CN114438116A - 棉花脂转运蛋白基因GhFIL在改良棉花纤维品质中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开棉花脂转运蛋白基因GhFIL在改良棉花纤维品质中的应用。本发明中的脂转运蛋白GhFIL是棉纤维发育过程中的一个重要基因，它对纤维细胞的伸长具有重要作用。本发明首次报道该基因参与棉花纤维发育过程中的鞘脂运输，并且激活了生长素响应通路。以此基因为靶基因构建正反义植株表达载体进行转基因棉花功能验证，结果表明过表达该基因使纤维中脂肪酸和生长素含量增加，纤维长度、强度显著增加，马克隆值显著降低；而抑制该基因表达使纤维中脂肪酸和生长素含量降低，纤维长度、强度显著降低，马克隆值显著升高。因此，在棉花中过量表达该基因可显著改善棉纤维品质。

Description

棉花脂转运蛋白基因GhFIL在改良棉花纤维品质中的应用
技术领域
本发明属于生物技术应用领域，涉及棉花脂转运蛋白基因GhFIL在改良棉花纤维品质中的应用。该棉花脂转运蛋白基因GhFIL ORF全长363bp，编码含120个氨基酸的脂转运蛋白，具有8个保守的半胱氨酸残基，在N端具有典型的信号肽结构，等电点为8.8。通过qRT-PCR分析，发现该基因在纤维伸长期优势表达。该基因在陆地棉(Gossypium hirsutum)李氏超短纤维突变体Li1(G.hirsutum acc.Li1)与纤维发育正常的Li1野生型、陆地棉遗传标准系TM-1(G.hirsutum acc.TM-1)的纤维伸长期均存在显著差异表达，通过PCR技术在TM-1中获得该基因全长ORF序列。利用生物技术明确了该基因参与纤维品质改良及功能特征，结果表明过量表达GhFIL能显著提高棉花纤维品质，转基因棉花材料纤维长度、强度显著增加，马克隆值显著降低。
背景技术
棉花是重要的经济作物，棉纤维是世界上最重要的天然纺织原料。棉纤维是由棉花胚珠外珠被表皮层的单细胞发育分化而来。棉纤维细胞起始分化后持续地伸长，最后其长度可达其直径的1000-3000倍。棉纤维的发育从花期(开花)开始，分为四个不同但相互重叠的阶段：起始分化期、快速伸长期、次生细胞壁合成期和脱水成熟期。
在纤维伸长过程中，脂质和蛋白质的持续合成和运输对于支持液泡和质膜的扩张至关重要。研究表明，脂肪酸与纤维素交替沉积在同心圆细胞壁层中，发育中的纤维细胞从3到20天可以将大部分具有各种极性脂质的葡萄糖纳入细胞壁(Kim et al.,2012)。脂质分析表明极性磷脂类包括磷脂酸(PA)、磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰肌醇(PI)和磷脂酰甘油(PG)，在纤维伸长期间磷脂含量不断增加，到纤维发育的5-14天达到最高水平后便不断减少。说明磷脂是纤维细胞扩张所必需的。超长链脂肪酸通过上调丝氨酸棕榈酰转移酶促进鞘脂生物合成，在胚珠培养基中添加VLCFAs可显著提高纤维细胞的伸长率(Qin et al.,2007)。在植物中，长链脂肪酸作为膜脂的组成部分，通过不同的代谢途径与质体中的甘油脂结合(Nobusawa et al.,2013；Edstam et al.,2014)。VLCFAs可能转化为磷脂或鞘脂，作为细胞成分的前体或调节目标基因的表达(Wan et al.,2005)。然而，由于新启动的纤维细胞不具备合成大量脂质以实现细胞快速扩张的能力，因此，在纤维伸长过程中，脂质如何从胚珠表皮细胞转移到发育中的纤维细胞尚不清楚。鉴定将脂质从胚珠运输到发育纤维中的因素将有助于阐明相关机制。先前的研究表明，脂质转移蛋白(LTPs)很可能是将磷脂传递给发育中的细胞的候选蛋白(Edstam et al.,2013；Lei et al.,2014；Kader et al.,1996)，因为大多数LTPs在发育组织的表皮中大量表达(Debono et al.,2009；Edstam et al.,2011)。