン及びホグネス〔グラン
シュタイン・エム及びホグネス・デー・エス,1975年，
プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オ
ブ・サイエンスUSA,第72巻，第3961頁（Grunstein,M＆H
ogness,D.S.,1975,Proceeding of National Academy of
Science USA 72,3961）〕の操作法に従い、第２図の領
域Ｃの配列に対して相補的な16種の14量体に相当する混
合された32P標識合成ヌクレオチド （２列目の塩基は上記ヌクレオチドにおいて代替塩基を
表わす）との現場での（in situ）コロニーハイブリッ
ド形成により、CpTI配列に関してスクリーリングされ
た。このプローブは約14％のみのクローンを標識したこ
とから、クローンの一部はトリプシンインヒビターメッ
セージから得られたものでないことが明確に示された。
しかしながら、プラスミドpAGC1含有の14量体陽性クロ
ーンは、ウィルスベクターM13mp9への導入後におけるBa
mH I部位中の挿入物のヌクレオチド配列決定及び確立さ
れたM13ジデオキシ鎖終結法を用いる配列決定により、
部分的CpTIメッセージを有していることが明らかに確認
された。この挿入物における唯一の長鎖オープン読取枠
から予測されるアミノ酸配列は、主CpTI一次配列及び他
のマメ化植物ボーマン−バーク型トリプシンインヒビタ
ーに関して公表された一次配列〔シモカワ・ワイ（Shim
okawa,Y.），アベ・オー（Abe,O.）及びクロミズ・ケー
（Kuromizu,K.）,1984年，マメ科植物二重ヘッド化（do
uble−headed）プロティナーゼインヒビター，ネーチャ
ー＆カルチャー（Nature ＆ Culture），第11巻，第39
−45頁〕と顕著な相同性を示している。その配列は、大
豆SB1遺伝子コード配列に関する公表配列の対応領域と6
5％の相同性を示した〔ハモンド・アール・ダブル（Ham
mond,R.W.）フォード・デー・イー（Foard,D.E.）及び
ラーキンス・ビー・エー（Larkins,B.A.）,1984年，大
豆のボーマン−バークプロテアーゼインヒビターについ
てコードする遺伝子の分子クローニング及び分析、ジャ
ーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Journa
l of Biological Chemistry），第259巻、第9883−90
頁〕。 プラスミドpAGC1は、第３図に示された配列からなる
コード配列183bpを含むCpTImRNAから得られる配列を有
している。この配列はCpTIのＣ末端側の半分についてコ
ードする。本発明でCpTIの完全コード配列を必要とする
ため、高効率cDNAクローニングプロトコールを用い、し
かも以下で概説されかつ第４図に示されたオリゴヌクレ
オチド及びpAGC1双方をプローブとして用いて、新しい
ライブラリーが作成された。 ササゲ子葉mRNAは、ヒト胎盤RNアーゼインヒビターの
存在下流転写酵素によってcDNAに複製された。二次鎖合
成は、RNアーゼＨの存在下無ヌクレアーゼDNAポリメラ
ーゼＩにより行なわれた。二重鎖cDNAの末端は、T4 DNA
ポリメラーゼ消化によりフラッシュ末端化された。反応
生成物は、制限エンドヌクレアーゼHinc IIで直鎖化さ
れかつ子牛腸ホスファターゼで脱リン酸化されたプラス
ミドpUC19にブラント末端結合された。この結合混合物
は、コンピテント大腸菌株JM83をアンピシリン耐性に形
質転換させるために用いられた。組換え体はYT−Amp−B
CIG寒天プレート上において白色コロニーとして検出さ
れ、選択されて、YT−Amp寒天上の複製ニトロセルロー
スフィルターにて増殖せしめられた。 pUSSRc3/2と命名されたこれら組換え体の一つは、以
下の事項によって、CpTIメッセージ配列の（ほぼ）完全
鎖長複製として確認された： ｉ） pAGC1のBamH I挿入物との現場コロニーハイブリ
ッド形成における強い交差ハイブリッド形成性 ii） 合成混合14量体に対する挿入断片の弱いけれども
陽性の交差ハイブリッド形成性 iii） pUSSRc3/2における挿入物の大きさは、pAGC1 Ba
mH I挿入物でプローブ処理されたササゲ子葉全RNAのノ
ザンブロット法により測定したところ、CpTI mRNAの大
きさ550±50ヌクレオチドと比較し、582bpと測定され
た。 iv） 挿入断片の配列は、確立された化学的配列決定法
〔マキサム・エー・エム（Maxam,A.M.）及びギルバート
・ダブル（Gilbert,W.）,1980年，相特異性化学的切断
による末端標識DNAの配列決定，メソッズ・イン・エン
ザイモロジー（Methods in Enzymology），第65巻，第4
99−560頁〕により決定された。その配列はpAGCの挿入
部に対してその鎖長全体にわたり完全に相同的であっ
た。その唯一の長鎖オープン読取枠から予測されるアミ
ノ酸配列は、成熟タンパク質に対応する領域全体にわた
り、マメ科トリプシン阻害剤に対して高度の相同性を示
した。その配列は、同相ATG−（メチオニン）−翻訳開
始コドンの５′側に数個の塩基対を延長させている。 プラスミドpUSSRc3/2は、第６図に示された配列を含
んでなる、プレカーサー（precursor）、成熟タンパク
質及び３′非翻訳領域の完全コード配列を含む、（ほと
んど）すべてのCpTI mRNAから誘導される配列を有して
いる。 プラスミドpUSSRd4/6は、異なる異性体インヒビター
の成熟タンパク質の完全コード配列を有しているが、天
然翻訳開始ATGコドンを欠く結果未知量のリーダーペプ
チド配列を欠いている。これは第７図に示された配列を
含んでなる。 CpTI配列は、大腸菌クローニングベクターpUC19か
ら、以下及び第５図で概説される植物質転換ベクターた
るアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacter
ium tumefaciens）Tiプラスミドに移された。 プラスミドpUSSRc3/2は制限エンドヌクレアーゼSca
I、Alu I及びXmn Iで消化され、ブラント末端化された5
50bpの長鎖断片が消化生成物のポリアクリルアミドゲル
電気泳動分離によって単離された。この断片は、完全Cp
TIコード配列、ATG翻訳開始コドンの５′側に集結20bp
及びTAA翻訳終結コドンの３′側に92bpを有していた。
この断片は、プラスミドpRok2のSma I部位とブラント末
端結合された。 プラスミドpRok2は、クローンcDNA配列が植物中に移
入されかつ構造的に発現されることを可能にする目的で
特にエム・ベバン（M.Bevan）博士及びテー・カバナフ
（T.Kavanagh）博士により発案されかつ組立てられたア
グロバクテリウム・ツメファシエンスTiプラスミド二成
分系ベクターである。（なお、「構造的に発現」とは、
遺伝子が植物のあらゆる部分において発現し、この発現
が植物の発育を通して行われることを意味する。）これ
は、翻訳終結シグナル及びmRNAポリアデニル化シグナル
を含むアグロバクテリウムＴ−DNAノパリンシンターゼ
遺伝子の250bp断片及びカリフラワーモザイクウィルス
（CaMV）35S RNAプロモータを有するCaMVゲノムの800bp
断片からなる発現カセットの左右Ｔ−DNAボーダー領域
間への挿入によって、Bin19〔ベバン・エム・ダブル,19
84年，植物形質転換用の二成分系アグロバクテリウムベ
クター、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic
Acids Research），第12巻、第8711−21頁〕から誘導さ
れた。これらの成分は二成分系Ti発現ベクターpRok1
〔バールカンベ・デー・シー（Baulcombe,D.C.）サンダ
ース・エス・アール（Saunders,S.R.），ベバン・エム
・ブイ，マヨ−エム・エー（Mayo,M.A.）及びハリソン
・ビー・デー（Harrison,B.D.）,1986年，形質転換植物
の核ゲノム由来成分学的活性ウィルスサテライトRNAの
発現，ネーチャー（Nature），第321巻，第446−９頁〕
に組込まれたが、pRok2はそれと比較してプロモーター
及びターミネーター断片間にポリリンカークローニング
部位を有している点で主に異なっている。このポリリン
カーはSma I部位を有しており、CpTIcDNA断片はその部
位に挿入された。これらの配列は、形質転換植物細胞中
において、挿入物の10bp上流に構成性翻訳開始部位及び
挿入物の200ヌクレオチド下流に転写ポリアデニル化部
位を与える。 pRok−CpTI構造体はコンピテント大腸菌株MC1022に組
込まれてクローニングされ、形質転換体はそれらのカナ
マイシン耐性によって選択された。構成体の同一は、各
クローンからのプラスミドDNA小試料（mini−prep）の
制限分析によって確認された。クローンpRok−CpTI＋５
は、CpTIポリペプチド発現のために下記のように正しい
向きでCpTI挿入物を有していた： CaMV−PROM−５′−CpTI−３′−NOS−TERM クローンpRok−CpTI−２は下記のように逆方向でCpTI
挿入物を有しており、コントロールとして機能した： CaMV−PROM−３′CpTI−５′−NOS−TERM Ｔ−DNA（Ｌ）/NOS−NEO/CAMV−PROM:CpTI:NOS−TERM
/T−DNA（Ｒ）構造体は、TiプラスミドpAL4404を有する
アグロバクテリウム・ツメファシエンスLBA4404、pRok
−CpTI＋５もしくはpRok−CpTI−２を有する大腸菌HB10
1及び移動性プラスミドpRk2013を有する大腸菌HB101間
の三種親細胞融合体中のアグロバクテリウム・ツメファ
シエンスTiプラスミドに導入された。 トランス接合個体は、最小寒天プレート中カナマイシ
ン，ストレプトマイシン及びリフアマイシン存在化30℃
で増殖しうる能力によって選択された。非耐性細菌の不
存在を確実化するため、耐性コロニーは２回以上選択プ
レート上で線状接種された。 Tiプラスミド含有CpTI＋５及びCpTI−２を有するアグ
ロバクテリアは、下記及び第５図で説明されるようなニ
コチアナ・タバクム（Nicotiana tabacum）〔cv.サムス
ン（Samsun）NN〕及びN.プルムバギニホリア（N.plumba
ginifolia）の葉片を形質転換させるために用いられ
た。形質転換体は、構造体中のNOS−NEO遺伝子から付与
されたカナマイシン耐性によって選択された。形質転換
植物は、根誘導性カナマイシン含有寒天培地に移すこと
により、小苗状（shootlet）から再生された。根付いた
植物は、シェラー（Sherer）栽培室内のパーライト／培
養土ポット中で成長せしめられた。 植物の昆虫耐性は、ヘリオチス・ビレセンスの幼虫を
各植物に寄生させて、植物に生じる損傷の程度並びに経
時的な昆虫の成長性及び生存性を調べることにより試験
した。H.ビレセンスは、米国においてワタ及びタバコ双
方の産業上重要な害虫であることから使用された。生後
24時間以内の体長１〜2mmの幼虫が用いられた。 CpTI＋５構造体で形質転換された植物に関して調べら
れた昆虫からの攻撃に対する耐性レベルは、コントロー
ル植物の場合とほどんど同様である（第２表）。しかし
ながら、個々の植物に関しては、５例のCpTI＋５形質転
換体（特に、N.タバクム＋5/5、＋5/21、＋5/D4;N.プル
ムバギニホリア＋5/T104及び＋5/T109）のうち約１つ
が、H.ビレセンス幼虫による損傷に対する耐性に関して
明確かつ一貫した増加傾向を示し、しかも植物において
昆虫の生存性及び成長性を低下させた（第４表）。 これらの耐性植物は、免疫結合ELISAアッセイにおい
てCpTI様タンパク質を発現していることが証明された。
抗CpTI抗血清はウサギから産生され、二次抗体たる市販
β−ガラクトシダーゼもしくは西洋ワサビペルオキシダ
ーゼ結合ヤギ抗ウサギIgG及び抗体結合量測定用に適し
た発色性気質を用いたCpTI＋５及びCpTI−２植物由来凍
結乾燥葉物質のpH9.5の50mMトリス/HClに抽出物に対す
る確立したELISA及びドット免疫結合法において使用さ
れた。すべての耐性植物からの抽出物がその中に検出可
能レベルのCpTI抗原を含有していたが、一方コントロー
ル（CpTI−２）植物からの抽出物は含有していない。ト
リプシン阻害性は、トリプシン活性阻害アッセイによっ
て、耐性植物からの葉抽出物硫酸アンモニウム分画中で
直接証明された。観察されたCpTI活性レベルは、人工飼
料中に配合された場合代謝拮抗性であることが証明され
たレベルと匹敵する。 １ ６例（N.タバクム）及び２例（N.プルムバギホリ
ア）の植物に対する全損傷を１（最少の損傷）〜５（広
範囲の損傷）の尺度で個々に評価した場合の平均値 ２ 頂部から３番目の成熟葉における測定 ３ 出生したばかりの８匹の幼虫が植物を侵襲したとき
から７日目 ４ 精製CpTI f IV（標準）ng当量数/100μｌ葉抽出物
として表示。ELISA法は主に抗血清の低い交差反応性の
故に存在するトリプシン阻害剤（TI）の絶対量を過小評
価していることに注意せよ。 前記ベクターで形質転換された植物の大部分は、それ
らのゲノム中に安定的に挿入されたCpTI遺伝子及びNPTI
Iマーカー遺伝子双方を有するDNA断片を含有するように
なるであろう。このことは、カナマイシン耐性に関する
分離分析及びサザンサンブロット実験の結果から確認さ
れた。 形質転換によって獲得された新しい表現型特性は、古
典的なメンデル遺伝学に従い当然遺伝される。最初の形
質転換体は挿入が起きた各遺伝子座において半接合状態
であると予想され、特性はメンデルの優性形質として発
現することが期待される。新しい特性の安定的発現を確
認するために、形質転換植物のS1（自家受粉により発生
した植物の第一世代）継代物がカナマイシン耐性及びCp
TI発現に関して分析された。 上記方法に対するもう１つの方法はCpTIコード配列を
得るために、下記変更選択肢の一部又は全部を組入れて
用いることができた。 ｉ） CpTIポリペプチドの他の領域についてコードする
合成オリゴヌクレオチドが、前記混合14量体（領域Ｃ）
に加えて又はその代わりに用いることができた。 ii） 部分的又は完全鎖長cDNAクローン（又は合成オリ
ゴヌクレオチド）は、V.ウングイクラタゲノムDNAから
製造された組換えゲノムDNAライブラリーからのCpTI遺
伝子群のうちいずれかを含むゲノム配列の複製を得るた
めのプローブとして使用することができた。 iii） CpTI一次配列は、CpTI群のいずれかについてコ
ードする化学的合成ヌクレオチド配列を特定化させるた
めに使用することができた。 以下では、本発明について説明している。 （１）ポリアデニル化RNAの単離 種子を成熟に近づいている市販の様々なササゲ〔カリ
フォルニア人黒目（Californian black−eye）〕から採
取した。種皮及び胚を子葉から無菌的に取除き、後者を
液体窒素中で凍結した。 凍結子葉10gをDDT 0.2g含有試験管中で−20℃まで加
温し、そこに100℃でpH9.0の30mM EDTA、１％SDS含有0.
