CN106008687A - 抗逆相关基因ZmHDZIV13在调控植物抗逆性中的应用方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种增强植物抗旱抗逆性的基因，是一种增强植物抗逆性的相关蛋白；名称为ZmHDZIV13，来源于玉米(Zea mays L.)自交系B73，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示。该蛋白的编码基因序列如SEQ ID NO：1所示。本发明还涉及增强植物抗逆相关蛋白的编码基因的应用方法：将携带有本发明的ZmHDZIV13基因的表达载体，通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电导、农杆菌介导等常规生物方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物经组织培育成植株，获得抗旱抗逆性提高的植株。本发明的ZmHDZIV13基因可用现有的方法构建到现有的植物表达载体中，将本发明的植物抗逆性相关蛋白的编码基因按常规方法转入其他植物中，可增强植物的抗旱性。

Description

抗逆相关基因ZmHDZIV13在调控植物抗逆性中的应用方法

技术领域

本发明涉及一种增强植物抗旱抗逆性的基因；本发明还涉及所述基因在改良植物对干旱胁迫抗性方面的应用方法。

背景技术

同源异型域-亮氨酸拉链(HD-Zip)是植物所特有的一类转录因子，广泛存在于多种植物中，不仅在高等植物生长发育、形态建成中发挥重要作用，同时调控植物对生物和非生物胁迫等逆境的响应过程。拟南芥中的AtHDG11基因编码一个属于HD-ZipIV类家族的转录因子，该基因的表达可促进根的伸长和气孔关闭从而提高植物耐旱性，已有的研究表明转AtHDG11基因的拟南芥、烟草和草坪草均表现出较强的耐旱性。目前已经鉴定出玉米HD-Zip IV类转录因子基因17个，进化分析表明ZmHDZIV13基因与AtHDG11基因的同源性较高，推测这两个基因与AtHDG11基因有相似的功能。但是目前对于玉米HD-Zip IV基因家族的研究还较少，主要是其在植物不同组织的表达模式和在植物外表皮及毛状根发育过程中的研究，其生理功能特别是在环境胁迫中的生理功能还未见报道。

本发明根据NCBI数据库中与AtHDG11基因同源的玉米HD-Zip IV基因ZmHDZIV13的cDNA序列。研究了ZmHDZIV13基因克隆，生物信息学分析及植物表达载体构建，并将这个克隆基因转入植物，从而快速获得具有抗逆性状的转基因植物。

发明内容

本发明的目的是提供一种增强植物抗逆性的相关蛋白及其编码基因；本发明的第二目的是提供一种增强植物抗逆相关蛋白的编码基因的应用方法。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种增强植物抗逆性的相关蛋白；名称为ZmHDZIV13，来源于玉米(Zea mays L.)自交系B73，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

(1)序列表中SEQ ID：2；

(2)序列表中SEQ ID：2的氨基酸残基序列经过一个或者几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗逆相关的蛋白质。

其中，序列SEQ ID：2由698个氨基酸残基组成。

所述一个或者几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加。氨基酸优先取代如表1所示。

表1氨基酸替换表

上述ZmHDZIV13植物抗逆相关蛋白编码基因也属于本发明的保护范围。

上述ZmHDZIV13植物抗逆相关蛋白编码的基因具有下述核苷酸序列之一：

(1)序列表中SEQ ID NO：1的核苷酸序列；

(2)编码序列表中SEQ ID NO：2蛋白质序列的DNA；

(3)与序列表中SEQ ID NO：1的DNA序列具有90％以上同源性，切编码相同功能蛋白质的DNA序列；

(4)在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID NO：1限制的DNA序列杂交的核苷酸序列。

上述高严谨条件为在0.1×SSC，0.1×SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜；其中，序列表中的SEQ ID NO：1由2097个脱氧核苷酸组成。

含本发明基因的重组表达载体、转基因细胞及工程菌属于本发明的保护范围。

本发明的第二目的是通过以下技术方案来实现的：一种增强植物抗逆相关蛋白的编码基因的应用方法；其特征在于：将携带有本发明的ZmHDZIV13基因的表达载体，通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电导、农杆菌介导等常规生物方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物经组织培育成植株，获得抗旱抗逆性提高的植株。