LTPs含有一个疏水囊，能够结合长链脂肪酸(Thoma et al.,1994)，研究表明，植物LTPs参与从内质网(ER)到质膜(PM)的脂质运输，随后从质膜运输到细胞外部(Yeats et al.,2008；Choi et al.,2012；Nielsen et al.,1997)。GPI锚定的脂质转移蛋白(LTPG)属于G型LTP家族，由分泌的N端信号肽(SP)、LTP结构域以及蛋白加工和膜锚定的GPI结构域组成(Edstam et al.,2014)。在植物中，LTPGs参与花序茎表皮的胼胝质沉积和代谢，以及角质层生物合成。AtLTPG1表达降低的拟南芥幼苗其茎表面蜡质负荷减少，表明LTPG参与角质层沉积(Kim et al.,2012)。然而，这些LTPs是否将极性脂质传递给伸长的纤维细胞以及它们的作用仍有待确定。尽管许多研究集中在参与棉纤维伸长激活和抑制的基因/蛋白质的功能鉴定上(Luo et al.,2007；Liu et al.,2015；Tang et al.,2014)，但脂质运输的机制及其影响却很少被研究。目前已有文献报道了一个在发育纤维中高表达的棉花基因GhLTPG1的鉴定和功能特性。抑制GhLTPG1表达使纤维变短，这是由于伸长纤维中脂质含量降低所致(Deng et al.,2016)。磷脂酰肌醇是纤维细胞膜的组成成分，也是棉纤维伸长过程中的重要信号分子。棉纤维中PI的显著增加发生在纤维伸长的早期，表明快速发育的纤维细胞需要大量PI的合成。PI是第二大极性脂类，平均占伸长纤维中总极性脂类的18％。然而，有关鞘脂在伸长纤维中是如何发挥作用尚不清楚。
发明内容
本发明的目的是提供一种棉花脂转运蛋白基因(GhFIL)在改良棉花纤维品质及培育棉花新种质中的应用。提供了该基因在陆地棉TM-1中的全长cDNA ORF核苷酸序列及氨基酸序列。以此基因为靶基因，通过基因工程的方法进行转基因材料创制，明确其功能，并用于培育在生产上应用的新种质。
本发明的另一目的在于提供一种改良棉花纤维品质的方法。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
如SEQ ID NO.1所示的棉花脂转运蛋白基因GhFIL在改良棉花纤维品质或培育棉花新种质中的应用。
含有如SEQ ID NO.1所示棉花脂转运蛋白基因GhFIL的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在改良棉花纤维品质或培育棉花新种质中的应用。
所述的改良棉花纤维品质为改良棉花纤维长度、强度和细度。
上述的应用，是以所述的棉花脂转运蛋白基因GhFIL为靶基因，通过基因工程方法，过量表达基因GhFIL，培育棉花纤维长度、强度和细度显著改良的新种质并在生产上应用。
一种改良棉花纤维品质的方法，在棉花中过量表达如SEQ ID NO.1所示的棉花脂转运蛋白基因GhFIL。
本发明的优点表现在：
(1)本发明所克隆的基因是一种脂转运蛋白GhFIL，该基因表达与棉纤维伸长时期的脂肪酸含量密切相关，是转运脂类物质途径中的关键基因。在棉纤维伸长过程中，脂肪酸及由此合成的脂类物质在促进纤维伸长上扮演着重要的角色，饱和超长链脂肪酸(C24:0)以及亚麻酸(C18:3)均对棉纤维伸长有明显的促进作用，而脂质转运蛋白是脂肪酸运输途径中必不可少的，因此明确它对纤维伸长的作用机制，对于改良棉纤维品质具有重要的理论和应用价值。
(2)本发明所克隆的脂转运蛋白基因GhFIL，其在棉花中前人还未曾研究过其功能。