2Mホウ酸ナトリウム26mlを加えた。混合物をMk5ポリト
ロン（Polytron）中で30秒間混合し、次いで37℃で１時
間プロティナーゼK0.5mg/mlと共にインキュベートし
た。2M KCl 2mlを０℃で加え、混合物を遠心含離した。
上澄を2M LiClとし、不溶性物質を４℃で一夜沈殿させ
た。 沈殿物を遠心含離によりペレット化し、０℃において
LiCl 25mlで２回洗浄し、0.2M酢酸カリウムに再懸濁
し、エタノールに沈殿させた。 沈殿物をpH7.4の10mMトリスHCl、1mM EDTA 8mlに再懸
濁し、同量のフェノール／クロロホルム／イソアミルア
ルコール（25:25:1）で２回タンパク質除去した。最終
水相をエタノール沈殿させ、RNAをアビブ及びレーダー
〔アビブ・エッチ（Aviv,H.）及びレーダー・ピー（Led
er,P.）,1972年，オリゴチミジル酸セルロースでのクロ
マトグラフィーによる生物学的活性グロビンmRNAの精
製、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー
・オブ・サイエンスUSA,第69巻，第1408−12頁〕により
記載されているオリゴ（dT）−セルロースカラムクロマ
トグラフィーによるポリアデニル化RNAの単離前に0.2M
酢酸カリウムから更に１回沈殿させた。 （２）クローニング用cDNAの製造 ２つの択一的なcDNA合成法が用いたれた。第一の方法
ではpAGC1中でクローニングされかつしかる後CpTI遺伝
子配列用のプローブとして使用される部分的cDNA配列を
製造したが、一方第二の高効率法ではほぼ完全鎖長のcD
NAを製造した。両方法とも配列についてコードするCpTI
を製造しうるため、いずれも記載されている。前者の方
法が最初に詳述されている。 （３）cDNAIの合成 子葉ポリＡ＋RNA 5μｇの逆転写は、トレーサーとし
ての50μCi3H−dCTP〔50μCi/mM;ラジオケミカル・セン
トレ（Radiochemical Centre），アメルシャム（Amersh
am），英国〕、各1mMのdATP、dCTP、dGTP及びdTTP、5mM
DTT、1mg/mlオリゴ（dT）、50単位ヒト胎盤リボヌクレ
アーゼインヒビター、pH8.0の50mMトリスHCl、10mM MgC
l2並びに100単位/mlAMV逆転写酵素を含有した反応混合
中42℃で２時間インキュベートすることにより行なわれ
た。反応を終了させ、100℃で３分間加熱しかつ０℃で
冷却することにより鎖を分離した。変性タンパク質を遠
心分離により除去した。 （４）二次鎖合成 逆転写反応上澄45μｌをpH6.9の100mM HEPES、20mM M
gCl2、70mM KCl、5mM DTT、各1mMのdATP、DCTP、dGTP及
びdTTP並びに25単位DNAポリメラーゼＩ大（クレノウ）
断片の50μｌと共に15度で４時間インキュベートした。
反応混合物をフェノール及びクロロホルムで抽出し、高
分子両反応生成物をpH7.4の10mMトリスHCk、50mM NaC
l、1mM EDTA含有の10ml層容量セファデックス（商標
名）Ｇ−50−Ｓカラム上でのカラムクロマトグラフィー
により分離した。 （５）クローニング用二重鎖DNA末端の処理 上記カラムからの溶出分画を0.3M NaCl、30mM NaAc p
H4.5、3mM ZnCl2含有の1ml容器に調製し、S1ヌクレアー
ゼ250単位と共に37℃で30分間インキュベートして、末
端ループを除去した。EDTA5mMまで加え、混合物をフェ
ノール及びクロロホルムで２回抽出し、アルコール沈殿
させ、50mMトリスHCl pH7.8、10mM MgCl2、10mM 2−メ
ルカプトエタノール、各0.25mM dATP、dCTP、dGTP及びd
TTPの20μｌに再懸濁し、DNAポリメラーゼ大断片５単位
で15℃で30分間インキュベートして、末端を修復した。 配列５′−ｄ（GGGATCCC）の合成BamH Iリンカー〔BC
L〕を１μｇリンカー、50mMトリスHCl、pH7.8、10mM Mg
Cl2、10mM 2−メルカプトエタノール、1mM ATP及び11単
位ポリヌクレオチドキナーゼ含有の10μｌ容量中で加リ
ン酸反応させた。これを25℃で４時間インキュベートし
た。 “ポリッシングされた”二重鎖cDNA及びキナーゼ処理
されたリンカーを混合し、容量をキナーゼ反応緩衝液で
50μｌに調整し、T4DNAリガーゼ５単位と共に15℃で一
夜インキュベートした。 リンカー結合反応を80℃で５分間のインキュベートに
よって終結させた。反応容量を100mMトリスHCl pH7.4、
8mM MgCl2含有の200μｌに調整し、制限エンドヌクレア
ーゼBst I 10単位と共に37℃で８時間インキュベートし
た。 反応混合物は、セファデックスＧ−50−Ｓの10ml層容
量カラムに供し10mMトリスHClpH7.4、50mM NaCl、1mM E
DTAで溶出させる前に同量のフェノールで２回及び同量
のクロロホルムで２回抽出することによってタンパク質
を除去した。このカラムからの溶出分画をベクタープラ
スミドへの結合用に直接使用した。 （６）ベクターとしてpBR322を用い、大腸菌910に組込
むクローニング 超らせんプラスミドpBR322〔ギブコ（GIBCO）−BRL,
アクスブリッジ（Uxbridge），英国〕を制限エンドヌク
レアーゼBst Iとの処理で直鎖化し、確立されたプロト
コールに従い（ベクター末端の自己結合性を低下させる
ために）子牛腸アルカリホスファターゼとの処理により
部分的に脱リン酸化した。 66mMトリスHCl pH7.6、6.6mM MgCl2、10mM DTT、0.5m
M ATPの20μｌ中に処理済ベクター約100ng及び“リンカ
ー結合”二重鎖cDNA約50ngを含有する個々の結合反応液
をT4 DNAリガーゼ２単位と共に15℃で一夜インキュベー
トした。 結合用混合物の３μｌアリコートを0.1M CaCl2で50μ
ｌ容量まで希釈し、標準的方法に従い〔ダブル・ブラマ
ー教授（Prof.W.Brammar），生化学部，ライセスター
（Leicester）大学，英国から入手した〕CaCl2処理大腸
菌株910、バッチ100μｌを形質転換させるために用い
た。 アンピシリン耐性コロニー約800個（50μg/ml）を１
回の形質転換当たりで得た。アンピシリン又はテトラサ
イクリン（50μg/ml）含有寒天プレート上でこれらを複
製培養したところ、これらの一部25％がアンピシリン耐
性テトラサイクリン感受性組換え体であった。 組換えコロニー360個をニトロセルロースフィルター
上で培養し、現場ハイブリット形成によるスクリーニン
グ用にレプリカフィルターがハナハン・デー（Hanahan,
D.）及びメセルソン・エム（Meselson,M.）〔1980年，
プラスミドスクリーニング及び高コロニー密度，ジーン
（Gene），第10巻，第63−７頁〕による記載に従いそれ
から調製された後、−80℃で貯蔵した。 （７）CpTIコード配列に関する組換え体のクリーニング CpTI cDNA配列としての絶対的特異性をもつシグナル
プロープは入手できなかったため、かかる配列を有する
クローンが下記に関する一連の試験に基づき同定され
た： ｉ） 子葉RNA中で予想されるCpTI mRNAの豊富性 ii） CpTI f IVポリペプチドのＣ領域のコード可能部
分と相補的な混合合成14量体オリゴヌクレオチドとのハ
イブリッド形成 iii） 完全鎖長CpTI cDNAに関して予想される場合とほ
ぼ同様の挿入配列の大きさ iV） トリプシンインヒビター（の一部）に関するコー
ド部分を有していることを確認するための挿入配列の直
接的決定ハイブリッド形成のために用いられる細菌コロ
ニーを担持したニトロセルロースフィルターを最初にク
ロラムフェニルコール250μg/ml含有寒天プレート上で1
2〜16時間インキュベートし、プラスミド複製数を増幅
させた。フィルターをプレートから取出し、連続的に３
分間15％SDS;5分間0.5M NaOH、1.5M NaCl;5分間1Mトリ
スHCl、pH8.0、1.5M NaCl及び５分間で２回３×SSC（１
×SSC＝0.15M NaCl、0.015Mクエン酸ナトリウム）に浸
漬されたワットマン（Whatman）3MM紙の一連のパッド上
にコロニーが上にくるようにしておいた。フィルターを
風乾し、減圧オーブン中80℃で２時間ベーキング（baki
ng）した。 CpTI mRNAは、子葉mRNA中で適度に豊富に存在してい
るが、その量はタンパク質量を多少なりとも反映してい
ることから全量の１％を占めていると予想された。ササ
ゲ子葉ポリＡ＋RNA2μｇを前記（３）で記載したように
32P−dCTP 50μCi（410Ci/mM）の存在下逆転写によって
放射性同意元素標識した。高分子量反応生成物を、pH7.