本发明的ZmHDZIV13基因可用现有的方法构建到现有的植物表达载体中，可在其转录超始核苷酸前加包括组成型启动子、增强启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子、发育阶段特异性启动子在内的任何一种启动子。为了便于对ZmHDZIV13基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所使的载体进行加工，如加入植物可选择性标记(bar基因、GUS基因、荧光素酶基因等)或具有抗性的抗生物素标记物(庆大霉素、卡那霉素等)。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以使双子叶植物，如：水稻、小麦、玉米、烟草、拟南芥等。

实验证明，在逆境条件下，转ZmHDZIV13烟草比野生型烟草具有较强的抗旱性。在干旱胁迫条件下，转基因烟草存活率、生物量和相对含水量均高于非转基因植株，同时脯氨酸含量得到提高，丙二醛含量降低。

将本发明的植物抗逆性相关蛋白的编码基因按常规方法转入其他植物中，可增强植物的抗旱性。

附图说明

图1为玉米ZmHDZIV13基因全长PCR扩增产物；

图2为载体pUCm-T-ZmHDZIV13的酶切鉴定；

图3为载体pCAMBIA3300-35S-ZmHDZIV13-bar的酶切鉴定；

图4为6个限制性酶BamH I、EcoR I、Hind III、Sma I、Xba I、Sac I消化烟草基因组的对比图；

图5为玉米和拟南芥HD-Zip IV型转录因子基因编码蛋白的进化分析；

图6为玉米ZmHDZIV13和拟南芥AtHDG11基因编码蛋白序列的同源性比较；

图7为pCAMBIA3300-35S-ZmHDZIV13-bar表达载体构建流程；

图8为玉米ZmHDZIV13基因转基因烟草获取过程图；

图9为转基因烟草的PCR鉴定；(其中：M为DNA Marker D2500；CK⁺为阳性对照；CK^—为阴性对照；1-10为抗性植株)

图10为部分经PCR检测的阳性转基因烟草植株的Northern blot分析结果；杂交结果表明SEQ ID NO：1核苷酸序列能在转基因烟草中表达；

图11为20％PEG对ZmHDZIV13转基因烟草幼苗生长的影响；

图12为20％PEG胁迫下ZmHDZIV13转基因烟草和野生烟草存活率的变化；

图13为20％PEG胁迫下ZmHDZIV13转基因烟草和野生烟草相对含水量的变化；

图14为20％PEG胁迫下ZmHDZIV13转基因烟草和野生烟草生物量的变化；

图15为20％PEG胁迫下ZmHDZIV13转基因烟草和野生烟草中丙二醛含量对比；

图16为20％PEG胁迫下ZmHDZIV13转基因烟草和野生烟草中脯氨酸含量对比。

具体实施方式

下述实施中的方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例1；SEQ ID NO：2蛋白及其编码基因的获得

烟草(Nicotiana tobaccum)，生态型为T12，由甘肃省农业科学院提供。

菌株：大肠杆菌(Eschrichiacoli)DH5a，用于烟草遗传转化的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)为LBA4404，两个菌株均为甘肃省干旱生境作物学玉米重点实验室保存。

质粒：T/A克隆载体pUCm-T购自生工生物工程(上海)有限公司，植物表达载体pCAMBIA3300-35S-PROIIMCS-bar为甘肃省干旱生境作物学玉米重点实验室改造，卡那抗性用于T/A克隆。