(3)实时荧光定量PCR结果表明该基因在陆地棉遗传标准系TM-1的纤维伸长期优势表达，该基因在不同纤维发育时期表达量有差异，在纤维起始期开始表达但表达量较低，在纤维快速伸长时期(开花后5、8、10、13、15天)表达量逐渐升高，在次生壁增厚时期(开花后18、20、23、25天)表达量逐渐下降，这一结果表明该基因与纤维发育伸长过程密切相关。
(4)实时荧光定量PCR结果表明，该基因在Li1超短纤维突变体及其对应的野生型不同发育时期纤维中的表达相比，在Li1超短纤维突变体表达量极显著的降低，表明该基因参与调控棉纤维发育。Li1是一种极短纤维突变体，其对应的野生型是纤维正常发育的材料。
(5)利用纤维发育专化的RDL启动子构建植物过表达和抑制表达载体，以陆地棉材料W0(G.hirsutum acc.W0)为受体进行转基因研究，对转基因材料表达分析发现：与野生型相比，在纤维发育的不同时期(开花后5、10、15天)，过表达株系中GhFIL表达量显著提高，抑制表达株系中GhFIL的表达显著降低。过表达植株成熟纤维表现纤维长度、强度增加，马克隆值降低的表型，抑制表达植株成熟纤维表现纤维长度、强度降低，马克隆值升高的表型，表明该基因的表达水平影响棉花纤维发育。
(6)对GhFIL转基因株系及非转基因野生型对照材料W0，选取10、15、20天的纤维流水法测量长度，结果表明，与野生型相比，过表达株系的纤维显著变长，抑制表达株系的纤维显著变短。
(7)对GhFIL转基因株系及非转基因野生型对照材料W0，选取0、1、2天的胚珠扫描电镜观察，结果表明在0DPA和1DPA时，GhFIL转基因株系与野生型的纤维细胞形态无明显差异，但在2DPA时，GhFIL过表达转基因株系的纤维较长，而抑制表达转基因株系的纤维较短。
(8)对GhFIL转基因株系及非转基因野生型对照材料W0，选取成熟纤维扫描电镜观察，发现与野生型相比，GhFIL过表达转基因材料棉纤维的螺旋化程度显著升高，螺距显著小于野生型，而抑制表达株系棉纤维的螺旋化程度显著降低，螺距显著大于野生型，表明GhFIL对棉纤维强度产生重要影响。
(9)对GhFIL转基因株系及非转基因野生型对照材料W0，取发育2天的胚珠培养在BT培养基中，在相同的生长条件下，观察胚珠离体培养3周后的纤维表型差异，发现不同转基因材料纤维长度和产量均有明显差异。
(10)脂质组学分析表明，与野生型相比，GhFIL过表达株系增加的脂质主要为神经酰胺(Cer)和磷脂酰胆碱(PC)，抑制表达株系降低的脂质也包含有神经酰胺(Cer)和磷脂酰胆碱(PC)，而这两种脂类物质是鞘脂合成的底物，因此结果表明GhFIL主要通过转运鞘脂促进纤维发育。此外，离体培养实验也证明了体外施加Cer促进纤维发育。
(11)脂类物质是由不同碳链长度的脂肪酸加工合成的。选取GhFIL转基因株系及非转基因野生型对照材料W0开花后10天和15天的纤维测定脂肪酸含量，结果表明与野生型相比，GhFIL过表达株系长链和超长链脂肪酸的含量显著增加，相反，抑制表达株系的长链和超长链脂肪酸含量显著减少。表明该基因影响了棉纤维中的脂肪酸含量，进而影响纤维发育。
(12)选取GhFIL转基因株系及非转基因野生型对照材料W0开花后10天的纤维测定生长素含量。离体培养实验证明外源施加IAA对纤维伸长有促进作用，而施加NPA(一种生长素抑制剂)，对纤维伸长有抑制作用。结果表明，与野生型相比，GhFIL过表达株系的生长素含量显著增加，而抑制表达株系的生长素含量显著降低，表明该基因影响了棉纤维发育中的生长素含量，进而影响了纤维伸长。
附图说明
图1为GhFIL在陆地棉遗传标准系TM-1不同组织器官中的表达特征分析