4の10mMトリスHCl、1mM EDTA中でのセファデックスＧ−
50−Ｓカラム操作により回収した。32P−標識cDNAを、
３×SSC、0.1％SDS、各0.02％の牛血清アルブミン（BS
A）、ポリビニルピロリドン（PVP）及びフィコール（Fi
coll）、250μg/ml超音波処理変性サケ精子DNA、100μg
/mlポリアデノシンの10ml中65℃で１時間前インキュベ
ートした。フィルターを３×SSC、0.1％SDS中これを４
回交換して各々65℃で30分間、次いで３×SSC、0.1％SD
S、各0.02％のBSA、PVP及びフィコール、250μg/ml超音
波処理変性サケ精子DNA中65℃で４時間前ハイブリッド
形成させた。全処理プローブを脱水されたフィルターに
加え、65℃で16時間インキュベートした。フィルターを
脱水し、表面積1cm当り約2mlの３×SSC、0.1％SDSで２
回室温で５分間、３×SSC、0.1％SDSで３回65℃で40分
間、２×SScで２回室温で５分間連続的に洗浄し、次い
で乾燥し、室温で19時間フジ（Fuji）RX X線フィルムに
露出させて写真撮影した。 コロニーの一部30〜40％は、それらがプローブ中で中
度〜高度の反復性のある配列を有している場合に予想さ
れるオートラジオグラフシグナル強度を示した。 混合オリゴヌクレオチドの慣例的な合成が、ジェネッ
クス社（Genex Corporation）により全部で16種の14量
体： ５′−dCC〔A/G〕CA〔A/G〕AA〔A/G〕CA〔T/C〕TGに関
して行なわれた。配列は、Ｔ、Ｔ＋Ｃ＋Ｃ、Ａ＞Ｃ、Ａ
＋Ｇ及びＧに関して特異的な反応を用いる確立された化
学的修飾配列決定法により調べた。オリゴヌクレオチド
は、確立された方法でポリヌクレオチドキナーゼを用
い、32P−ATPとの反応により５′末端において放射性同
位元素標識された。 ニトロセルロースフィルターを３×SSC、0.1％SDS中
で４回65℃で３分間、次いで６×SSC、0.1％SDS、各0.0
2％のBSA、PVP及びフィコール、1mM EDTA、125μg/mlサ
ケ精子DNA中45℃で８時間前インキュベートした。フィ
ルターを同様の混合物中37℃で21時間標識14量体とハイ
ブリット形成させた。フィルターを６×SSC、0.1％SDS
で４回25℃で10分間、次いで２回39℃で５分間洗浄し
た。それらを６×SSCで洗浄し、乾燥し、単一デュポン
・クロネックス（Dupont Cronex）増強スクリーンで21
時間前−80℃において前フラッシュをあびたフジTXフィ
ルムに露出させた。組換え体の一部14％がバックグラウ
ンド上で明らかに標識されていた。 プラスミドDNAは、前記２つの基準によれば陽性のCpT
I cDNAである24種の組換え体培養物10mlから製造した。
これらプラスミド中に挿入されたDNA配列の大きさは、
アガロースゲル電気泳動におけるBamH I制限断片の移動
性から決定された。挿入物は約400〜1800塩基対の大き
さであった。CpTI cDNAは約550bp以下と予想されていた
ため、鎖長がそれ以下の挿入物を有する４個のクローン
を配列分析によって選択した。これらクローンのBamH I
挿入物を一本鎖バクテリオファージベクターM13mp9のBa
mH I部位に導入し、確立された方法を用いてて、35S−
チオ−dATPでジオキシ鎖終結させることにより配列決定
した。得られた配列及びそれらの相補物は、CpTI f IV
の一次配列、他のマメ化植物ボーマン−バーク型トリプ
シンインヒビターの一次配列と相同的な生成物を生成し
うるコード能力、及び公表された大豆ボーマン−バーク
トリプシン組成害剤遺伝子配列〔ハモンド・アール・ダ
ブル（Hammond,R.W.），フォード・デー・イー（Foard
e,D.E.）及びラーキンス・ビー・エー（Larkins,B.
A.）,1984年，大豆ボーマン−バークプロテアーゼイン
ヒビターについてコードする遺伝子の分子クローニング
及び分析，ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミス
トリー，第259巻，第9883−90頁〕との相同性に関して
試験された。 プラスミドpAGC1は上記CpTIの部分的cDNA配列を有し
ていた。プラスミドpUSSRa11/7は同一のコード配列を有
していたが、５′末端において更に６個のヌクレオチド
を欠いていた。他の２つのプラスミドは、CpTIコード配
列とは無関係の未確認配列を有していた。 （８）高能率cDNA合成 cDNA改良合成法が、完全CpTIコード配列をもつ組換え
体を得るために用いられた。この方法は完全鎖長cDNAを
製造する可能性が高い。その理由は、二次鎖合成の末端
ループプライミングには依存せず、しかもS1ヌクレアー
ゼ消化の必要性も不要であるからである。 ササゲ子葉mRNA 5.4μｇを50mMトリスHCl,pH8.3;10mM
MgCl2;10mM DTT;4mMピロリン酸ナトリウム；各1.25mM
のdATP、dCTP、dGTP及びdTTP;100μg/mlオリゴ（dT） 1
2−18;120単離AMV逆転写酵素;40単位ヒト胎盤RNアーゼ
インヒビター及び２μCi32P−dCTP（トレーサ）の40μ
ｌ中43℃で80分間インキュベートした。反応液を溶解氷
に移しかつEDTA 20mMとすることにより反応停止させ、
次いでフェノール／クロロホルム抽出によって２回タン
パク質除去した。核酸を、酢酸アンモニウムで2Mかつ高
度精製カキ（oyster）グリコーゲン（担体として）で１
μg/μｌに予め調製された水相からエタノール沈殿させ
た。ペレット化された核酸を2M酢酸アンモニウムから際
沈殿させ、水10μｌに再懸濁させた。 一次鎖合成生成物を、20mMトリスHCl,pH7.5;100mM KC
l;10mM硫酸アンモニウム;5mM MgCl2;0.15mM NAD;50μg/
ml無ヌクレアーゼBSA;40μM dATP、dCTP、dGTP及びdTT
P;8.5単位/ml大腸菌RNアーゼH;230単位/mlDNAポリメラ
ーゼI;10単位/ml大腸菌DNAリガーゼ含有の全容量35μｌ
中で12℃１時間次いで22℃で更に１時間インキュベート
した。反応を終了させ、生成物を前記反応と同様に処理
した。一次鎖において残存する３′突出部分を除去し、
二重鎖cDNAを33mMトリス酢酸;pH7.9;66mM酢酸カリウム;
10mM酢酸マグネシウム;0.5mM DTT;dTTP;2.5単位T4 DNA
ポリメラーゼの25μｌ中12℃で１時間インキュベートし
た。反応生成物を上記のように処理した。 （９）ベクターとしてpUC19を用い大腸菌JM83に組込む
クローニング 超らせんプラスミドpUC19（ギブコ−BRL,アクスブリ
ッジ，英国）を確立されたプロトコールに従い、制限エ
ンドヌクレアーゼHinc IIとの処理で直鎖化し、子牛腸
ホスファターゼとの処理で脱リン酸化した。 66mMトリスHCl,pH7.5;6.6mM MgCl;10mM DTT;0.5mM AT
P及び２単位T4 DNAリガーゼの20μｌ中処理ベクター約1
00ng及び二重鎖cDNA約20ngを含有したブラント末端結合
反応液を４℃で一夜インキュベートした。結合反応液を
酢酸アンモニウム2Mに調製し、エタノール沈殿させた。
それらを0.1M CaCl210μｌに再溶解し、確立された方法
に従いコンピテント大腸菌JM83〔ジェイ・メッシング博
士（Dr.J.Messing），生化学部，ミネソタ大学，米国か
ら入手した〕バッチ100μｌを形質転換させるために用
いた。組換え体をYT−BCIG−アンピシリン−寒天プレー
ト上で白色コロニーとして選択した。283個の組換え体