一、核苷酸序列SEQ ID NO：1的克隆步骤如下：

(一)玉米总RNA的提取与纯化

玉米RNA的提取(Trizol法)：

实验前准备工作：DEPC水的配置：1L水中加入1ml的DEPC(DEPC体积份数是0.1％)，37℃温浴12h。

高压灭菌至少20min，灭菌2次，使DEPC彻底失活。PCR管，1.5ml离心管，2ml离心管，各种枪头等用DEPC水(未灭菌)浸泡，37℃过夜，次日灭菌备用。

试剂：trizol，氯仿，异丙醇，75％乙醇(DEPC水配置)，DEPC。

(1)取0.1g玉米未成熟雄穗放入研钵中迅速研磨，期间不断加入液氮；

(2)将研磨好的材料放入离心管中，迅速加入1ml的trizol试剂，涡旋混匀，室温静置5min(室温过高时也可以冰上放置)；

(3)4℃条件下12000rpm离心15min，取上清液1ml；上清液中加入200μl氯仿，涡旋振荡15S，室温静置3min；

(4)4℃条件下12000rpm离心15min；将样品上层无色水相(约500μl)移入另一离心管中，加入等体积的异丙醇，振荡混匀，室温静置10min；

(5)4℃条件下12000rpm离心15min，弃上清液；

(6)离心管中加入1ml 75％乙醇(RNase free)洗涤沉淀；

(7)4℃条件下5000rpm离心5min，弃上清液；

(8)重复步骤(6)、(7)；

(9)将沉淀放在超净工作台中，风干约10min，至沉淀变成半透明状；

(10)离心管中加入60-80μl RNase free ddH2O，4℃条件下溶解30min；

(11)取3μl RNA溶液在1％的琼脂糖凝胶上电泳检测RNA质量。

(二)RT-PCR扩增玉米ZmHDZIV13基因

第一链cDNA的合成：

(1)按照生工生物公司M-MuLV第一链cDNA合成试剂盒说明，建立20μl反应体系：将下列组分依次加入RNase free的PCR管中：RNA溶液5μl，Oligo d(T)18Primer(0.5μg/μl)1μl，RNase free ddH2O加至12μl；轻轻混匀后，离心3-5S；65℃温浴5min；

(2)温浴后PCR管迅速置冰上冷却30s，离心3-5s后依次加入以下组分：W5×Reaction Buffer 4μl，RNaseInhibitor(20U/μl)1μl，dNTP(10mmol/L)2μl；

(3)轻轻混匀后置37℃水浴5min；加入M-MuLV逆转录酶(20U/μl)1μl，使终体积为20μl；

(4)将上述混合物置于42℃水浴60min；72℃孵育10min终止反应，得到反转录cDNA。

(三)目的基因的克隆

将上一步得到的反转录cDNA稀释20倍备用。根据已测序的ZmHDZIV13基因组序列设计一对PCR特异性引物，从cDNA中扩增完整的核苷酸序列。反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，57.1℃退火30s，72℃延伸2min；变性、退火、延伸重复35个循环；72℃10min，4℃结束程序保存。1.0％琼脂糖凝胶电泳检测。电泳如图1所示：结果表明获得2097bp的片段。

ZmHDZIV13具有序列SEQ ID NO：1的核苷酸序列。通过RT-PCR的方法从玉米基因组中克隆到ZmHDZIV13基因的全长cDNA序列，序列长2097bp。以cDNA序列为探针搜索NCBI数据库，得到该基因的全长DNA序列(GenBank登录号：BK008038)，序列比对发现该基因包含10个外显子和9个内含子。以ZmHDZIV13基因的DNA序列为探针搜索玉米基因组数据库(MaizeGDB)，发现该基因位于第4号染色体上靠近端粒的位置。Protparam工具分析表明ZmHDZIV13基因编码698个氨基酸，预测分子量为7.62kD，分子式为C₃₃₁₄H₅₂₈₅N₉₆₃O₁₀₀₅S₄₆，等电点pI＝6.19，理论推导半衰期为30h，不稳定指数53.03，脂溶指数82.58。蛋白质氨基酸序列分析表明ZmHDZIV13蛋白不含吡咯赖氨酸(Pyl)和硒半胱氨酸(Sec)；丝氨酸(Ser)含量最多为10.5％；其次是亮氨酸(Leu)，含量为9.3％。总的负电残基(Asp+Glu)为77，正电残基(Arg+Lys)为69，疏水性平均系数(GRAVY)：为-0.164。

二、ZmHDZIV13拟南芥AtHDG11基因编码蛋白序列的同源性比较

以AtHDG11蛋白氨基酸序列为探针检索NCBI的拟南芥和玉米蛋白质数据库得到12个拟南芥HD-Zip转录因子序列和17个玉米HD-Zip转录因子序列，将这些序列进行比对并构建进化树(见图5)。根据序列比对的结果选取ZmHDZIV13这个HD-Zip IV型转录因子基因作为我们的目标基因。将这个蛋白氨基酸序列分别与拟南芥AtHDG11蛋白氨基酸序列进行同源性比对，结果表明ZmHDZIV13与AtHDG11的蛋白氨基酸同源性分别为53.51％(见图6)。通过查找GenBank数据库，找到ZmHDZIV13基因的全长cDNA序列，GenBank登录号为BK008038，并以此设计特异引物通过RT-PCR的方法从玉米基因组中克隆ZmHDZIV13基因，并连接到pUCm-T克隆载体中。

