CN113826502B - 一种提高油茶种子中类黄酮含量的方法 - Google Patents

一种提高油茶种子中类黄酮含量的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN113826502B
CN113826502B CN202111062023.1A CN202111062023A CN113826502B CN 113826502 B CN113826502 B CN 113826502B CN 202111062023 A CN202111062023 A CN 202111062023A CN 113826502 B CN113826502 B CN 113826502B
Authority
CN
China
Prior art keywords
camellia
camellia oleifera
seeds
seed coats
pollination
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202111062023.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113826502A (zh
Inventor
龚文芳
宋启玲
袁德义
纪珂
向晓峰
陈乐�
王林凯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Central South University of Forestry and Technology
Original Assignee
Central South University of Forestry and Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Central South University of Forestry and Technology filed Critical Central South University of Forestry and Technology
Priority to CN202111062023.1A priority Critical patent/CN113826502B/zh
Publication of CN113826502A publication Critical patent/CN113826502A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113826502B publication Critical patent/CN113826502B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01G—HORTICULTURE; CULTIVATION OF VEGETABLES, FLOWERS, RICE, FRUIT, VINES, HOPS OR SEAWEED; FORESTRY; WATERING
    • A01G7/00—Botany in general
    • A01G7/06—Treatment of growing trees or plants, e.g. for preventing decay of wood, for tingeing flowers or wood, for prolonging the life of plants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N37/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most two bonds to halogen, e.g. carboxylic acids
    • A01N37/42—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most two bonds to halogen, e.g. carboxylic acids containing within the same carbon skeleton a carboxylic group or a thio analogue, or a derivative thereof, and a carbon atom having only two bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. keto-carboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
    • C12Y114/11—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with 2-oxoglutarate as one donor, and incorporation of one atom each of oxygen into both donors (1.14.11)
    • C12Y114/11023—Flavonol synthase (1.14.11.23)

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Ecology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Forests & Forestry (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)

Abstract

本发明涉及油茶次生代谢产物技术领域，尤其涉及一种提高油茶种子中类黄酮含量的方法，在油茶种子形成过程中增加油茶种子中的茉莉酸甲酯含量。类黄酮的生物合成受到多种内部和外部因素的控制，本发明研究了环戊酮类植物激素茉莉酸甲酯对油茶种子中的次生代谢产物类黄酮的影响，通过油茶种子不同发育阶段的代谢组学分析、不同发育阶段差异表达基因的比较、黄酮类化合物的积累模式和成份分析、代谢与转录组的联合分析等手段发现，油茶种子中的茉莉酸甲酯的含量增加会增强其中类黄酮的积累。

Description

一种提高油茶种子中类黄酮含量的方法
技术领域
本发明涉及油茶次生代谢产物技术领域，尤其涉及一种提高油茶种子中类黄酮含量的方法。
背景技术
类黄酮(Flavonoid)是广泛存在于植物中的次级代谢产物，它们是高等植物中 最具特征的化合物之一。在植物体内，类黄酮大部分与糖结合成苷类存在于花、叶、 果实等多个部位，有一部分是以游离态(苷元)的形式存在于木质部中。迄今为止， 10000种类黄酮结构被分离鉴定，它们在植物的生长发育以及抗逆等方面均起着重要 的作用。此外，类黄酮是一类重要的天然产物，具有广泛的健康促进作用，是各种保 健食品、药物和化妆品应用中必不可少的成分。类黄酮可以直接清除活性氧自由基、 激活抗氧化酶、抑制氧化酶以及提高低分子量抗氧化剂的抗氧化性能等。富含类黄酮 的水果和蔬菜可作为癌症化学预防剂的植物性原料，在防御和治疗阿尔茨海默氏病、 动脉粥样硬化等方面起到重要的作用。多项临床研究发现类黄酮可以有效安全的治疗 肝胆功能障碍等方面的疾病。而且通过食用富含类黄酮的水果和蔬菜来摄入类黄酮可 能是抵抗疾病和调节身体最简单安全的方法。
类黄酮是指黄酮类化合物，是一大类天然产物，类黄酮可分成黄酮类(Flavones)、黄酮醇类(Flavonols)、二氢黄酮醇类(Flavanonols)、黄烷酮类(Flavanones)、 黄烷醇类(Flavanols)、查尔酮类(Chalcones)、花青素类(Anthocyanins)、异黄 酮类(Isoflavones)等亚组。类黄酮化合物的生物合成受多种内部和外部因素的控制， 其中植物激素是关键的调节因子之一。如赤霉素和脱落酸通过控制类黄酮生物合成基 因的转录水平来影响类黄酮的积累。乙烯介导的类黄酮积累调控主要通过乙烯信号转 导通路的调控因子来控制结构基因的表达，导致各种黄酮成分的积累。