コロニーをニトロセルロースフィルター上でレプリカ培
養した。 （10）CpTIコード配列に関する組換え体のスクリーニン
グ この段階において、pAGC1挿入物及び合成14量体オリ
ゴヌクレオチド双方との交差ハイブリッド形成は、CpTI
cDNA配列識別上の特徴をなすと考えられた。組換えク
ローン由来DNAを上記（セクション７）のようにニトロ
セルロースフィルターに固定した。pAGC1挿入物をpAGC1
のBamH I制限断片の２％アガロースゲル電気泳動分離に
よって単離し、市販ニック−トランスレーション（nick
−translation）キットを用いてニックトランスレーシ
ョンにより32P−dCTPで標識した。合成14量体を前記の
ようにポリオヌクレオチドキナーゼを用いて32P−標識
化させた。コロニーフィルターとのハイブリッド形成は
前記のように行なったが、厳重さを要する最後の洗浄は
pAGC1挿入物プローブの場合が65℃で２×SSC、合成オリ
ゴヌクレオチドの場合が39℃で６×SSCにより行なわれ
た。 プラスミドpUSSRc3/2はpAGC1挿入物と非常に強くかつ
14量体とはそれよりも弱くハイブリッド形成したが、一
方pUSSRd4/6は14量体と非常に強くかつpAGC1挿入物とは
それよりも弱くハイブリッド形成した。プラスミドDNA
を塩化セシウム勾配下これらのクローンから精製し、確
立した操作法に従い制限地図を作成した。挿入断片のヌ
クレオチド配列を化学的装飾DNA配列決定法により調べ
た。 プラスミドpUSSRc3/2は、pAGC1で前記例示されたCpTI
異性体インヒビターに関する事実上完全鎖長のcDNA配列
を有していた。プラスミドpUSSRd4/6は、５′−リーダ
ー配列の一部を欠く異性体インヒビターf IVと一層関連
した別のCpTI異性低インヒビターの成熟タンパク質に関
する完全コード配列有したcDNA配列を含んでいた。 （11）アグロバクテリウムBIN発現ベクター中へのpUSSR
c3/2 CpTI配列の導入 pUSSRc3/2 DNA 10μｇを33mMトリス酢酸,pH7.8;66mM
酢酸カリウム;10mM酢酸マグネシウム;4mMスペルミジン
及び0.5mM DTT（TA緩衝液）中制限エンドヌクレアーゼA
lu I、Sca I及びXmn Iで消化した。完全CpTIコード配列
を有する生成した唯一の552bp断片を消化物の６％アク
リルアミドゲル電気泳動分離により精製した。ベクター
プラスミドpBok〔エム・ベバン博士（Dr.M.Bevan），プ
ラント・ブリーディング・インスティテュート（Plant
Breeding Institute）ケンブリッジ，英国から提供され
た〕を制限エンドヌクレアーゼSma Iで直鎖化し、子牛
腸ホスファターゼで脱リン酸化し、上記550bp断片にブ
ラント末端結合させた。結合反応物は、大腸菌株MC1022
（上記エム・ベバン博士）をカナマイシン（50μg/ml）
耐性に形質転換させるために直接使用した。 プラスミドDNAを各形質転換コロニー培養物10mlから
調製し、制限地図作成により挿入断片の独自性及び向き
についての分析した。正しい向きをもつ挿入物のクロー
ン、即ち CaMVプロモーター−５′CpTIコード配列３′−NOSタ
ーミネーターは pRokCpTI＋（クローンNo.）と命名された。誤った向き
をもつクローン、即ち： CaMVプロモーター−３′CpTIコード配列５′−NOSタ
ーミネーターは pRokCpTI−（クローンNo.）と命名された。 （12）アグロバクテリウム・ツメファシエンスへの導入 下記の一夜培養物10mlを調製した： 30℃における栄養ブロス＋ストレプトマイシン500μg
/ml＋リファマイシン100μg/ml中のアグロバクテリウム
・ツメファシエンス株LB4404（上記エム・ベバン博
士）； 37℃におけるＬ−ブロス＋カナマイシン50μg/ml中の
pRockCpTI＋５又はpRokCpTI−２を有する大腸菌株MC102
2; 37℃におけるＬ−ブロス＋ストレブトマイシン500μg
/ml＋リファマイシン100μg/ml中のpRK2013（上記エム
・ベバン博士）を有する大腸菌HHB101。 各200μｌのアグロバクテリウム起動性（mobilizin
g）株及びCpTI含有株の１種を混合し、Ｌ−寒天プレー
ト上で培養し、30℃で一夜インキュベートした。細菌培
養物をpH7.0のトリスHCl、10mM MgCl2の5ml中に懸濁
し、その一部をストレプトマイシン（500μg/ml）、リ
ファマイシン（100μg/ml）及びカナマイシン（50μg/m
l）含有最小寒天プレート上で培養し、30℃で２日間イ
ンキュベートした。これら３種の抗生物質に対するコロ
ニーの耐性は、同様の選択プレート上で更に２回各コロ
ニーを再培養することによって一層強固にされた。 （13）ニコチアナ・タバクム及びニコチアナ・プルムバ
ギニホリアへのCpTI遺伝子の導入 葉片を、純培養N,タバクム〔変種（var.）サムスン〕
及びN.プルムバギニホリア〔インスティテュト・ナショ
ナル・デ・レシェルシェ・アグロノミク（Institut Nat
ional de Recherche Agronomique），ヴェルサイユ，パ
リ，フランスから得られた名称のない二ゲノム性半数体
変種〕植物の葉から打ち抜き、Ti−RokCpTIプラスミド
構造体を有するA.ツメファシエンスの一夜培養物と共に
インキュベートした。葉片をカルベニシリン（500μg/m
l）及びカナマイシン（100μg/ml）の存在下公知の方法
に従い苗条再生培地プレート上に乾燥ブロットし、移し
替えた〔フレリー・アール・テー（Fraley,R.T.），ロ
ジャース・エス・ジー（Rogers,S.G.）、ホーシュ・ア
ール・ビー（Horsch,R.B.）．サンダース・ピー（Sande
rs,P.），フリック・ジェイ（Flick,J.），アダムス・
エス（Adams,S.），ビットナー・エム（Bittner,M.），
ブロント・エル（Brond,L.），フィンク・シー（Fink,
C.），フライ・ジェイ・イー（Fry,J.E.），ガルッピ・
ジー（Galluppi,G.），ゴールドバーグ・エス（Goldber
g,S.），ホフマン・エヌ・エル（Hoffman,N.L.），ウー
・エス（Woo,S.），植物細胞中における細菌遺伝子の発
現,1983年，プロシーディング・オブ・ナショナル・ア
カデミー・オブ・サイエンスUSA,第80巻，第4803−７
頁；ホーシュ・アール・ビー（Horsch,R.B.），フライ
・ジェイ・イー，ホフマン・エヌ・エル，アイヒホルツ
・デー（Eichholtz,D.）ロジャース・エス・ジー，フリ
ーリー・アール・テー,1985年，遺伝子を植物中に組込
んで形質転換させるための簡単かつ一般的な方法，サイ
エンス（Science），第227巻，第1229−31頁〕。カナマ
イシン耐性小苗条をカルベニシリン及びカナマイシン含
有の根誘導培地に移した。個々の根付いた植物の複製を
苗条栽培により得た。十分に根付いた小植物を50:50培
養土及びパーライト中に植え、日光下25℃で16時間シェ
ラー栽培室内で成長させた。 植物は、成長性、成長率、開花時間、種子生育性等の
表現型に関して正常であった（第３表参照）。 （14）形質転換植物の昆虫耐性に関するバイオアッセイ ヘリオチス・ビレセンス（f.）〔鱗翅類；ノクツイダ
エ（Noctuidae）〕のさなぎ、即ちオオタバコガ幼虫又
はトマト食い虫（tomato budworm）USDA〔ブラウンスビ
ル（Brownsville），テキサス，米国〕から入手した。
英国到着時、飼育物は１日の日光照射時間13時間で25℃
において維持されていた。幼虫段階ではアルファルフ
ァ、インゲンマメ肉、小麦麦芽並びに必須のビタミン類