实施例2；ZmHDZIV13及其编码基因的功能验证

一、ZmHDZIV13基因表达载体的构建

(一)目的片段与pUCm-T载体连接

根据pUCm-T vector(生工生物)说明书配置如下溶液：10×Ligation Buffer 1.0μl，50％PEG 1.0μl，pUCm-Tvector 1.0μl，纯化的PCR产物4.0μl，T4 DNA Ligase 1.0μl，dd H₂O 2μl；16℃连接6小时。

(二)大肠杆菌感受态细胞的制备(采用1.5ml离心管制备)

菌液转入预冷的1.5ml离心管中，4℃3500rpm离心10min，去上清液。离心管中加入300μl冰冷的0.1mol/L的CaCl₂溶液重悬菌体，冰浴30min。4℃条件下3500rpm离心10min。去上清液，将菌体悬浮于60μl冰冷的0.1mol/L的CaCl₂溶液中，加入10μl甘油，液氮速冻后于-80℃冰箱中保存，使用时取出，置于冰上融化。

(三)连接产物转化大肠杆菌

取100μl感受态细胞置于冰上，完全解冻后轻轻将细胞均匀悬浮。加入5μl连接液，轻轻混匀。冰上放置30min。加入400μl LB液体培养基，37℃，250rpm振荡培养1h。将离心管内容物混匀，吸取200μl菌液涂布在预先用20μl100mM IPTG和100μl 20mg/ml X-gal涂布的氨苄青霉素平板上。平板在37℃下正向放置1小时以吸收过多的液体，然后倒置培养过夜。

(四)碱裂解法小量提取大肠杆菌质粒DNA

(1)挑取平板上单菌落，接种于5ml附加氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，250rpm振荡培养过夜。

(2)取1.5ml培养液倒入1.5ml离心管中，4℃12000rpm离心30s。

(3)弃上清，将离心管倒置于滤纸上几分钟，使液体流尽。

(4)菌体沉淀重悬于100μl溶液I中，剧烈振荡，室温放置10min。

(5)加入新配置的溶液II 200μl，盖紧管口，快速温和振荡离心管数次，以混匀内容物，冰浴5min。

(6)加入150μl预冷的溶液III，盖紧管口并倒置离心管，温和振荡10s，冰浴5min，4℃条件下，12000rpm离心5min。

(7)将上清液(约400μl)移入另一干净的离心管中，加入200μl tris-饱和平衡酚和200μl氯仿/异戊醇(24/1)振荡混匀，4℃条件下12000rpm离心5min。

(8)将上层无色水相(约400μl)移入一新的干净离心管中，加入1ml(2.5倍体积)预冷的无水乙醇，振荡混匀后置于-20℃冰箱中20min，然后4℃条件下12000rpm离心5min。

(9)倒掉上清液，将管口敞开倒置于滤纸上使所有液体流尽，加入1ml预冷的70％乙醇洗涤沉淀，4℃条件下，12000rpm，离心5min。

(10)重复步骤9。

(11)吸出上清液，将离心管倒置于卫生纸上，使液体流尽，室温干燥。

(12)将沉淀溶于20μl TE缓冲液中，37℃水浴1h，储存于-20℃冰箱中。

(五)质粒DNA的PCR验证

以大肠杆菌质粒DNA为模板(稀释10倍)，扩增ZmHDZIV13，并引入酶切位点。PCR反应25.0μl体系如下：ddH₂O 9.5μl，Premix EX Taq 12.5μl，5′引物(10μmol/L)1.0μl，3′引物(10μmol/L)1.0μl，质粒DNA 1.0μl。反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，57.1℃退火30s，72℃延伸1min；变性、退火、延伸重复30个循环；72℃10min；4℃结束程序保存。1.0％琼脂糖凝胶电泳检测。挑选阳性克隆菌液送去测序。测序结果表明2097bp的片段具有由序列1的5′的第1至2097位脱氧核苷酸组成的核苷酸序列。