油茶(Camellia oleifera Abel.)是世界四大木本油料之一，在我国有2300多年的栽 培历史。油茶种子主要含油分、蛋白质、淀粉、皂素、茶籽多糖、黄酮类化合物、多 酚类物质和粗纤维，还有少量的鞣质。油茶种子不仅含有丰富的糖类、蛋白质、淀粉、 脂肪酸等营养成分，还富含多种有益健康的生物活性物质，调节血管通透性、提高记 忆力、抗抑郁、保护中枢神经系统，预防冠心病和癌症，并减少DNA氧化损伤以 预防自由基相关疾病。此外，油茶种子经榨油后，产生了大量的副产物——茶粕，而 茶粕中含有多种有效成分，其中包括黄酮类物质。药学药效质量表征关联分析发现油 茶种子中的黄酮类成分为其抗血栓、抗心肌缺血和抗痴呆药物体系构架的主要有效物 质基础。目前，油茶中的类黄酮研究主要集中在提取技术的探索与优化方面，无法高 效、系统、全面地表征油茶的类黄酮物质基础。
发明内容
本发明旨在提供一种提高油茶果实中类黄酮含量的方法，从而为进一步开发油茶相关的保健产品提供了有价值的信息。
具体地，一种提高油茶种子中类黄酮含量的方法，在油茶种子形成过程中增加 油茶种子中的茉莉酸甲酯含量。
类黄酮的生物合成受到多种内部和外部因素的控制，本发明研究了环戊酮类植物激素茉莉酸甲酯对油茶种子中的次生代谢产物类黄酮的影响，通过油茶种子不同发 育阶段的代谢组学分析、不同发育阶段差异表达基因的比较、黄酮类化合物的积累模 式和成份分析、代谢与转录组的联合分析等手段发现，油茶种子中的茉莉酸甲酯的含 量增加会增强其中类黄酮的积累。
在一些可能的实施方式中，所述增加油茶种子中的茉莉酸甲酯含量通过以下中的任一种或多种方式进行：
(a)在油茶种子形成过程中喷施茉莉酸甲酯或茉莉酸甲酯合成的前体物质；
(b)增加所述油茶种子形成过程中茉莉酸甲酯合成关键基因的表达。
增加油茶种子形成过程中茉莉酸甲酯合成关键基因的表达既包括化学物质的策略，如通过控制茉莉酸甲酯合成关键基因过表达诱因的发生；也包括分子生物手段， 如所用的油茶品种为过表达茉莉酸甲酯合成关键基因的植株。
研究发现，油茶种子中的茉莉酸甲酯含量与类黄酮含量呈现正相关，两者均在 授粉后的第258天达到高峰，检测发现，在油茶授粉之日起的第258-292天采集油茶种 子，油茶种子中的类黄酮含量较高；若是油茶喷施茉莉酸甲酯溶液，则在喷施后的第 4-6周类黄酮含量较高。
具体地，在油茶授粉之日起的第258-292天采集油茶种子，提取油茶种子中的类黄酮；
或在油茶授粉之日起的第210天开始喷施0.5mmol/L的茉莉酸甲酯溶液，每隔两周喷施一次，喷施后的第4-6周采集油茶种子，提取油茶种子中的类黄酮。
研究发现，油茶种子包括种皮和种仁，种皮和种仁中均含有类黄酮，其中，按 单位量计，种皮中的类黄酮含量更高，因此，本发明对种皮中的类黄酮含量进行了检 测，发现，在油茶授粉之日起的第210天开始喷施0.5mmol/L的茉莉酸甲酯溶液，每 隔2周喷施一次，于喷施茉莉酸甲酯溶液之日起的第252±2天采集油茶种子，提取油 茶种子种皮中的类黄酮，此时，种皮中的类黄酮含量更高。
若是提高油茶种皮中类黄酮含量，所述类黄酮为表儿茶素，在油茶授粉之日起 的第210天开始喷施0.5mmol/L或2.5mmol/L的茉莉酸甲酯溶液，每隔2周喷施一次， 于授粉后的第252±2天采集油茶种子，提取油茶种子种皮中的表儿茶素，此时，种皮 中的表儿茶素含量更高；
或在油茶授粉之日起的第210天开始喷施2.0mmol/L的水杨苷异羟肟酸，每隔2 周喷施一次，于授粉后的第266天采集油茶种子，提取油茶种子种皮中的表儿茶素， 此时，种皮中的表儿茶素含量更高。
若是提高油茶种皮中类黄酮含量，所述类黄酮为芦丁，在油茶授粉之日起的第210天开始喷施0.5mmol/L的茉莉酸甲酯溶液，每隔2周喷施一次，于授粉后的第231 ±2天或252±2天采集油茶种子，提取油茶种子种皮中的芦丁，此时，种皮中的芦丁 含量更高。
若是提高油茶种皮中类黄酮含量，所述类黄酮为金丝桃苷，在油茶授粉之日起 的第280天采集油茶种子，提取油茶种子种皮中的金丝桃苷，此时，种皮中的金丝桃 苷含量更高；
或在油茶授粉之日起的第210天开始喷施0.1-2.5mmol/L的茉莉酸甲酯溶液，每隔2周喷施一次，于授粉后的第280天采集油茶种子，提取油茶种子种皮中的金丝桃苷， 此时，是否喷施茉莉酸甲酯溶液对种皮中的金丝桃苷含量影响不大。
若是提高油茶种皮中类黄酮含量，所述类黄酮为异槲皮苷，在油茶授粉之日起 的第307天采集油茶种子，提取油茶种子种皮中的异槲皮苷，此时，种皮中的异槲皮 苷含量更高；
或在油茶授粉之日起的第210天开始喷施2.5-5.0mmol/L的茉莉酸甲酯溶液，每隔2周喷施一次，于授粉后的第280±2天采集油茶种子，提取油茶种子种皮中的异槲 皮苷，此时，种皮中的异槲皮苷含量更高。
若是提高油茶种皮中类黄酮含量，所述类黄酮为柚皮素，在油茶授粉之日起的 第210天开始喷施0.1mmol/L的茉莉酸甲酯溶液，每隔2周喷施一次，于授粉后的第280 天采集油茶种子，提取油茶种子种皮中的柚皮素，此时，种皮中的柚皮素含量更高；
或在油茶授粉之日起的第210天开始喷施0.5mmol/L的茉莉酸甲酯溶液，每隔2 周喷施一次，于授粉后的第294天采集油茶种子，提取油茶种子种皮中的柚皮素，此 时，种皮中的柚皮素含量更高。
类黄酮生物合成基因的转录调控涉及几类转录因子之间的组合相互作用，例如R2R3 MYB结构域(MYB)、碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)和来自调节MWB复合物 的WD-重复蛋白(WD)植物中类黄酮化合物的合成。MYB和bHLH基因的异常 表达会影响类黄酮的生物合成。MYB和bHLH的成员通过调节参与类黄酮途径的 结构基因的转录来调节苹果和梨中类黄酮的积累。此外，WRKY家族成员通过控制 类黄酮相关结构基因的表达来调节类黄酮生物合成。
类黄酮化合物的生物合成也受多种内部和外部因素的控制，其中植物激素是关键的调节因子之一。赤霉素和脱落酸通过控制类黄酮生物合成基因的转录水平来影响 类黄酮的积累。乙烯介导的类黄酮积累调控主要通过乙烯信号转导通路的调控因子来 控制结构基因的表达，导致各种黄酮成分的积累。此外，茉莉酸信号通路的调节剂可 以直接与MYB和bHLH相互作用，作用于相应的靶基因，从而激活黄酮类生物合 成通路中结构基因的表达。外源茉莉酸甲酯的应用显著上调了参与类黄酮生物合成途 径的结构基因和转录因子的表达。
植物代谢组是指生物体内源性代谢物质的动态整体。对生物样本中所有低分子量代谢产物进行定性和定量分析。基于代谢组学，类黄酮研究从整体出发，系统地分 析植物中所有类黄酮成分及其随植物器官发育阶段的变化，全面阐述了植物类黄酮代 谢过程。此外，加权基因共表达网络分析(WGCNA)已被频繁用于识别植物中潜在 的靶基因和转录因子。
类黄酮化合物通过苯丙烷途径生物合成，并由一系列酶催化，包括苯丙氨酸解 氨酶(PAL)、查尔酮合酶(CHS)和查尔酮异构酶(CHI)，它们是产生常见前体柚皮 素。柚皮素是类黄酮生物合成的核心中间体，通过多种酶异构化为各种中间体，产生 不同种类的黄酮类化合物。类黄酮3-羟化酶(F3H)、类黄酮3'-羟化酶(F3'H)和类 黄酮3'5'-羟化酶(F3'5'H)是花青素、黄酮醇和原花青素代谢分支共有的催化酶，导 致类黄酮的化学多样性；黄酮醇合成酶(FLS)专用于黄酮醇生物合成；二氢黄酮醇 4-还原酶(DFR)、花青素合酶(ANS)和UDP-葡萄糖基转移酶(UGT)与花青素的 生物合成特别相关。此外，无色花青素还原酶(LAR)和花青素还原酶(ANR)是调 节原花青素生物合成的关键酶。
本发明通过综合分析，从总体表达情况来看，FLS的表达与喷施茉莉酸甲酯溶 液处理组中的类黄酮的积累量基本一致，说明在喷施茉莉酸甲酯溶液过程中，FLS的 表达情况与喷施茉莉酸甲酯溶液密切相关，因此，过表达油茶中的FLS基因可达到增 加黄酮醇类积累的效果。