实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测棉花脂转运蛋白LTP基因(GhFIL)在TM-1不同组织器官中的表达模式。Root：根；Stem：茎；Left：叶；5,10,15,20dpa seed：开花后5天、10天、25天、20天的胚珠；0,3dpa fiber：开花后0天、3天的胚珠纤维混合物；5,8,10,13,15,18,20,23,25dpa fiber：分别代表开花后5天、8天、10天、13天、15天、18天、20天、23天、25天的纤维组织。
图2为GhFIL在超短纤维Li1突变体和其对应的纤维发育正常的野生型WT不同棉纤维发育时期中的表达模式分析
实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测棉花脂转运蛋白LTP基因(GhFIL)在Li1Mutant和WT不同发育时期胚珠和纤维中的表达模式。-1,0,1dpa seed：-1天、0天、1天的胚珠；3dpafiber：开花后3天的胚珠纤维混合物；5,8,12,15,18dpa fiber：分别代表开花后5天、8天、12天、15天、18天的纤维组织。
图3为GhFIL过表达和抑制表达的转基因棉花材料创制
利用纤维专化表达RDL启动子+目的基因构建过量和反义表达载体创制转基因棉花材料。设计正向和反向引物，转基因植株PCR检测表明，该基因正反义载体均已导入棉花。M为Marker，H2O和W0为阴性对照；1为阳性对照，2-8为转基因植株目标基因PCR检测结果。RDL-SC过量表达转基因材料；RDL-ASC抑制表达转基因材料。
图4为GhFIL在转基因棉花中的表达分析
实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析GhFIL在2个不同表达载体(RDL-SC、RDL-ASC)转基因株系开花后5天、10天以及15天纤维中的表达。W0为受体对照，RDL-SC示目标基因过量表达载体，RDL-ASC示目标基因抑制表达载体，RDL代表纤维发育优势表达启动子。OE-20和OE-23为RDL-SC转基因材料；SE-54和SE-74为RDL-ASC转基因材料。均为转基因纯合株系。
图5为GhFIL转基因植株和受体W0不同发育时期纤维长度比较
(a)对GhFIL转基因株系和受体W0开花后10、15、20天纤维长度的表型分析。
(b)对GhFIL转基因株系和受体W0开花后10、15、20天纤维长度的测量，结果表明与野生型相比，过表达植株的纤维长度显著变长，抑制表达植株的纤维长度显著变短。
图6为GhFIL转基因植株和受体W0成熟期纤维长度、强度和细度分析
(a)GhFIL转基因植株和受体W0成熟期纤维表型分析。
(b)与受体W0相比，过表达植株的纤维长度显著增加；抑制表达材料的纤维长度显著降低。FL：纤维长度。
(c)与受体W0相比，过表达植株的纤维马克隆值显著降低；抑制表达材料的纤维马克隆值显著增加。FM：纤维马克隆值。
(d)与受体W0相比，过表达植株的纤维强度显著提高；抑制表达材料的纤维强度显著降低。FS：纤维强度。
图7为GhFIL转基因株系和受体W0的胚珠扫描电镜结果分析
对GhFIL转基因株系和W0开花0、1、2天的胚珠扫描电镜观察。
图8为GhFIL转基因株系和野生型植株W0的成熟纤维扫描电镜结果分析
(a)对GhFIL转基因株系和野生型植株W0的成熟纤维螺旋化程度表型分析。
(b)对GhFIL转基因株系和野生型植株W0的成熟纤维的螺距测量分析。
图9为GhFIL转基因株系和野生型W0开花后2天的胚珠离体培养观察
(a)对GhFIL转基因株系和野生型W0开花后2天的胚珠培养在BT培养基中，在相同条件下培养三周后，胚珠表面的纤维表型分析。
(b)对GhFIL转基因株系和野生型W0开花后2天的胚珠培养在BT培养基中，在相同条件下培养三周后，胚珠表面的纤维长度测量。
(c)对GhFIL转基因株系和野生型W0开花后2天的胚珠培养在BT培养基中，在相同条件下培养三周后，胚珠表面的纤维产量测定。