及び無機物類含有の寒天基礎飼料で飼育され、成虫段階
ではビタミン補充ハチミツ溶液で飼育された。 N.タバクムの場合には約12cm長及びN.プルムバギニホ
リアの場合には約8cm長の植物が、栽培室中の個々の密
閉された植物育生所内に植えられた。これらに、生後12
〜24時間のH.ビレセンス幼虫８匹を寄生させた（これら
の条件下におけるコントロール植物上で幼虫生存性に関
して、８匹というのは最適数であることが発明した）。
植物上で７日目に、すべての生存幼虫を取除き、酢酸メ
チルで麻酔し、ブーアン（Bouin's）固定液で保存し、
測定した。植物に対する損傷は、視覚上の損傷に関して
任意的な１〜５の段階に植物をランク付けし、かつ特定
の葉（頂部から３番目の成熟葉，通常最も損傷が大き
い）において食べられた範囲を測定することによって評
価した。この実験結果は第２表に示されている。個々の
植物においてCpTI量及び昆虫生存率％を示すデータは第
４表に示されている。 昆虫に対して中度〜高度の耐性を示す植物（数本のコ
ントロール植物と共に）、第一令又は第二令の幼虫で侵
襲される次の実験で使用した。 クローン複製植物におけるH.ビレセンスでの摂食実験 N.タバクム形質転換体＋5/5、＋5/21及び−2/8をさし
木により複製し、カナマイシン含有寒天中各群８〜16本
の植物を根付かせた。これらを約12cm長となるまで培養
土中で成長させ、次いで前述のように密閉された植物育
生所内で植物１本につき出生したばかりの８匹のH.ビレ
センス幼虫を寄生させた。７日後生存昆虫を取り除き
（但し、長期間にわたりモニターされている数本の植物
を除く）、昆虫生存数及び成長性を前記のように調べ
た。植物に対する損傷は、サイトシステムズ社（Sights
ystems Ltd.,ニューベリー，英国）市販の“VIP"画像ア
ナライザー及びソフトウェアを用いる特定葉の画像分析
により、食べられた葉の％として評価した。 結果は第５表に要約されている。H.ビレセンス幼虫
は、CpTI発現形質転換体＋5/5及び＋5/21上において著
しく高い死亡率及び著しい低い成長率を示した。これら
の植物は又、コントロールほど損傷をうけていなかっ
た。 （15）他の昆虫害虫による摂食実験 摂食実験は、ワタ及び穀類において重要な他のいくつ
かの昆虫害虫に対するタバコ（＋5/5）中のCpTI遺伝子
の効果を調べるために行なわれた。 （ａ）ヘリオチス・ゼア H.ゼアの幼虫をグラスハウス・クロップス・リサーチ
・インスティテュート（Glasshouse Crops Research In
stitute）〔リトルハンプトン（Littlehampton）〕及び
USDA（ブラウンスビル，テキサス，米国）から入手し、
H.ビレセンスに関して記載したように飼育した。クロー
ン複製物＋5/5及び−2/8に植物１本当たり８匹の生まれ
たばかりの幼虫（生後24時間以内）を寄生させ、上記の
ようにバイオアッセイを行なった。 初期実験では、192例中16例のみの幼虫がコントロー
ル植物において生存しており（cf.＋5/5では224例中10
例）、植物１本当たりの平均生存数は有効な０にほぼ近
かった。しかしながら、やや若い植物（6cm長）を用い
た場合において、コントロール群の生存率は30％に達し
ており、有意義な比較をすることができた（第６図
表）。CpTI発現植物は、H.ゼアによる攻撃及びその生育
に対してより高い耐性を明らかに示した。 （ｂ）スポドピテラ・リットラリス S.リットラリス幼虫をメイ＆ベーカー社（May ＆ Bak
er Ltd.），オンガー・リサーチ・ステーション（Onger
Research Station），エセック，英国から入手し、H.
ビレセンスに関して記載したように飼育した。クローン
複製物＋5/5及び−2/8に生まれたての８匹の幼虫（生後
12時間以内）を寄生させ、上記のようにバイオアッセイ
を行なった。植物に対する損傷は、この昆虫種の場合に
下部の葉において一層明らかであったため、画像分析用
にこの、部分から葉を摂取した。第７表で示したよう
に、CpTI発現植物はS.リットラリスの幼虫による攻撃及
びその生育に対してより耐性の高いことが判明した。 生存昆虫の平均体長間には有意差がなかったものの、
体長の分布には著しい差異がみられたことは重要であろ
う。コントロール植物の場合に体長分布は連続的であっ
たが、一方＋5/5の場合にはそれは二極化しており、各
極の体長は平均より著しく小さいか又は大きなものであ
った。我々は、このことに関して、前者はCpTIの代謝拮
抗作用に屈服したものであり、一方後者はその作用に抵
抗しうるに十分な体長に達したためである（おそらく、
いくつかのケースにおいては共食いによる）、と考え
た。 （ｃ）マンズカ・セクスタ M.セクスタの卵は、エス・レイノルズ博士（Dr.S.Rey
molds）〔生物科学校（School of biological Sciene
s），バス（Bath）大学，バス，英国〕から入手した。
＋5/5及び−2/8植物のカナマイシン耐性S1継代物に生ま
れたばかりの４匹の幼虫（生後24時間以内）を寄生さ
せ、上記のようにバイオアッセイを行なった。 M.セクスタ幼虫は試験された他の鱗翅類よりも著しく
大きく、コントロール植物に対して多大な損傷を急速に
及ぼす。かかる理由から、植物１本当たりに用いられる
昆虫数を減少させることが必要であり、しかも特定の葉
に対する損傷を調べるよりむしろ植物全体の損傷を評価
することが必要であった。CpTI発現植物は、この害虫種
に対して高い耐性を有することが発明した（第８表）。 （16）形質転換植物におけるCpTI発現量の測定 形質転換植物組織におけるCpTI発現性の実験方法は、
抗CpTI抗血清を用いる各種の免疫交差反応技術又は直接
的インビトロリプシン阻害活性アッセイのいずれかに依
存していた。 （ａ）ウサギ抗CpTI抗血清の製造 一次抗CpTI抗体含有血清をウサギから製造した。CpTI
はウサギ血清アルブミン（RSA）とグルタルアルデヒド
交差結合した。ウサギに、フロイント完全アジュバント
500μｌに懸濁されたCpTI−RSA 500μｌを注射した。フ
ロイント不完全アジュバント500μｌに懸濁されたCpTI
−RSA 500μｌを約１週間毎に更に４回注射した。最後
に、リン酸緩衝液中の未修正CpTI 0.5mg及び３週間後に
おけるCpTI−RSA 0.25mgの追加免疫注射を免疫血清回収
前に行なった。 この抗血清を産生する際に生じる問題は、CpTIが抗原
性に乏しいということであった。抗体は全CpTIに対し産
生され、全CpTIの中ではpUSSRc3/2でコードされた異性
体インヒビターのみが機能する、ということに注意しな
ければならない。インヒビター上で最も可能性の高い抗
原部位はポリペプチドの可変領域に存在することから、
抗体の何％が導入されたCpTI遺伝子生成物と事実上交差
反応するのかはわからないのである。したがって、これ
らの方法では標準として全CpTIを用いた場合に単一のCp
TI異性体インヒビター量を過小評価しがちである。 （ｂ）植物組織タンパク室抽出物の調製 一部の初期ELSA及びドット免疫のブロットのために、
粗タンパク質抽出物を成長中の若葉、洗浄された根及び
茎部分から調製した。これらを取出し、液体空気で凍結
し、粉末化し、凍結乾燥した。それらを回転ホイール上
pH9.5の50mMトリスHCl 1mlにつき乾燥重量40μｇの割合
で４℃にて一夜抽出した。次のELISA、インビトロトリ
プシンインヒビターアッセイ及びウェスターンブロット
を硫酸アンモニウム沈殿分画について行なった。葉を採
取し、凍結し、上記のように粉末化した。それらを４℃
で一夜pH9.5の50mMトリスHCl,1mM DTT中湿潤重量1mg/2.