进一步地，FLS基因在提高油茶种子中黄酮醇类含量的应用，其中，所述FLS基 因的核酸序列如SEQ ID NO:1所示。如可以通过过表达油茶中的FLS基因来达到提高 油茶种子中黄酮醇类含量。
基因过表达的一般步骤如下：目的基因克隆，并选择特定的载体(含增强的启动子)，将目的基因连接在特定的载体上；然后将载体导入生物材料中。其中，载体介 导转化方法，即将目的基因插入到农杆菌的质粒或病毒的DNA等载体分子上，随着 载体DNA的转移而将目的基因导入到植物基因组中。另外，还可以通过其他途径， 如种质系统法，包括花粉管通道法、生殖细胞侵染法、胚囊和子房注射法；又如基因 直接导入法，通过物理或化学的方法直接将外源目的基因导入植物的基因组中，物理 方法包括基因枪转化法、电激转化法、超声波法、显微注射法和激光微束法等，化学 方法有PEG介导转化方法和脂质体法等。具体内容按照常规步骤进行。
本发明中，对油茶树的喷施一般为树干以上的树枝、树叶以及果实的喷施。但 并不限于此，也可以只喷施油茶树的部分组织，如包括根、茎、叶、果实中的任一种 或多种。
本发明与现有技术相比所具有的有益效果：
(1)本发明通过化学提取以及分子生物学手段，研究了油茶种子中类黄酮含量 的影响因素，发现，在油茶种子形成过程中增加油茶种子中的茉莉酸甲酯含量有助于 提升油茶种子中类黄酮的含量。
(2)本发明还提供了不同浓度茉莉酸甲酯和水杨苷异羟肟酸对油茶种皮中类黄酮、表儿茶素、芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、柚皮素含量的影响，为油茶种子的收获 时期提供良好的技术基础。
(3)本发明中，使用的茉莉酸甲酯溶液为安全高效的制剂，不会对人体造成伤 害，并对环境友好，可切实提高油茶果实的类黄酮含量，对油茶果实多元化利用，帮 助农户提高经济效益。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1示出了本发明实施例1提供的油茶种子在五个生长期的表型表征和主成分分析(PCA)分析图，其中：M1：210DAP，M2：235DAP，M3：258DAP，M4：292 DAP，M5：333DAP；
图2示出了本发明实施例1提供的油茶种子发育过程中不同比较中上调和下调的DEG数量的转录组学分析柱形图，其中，T1：210DAP，T2：235DAP，T3：258DAP， T4：292DAP，T5：333DAP；
图3示出了本发明实施例1提供的确定的DEGs的表达趋势图；
图4示出了本发明实施例1提供的通过HPLC和UPLC-MS/MS在五个发育阶段 测量油茶种子的黄酮类化合物积累柱形图；
图5示出了本发明实施例1提供的与图4对应时间种子中黄酮类化合物积累的新鲜手部切片共聚焦显微镜观察图；
图6示出了本发明实施例1提供的油茶种子发育过程中内源性茉莉酸甲酯浓度的曲线图；
图7示出了本发明实施例1提供的油茶种子发育过程中与JA生物合成和信号通路相关的DEGs的转录谱，色标表示不同生长期的log2(RPKM值)，色阶从左到右的 进展代表FPKM值的增加；
图8示出了本发明实施例1提供的茉莉酸甲酯处理的(0.5mmol/L，J0.5)和对照 中油茶种子中的黄酮类积累柱形图；
图9示出了本发明实施例1提供的与图8对应时间种子中黄酮类化合物积累的新鲜手部切片共聚焦显微镜观察图；
图10-12示出了本发明实施例1提供的结构基因和转录因子在茉莉酸甲酯处理和对照种子中与类黄酮生物合成相关的基因表达谱；
图13示出了本发明实施例1提供的外源性茉莉酸甲酯调节油茶种子类黄酮积累的模拟模型；
图14示出了本发明实施例2提供的不同浓度的茉莉酸甲酯溶液对油茶种皮中类黄酮含量的影响柱形图；
图15示出了本发明实施例2提供的不同浓度的水杨苷异羟肟酸溶液对油茶种皮中类黄酮含量的影响柱形图；
图16示出了本发明实施例2提供的不同浓度的茉莉酸甲酯和水杨苷异羟肟酸溶液对油茶种皮中表儿茶素含量的影响柱形图；
图17示出了本发明实施例2提供的不同浓度的茉莉酸甲酯和水杨苷异羟肟酸溶液对油茶种皮中芦丁含量的影响柱形图；
图18示出了本发明实施例2提供的不同浓度的茉莉酸甲酯和水杨苷异羟肟酸溶液对油茶种皮中金丝桃苷含量的影响柱形图；
图19示出了本发明实施例2提供的不同浓度的茉莉酸甲酯和水杨苷异羟肟酸溶液对油茶种皮中异槲皮苷含量的影响柱形图；
图20示出了本发明实施例2提供的不同浓度的茉莉酸甲酯和水杨苷异羟肟酸溶液对油茶种皮中柚皮素含量的影响柱形图。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面结合附图和具体 实施方式对本发明进行进一步的详细描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申 请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还 可以采用其他不同于在此描述的其他方式来实施，因此，本发明的保护范围并不限于 下面公开的具体实施例的限制。
实施例1
一、方法
1.材料
本研究以油茶优良品种“华硕”为试验材料，种植于中南林业科技大学试验田， 位于湖南省长沙市望城区(28°05′N,113°2′E)。选取生长条件和生长势相近且无病害的 20株油茶树进行授粉记录。2019年，分别在在授粉后210天(DAP)、235DAP、 258DAP、292DAP和333DAP，从油茶树的四个主要方向随机采集样品。2020年， CK组和茉莉酸甲酯溶液(0.5mmol/L)处理组不同时间喷施12棵油茶树，其中，CK (阴性对照)喷施的液体为含有体积浓度为0.1％酒精和体积浓度为0.01％Tween-20 中的清水溶液，茉莉酸甲酯溶液(0.5mmol/L)是以含有体积浓度为0.1％酒精和体积 浓度为0.01％Tween-20中的清水溶液作为溶剂溶解茉莉酸甲酯得到，喷施时间选择 阴天的早上或者傍晚，每棵树要均匀喷施直至树体呈滴水状态以保证充分吸收。喷施 溶液处理的组别喷施后间隔两周收集材料，若收集材料与喷施为同一天，先收集材料， 然后再进行喷施。每个处理有3个生物重复，每个重复2棵树。采样得到的种子即用液 氮冷冻后保存在-80℃待进一步分析使用。
2.代谢物提取和非靶向代谢分析
分别收集5个不同发育阶段的油茶种子(210DAP＝M1,235DAP＝M2,258 DAP＝M3,292DAP＝M4,333DAP＝M5；五个时间点×三个生物学)，液氮速冻 后于-80℃中保存备用。取出超低温冷冻保存的油茶种子，进行真空冷冻干燥。干燥 后的样品，利用研磨仪(MM 400,Retsch)在30Hz条件下研磨1.5min。称取100mg 的粉末，利用含有0.1mg/L利多卡因作为内标的70％甲醇1.0mL于4℃提取过夜，期间 涡旋三次，使提取更为充分。提取后，10,000g离心10min，吸取上清，用微孔滤膜 (0.22μm)过滤样品，并保存在进样瓶中随后用于LC-MS/MS分析。UPLC分析条件 主要包括：①色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18 1.8μm(2.1mm*100mm)； ②流动相：水相为超纯水(加入0.04％的乙酸)，有机相为乙腈(加入0.04％的乙酸)； ③洗脱梯度：0min水/乙腈(95:5V/V)，11.0min为5:95V/V，12.0min为5:95V/V， 12.1min为95:5V/V，15.0min为95:5V/V；④流速0.4mL/min；柱温40℃；进样量2μL。分离的样品进入ESI-QTRAP-MS进行质谱分析。质谱条件主要包括：电喷雾离子源温 度：550℃；质谱电压：5500V；帘气：25psi；碰撞诱导电离参数设置为高；每个离 子对根据优化的去簇电压和碰撞能进行扫描检测。所得到的数据利用软件Analyst 1.6.1(AB SCIEX)进行数据处理。