图10为GhFIL转基因株系和野生型植株W0发育10天的纤维差异脂质分析
(a)与野生型植株W0相比，对GhFIL过表达株系增加的脂类物质分析。
(b)与野生型植株W0相比，对GhFIL抑制表达株系减少的脂类物质分析。
图11为外源施加神经酰胺(Cer)和不施空对照两种不同生长条件下的胚珠离体培养观察
选取GhFIL转基因株系和野生型W0开花后2天的胚珠，分别培养在施加10μM Cer和空对照的BT培养基中，培养14天后观察胚珠表面的纤维表型变化。
图12为GhFIL转基因株系和野生型W0在开花后10天和15天纤维中脂肪酸含量测定分析。
(a)与野生型相比，GhFIL过表达材料开花后10天纤维中长链脂肪酸含量显著增加，抑制表达材料开花后10天纤维中长链脂肪酸含量显著降低；与野生型相比，GhFIL过表达材料开花后15天纤维中长链和超长链脂肪酸含量显著增加，抑制表达材料开花后15天纤维中长链和超长链脂肪酸含量显著降低。
(b)与野生型相比，GhFIL过表达材料开花后10天和15天纤维中中总脂肪酸含量显著增加，相反在GhFIL抑制表达材料中总脂肪酸含量显著降低。
图13为GhFIL转基因株系和野生型W0在开花后10天纤维中生长素含量测定分析
与野生型相比，GhFIL过表达材料中生长素含量显著增加，而在GhFIL抑制表达材料中生长素含量显著降低。
图14为外源施加IAA和NPA这两种不同生长条件下的胚珠离体培养观察
(a)选取GhFIL转基因株系和野生型W0开花后2天的胚珠，分别培养在施加5μM IAA的BT培养基中，培养三周后胚珠表面的纤维表型分析。
(b)选取GhFIL转基因株系和野生型W0开花后2天的胚珠，分别培养在施加20μMNPA的BT培养基中，培养三周后胚珠表面的纤维表型分析。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
实施例1棉花脂转运蛋白GhFIL全长序列获得：
通过构建海岛棉7124-3～6DPA胚珠/纤维cDNA文库(GB1)和6～24DPA纤维cDNA文库(GB2)，EST差异表达分析显示在海岛棉GB1和GB2中，两文库共有2260条unigenes。基于生物信息学分析和基因的结构、功能研究，获得9个编码120个氨基酸序列，编码脂转移蛋白的基因，分别命名为LTP1～LTP9。其中LTP4在纤维发育时期中明显优势表达，故命名为FIL。因此根据已有序列，设计PCR扩增引物，从陆地棉TM-1中扩增该基因(GhFIL)的ORF全长。扩增所用引物见表1。
表1：扩增所用引物
Figure BDA0003462867490000081
实施例2棉花脂转运蛋白基因GhFIL的定量RT-PCR分析
设计GhFIL的特异引物：
F:5’-TTACTTGACAGGGAATGGTGC-3’
R:5’-GTCCGCTTGCAATACCATAG-3’
在不同组织器官中，进行定量qRT-PCR检测。结果表明该基因在根，茎，叶中表达量很低，在纤维发育的不同时期差异表达，其中在纤维快速伸长期8-15天表达量逐渐升高，后续表达量逐渐下降(如图1和图2所示)。
实施例3棉花脂转运蛋白基因GhFIL的转基因功能验证
pCAMBIA2301是一种传统的植物双元表达载体，其启动子为棉纤维优势表达基因RDL的启动子。以此为基础构建了RDL启动子的正反义双元载体，正反义片段的插入位置为RDL-P(启动子)与Nos-T(终止子)之间。
以本发明基因SEQ NO ID.1序列全长片段构建正反义植株表达载体，构建完成后通过农杆菌介导法转化棉花进行功能验证，获RDL启动子正反义转基因植株，以上两个载体转基因植株均已通过PCR鉴定(如图3所示)。表达分析发现在正义载体转基因植株中，该基因的表达被显著提高，纤维长度变长，而反义载体转基因植株中，该基因的表达被显著抑制，纤维长度变短(如图4、图5和图6所示)。因此该基因与棉纤维发育相关的功能得到了直接验证。