7μｌの割合で直ちに抽出した。不活性物質を遠心分離
によりペレット化し、上澄1mlを95％飽和以下の硫酸ア
ンモニウムにより４℃で一夜沈殿させた。沈殿タンパク
質をペレット化し、抽出緩衝液400μｌに再懸濁し、pH
9.5の50mMトリスHClに対して透析した。タンパク質濃度
はブラッドフォードタンパク質アッセイにより調べた
〔ブラッドフォード・エム・エム（Bradford,M.M.）,19
76年，タンパク質−色素結合原理を用いたタンパク質mg
量の高速高感度定量方法，アナライティカル・バイオケ
ミストリー（Analytical Biochemistry），第72巻，第2
48−54頁〕。 （ｃ）酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA） CpTI発現量は、市販ペルオキシダーゼ結合二次抗体EL
ISAキットを用いて、形質転換植物からの葉抽出物のELI
SAにより測定した。これらのアッセイ結果は、高発現性
植物の定性的確認を可能ならしめるに十分であったが、
CpTIの乏しい抗原性及びELISAプレートと結合しうるタ
ンパク質が低量であることに起因して定量的にはむしろ
信頼できないと思われた。 （ｄ）インビトロトリプシンインヒビターアッセイ 試料のトリプシン阻害活性は、アーランガーらの方法
に従い基質としてＮ−ベンゾイル−DL−アルギニン−ｐ
−ニトロアリニドHCl（BAPNA）を用いて測定した〔アー
ランガー・ビー・エフ（Erlanger,B.F.）、カコフスキ
ー・エヌ（Kakowsky,N.）、コーエン・ダブル（Cohen,
W.）,1961年，トリプシンの２種の新規な発色気質の製
造及び性質，アーチブス・オブ・バイオケミストリー・
アンド・バイオフィジクス（Archives of Biochemhistr
y and Biophysics），第95巻，第271−278頁〕。この方
法で測定されたCpTI活性レベルは、ELISAで示されたレ
ベルよりも著しく高く（第２表）、即ち観察された生物
学的活性に相当すると思われるレベルと一致して著しく
高いものであった。しかしながら、このアッセイも制御
不可能な変動干渉をうけた。 （ｅ）タンパク質ドット免疫ブロットアッセイ タンパク質５μｇ含有組織抽出物をニトロセルロース
フィルターに結合させ、125I−ロバ抗ウサギ抗体を用い
てジャン・アール（Jahn,R.）、シーブラー・ダブル（S
chiedler,W.）、グリーンガード・ピー（Greengard,
P.）〔1984年，ニトロセルロース膜フィルターを用いる
タンパク質用定量ドット免疫結合アッセイ，プロシーデ
ィング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエ
ンスUSA,第81巻，第1684−87頁〕により記載されたドッ
ト免疫結合アッセイに供した。既知量の精製起CpTI標準
を非形質転換タバコ抽出物５μｇ中で同時に供した。オ
ートラジオグラフィー後、定量は各“ドット”のシンチ
レーションカウント又はLKBウルトラスキャン（Ultrasc
an）積算レーザー濃度計でのオートラジオグラフの走査
により行なわれた。 この方法を用いた結果は全く再現可能であった。＋5/
5においてCpTIとして評価された全タンパク質中約0.9％
というレベルは、抗体の低交差反応性の故に、おそらく
まだ過小評価されているであろう。 若及び老葉、茎並びに根組織におけるCpTI発現レベル
はこの方法で調べた。この詳細な実験において、高レベ
ルの“バックグラウンド”非特異的抗体結合性は、信頼
検出レベルを約18mg/試料（タンパク質0.4％）に限定
し、かつ＋5/5の若葉における発現レベルの著しく低い
評価の原因をなしていた。しかしながら、結果（第９
表）は下記のことを明らかに証明している： CpTIの相対量は葉の成熟に伴い低下する； CpTIは形質転換植物の茎に存在する； CpTIは根の全タンパク質中更に高率で発現せしめられ
る。 （ｆ）ウェスターンブロット 形質転換タバコ植物中におけるCpTIの存在もウェスタ
ーンブロットにより確認された。＋5/5及び−2/8植物の
若葉からの硫酸ナトリウム沈殿可溶性タンパク質を非還
元条件下17％ポリアクリルアミド−SDSゲル電気泳動に
より処理した。トリプトシンアフィニティーカラム精製
CpTI及びササゲTvu2027の種子から抽出された可溶性タ
ンパク質を標準として同時に処理した。ウェスタンーン
ブロットはトービンらにより記載されているように実施
した〔トービン・エッチ（Towbin,H.），ステヘリン・
テー（Staehelin,T.），ゴードン・ジェイ（Gordon,
J.）,1979年，ポリアクリルアミドゲルからニトロセル
ロース紙へのタンパク質電気泳動移動，操作及びいくつ
かの用法，プロシーディング・オブ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンスUSA,第76巻，第4350−４
頁〕。ブロット（第９図）は、−2/8には存在せず＋5/5
の葉中に存在するCpTI抗体交差反応性物質のバンドが出
現し、これらのバンドがササゲ種子中のCpTIの主バンド
と一致することを示している。 第９図は以下のものを示している： Ａ）アフィニティー精製CpTI Ｂ）ササゲTVu2027の種子抽出物 Ｃ）−2/8葉組織 Ｄ）＋5/5葉組織 （17）形質転換体の遺伝子分析 （ａ）カナマイシン耐性の分離分析 原N.タバクム形質転換植物は自家受粉種子を発生する
ことができた。成熟種子を回収し、気密ボトル中４℃で
貯蔵した。種子を20％“クロロス（Chloros）”中で表
面殺菌し、栽培室中0.5×ムラシゲ（Murashige）及びス
クッグ（Skoog）培地及びカナマイシン200μg/ml含有の
0.8％寒天上で発芽させた。 ４つのタイプの下記表現型は苗のS1世代間において明
確に区別することができた： 非生存性−発芽しえない種子； カナマイシン耐性−カナマイシン200μg/ml上で良好
に成長し、高度に分岐した根系及び“健常”な緑色真葉
を形成した； カナマイシン感受性−種子は発芽するが、但し根は分
岐せず、真葉は適度には生育せず、かつ子葉は白色化し
た； 中間耐性−種子は発芽して真葉を形成するが、但し根
系は十分に耐性の苗ほどは明らかに分岐せず（特に苗が
寒天から引き抜かれた場合に明らかである）、かつ若干
的に白色化した葉が観察された； 形質転換植物からの種子の生育力は、無カナマイシン
であること以外は同様の条件下で発芽した非形質転換N.
タバクム（変異サムスム）からの種子と比べて少なくと
も同じ程度に高かった。 第10表に要約された結果は、カナマイシン耐性が単純
なメンデルの法則に従い発現し、試験植物中１又は２の
遺伝子座に存在し、かつ古典的メンデルの法則によると
3:1又は9:3:3:1の分離比であることを証明した。その特
性は予想されるように通常優性であるが、可変的浸透度
をもつようである。したがって、二遺伝子座植物の一部
における中間表現型の出現は、一部の遺伝子座が他の場
合よりも非常に強い表現型効果を発揮していることを示
している。親植物−2/2及び＋5/19はこの選択レベル
（最初に適用されたカナマイシン濃度の２倍）では成長
しないであろうし、実際にも−2/2系はカナマイシン100
μg/ml上での連続栽培時に消失したことに注意せよ。１
又は２の遺伝子座のみが含まれている場合に、ホモ接合
植物がS2世代で確認可能であった。（ｂ）昆虫耐性表現型の遺伝 ＋5/5のカナマイシン耐性S1継代物（＋5/5〔１〕A11
−20と呼ばれる）10例をS.リットラリスに対するバイオ
アッセイで試験し（第11表参照）、しかる後それらを成
長させて、自家受精S2種子を発生させた。この種子はカ
ナマイシン200μg/mlを含有した1/2のMS寒天上で発芽し
た。10例中の植物からのS2種子は試験されたカナマイシ
ン耐性表現型に関して分離を示さず、かかる試料の大き
さから予想される分離比を示した。面白いことに、この
４例のホモ接合植物はバイオアッセイで昆虫耐性に関し
て１番目、２番目、３番目及び５番目にランク付けされ
た。 （ｃ）サザンブロット 高分子量ゲノムDNAを標準的操作により形質転換原性
植物の成熟したばかりの葉から単離した。ゲノムDNA10
μｇを37℃で一夜EcoR I及びHind III各40単位により消
化し、制限断片を１％アガロースゲル上での電気泳動に
より分離した。“マーカー”断片を用意しかつコピー数
再組換えをするために、比率5:1のpRokCpTI＋５及びpRo
kCpTI−２の混合物をEcoR I及びHind IIIで消化した。
ニコチアナDNA 10μｇ当りのニコチアナ遺伝子団体（ge
nophore）につき導入配列コピー数1,5及び20に相当する
制限プラスミドを同時に処理した。DNAをニトロセルロ
ースフィルターに“サザン”導入し、ニックトランスレ