质谱数据处理方法：
(1)代谢物定性：根据公共数据库与自建数据库对代谢物进行定性分析。其中 部分物质定性，分析时去除了同位素信号，含K+离子、Na+离子、NH4+离子的重复 信号，以及本身是其他更大分子量物质的碎片离子的重复信号。代谢物结构解析参考 Mass Bank、KNAPSAc K、HMDB、MoTo DB和METLIN等已有的质谱公共数据库。
(2)代谢物定量：利用三重四级杆质谱的多反应监测模式(multiple reactionmonitoring，MRM)进行分析。通过三重四级杆筛选出每个物质的特征离子，在检测 器中获得特征离子的信号强度(CPS)，用Multia Quant软件打开样本下机质谱文件。 获得不同样本的代谢物质谱分析数据后，对所有物质质谱峰进行峰面积积分，并对其 中同一代谢物在不同样本中的质谱出峰进行积分校正，以确保定量的准确性。最后导 出所有色谱峰面积积分数据保存。将OPLS-DA的项目变量重要性(VIP)值与多变量 统计分析和T检验的P值相结合，用作单变量统计分析来筛选样品之间存在差异的代 谢物。VIP≥1且T检验P值<0.05的样品代谢物被认为是差异积累代谢物。基于代谢物 丰度，使用R包(www.r-project.org/)进行主成分分析(PCA)。
3.RNA提取、RNA测序和转录组分析
使用Trizol试剂盒(Invitrogen)按照制造商的说明提取每个样品(210DAP、235DAP、258DAP、292DAP和333DAP)的总RNA。使用1％琼脂糖电泳和Agilent 2100 生物分析仪(安捷伦科技公司，帕洛阿尔托，美国)确认RNA的完整性和浓度。对 于每个样品，使用磁性寡核苷酸(dT)珠纯化mRNA并破碎成小块。使用NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit forIllumina(NEB，美国)构建cDNA文库。使用Illumina HiSeqTM 4000由Gene DenovoBiotechnology Co.(中国，广州)进行测序。总共对15 个样本(210DAP＝T1、235DAP＝T2、258DAP＝T3、292DAP＝T4、333DAP＝T5； 五个时间点×三个生物学)进行了测序。使用fastp(0.18.0版)获得高质量的干净 读数，通过去除包含适配器的读数、超过10％的未知核苷酸(N)和低质量读数(Q 值≤20)。使用RSEM软件对转录本丰度进行量化并标准化为每百万映射读取的每 千碱基读取数(RPKM)。使用DESeq2软件执行显示差异的基因。错误发现率(FDR) <0.05和倍数变化≥2的基因被鉴定为显着差异表达基因(DEG)。对基因本体论 (GO)功能和京都基因和基因组百科全书(KEGG)途径进行了DEG的富集分析，以 获得对油茶籽发育过程中DEG的详细描述。
4.类黄酮和内源性茉莉酸甲酯含量的测定
类黄酮的提取和分析如下：
将0.5g样品在液氮中研磨，并在超声波处理器中用7mL 70％的甲醇在4℃ 下萃取30分钟。在10000rpm离心10分钟后，残留物加入3ml 70％的甲醇并 按上述方法重新提取。合并上清液，用氮吹仪在35℃下浓缩至1/3体积。用微孔膜(0.22 μm)过滤，4℃保存用于HPLC分析。
数据采集仪器系统主要包括高效液相色谱(HPLC)，色谱柱：Agilent EclipesPlus C18液相色谱柱(4.6mm×100nm，3.5μm)，液相条件主要包括：流动相A：乙酸水溶 液(超纯水添加0.01％体积的冰乙酸)；流动相B：纯乙腈溶液；洗脱梯度0-5min， 15％-20％流动相B；5-10min，20％-25％流动相B；10-15min，25％-45％流动相B； 15-20min，45％-80％流动相B；20-25min，80％-45％流动相B；25-26min，45％-15％流 动相B；26-30min，15％流动相B；流速0.6ml/min；柱温30℃；进样量10μl；检测波 长280nm。
根据代谢组学，选择含量较高且常用的芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、l-表儿茶素 和柚皮素作为标准品。
配置标准品溶液的方法：分别配制芦丁、表儿茶素、金丝桃苷、异槲皮苷、柚 皮素浓度为0.1mg/ml、0.125mg/ml、0.17mg/ml、0.25mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml的标 准溶液；采用外标法进行类黄酮含量计算。
所有标准品均购自阿拉丁(上海阿拉丁生化科技有限公司，上海)。
内源性茉莉酸甲酯含量的测定：
取0.5g种子在液氮中粉碎，用9mL 0.01mol/L PBS(pH 7.2-7.4)悬浮，25℃3000rpm离心20min，上清液用于测定内源性茉莉酸甲酯含量。使用茉莉酸甲酯 ELISA试剂盒(上海晶康生物工程有限公司，中国上海)按照制造商的说明测定和 计算内源性茉莉酸甲酯含量。
5.类黄酮染色
将新鲜徒手切成的种皮和种仁用在0.01％(v/v)Triton X-100中的2.52mg/mL 二苯硼酸2-氨基乙基酯(DPBA)染色25分钟，并在水中洗涤2分钟。使用共焦激光扫 描显微镜cLSM-510META(版本4.2SP1)连接到Axiovert 200M(卡尔·蔡司)上拍摄 图像。设置如下：类黄酮的激发波长是488nm，发射波长是500-650nm。所有图像均 使用LSM图像浏览器4.2版(Carl Zeiss)处理。
6.代谢与转录组的联合分析
加权基因共表达网络分析(WGCNA)R包用于研究类黄酮生物合成的调控网络 并探索可能涉及的转录因子。筛选出1880个转录因子、229个参与黄酮生物合成的结 构基因(FPKM>1)和59个差异积累的类黄酮进行综合分析。WGCNA R包中的动 态树切割(合并切割高度＝0.75，最小模块大小＝50)用于识别分层树中的相似模块。 使用Pearson相关性与t检验(Ttest)(p<0.05)计算模块特征基因值并用于评估模块和 类黄酮成分之间的关联。使用Cytoscape 3.7.2可视化监管网络。
7.qRT-PCR的基因验证和表达分析
按照Trizol试剂试剂盒说明书(Invitrogen公司，美国卡尔斯巴特)提取RNA。用II Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)kit(Vazyme,China)按规格合成 第一链cDNA。利用Primer Premier Software(v.5.0)设计特异性引物。选取EF-1a基因作 为内参基因。使用用户手册中描述的ChamQ Universal SYBR qPCRMaster Mix试剂盒(Vazyme，中国)进行qRT-PCR。使用2-ΔΔCt方法计算相对表达量。
二、结果
1.油茶种子不同发育阶段的代谢组学分析
为了全面了解油茶种子在代谢过程中的变化，我们使用UPLC-MS/MS进行了非 靶向代谢分析。主成分分析(PCA)显示不同阶段发育中的油茶种子之间存在明显的 分离，并且样品之间66.3％的差异可以用PCA1(47.6％)和PCA2(18.7％，图1)来 解释，表明代谢随着油茶籽的发育，这些样品中的代谢物有显著的动态变化。此外， PCA在生物重复之间表现出较低的变异性，表明重复之间具有良好的一致性。
共识别出433个代谢物，其中黄酮类148个，酚酸类60个，氨基酸及其衍生物46 个，核苷酸及其衍生物36个，有机酸类27个，糖类和醇类21个，生物碱类16个，其他 代谢物56个。
VIP≥1、t检验P值<0.05的代谢物离子为显著差异代谢物。与M1期相比，M2期 有38个差异代谢物增加；M1-vs-M3比较组包含77个差异代谢物，其中44个上调代谢 物，33个下调代谢物；在M1-vs-M4和M1-vs-M5比较中，分别检测到43和54个下调的 代谢物。值得注意的是，5个生长期共有45种差异代谢物(11种普遍上调，19种普遍下 调)，其中黄酮类化合物最为丰富，共21种化合物。