(六)pUCm-T-ZmHDZIV13载体酶切验证

用XbaI和SmaI双酶切pUCm-T-ZmHDZIV13得到2115bp的ZmHDZIV13基因线性片段(见图2)；双酶切CPB(pCAMBIA3300-35S-PROII MCS-bar)得到单一的大小为9580bp的线性片段，两个线性片段连接得到pCAMBIA3300-35S-ZmHDZIV13-bar表达载体(见图7)。XbaI和SmaI双酶切pCAMBIA3300-35S-ZmHDZIV13-bar表达载体进行鉴定，结果表明植物表达载体pCAMBIA3300-35S-ZmHDZIV13-bar构建正确(见图3)。

二、转ZmHDZIV13基因烟草的鉴定及功能分析

(一)转ZmHDZIV13基因烟草的获得及筛选

(1)利用叶盘法转化烟草，Baste除草剂抗性筛选

将构建的质粒PCAMBIA3300-35S-ZmHDZIV13-bar转入农杆菌LBA4404，用叶盘法转化烟草，方法如下：

外植体预培养：剪取完全展开的无菌试管苗的叶片，剪去叶缘接种于再生培养基(MS+6BA 1mg/L)黑暗培养1～2d。

(2)农杆菌的培养

从含有根癌农杆菌平板上挑取含有目的基因的单菌落，接种到3ml YEP液体培养基中(Rif 50μg/ml、Kan50μg/ml)于27℃恒温摇床上，220rpm震荡培养过夜OD₆₀₀为0.6-0.8。培养过夜的菌液按1％～2％的比例，转入新配置的无抗生素的YEP培养基中，在与上述相同的条件下培养6h左右，OD600为0.4～0.6时即可用于转化。

(3)转化

于超净工作台上，将菌液倒入无菌的小培养皿中，取不具Basta除草剂抗性的烟草无菌苗的幼嫩、健壮叶片，去主脉，将叶片剪成0.5cm²的小块，放入菌液中，浸泡5～10min，取出叶片置于无菌滤纸上吸去附着的菌液，接种于共培养基MS培养基，pH 5.8、添加琼脂9g/L，共培养(黑暗，23℃)3d。

(4)选择培养

将共培养后的外植体接种于选择培养基，培养基为：MS培养基+6BA 3mg/L+NAA 0.2mg/L+Carb 500mg/L+Basta 30mg/L+琼脂8g/L，pH5.8；置于光照培养架上，每隔20～30d继代一次，至分化出转基因植株。

(5)转基因植株生根与移栽

将转基因植株接种到生根培养基中，生根培养基为：1/2MS培养基+Carb 250mg/L+Basta 30mg/L+琼脂8g/L，pH 5.8，置于培养架上，进行诱导生根培养，转基因植株生根后打开瓶盖，进行自然光照，温度控制在20～25℃，炼苗4d，再将转基因苗移栽至营养钵中，置于温室培养。等根系发达后，将植株取出，用无菌水洗净附着的固体培养基，移入土壤中，刚开始用玻璃罩罩几天，待植株健壮后再取下玻璃罩，温室中培养主要过程如图8所示：其中：A表示烟草叶片共培养；B表示选择和生根培养；C表示转化植株移栽；D表示T1代株系纯化筛选。

将转基因烟草T₀代种子播种于营养土中，在22℃/18℃、16h/8h光周期条件下培养7d左右，用300μg/LBasta除草剂均匀喷洒叶片，5d后大部分幼苗开始黄花，逐渐枯萎死亡，少数能继续生长，并且叶片为绿色，表形正常(见图8中的D图)。经PCR鉴定的阳性植株，分单株系收获籽粒，得到的种子为T₁代，经除草剂筛选单株收获得到种子为T₂代，纯合体同一株系可以混收种子。本研究共得到25株ZmHDZIV13T₂代纯合株系，从中分别随机选取10个株系进行表型鉴定。

(二)转基因烟草植株的PCR鉴定

以ZIV13-F1：5′ATGGACTTCGGCGACGACGT CAT 3′，ZIV13-R1：5′TCAATGGCTGGCCAATTCAAGGC3′，为引物，对Basta除草剂筛选为阳性的转PCAMBIA3300-35S-ZmHDZIV13-bar T2代烟草基因组进行PCR检测，以野生型的烟草(图9中CK^－)和PCAMBIA3300-35S-ZmHDZIV13-bar(图9中CK⁺)的PCR检测为对照，结果表明除了L4、L9外，其他均可以扩增到2097bp的条带，而野生型中没扩增产物出现。