表2：转基因目标基因在基因组和表达水平上检测所用引物
Figure BDA0003462867490000091
实施例4流水法测量GhFIL转基因株系和野生型开花后10、15、20天纤维的长度
取GhFIL转基因株系和野生型W0发育10、15和20天的棉铃，用镊子小心地剥开，在加入0.1％浓盐酸的沸水中煮2～3min，再放在水流下小心冲离，用尺子测量纤维的长度(如图5所示)。
实施例5棉花0、1和2天的胚珠以及成熟纤维扫描电镜观察
在大田取开花当天以及开花后1和2天的胚珠，用2.5％的戊二醛固定8小时以上，然后用磷酸缓冲液清洗3次(每次10分钟)，再用50％、70％、80％、90％的乙醇梯度脱水各15min，无水乙醇脱水3次(每次30分钟)，用叔丁醇置换3次(每次30分钟)，用冷冻干燥仪干燥样品，之后将样品粘到样品台上镀金膜，用扫描电镜观察。而成熟纤维无需脱水步骤，直接在显微镜下挑取单根纤维粘到样品台上镀金膜，用扫描电镜观察即可(如图7和8所示)。
实施例6GhFIL转基因株系和野生型材料开花后2天的胚珠离体培养
取棉花胚珠，首先用70％乙醇对外植体表面进行消毒处理1min左右，进而用无菌水(ddH2O)冲洗2-3遍。用30％H2O2进行灭菌处理5-10min，ddH2O冲洗2-3遍。无菌条件下剥离胚珠，将剥离的胚珠置于液体BT培养基中，30℃暗培养，培养三周后观察胚珠表面的纤维表型变化。(如图9所示)。
实施例7纤维TFU的测定
取10个胚珠于培养皿中，每份材料设5个生物学重复，加入20mL培养液震荡2min，倒掉培养液，加入20mL 0.02％的甲苯胺蓝于培养皿中，进行染色；用无菌水冲洗后，加入20mL FAA进行去腐，摇晃倒掉FAA，再加入200μL培养液过夜脱色，用稀释的不同浓度梯度的甲苯胺蓝溶液做标准曲线，次日测定样品的吸光度(如图9c所示)。
实施例8脂质提取
取GhFIL转基因株系和野生型开花后10天的棉铃，用镊子小心的剥离胚珠上的纤维，用液氮研磨粉碎纤维后称取0.1g于2mL离心管中，加入750μL氯仿甲醇混合溶液(2:1)，涡旋震荡30s，冰上静置10min，12000rpm室温离心5min，取下层液300μL到新的2mL离心管中，样品用真空离心浓缩仪浓缩，加入200μL异丙醇溶解样品，0.22μm膜过滤，待测样本进行LC-MS上机检测(如图10所示)。
实施例9胚珠离体培养在施加Cer和空对照的BT培养基中
取GhFIL转基因株系和野生型材料开花后2天的胚珠，首先用70％乙醇对外植体表面进行消毒处理1min左右，进而用无菌水(ddH2O)冲洗2-3遍。用30％H2O2进行灭菌处理5-10min，ddH2O冲洗2-3遍。无菌条件下剥离胚珠，将剥离的胚珠置于含有10μM Cer和空对照的BT培养基中，30℃暗培养，培养14天后观察胚珠表面的纤维表型变化。(如图11所示)。
实施例10 GhFIL转基因株系和野生型开花后10天和15天的纤维脂肪酸含量测定
在大田中摘取GhFIL转基因株系和野生型开花后10天和15天的棉铃，用镊子小心的剥离胚珠上的纤维，用液氮研磨粉碎纤维后放置于冷冻干燥仪中进行冷冻干燥2-3天，称取干燥后的纤维0.1g于15mL离心管中，每份材料各3个生物学重复，向离心管中加入2mL异丙醇(含0.01％BHT)，于85度水浴30min后，每个样品中加入3mL正己烷，彻底颠倒混匀，再加入2.5mL15％的硫酸钠颠倒混匀，室温静置5min，取最上层溶液转移到10mL的玻璃瓶中，用氮气吹干，加入2mL的甲醇和0.6mL甲苯以及40μL 10mg/mL的C17:0作内标，于90度水浴1.5h，再分别加入1mL水和1mL正己烷混匀4500rpm离心5min，取上清有机相进行气相测定。结果表明，与野生型相比，GhFIL过表达材料中脂肪酸含量显著增加，而在GhFIL抑制表达材料中脂肪酸含量显著降低(如图12所示)。