2.油茶种子不同发育阶段差异表达基因的比较分析
为了揭示差异代谢物积累的基因表达，分析了发育种子的转录组。总共获得了4685-5981万个clean read，Q30和Q20分别大于92％和97％，GC含量为46.05-49.48％， 表明RNA的高通量和质量序列数据。通过对5个生长期的样品进行成对比较，总共检 测到22,438个差异基因(DEGs)。与T1阶段相比，3322(2151)、5019(2844)、5458(7461)、4859(10,587)个DEGs在T2、T3、T4和T5阶段分别显著上调(下调； 图2，图2中每组并列的柱形图，左边为上调，右边为下调)。此外，在所有四个比较 对中检测到2685个DEGs。为了反映油茶种子发育过程中的主要趋势和关键DEG，通 过K-means方法将所有22,438个DEG分配到20个簇中。总共有8818、4331、3726和1588 个DEG分别显著地归类为0、16、19和18表达簇(图3)。随后对这些簇进行了GO富 集分析，结果表明“氧化还原酶活性”、“单加氧酶活性”和“裂解酶活性”在“分子功能” 中占主导地位，“外部包封结构”、“细胞外围”和“膜的内在成分”在“分子功能”中更为 丰富。“生物过程”中，“单一生物过程”、“分生组织发育的调节”、“黄酮类生物合成 过程”和“黄酮类代谢过程”占主导地位。基于KEGG富集分析，这些样品中具有不同表 达模式的DEGs与代谢途径、次级代谢产物的生物合成、苯丙烷生物合成、淀粉和蔗 糖代谢、碳代谢和类黄酮生物合成途径有关。
3.油茶种子发育过程中黄酮类化合物的积累模式和成份分析
结合代谢组和转录组分析结果，类黄酮是油茶种子中的主要代谢产物，DEGs也 富含类黄酮途径。因此，我们专注于类黄酮生物合成的研究。我们首次报告了油茶代 谢组，并且类黄酮是最丰富的代谢物，占油茶籽总代谢物的34.18％。代谢物谱表明类 黄酮含量在258DAP时显著增加并达到峰值，但在333DAP时降低(图4)。HPLC结 果和新鲜种子切片也显示出与发育种子中类黄酮差异积累的代谢物谱一致的结果(图 4和图5)。共鉴定出类黄酮148种，其中黄酮醇54种、黄酮类36种、黄烷醇11种、原 花青素11种、二氢黄酮10种、黄酮碳苷9种、二氢黄酮醇7种、异黄酮6种、花青素3 种、1个发育阶段。与M1期相比，在M1-vs-M2、M1-vs-M3、M1-vs-M4和M1-v-M5比 较中分别鉴定出12、32、22和24种差异累积的类黄酮。两种黄酮醇(kaempferolglc-rha and kaempferol 3-o-rutinoside(Nicotiflorin))、两种类黄酮(diosmetin-7-o-galactoside； luteolin-7-o-glucoside)、一种黄烷醇(gallicacid)和一种异黄酮(phloretin 2'-o-glucoside) 在所有四个比较对中检测到差异累积的类黄酮。
4.共表达网络分析确定了类黄酮相关的DEGs
为了研究油茶种子中类黄酮合成的基因调控网络，利用225个与类黄酮合成相关的结构基因和1880个转录因子构建了WGCNA。WGCNA分析中也添加了差异积累的 类黄酮化合物。这些基因聚类成7个主基因模块，模块-类黄酮化合物关系分析显示， 主要的两个模块与大部分花青素、二氢黄酮、二氢黄酮醇、黄烷醇、黄酮、黄酮-碳 酸酯、黄酮醇、异黄酮和原花青素的相关性最高(|相关系数|>0.7，p值<0.05)。此外， 类黄酮合成结构基因在这些模块中大量富集，进一步证明这些共表达基因聚集成的主 要模块参与了油茶种子中类黄酮的积累。
为了进一步确定两个模块内的基因关系，根据基因之间的连通性筛选高连锁基因，构建基因相关网络。其中一个模块的网络图包含18个看似紧密相连的独特基因， 其中转录因子WRKY26和MYB86与类黄酮相关结构基因呈高度正相关。bHLH128与类 黄酮合成的结构基因如PAL、F3H、F3'H2、ANS、ANR2、DFR呈正相关。此外，MYC2 与WRKY26、MYB86、bHLH128等转录因子具有较强的相关性。提示MYC2参与了油 茶种子中类黄酮的生物合成，并通过茉莉酸途径调控类黄酮的积累。在另一个模块中， F3'5'H2、CHI、WRKY32、MYB44的网络连通性最高。其中，F3'5'H2、CHI、ANS、 4CL7、UGT94P1、C4H等连接度最高的基因在黄酮和黄酮醇、类黄酮、苯丙素、花 青素等生物合成中发挥重要作用。WRKY32和MYB44与类黄酮合成相关的结构基因具 有较强的相关性，说明WRKY32和MYB44在该模块中对类黄酮的合成有较大的贡献。
5.类黄酮生物合成途径的基因表达和代谢产物积累
类黄酮的生物合成是一个动态复杂的过程，具有一系列结构基因和调控因子。 随着油茶种子的发育，大量差异表达的类黄酮相关结构基因的转录水平减少。结果显 示，11个PAL在210和292DAP时高表达，并且观察到L-苯丙氨酸积累的相反模式。 在292DAP中发现9个4CL的高表达。CHS和CHI的表达随着油菜种子的发育而降低。 编码F3’H2、F3’5’H2和F3H的基因的表达在210和235DAP中增强，并且观察到与二 氢黄酮相关的一致模式。我们观察到5个FLS基因显著上调，并且黄酮醇的含量在235 和258DAP增加。两个DFR、8个ANS和两个UGTs的表达水平持续降低。在种子发育 后期发现10个UGTs的高表达。此外，发现12个ANR和2个LAR基因的表达模式分别与 黄烷酮和原花色素的表达模式一致。同时，我们发现花青素(天竺葵素、花青素和飞 燕草素)在210和235DAP的积累较低，这可能是由DFR、ANS、ANR和UGT的共同调 节引起的。
bHLH3、bHLH128、MYB86、MYB44、WRKY26、WRKY32和MYC2的转录因子 随着油菜籽的发育而持续减少。除4CL7和FLS外，这些转录因子与大多数结构基因之 间存在正相关。相反，bHLH18和bHLH155的表达随着油茶种子的发育而逐渐增加， 并且与除4CL7和FLS外的大多数结构基因呈负相关。此外，这些转录因子与在共表达 网络的另个主要模块中鉴定的那些大致一致。
6.油茶种子发育过程中茉莉酸甲酯与黄酮类生物合成的关系
内源性茉莉酸甲酯的含量从210到258DAP显著增加，增加了0.91倍，然后下降 到333DAP，相对于258DAP，减少了52.44％(图6)。分析发现，茉莉酸甲酯与黄酮 醇和类黄酮的含量呈显著正相关，而与查尔酮和黄酮类碳苷的含量呈负相关。从转录 组中分别筛选出52个和21个与JA生物合成和信号转导相关的基因进行聚类分析。11 个脂氧合酶(LOX)、2个丙二烯氧化环化酶(AOC)、3个丙二烯氧化合酶(AOS)和1 个含氧化_FMN结构域蛋白(OPR3)的表达随种子发育显著降低。在信号转导中， 所有coronatine insensitive 1(COI1)在258DAP高表达，333DAP低表达；6个茉莉酸 -zim结构域蛋白基因(JAZ)的表达水平在210DAP时有较高的表达。两个MYC2(与 黄酮类合成的结构基因高度相关)，在210DAP表达水平较高，但与210DAP相比， 333DAP表达水平显著降低74％以上；与210DAP相比，258DAP时的2个茉莉酸-酰 胺合成(JAR1)的表达水平显著增加了61.21和43.63倍(图7)。