(三)转PCAMBIA3300-35S-ZmHDZIV13-bar烟草的Southern杂交验证

将Basta除草剂筛选和PCR为阳性的转PCAMBIA3300-35S-ZmHDZIV13-bar烟草单株提取DNA，以ZmHDZIV13基因的特异引物ZIV13-F1、ZIV13-R1，以转PCAMBIA3300-35S-ZmHDZIV13-bar烟草基因组DNA为模版扩增得到2097bp基因片段为探针进行Southern杂交，具体方法如下：

3.1探针的纯化及标记效率检测

探针标记效率检测是为了确定杂交时最适探针浓度及检测探针敏感性。根据预估合成的探针浓度，将标记的探针和阳性对照稀释到1ng/μl，以该浓度为起始浓度，进行系列稀释，分别稀释成10pg/μL、3pg/μL、1pg/μL、0.3pg/μL、0.1pg/μL、0.03pg/μL、0.01pg/μL、0pg/μL；标记的探针与阳性对照一一对应点在尼龙膜的同一行，选择信号强度相当的乘以相应的稀释倍数，计算出探针的最终浓度。合适的探针浓度较难掌握，可根据杂交效果进行微调，如果背景值较高，可将原来的杂交液进行适当的稀释，信号较低时，再加入少量探针。

3.2拟南芥DNA的提取及定量

样品基因组DNA含量会影响Southern杂交的结果。一次Southern杂交约需10μg总DNA(OD260/OD280＝1.8～2.1)。植物组织基因组较大，要获得较强的杂交信号，样品DNA量在30μg左右为宜。本实验采用改良CTAB法提取DNA，延长样品在55℃提取液中水浴时间至3h，提取的棉花基因组DNA量大，完整性好。提取多个样品需通过电泳或紫外分光光度计来保证各样品之间的DNA含量基本相同，使杂交信号强度一致，有可比性。

3.3限制性内切酶的选择

参见图4：选择BamHⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ、SmaⅠ、XbaⅠ、SacⅠ六个限制性酶消化拟南芥基因组。对于ZmHDZIV13基因，6个内切酶消化基因组的效果较完全，表现出弥散的电泳图谱，且出现卫星条带。对ZmHDZIV14基因除HindⅢ外，其他内切酶消化基因组的效果较完全因此最终选取BamHⅠ、EcoRⅠ、SmaⅠ、XbaⅠ、SacⅠ五个内切酶消化拟南芥DNA。

3.4酶切产物的回收及电泳

酶切16h后取5μl电泳观察拟南芥DNA是否酶切彻底，若酶切后有卫星条带，表明酶切较为彻底。然后加1/10倍体积3mol/L的乙酸钠，0.6-1倍体积预冷的异丙醇，混匀，12000rpm离心10min，沉淀用35μl ddH2O溶解，加5μl loading buffer轻轻混匀，65℃水浴10min，迅速至冰上2-5min，将DNA上样到1％凝胶孔中，40V电泳12h。

3.5转膜与固定

将胶裁成5.0×4.0cm大小，于平皿中用ddH2O冲洗一次，加入100ml 0.25mol/L的盐酸脱嘌呤，室温震荡15-30min，至溴酚蓝变成黄色；ddH2O冲洗两次，加变性液混合液(1.5mol/L NaCL，0.5mol/L NaOH)室温震荡20-30min，可延长至90min，至溴酚蓝恢复到原来的蓝色；用ddH2O冲洗2次，加入2×SSC平衡凝胶5min。

3.5.1虹吸印记法转膜

在清洗干净的方盘中放置一玻璃板，其上放置一滤纸，滤纸两端浸入盘内10×SSC中，用玻璃棒赶走滤纸和平板之间的气泡；将凝胶倒置于玻璃板上，正面朝下，切掉一角作为标记，并用保鲜膜将四周封闭以防吸水纸接触凝胶的边缘造成液体短路；将尼龙膜至于置于平衡凝胶上面，赶走气泡；膜上放两张滤纸，其上再放20层吸水纸；吸水纸上放一玻璃板，其上放600g左右的重物，建立液体从液池经凝胶像尼龙莫的上行通路，以洗脱凝胶中的DNA并使其聚集到尼龙膜上；室温下过夜转膜16h以上，期间更换2-3次吸水纸；转膜后EB染色，观察转膜效果，并标记序号、加样孔位置及对应的分子量标准位置；用2×SSC漂洗尼龙膜1次，滤纸吸干，静止10min。