实施例11 GhFIL转基因株系和野生型材料开花后10天的纤维生长素含量测定
在大田中摘取GhFIL转基因株系和野生型开花后10天的棉铃，用镊子小心的剥离胚珠上的纤维，用液氮研磨粉碎纤维后称取0.1g于1.5mL离心管中，加入180μL PBS，使用植物生长素(IAA)酶联免疫分析试剂盒(Meimian Industrial Co.,Ltd,China)，加入待测样品10μL和样品稀释液40μL于酶标板底部，用封板膜封板后置于37度温育30min，小心揭掉封板膜，弃去液体甩干，每孔加满洗涤液静置30s后弃去，每孔加入酶标试剂50μL置于37度温育30min，弃去液体，每孔加入显色剂A 50μL，再加入显色剂B 50μL，轻轻震荡混匀37度避光显色10min，每孔加入50μL终止液，450nm波长依次测量各孔的吸光度(OD值)。测定结果表明，与野生型相比，GhFIL过表达材料中生长素含量显著增加，相反在GhFIL抑制表达材料中生长素含量显著降低(如图13所示)。
实施例12胚珠离体培养在施加IAA和NPA的BT培养基中
取GhFIL转基因株系和野生型材料开花后2天的胚珠，首先用70％乙醇对外植体表面进行消毒处理1min左右，进而用无菌水(ddH2O)冲洗2-3遍。用30％H2O2进行灭菌处理5-10min，ddH2O冲洗2-3遍。无菌条件下剥离胚珠，将剥离的胚珠置于含有5μM IAA和20μM NPA的BT培养基中，30℃暗培养，培养三周后观察胚珠表面的纤维表型变化。(如图14所示)。
研究结果表明，本发明中的脂转运蛋白GhFIL是棉纤维发育过程中的一个重要基因，它对纤维细胞的伸长具有重要作用。GhFIL通过转运鞘脂并影响了不同碳链长度的脂肪酸含量，激活了下游的生长素信号通路，进而促进纤维发育。本发明首次报道该基因参与棉花纤维发育过程中的鞘脂运输，并且激活了生长素响应通路。以此基因为靶基因构建正反义植株表达载体进行转基因棉花功能验证，结果表明过表达该基因使纤维中脂肪酸和生长素含量增加，纤维长度、强度显著增加，马克隆值显著降低；而抑制该基因表达使纤维中脂肪酸和生长素含量降低，纤维长度、强度显著降低，马克隆值显著升高。因此，在棉花中过量表达该基因可显著改善棉纤维品质。
SEQ ID NO.1
陆地棉(Gossypiumhirsutum)
棉花脂转运蛋白GhFIL基因ORF序列
ATGGCTAGCTCAATGTCCCTTAAGCTTGCATGTGTGGCGGTGTTGTGCATGGTGGTGGGTGCACCCCTGGCTCAAGGGGCCGTAACCTGTGGTCAAGTCACAAGCTCCCTCGCACCCTGCATTGGTTACTTGACAGGGAATGGTGCTGGTGGCGTTCCCCCAGGTTGCTGCGGCGGCATAAAATCTCTCAACTCCGCCGCCCAAACAACACCAGACCGGCAAGCAGCTTGCAAATGCATCAAAAGTGCGGCCGCCGGCATTTCTGGCATCAACTATGGTATTGCAAGCGGACTCCCAGGCAAGTGCGGTGTCAACATCCCTTACAAGATCAGCCCTAGCACTGACTGCAACAGGTTCGTATGA
SEQ ID NO.2
棉花脂转运蛋白GhFIL氨基酸序列
MASSMSLKLACVAVLCMVVGAPLAQGAVTCGQVTSSLAPCIGYLTGNGAGGVPPGCCGGIKSLNSAAQTTPDRQAACKCIKSAAAGISGINYGIASGLPGKCGVNIPYKISPSTDCNRFV
序列表