为了评估茉莉酸甲酯对油茶种子类黄酮合成的影响，使用0.5mmol/L茉莉酸甲 酯(J0.5)喷洒整棵树。茉莉酸甲酯处理的种子和对照种子的类黄酮含量在2-6周内继 续增加，但在处理后降低至10周；然而，在处理期间，用茉莉酸甲酯处理的类黄酮的 含量仍然高于对照(图8)。新鲜种子切片还显示出在茉莉酸甲酯处理的种子中类黄 酮的积累更丰富(图9)。进一步研究了参与黄酮类生物合成的结构基因和转录因子 的表达水平(图10-12)。相对于未处理对照，茉莉酸甲酯处理4周后C4H和CHI的表 达水平分别增加42.05和7.21倍；4CL7的表达随着种子成熟而增加，并且在茉莉酸甲 酯处理的种子中显著高于未处理的对照；在处理6周后，相对于未处理对照组，F3H、 F3'H2和F3'5'H2转录水平在茉莉酸甲酯处理的种子中显著上调，表达量分别增加了 548.98、199.49.19.44倍。处理6周和8周后，FLS基因表达比CK分别显著增加71.26和 160.1倍。茉莉酸甲酯处理4周和6周后，DFR的表达水平分别上调了253.93和772.09倍。 在茉莉酸甲酯处理6周后，UGT78A15上调了60.78倍。此外，茉莉酸甲酯还上调了参 与原花青素生物合成的关键基因(ANR2和LAR)的表达。WRKY32的表达水平在茉莉 酸甲酯处理后8周上调了222.35倍。MYB44的表达水平在茉莉酸甲酯处理后10周显著 上调了67.70倍。在茉莉酸甲酯处理10周时，NAC078上调了864.63倍。在整个处理过 程中，茉莉酸甲酯显著增加了bHLH3和bHLH128的表达水平。尤其是bHLH3的表达水 平在茉莉酸甲酯处理8周时显著增加了1259.35倍。此外，还发现MYC2的表达水平在 茉莉酸甲酯处理2-6周显著增加，在处理10周时，相较于CK，MYC2的表达水平增加 了1.75倍。另外，从总体表达情况来看，FLS的表达与喷施茉莉酸甲酯溶液处理组中 的类黄酮的积累量基本一致，说明在喷施茉莉酸甲酯溶液过程中，FLS的表达情况与 喷施茉莉酸甲酯溶液密切相关，上述内容可知，FLS基因与类黄酮中的黄酮醇类积累 一致，因此，过表达油茶中的FLS基因可达到增加黄酮醇类积累的效果。
这些结果表明，茉莉酸甲酯可以通过调节结构基因和转录因子来增加油茶种子中类黄酮的合成。
本发明提出了一个模型来阐明茉莉酸甲酯调节发育中的油茶种子中类黄酮积累的分子机制(图13)。外源性茉莉酸甲酯可正向调控类黄酮合成途径中的早期结构基 因。此外，外源性茉莉酸甲酯还直接或间接调节转录因子，通过调节下游结构基因的 表达来增强多种类黄酮的积累。
实施例2
1、基于显微技术观察油茶种子中类黄酮的分布情况
将图5中258天新鲜徒手切成的种皮和种仁用分析发现，类黄酮主要分布于细胞壁附近，虽然在油茶种子和种仁中均有分布，分析发现在种皮中的含量为 298μg/g*FW，而种皮中的含量为699μg/g*FW，种皮中的累积显著高于种仁。
2、测定不同处理组中油茶种皮中的类黄酮含量以及各组分的变化
不同处理组中同实施例1材料部分CK组和茉莉酸甲酯溶液处理组的处理方式、 处理时间和取样时间，另外还包括茉莉酸甲酯抑制剂水杨苷异羟肟酸溶液处理组，茉 莉酸甲酯溶液处理组和水杨苷异羟肟酸溶液处理组的溶剂均为含有体积浓度为0.1％ 酒精和体积浓度为0.01％Tween-20中的清水溶液。茉莉酸甲酯溶液处理组中茉莉酸甲 酯的浓度分别为0.1mmol/L、0.5mmol/L、2.5mmol/L、5.0mmol/L。水杨苷异羟肟酸 溶液处理组中水杨苷异羟肟酸的浓度分别为0.1mmol/L、0.5mmol/L、2.5mmol/L、 5.0mmol/L。
类黄酮提取液制备：同实施例1步骤。
基于HPLC对油茶种子中类黄酮样品的检测：步骤同实施例1。
计算方法：步骤同实施例1。
结果如图14-20所示。
由图14可知，在授粉后217-252DAP，油茶种皮中的类黄酮含量从1062.50μg/g 上升至1435.03μg/g；之后显著下降至266DAP，含量为537.36μg/g；在266-307DAP， 有不同程度升高，但变化不显著；由此可知在整个油茶种子成熟过程中，种皮中的类 黄酮在217-252DAP迅速累积，之后迅速下降后随着油茶种子的成熟类黄酮的含量没 有明显变化。
本发明发现经过低浓度的茉莉酸甲酯可以显著提高油茶种皮中类黄酮的累积。图14可知，0.5mmol/L茉莉酸甲酯溶液(J0.5)处理后油茶种子中类黄酮含量均显著 高于对照组(CK)。其中，在252DAP，茉莉酸甲酯溶液处理使类黄酮含量达到了 峰值，为1844.39μg/g，相对于对照增加了0.29倍。在整个油茶种子成熟阶段，喷施0.1 mmol/L的茉莉酸甲酯溶液(J0.1)后可以后期(294-307DAP)提高油茶种子中类黄 酮含量，但是作用效果不如J0.5的稳定。此外，高浓度的茉莉酸甲酯(2.5、5mmol/L) 对类黄酮的影响也具有不稳定性，大多情况下5mmol/L茉莉酸甲酯显著抑制了油茶种 子中类黄酮的累积。
由图15(如4mmol/L的水杨苷异羟肟酸表示为S4)可知，不同浓度的茉莉酸甲 酯抑制剂水杨苷异羟肟酸溶液(S)处理油茶后，在油茶种子不同发育阶段显著减少 了种皮中类黄酮的累积或类黄酮的累积基本没有变化。这些影响模式与不同浓度茉莉 酸甲酯具有相反的变化趋势。
在217-307DAP，0.5mmol/L的茉莉酸甲酯能显著促进不同发育阶段油茶种子中 的表儿茶素、芦丁的累积。0.5mmol/L的茉莉酸甲酯处理后，表儿茶素含量呈现先上 升后下降的趋势，在252DAP含量最高，为1575.10μg/g，相对于CK增加了0.32倍； 之后随着种子成熟不断下降(图16)。而芦丁含量主要在处理后的217-252DAP累积， 之后含量较低；其中，0.5mmol/L的茉莉酸甲酯处理后的样本在231DAP含量最高为 312.00μg/g，在252天含量次之(图17)。茉莉酸甲酯处理与CK组差异不大，金丝桃 苷在280DAP显著累积(图18)。
茉莉酸甲酯抑制剂水杨苷异羟肟酸处理可以稍微增加表儿茶素的累积，但是整体没有显著影响(图16)。217-252DAP检测到芦丁的累积，之后并未检测，水杨苷 异羟肟酸显著降低了种皮中芦丁的含量(图17)。对于金丝桃苷来说，水杨苷异羟肟 酸也是降低了种皮中金丝桃苷的含量(图18)。
异槲皮苷和柚皮素的累积模式在茉莉酸甲酯处理后没有明显规律性变化。在喷施0.5、2.5和5.0mmol/L的茉莉酸甲酯溶液后，分别在第280天、280天和307天达到异 槲皮苷积累的最高值；而CK组则是在307天达到异槲皮苷积累的最高值(图19)。在 喷施0.1和0.5mmol/L的茉莉酸甲酯溶液后，分别在第280天、294天达到柚皮素积累的 最高值(图20)。
需要说明的是，图17-20中，未显示的部分均为未检测到相应的物质。
本发明中，DAP是指授粉后天数。
在本发明中，步骤(a)、(b)、(c)、(d)、(e)，仅用于区分不同的步 骤，并不能理解为指示或暗示步骤的先后顺序；术语“多个”则指两个或两个以上，除 非另有明确的限定。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术 语在本发明中的具体含义。
在本说明书的描述中，术语“一些实施例”、“具体实施例”等的描述意指结合该 实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或特点包含于本发明的至少一个实施例或 示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或实例。 而且，描述的具体特征、结构、材料或特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中 以合适的方式结合。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的 技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作 的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中南林业科技大学
<120> 一种提高油茶种子中类黄酮含量的方法
<130> 2021
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 993
<212> DNA
<213> Camellia oleifera Abel.