ーションされた32P−dCTP標識pRokCpTI＋５でプローブ
処理した。高度の厳重性を要する洗浄は、オートラジオ
グラフィー前に0.5×SSC、0.1％SDS中68℃で行なった。
植物＋5/5及び−2/8のオートラジオグラフ上における重
要なバンド源は第９図に示されているが、そこにおいて
（Ａ）はpRokCpTI＋５及びpRokCpTI−２構造中の特徴的
制限部位を示してあり、（Ｂ）はサザンブロットのオー
トラジオである。 主な結論は下記のように要約される： ｉ） 試験されたすべての植物は、−５における480kp
及び1200バンド、並びに−２における610kp及び1070kp
バンドの存在から示されるように、CaMV35Sプロモータ
ー−CpTI−NOSターミネーター構造体の少なくも１つの
未再配列コピーを有している。 ii） すべてが複数の遺伝子挿入物コピーを有している
（以下参照）。 iii） 大多数のコピーは、2570kpバンドを生じる“頭
−尾（head to tail）”タンデム（tandem）配列中に存
在している。このタンデム的繰返しとしての挿入が、遺
伝子コピー数及び遺伝子座数間の差異の原因をなしてい
る。 iv） 構造体中での内部再配列を強く示唆するバンドは
共通して存在するものではないが、数種の植物において
は認識可能である（例えば、5/8）。 ｖ） 高分子量バンドはおそらく以下の結果による： ａ）不完全消化 ｂ）宿主DNA中への“末端断片”流入 ｃ）遺伝子再配列 ｄ）Tiプラスミドの導入 （ｄ）遺伝子コピー数 コピー数は、標準としてプラスミドDNAゲノムコピー
数再組換え体を用い、サザンブロット及びゲノムDNAド
ットブロットの積算レーザー濃度測定スキャンによって
調べた。結果は第12表に示されている。コピー数及びCp
TI発現性（及び、ひいては昆虫耐性）間には相関々係の
ないことが注目される。挿入が生じた部位の性質がおそ
らくもっと重要なのであろう。
【図面の簡単な説明】
下記添付図面が参考にされる：
第１図は、ササゲ由来ボーマン−バークトリプシンイン
ヒビターのアミノ酸配列を示す。 第２図は、CpTIf IVのアミノ酸配列、及びCpTIcDNA用の
合成混合オリゴヌクレオチドプローブを特定化するため
に最も適した領域として予想される可能なコード配列を
示す。 第３図は、pAGC1における挿入物コード鎖のヌクレオチ
ド配列を示す。 第４図は、CpTIに対応する完全鎖長cDNAクローンの単離
方法を示す。 第５図は、pRok2ベクター中のpUSSRc3/2構造体によるタ
バコ植物の形質転換方法を示す。 第６図は、pUSSRc3/2中の挿入物コード鎖のヌクレオチ
ド配列に示す。 第７図は、pUSSRd4/6中の挿入物コード鎖のヌクレオチ
ド配列を示す。 第８図は、形質転換N.タバクム葉組織中におけるCpTI発
現のウエスターンブロット分析図である。 第９図は、＋5/5及び−2/8における形質転換配列のゲノ
ム構造のサザンブロット分析図である。
ヒビターのアミノ酸配列を示す。 第２図は、CpTIf IVのアミノ酸配列、及びCpTIcDNA用の
合成混合オリゴヌクレオチドプローブを特定化するため
に最も適した領域として予想される可能なコード配列を
示す。 第３図は、pAGC1における挿入物コード鎖のヌクレオチ
ド配列を示す。 第４図は、CpTIに対応する完全鎖長cDNAクローンの単離
方法を示す。 第５図は、pRok2ベクター中のpUSSRc3/2構造体によるタ
バコ植物の形質転換方法を示す。 第６図は、pUSSRc3/2中の挿入物コード鎖のヌクレオチ
ド配列に示す。 第７図は、pUSSRd4/6中の挿入物コード鎖のヌクレオチ
ド配列を示す。 第８図は、形質転換N.タバクム葉組織中におけるCpTI発
現のウエスターンブロット分析図である。 第９図は、＋5/5及び−2/8における形質転換配列のゲノ
ム構造のサザンブロット分析図である。
フロントページの続き
(72)発明者 ジョン、アーサー、ゲートハウス
イギリス国カウンティー、ダラム、スタ
ンリー、シールド、ロー、アイベストン
テラス、１、アールズディーン
(72)発明者 デイビッド、ボールター
イギリス国ダラム、シティー、クロスゲ
イル５
(56)参考文献 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ.
259，Ｎｏ．15，Ｐ．9883−9890（1984)
Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒ
ｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，Ｖｏｌ．132,
Ｎｏ．２，Ｐ．605−612（1985)
ＵＣＬＡ．Ｓｙｍｐ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌ
ｌ．Ｂｉｏｌ．，Ｐ．223−233（1983)
(58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名)
C12N 15/00
C12N 5/00
A01H 1/00
A01H 5/00
ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．種子細胞以外の植物細胞中でトリプシンインヒビタ
ー遺伝子を発現させて昆虫耐性を増強させうる形質転換
原性植物細胞の生産方法であって、トリプシンインヒビ
ターをコードする構造遺伝子、及び該遺伝子と結合して
おり、該遺伝子を種子細胞以外の植物細胞中で発現させ
うるように、プロモーターを含んでなる組換えDNAを植
物細胞の核ゲノム中に組込むことを特徴とする上記生産
方法。 ２．形質転換がアグロバクテリウムを用いて行なわれ
る、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３．形質転換すべき植物細胞が双子葉植物由来である、
特許請求の範囲第１項記載の方法。 ４．形質転換すべき植物細胞が単子葉植物由来である、
特許請求の範囲第１項記載の方法。 ５．構造遺伝子が、ボーマン・バーク型トリプシンイン
ヒビターをコードする、特許請求の範囲第１項記載の方
法。 ６．遺伝子が、マメ科植物由来のボーマン・バーク型ト
リプシンインヒビターをコードする、特許請求の範囲第
１項記載の方法。 ７．トリプシンインヒビターが、ビグナ・ウングイクラ
タ由来であり（ササゲトリプシンインヒビター又はCpT
I）、第１図に示されたアミノ酸配列を有するタンパク
質をコードする、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ８．トリプシンインヒビター遺伝子を含み、増強された
昆虫耐性を呈示するように、種子細胞以外の植物細胞中
で該遺伝子を発現しうる植物細胞の生産方法であって、
トリプシンインヒビターをコードする構造遺伝子、及び
該遺伝子と結合しており、該遺伝子を種子細胞以外の植
物細胞中で発現させうるように、プロモーターを含んで
なる組換えDNA分子を含む組換えDNAプラスミドで植物細
胞を形質転換させ、形質転換細胞を選択することを特徴
とする上記生産方法。 ９．形質転換がアグロバクテリウムを用いて行なわれ
る、特許請求の範囲第８項記載の方法。 １０．形質転換すべき植物細胞が双子葉植物由来であ
る、特許請求の範囲第８項記載の方法。 １１．形質転換すべき植物細胞が単子葉植物由来であ
る、特許請求の範囲第８項記載の方法。 １２．構造遺伝子が、ボーマン・バーク型トリプシンイ
ンヒビターをコードする、特許請求の範囲第８項記載の
方法。 １３．遺伝子が、マメ科植物由来のボーマン・バーク型
トリプシンインヒビターをコードする、特許請求の範囲
第８項記載の方法。 １４．トリプシンインヒビターが、ビグナ・ウングイク
ラタ由来であり、第１図に示されたアミノ酸配列を有す
るタンパク質をコードする、特許請求の範囲第８項記載
の方法。 １５．種子以外の植物組織中で発現するように、プロモ
ータに結合されており、発現したときに該植物に高い昆
虫耐性を付与するトリプシンインヒビター遺伝子で形質
転換されている、昆虫耐性が増強された形質転換原性双
子葉植物、または、種子以外の植物組織中で発現するよ
うに、プロモーターに結合されており、発現したときに
植物の子孫に高い昆虫耐性を付与する上記遺伝子を含む
上記植物の子孫。 １６．遺伝子が、ビグナ・ウングイクラタ由来のボーマ
ン・バーク型トリプシンインヒビターをコードし、第１
図に示されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコード
する、特許請求の範囲第15項記載の植物。
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-
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