3.5.2固定

120℃烘烤尼龙膜30min(若稍后进行实验：将干燥的尼龙膜储于2～8℃，用时用2×SSC浸泡5min)

3.6杂交

分2次小心的将64ml ddH₂O加入到试剂盒DIG Easy Hyb Granules中，立即在37℃下搅拌5min至完全溶解，溶解终体积100ml。

预杂交：取8.0ml 65℃预热的DIG Easy Hyb Granules高效杂交液加入杂交管中，排净气泡，65℃杂交炉中预杂交2h(8-15rpm)。

探针变性：将标记的探针沸水浴中变性5～10min，立即放冰上冷却10min。

杂交：排净预杂交液，在8.0ml新DIG Easy Hyb Granules加入4.0μl新变性好的探针(1～3μl/膜，5～20ng/ml杂交液)，混匀，65℃杂交仪中杂交20h(8～15rpm)；杂交完成后，将杂交液回收置于一可耐低温又可耐沸水浴的管中，储于-15～-20℃以备重复使用。使用时解冻并在65℃下变性10min。

3.7洗膜

(1)杂交后室温下，20ml 2×SSC/0.1洗膜2次，每次5min；

(2)预热到50℃，20ml 0.1×SSC/0.1％SDS洗涤2次，每次15min；

(3)然后将膜置于20ml的洗涤缓冲液中平衡2-5min；

(4)在摇床上轻轻摇晃，将膜在10ml封闭缓冲液中孵育30min；

(5)封闭完成后倒出阻断液，加入稀释好的10ml抗体溶液，孵育至少30min；

(6)去除抗体缓冲液，用20ml洗涤缓冲液缓慢洗膜2次，每次15min；

(7)去除洗涤缓冲液，20ml检测缓冲液中平衡膜2次，每次2-5min；

(8)用检测缓冲液稀释300μl NBT/BCIP化学显色底物，在约15ml新鲜制备的显色液中反映显色，在显色过程中勿摇动。16h完成反应，为检测显色程度，中途可短时间曝光观察；

(9)斑点或条带出现后，用50ml TE缓冲液或PCR级用水洗膜5min，照相，结果如图10所示，图10表明：未转化植株和L4未显示任何杂交信号，ZmHDZIV13基因L1、L10转化植株都显示了杂交信号。

三、功能鉴定

(一)干旱对转PCAMBIA3300-35S-ZmHDZIV13-bar烟草幼苗生长的影响

将野生型和转PCAMBIA3300-35S-ZmHDZIV13-bar烟草植株T2代种子种到营养钵中，生长至3叶期，添加20％PEG溶液。PEG胁迫7d后，转ZmHDZIV13基因烟草植株与非转基因植株的长发育状态发生了很大的变化，并且转基因植株与非转基因植株的萎蔫程度也有着明显的差别(见图11)。干旱胁迫时，非转基因植株叶片开始脱水，干旱环境已经对非转基因烟草的生长产生抑制，而转基因植株未受影响；随着胁迫时间延长，转基因烟草植株与非转基因植株都出现了不同程度的萎蔫死亡，但非转基因植株萎蔫程度要比转基因植株严重；说明转基因烟草有一定的抗旱能力，干旱胁迫环境下，ZmHDZIV13基因在一定程度上减轻了干旱对植株的胁迫伤害。

(二)干旱对转PCAMBIA3300-35S-ZmHDZIV13-bar烟草和野生烟草存活率、生物量、相对含水量的变化

干旱处理的T₂代烟草转基因植株和野生型烟草植株，在20％PEG胁迫处理5d后，测定其存活率、叶片相对含水量及生物量，对应结果如图12、图13与图14所示。

图12表明在非胁迫条件下，转基因植株与野生植株的存活率均为100％，PEG胁迫处理5d后，与胁迫条件下野生型相比，转ZmHDZIV13的存活率提高31.38％。

图13所示：在正常条件下野生型和转基因植株的叶片相对含水量都保持在97％左右，无明显差异；干旱处理后，各植株叶片相对含水量均表现为下降，野生型植株叶片相对含水量下降最多，下降了一半以上，其叶片相对含水量只有45.67％，而转ZmHDZIV1基因烟草T2代植株的相对含水量基本都在60％左右，即PEG胁迫5d时，转基因烟草叶片的相对含水量较胁迫下野生型的分别高出41.93％，表明在胁迫条件下，ZmHDZIV13转基因烟草T2代植株的叶片持水性较野生型植株强。