<400> 1
atggaggtgg agagagtgca agccctgtcc catgtaactc tccatgagct ccctgcaaaa 60
tttatccgac cggcccacga gcaaccggag aacagcaagg ctatcgaagg cgtcacggtg 120
cccgtgatct ccctctctca accgcacgat gtggttgttg atgaattatc aaaggcttgt 180
agtgaatggg gatttttcct catcacagat cacggtatcg agccctcgtt gatcggacgg 240
ctgaaagagg ttggggagga gttctttaag ctcccacaga aggagaaaga gagctatgca 300
aatgatcctt caagtgggag ttttgaaggg tatggaacaa agatgactaa aaatcttgat 360
gagaaagttg agtgggttga ttattatttt cacatcatgc accctcctaa gaagctcaat 420
catgacatgt ggcctaagaa cccttcttca tacaggggag tgacagagga atacaatgtg 480
gaaatactga gaacaaccaa caaaatattg gagcttctct cagagggact aggtttggat 540
gggaaggttt tgaattcttc tttgggtggt gatgaaattg aatttgaaat gaaaatcaac 600
atgtacccac catgcccaca acctcagctc gccctcggcg ttgaacctca cactgacatg 660
tctgctctca ctttacttgt ccccaatgac gttcccggtc ttcaagtttg gaaagacggt 720
aattgggtag ctgtcaatta cttgccaaat gcactgttcg tccatgttgg tgatcaactt 780
gaggtactaa gcaatggtaa gtacaagagt gttcttcaca ggagtttggt gaacaaagaa 840
aggacaagaa tgtcttgggc tgtgtttgtc gtgcctcctc atgaagcagt gattggacct 900
cttccagagc tcattgatga gaaaaaccca gcaaaatatt caaccaaaac atatgctgag 960
taccgttatc gcaaattcaa taagattcca caa 993

Claims (6)

1.一种提高油茶种子中类黄酮含量的方法，其特征在于，在油茶种子形成过程中增加油茶种子中的茉莉酸甲酯含量；
所述油茶种子包括种皮和种仁，在油茶授粉之日起的第210天开始喷施0.5 mmol/L的茉莉酸甲酯溶液，每隔2周喷施一次，于授粉之日起的第252±2天采集油茶种子，提取油茶种子种皮中的类黄酮，提高油茶种皮中类黄酮含量；
提取过程包括：
将0.5g样品在液氮中研磨，并在超声波处理器中用7mL 70%的甲醇在4℃下萃取30min；在10000rpm离心10min后，残留物加入3mL 70%的甲醇并按相同方法重新提取；合并上清液，用氮吹仪在35℃下浓缩至1/3体积；用0.22μm的微孔膜过滤，4℃保存用于HPLC分析。
2.一种提高油茶种皮中类黄酮含量的方法，其特征在于，所述油茶种子包括种皮和种仁，所述类黄酮为表儿茶素，在油茶授粉之日起的第210天开始喷施0.5 mmol/L或2.5mmol/L的茉莉酸甲酯溶液，每隔2周喷施一次，于授粉后的第252±2天采集油茶种子，提取油茶种子种皮中的表儿茶素，提高油茶种皮中类黄酮含量；
或在油茶授粉之日起的第210天开始喷施2.0 mmol/L的水杨苷异羟肟酸，每隔2周喷施一次，于授粉后的第266天采集油茶种子，提取油茶种子种皮中的表儿茶素，提高油茶种皮中类黄酮含量；
提取过程包括：
将0.5g样品在液氮中研磨，并在超声波处理器中用7mL 70%的甲醇在4℃下萃取30min；在10000rpm离心10min后，残留物加入3mL 70%的甲醇并按相同方法重新提取；合并上清液，用氮吹仪在35℃下浓缩至1/3体积；用0.22μm的微孔膜过滤，4℃保存用于HPLC分析。
3.一种提高油茶种皮中类黄酮含量的方法，其特征在于，所述油茶种子包括种皮和种仁，所述类黄酮为芦丁，在油茶授粉之日起的第210天开始喷施0.5 mmol/L的茉莉酸甲酯溶液，每隔2周喷施一次，于授粉后的第231±2天或252±2天采集油茶种子，提取油茶种子种皮中的芦丁，提高油茶种皮中类黄酮含量；
提取过程包括：
将0.5g样品在液氮中研磨，并在超声波处理器中用7mL 70%的甲醇在4℃下萃取30min；在10000rpm离心10min后，残留物加入3mL 70%的甲醇并按相同方法重新提取；合并上清液，用氮吹仪在35℃下浓缩至1/3体积；用0.22μm的微孔膜过滤，4℃保存用于HPLC分析。
4.一种提高油茶种皮中类黄酮含量的方法，其特征在于，所述油茶种子包括种皮和种仁，所述类黄酮为金丝桃苷，在油茶授粉之日起的第210天开始喷施0.1-2.5mmol/L的茉莉酸甲酯溶液，每隔2周喷施一次，于授粉后的第280天采集油茶种子，提取油茶种子种皮中的金丝桃苷，提高油茶种皮中类黄酮含量；
提取过程包括：
将0.5g样品在液氮中研磨，并在超声波处理器中用7mL 70%的甲醇在4℃下萃取30min；在10000rpm离心10min后，残留物加入3mL 70%的甲醇并按相同方法重新提取；合并上清液，用氮吹仪在35℃下浓缩至1/3体积；用0.22μm的微孔膜过滤，4℃保存用于HPLC分析。
5.一种提高油茶种皮中类黄酮含量的方法，其特征在于，所述油茶种子包括种皮和种仁，所述类黄酮为异槲皮苷，在油茶授粉之日起的第210天开始喷施2.5-5.0 mmol/L的茉莉酸甲酯溶液，每隔2周喷施一次，于授粉后的第280±2天采集油茶种子，提取油茶种子种皮中的异槲皮苷，提高油茶种皮中类黄酮含量；
提取过程包括：
将0.5g样品在液氮中研磨，并在超声波处理器中用7mL 70%的甲醇在4℃下萃取30min；在10000rpm离心10min后，残留物加入3mL 70%的甲醇并按相同方法重新提取；合并上清液，用氮吹仪在35℃下浓缩至1/3体积；用0.22μm的微孔膜过滤，4℃保存用于HPLC分析。
6.一种提高油茶种皮中类黄酮含量的方法，其特征在于，所述油茶种子包括种皮和种仁，所述类黄酮为柚皮素，在油茶授粉之日起的第210天开始喷施0.1 mmol/L的茉莉酸甲酯溶液，每隔2周喷施一次，于授粉后的第280天采集油茶种子，提取油茶种子种皮中的柚皮素，提高油茶种皮中类黄酮含量；
或在油茶授粉之日起的第210天开始喷施0.5 mmol/L的茉莉酸甲酯溶液，每隔2周喷施一次，于授粉后的第294天采集油茶种子，提取油茶种子种皮中的柚皮素，提高油茶种皮中类黄酮含量；
提取过程包括：
将0.5g样品在液氮中研磨，并在超声波处理器中用7mL 70%的甲醇在4℃下萃取30min；在10000rpm离心10min后，残留物加入3mL 70%的甲醇并按相同方法重新提取；合并上清液，用氮吹仪在35℃下浓缩至1/3体积；用0.22μm的微孔膜过滤，4℃保存用于HPLC分析。
CN202111062023.1A 2021-09-10 2021-09-10 一种提高油茶种子中类黄酮含量的方法 Active CN113826502B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111062023.1A CN113826502B (zh) 2021-09-10 2021-09-10 一种提高油茶种子中类黄酮含量的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111062023.1A CN113826502B (zh) 2021-09-10 2021-09-10 一种提高油茶种子中类黄酮含量的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113826502A CN113826502A (zh) 2021-12-24
CN113826502B true CN113826502B (zh) 2023-10-20

Family

ID=78958841

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111062023.1A Active CN113826502B (zh) 2021-09-10 2021-09-10 一种提高油茶种子中类黄酮含量的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113826502B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115500168B (zh) * 2022-10-20 2023-10-13 中南林业科技大学 一种采用茉莉酸甲酯调节油茶基因的方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106381301A (zh) * 2016-08-30 2017-02-08 云南省烟草农业科学研究院 一种烟草fls基因在调控植物类黄酮代谢中的应用
CN108048415A (zh) * 2018-02-01 2018-05-18 浙江大学 两个杨梅黄酮醇合成酶MrFLSs蛋白及其编码基因的应用
CN108893556A (zh) * 2018-07-24 2018-11-27 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 一种检测具有正向调控生物合成植物类黄酮作用基因的方法
CN110024787A (zh) * 2019-04-24 2019-07-19 南京林业大学 利用茉莉酸甲酯诱导植物叶片黄酮类和萜内酯类化合物积累的方法和应用
CN110272905A (zh) * 2019-07-03 2019-09-24 合肥工业大学 一种提高植物类黄酮含量的基因及应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106381301A (zh) * 2016-08-30 2017-02-08 云南省烟草农业科学研究院 一种烟草fls基因在调控植物类黄酮代谢中的应用