<110> 南京农业大学
<120> 棉花脂转运蛋白基因GhFIL在改良棉花纤维品质中的应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 363
<212> DNA
<213> 陆地棉(Gossypiumhirsutum)
<400> 1
atggctagct caatgtccct taagcttgca tgtgtggcgg tgttgtgcat ggtggtgggt 60
gcacccctgg ctcaaggggc cgtaacctgt ggtcaagtca caagctccct cgcaccctgc 120
attggttact tgacagggaa tggtgctggt ggcgttcccc caggttgctg cggcggcata 180
aaatctctca actccgccgc ccaaacaaca ccagaccggc aagcagcttg caaatgcatc 240
aaaagtgcgg ccgccggcat ttctggcatc aactatggta ttgcaagcgg actcccaggc 300
aagtgcggtg tcaacatccc ttacaagatc agccctagca ctgactgcaa caggttcgta 360
tga 363
<210> 2
<211> 120
<212> PRT
<213> 陆地棉(Gossypiumhirsutum)
<400> 2
Met Ala Ser Ser Met Ser Leu Lys Leu Ala Cys Val Ala Val Leu Cys
1 5 10 15
Met Val Val Gly Ala Pro Leu Ala Gln Gly Ala Val Thr Cys Gly Gln
20 25 30
Val Thr Ser Ser Leu Ala Pro Cys Ile Gly Tyr Leu Thr Gly Asn Gly
35 40 45
Ala Gly Gly Val Pro Pro Gly Cys Cys Gly Gly Ile Lys Ser Leu Asn
50 55 60
Ser Ala Ala Gln Thr Thr Pro Asp Arg Gln Ala Ala Cys Lys Cys Ile
65 70 75 80
Lys Ser Ala Ala Ala Gly Ile Ser Gly Ile Asn Tyr Gly Ile Ala Ser
85 90 95
Gly Leu Pro Gly Lys Cys Gly Val Asn Ile Pro Tyr Lys Ile Ser Pro
100 105 110
Ser Thr Asp Cys Asn Arg Phe Val
115 120

Claims (4)

1.如SEQ ID NO.1所示的棉花脂转运蛋白基因GhFIL在改良棉花纤维品质或培育棉花新种质中的应用。
2.含有如SEQ ID NO.1所示棉花脂转运蛋白基因GhFIL的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在改良棉花纤维品质或培育棉花新种质中的应用。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，以所述的棉花脂转运蛋白基因GhFIL为靶基因，通过基因工程方法，过量表达基因GhFIL，培育棉花纤维长度、强度和细度显著改良的新种质并在生产上应用。
4.一种改良棉花纤维品质的方法，其特征在于：在棉花中过量表达如SEQ ID NO.1所示的棉花脂转运蛋白基因GhFIL。
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