图14所示：在正常条件下生长20d的野生型和转基因单株生物量都保持在1.75g左右，差异不显著；干旱处理后，各植株的生物量均表现为下降，野生型植株叶片生物量下降最多，下降了42.28％。在胁迫条件下，与野生型烟草相比，转ZmHDZIV13基因烟草植株的生物量高出32.68％，因此，转ZmHDZIV13基因烟草对干旱胁迫具有更好的抵御能力。

(三)干旱对转PCAMBIA3300-35S-ZmHDZIV13-bar烟草幼苗丙二醛含量的影响

将野生型和转PCAMBIA3300-35S-ZmHDZIV13-bar烟草植株的T2代种子种在营养钵中，培养至3叶期后用20％PEG溶液处理幼苗根系，5d后称取0.1g叶片于10％三氯乙酸中研磨，12000rpm离心l0min。取2mL上清液与2mL0.6％硫代巴比妥酸混合，于沸水浴中反应15min，迅速冷却后离心。取上清液测定532nm、600nm和450nm波长下的光吸收。

丙二醛(Malondialdehyde,MDA)的浓度根据以下公式计算：C(μmol L^-1)＝6.45(OD₅₃₂-OD₆₀₀)-0.56OD₄₅₀；进一步算出组织中的含量；结果如图15所示。图15表明：在不加PEG的条件下，野生型和转基因植株的丙二醛含量基本无差异，在PEG胁迫处理5d后，相比于胁迫下的野生烟草，转ZmHDZIV13基因烟草叶片的MDA含量显著降低，降低了20.71％；说明干旱胁迫下转ZmHDZIV13植株的膜质过氧化程度明显小于野生型。

(四)干旱对转PCAMBIA3300-35S-ZmHDZIV13-bar烟草幼苗脯氨酸含量的影响

1、按照上述方法，将野生型和转PCAMBIA3300-35S-ZmHDZIV13-bar烟草植株的T2代种子种在营养钵中，培养至3叶期后用20％PEG溶液处理，然后，按照如下方法检测脯氨酸含量：准确称取不同处理的待测植物叶片各0.5g，分别置大管中，然后向各管分别加入5ml 3％的磺基水杨酸溶液，在沸水浴中提取10min，(提取过程中要经常摇动)，冷却后过滤于干净的试管中，滤液即为脯氨酸的提取液。

2、吸取2ml提取液于另一干净的带玻塞试管中，加入2ml冰醋酸及2ml酸性茚三酮试剂，在沸水浴中加热30min，溶液即呈红色。冷却后加入4ml甲苯，摇荡30S，静置片刻，取上层液至10ml离心管中，在3000rpm下离心5min。

3、用吸管轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯为空白对照，在分光光度计上520nm波长处比色，求得吸光度值。结果计算根据回归方程计算出(或从标准曲线上查出)2ml测定液中脯氨酸的含量(Xμg/2ml)，然后计算样品中脯氨酸含量的百分数。计算公式如下：脯氨酸含量(μg/g)＝[X×5/2]/样重(g)；结果如图16所示。图16表明：在非胁迫条件下，野生型和转基因株系中游离脯氨酸的含量基本无差异；在PEG胁迫处理5d后，与胁迫下的野生烟草相比，转基因株系游离脯氨酸含量显著增加，分别提高了33.95％。

Claims (4)

1.一种增强植物抗逆性的相关蛋白；其特征在于：名称为ZmHDZIV13，来源于玉米(Zea mays L.)自交系B73，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示。

2.如权利要求1所述的一种增强植物抗逆性的相关蛋白，其特征在于：该蛋白的编码基因序列如SEQ ID NO：1所示。

3.如权利要求2所述的一种增强植物抗逆性的相关蛋白，其特征在于：重组表达载体或转基因细胞或工程菌含有权利要求2的编码基因。

4.一种增强植物抗逆相关蛋白的编码基因的应用方法；其特征在于：将携带有本发明的ZmHDZIV13基因的表达载体，通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电导、农杆菌介导等常规生物方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物经组织培育成植株，获得抗旱抗逆性提高的植株。