CN108048415A (zh) * 2018-02-01 2018-05-18 浙江大学 两个杨梅黄酮醇合成酶MrFLSs蛋白及其编码基因的应用
CN108893556A (zh) * 2018-07-24 2018-11-27 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 一种检测具有正向调控生物合成植物类黄酮作用基因的方法
CN110024787A (zh) * 2019-04-24 2019-07-19 南京林业大学 利用茉莉酸甲酯诱导植物叶片黄酮类和萜内酯类化合物积累的方法和应用
CN110272905A (zh) * 2019-07-03 2019-09-24 合肥工业大学 一种提高植物类黄酮含量的基因及应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
flavonol synthase [Camellia fraterna]，Accession No：AUM57425.1;Yu,B. et al;《Genbank database》;20180110;全文 *
张悦.茉莉酸甲酯对甘遂黄酮积累的影响及EkFls(黄酮醇合成酶)基因功能验证与表达调控研究.《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(硕士)，基础科学辑(月刊)》.2021,(第02期), *
茉莉酸甲酯对甘遂黄酮积累的影响及EkFls(黄酮醇合成酶)基因功能验证与表达调控研究;张悦;《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(硕士)，基础科学辑(月刊)》;20210215(第02期);第17页第2.1.1节，摘要 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN113826502A (zh) 2021-12-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Villalobos-González et al. Long-term effects of abscisic acid (ABA) on the grape berry phenylpropanoid pathway: gene expression and metabolite content
Deluc et al. Water deficit alters differentially metabolic pathways affecting important flavor and quality traits in grape berries of Cabernet Sauvignon and Chardonnay
Zifkin et al. Gene expression and metabolite profiling of developing highbush blueberry fruit indicates transcriptional regulation of flavonoid metabolism and activation of abscisic acid metabolism
Hanhineva et al. Non-targeted analysis of spatial metabolite composition in strawberry (Fragaria× ananassa) flowers
Qu et al. Differential accumulation of phenolic compounds and expression of related genes in black-and yellow-seeded Brassica napus
Muñoz et al. The strawberry fruit Fra a allergen functions in flavonoid biosynthesis
Krakowska et al. Comparison of various extraction techniques of Medicago sativa: yield, antioxidant activity, and content of phytochemical constituents
Gadzovska Simic et al. Polysaccharide elicitors enhance phenylpropanoid and naphtodianthrone production in cell suspension cultures of Hypericum perforatum
Berim et al. A set of regioselective O-methyltransferases gives rise to the complex pattern of methoxylated flavones in sweet basil
Shi et al. Integrated metabolomic and transcriptomic strategies to understand the effects of dark stress on tea callus flavonoid biosynthesis
Wu et al. Complementary iTRAQ proteomic and transcriptomic analyses of leaves in tea plant (Camellia sinensis L.) with different maturity and regulatory network of flavonoid biosynthesis
Sng et al. Combination of red and blue light induces anthocyanin and other secondary metabolite biosynthesis pathways in an age-dependent manner in Batavia lettuce
Khan et al. Identification of key gene networks controlling anthocyanin biosynthesis in peach flower
Song et al. Dynamic metabolic and transcriptomic profiling reveal synthetic characters and regulators of flavonoid biosynthesis in Camellia oleifera seeds
Zou et al. Combined metabolomic and transcriptomic analysis reveals redirection of the phenylpropanoid metabolic flux in different colored medicinal Chrysanthemum morifolium
CN113826502B (zh) 一种提高油茶种子中类黄酮含量的方法
Li et al. Transcriptomic, proteomic and metabolomic analysis of flavonoid biosynthesis during fruit maturation in Rubus chingii Hu
Sheng et al. Joint transcriptomic and metabolic analysis of flavonoids in Cyclocarya paliurus leaves
Tian et al. Metabolic profiling and gene expression analysis provides insights into flavonoid and anthocyanin metabolism in poplar
Wang et al. Identification of genes involved in flavonoid biosynthesis of Chinese Narcissus (Narcissus tazetta L. var. chinensis)
Li et al. Development of fruit color in Rubus chingii Hu (Chinese raspberry): A story about novel offshoots of anthocyanin and carotenoid biosynthesis
Zhou et al. Combined metabolome and transcriptome analyses reveal the flavonoids changes and biosynthesis mechanisms in different organs of Hibiseu manihot L.
He et al. Insights into flavonoid biosynthesis during cucumber fruit peel coloration based on metabolite profiling and transcriptome analyses
Moldovan et al. Bioactive Flavonoids from Cornus mas L. fruits
He et al. Integration of metabolomics and transcriptomics analyses investigates the accumulation of secondary metabolites in maturing seed plumule of sacred lotus (Nelumbo nucifera)

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant