CN111269300B

CN111269300B - 一个调控木质素合成的基因及应用

Info

Publication number: CN111269300B
Application number: CN201811480917.0A
Authority: CN
Inventors: 李来庚; 桂金山
Original assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Current assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Priority date: 2018-12-05
Filing date: 2018-12-05
Publication date: 2022-12-30
Anticipated expiration: 2038-12-05
Also published as: CN111269300A

Abstract

本发明公开了一种具有负调控植物木质素基因合成的活性的MYB4突变蛋白，所述MYB4突变蛋白基于SEQ ID NO:1所示的序列(野生型MYB4蛋白序列)，其位点T146和T178的核心氨基酸突变为不能被磷酸化的氨基酸残基。本发明还公开了植物纤维细胞特异性表达和导管特异性表达的启动子序列。并且本发明还公开了一种抑制植物木质素的基因合成的方法。使用本发明的方法，可以特异性调控特定类型细胞的木质素含量，从而能够在不影响植物的生长、维持正常的植物生物量的情况下，实现木质素含量的显著降低。

Description

一个调控木质素合成的基因及应用

技术领域

本发明涉及植物学领域，具体地，涉及一个调控木质素合成的基因及其应用。

背景技术

植物细胞壁为细胞、组织和整个植物体提供机械支撑的重要结构。细胞壁可分为初生壁和次生壁。

木质素是次生壁中的一类芳香族类聚合物，具有疏水、强化细胞壁强度等特性。植物次生细胞壁中的木质素是伴随着维管植物的出现而存在的。木质素及其单体的化学结构决定了其具有很强的疏水功能。

木质素主要沉积在导管和纤维细胞。导管和纤维细胞在生理功能上具有不同的分工。木质素在导管中的沉积，使导管腔体物理结构强化、增强水分及营养物质运输能力。而水分运输效率是植物正常生长、发育的物质基础。此外，木质素也沉积在纤维细胞中，增强纤维细胞的刚性，是植物直立生长的结构基础。

在造纸工业制浆、生物质能源化利用过程中，由于木质素包裹着纤维素，其疏水特性，降低纤维素的分离及其酶促降解效率。因此需要使用大量的化学试剂去除木质素，于是产生大量的化学废水、造成严重的环境污染。

目前，通过对植物进行基因工程改造以降低木质素的含量，是植物材料绿色开发应用的重要途径。然而，大量的研究表明，降低木质素合成途径中的关键酶或转录调控网路中的关键转录因子，虽然能降低木质素的含量，但同时也会影响植物的正常生长，降低植物生物量。

因此，本领域迫切需要开发一种能够在不影响植物的正常生长的情况下，降低木质素含量的技术体系。

发明内容

本发明的目的就是提供一种能够在不影响植物的正常生长的情况下，降低木质素含量的方法。

在本发明的第一方面，提供了一种MYB4突变蛋白，所述MYB4突变蛋白基于SEQ IDNO:1所示的序列(野生型MYB4蛋白序列)，包括以下位点的核心氨基酸突变为不能被磷酸化的氨基酸残基：T146和T178；

并且，所述MYB4突变蛋白具有负调控植物木质素基因合成的活性。

在另一优选例中，所述不能被磷酸化的氨基酸残基包括：苏氨酸、丝氨酸、和酪氨酸以外的其他氨基酸。

在另一优选例中，所述MYB4突变蛋白来源于野生型MYB4蛋白。

在另一优选例中，所述野生型MYB4蛋白来源于维管植物。

在另一优选例中，所述维管植物包括：被子植物和裸子植物。

在另一优选例中，所述被子植物包括：双子叶植物和单子叶植物。

在另一优选例中，所述单子叶植物包括水稻。

在另一优选例中，所述双子叶植物包括杨树。

在另一优选例中，所述植物为杨树。

在另一优选例中，所述野生型MYB4蛋白包括野生型杨树PdMYB4蛋白。

在另一优选例中，所述MYB4突变蛋白还包括其活性片段、变异形式或衍生蛋白，所述MYB4突变蛋白活性片段、变异形式或衍生蛋白与所述MYB4突变蛋白具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，且具有负调控木质素基因合成的活性。

在另一优选例中，所述MYB4突变蛋白衍生蛋白除所述核心氨基酸突变以外，其余序列与SEQ ID NO:1所示的序列相同或基本相同。

在另一优选例中，所述MYB4突变蛋白选自下组：

(i)序列如SEQ ID NO:2所示；

(ii)对SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列在保持酶活性范围内，进行一个或多个氨基酸的替换、缺失、改变、插入或增加，所得到的氨基酸序列。

在本发明的第二方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码本发明第一方面所述的MYB4突变蛋白。

在另一优选例中，所述多核苷酸的序列如SEQ ID NO:3所示。

在本发明的第三方面，提供了一种植物纤维细胞特异性启动子元件，所述启动子元件选自下组：

(a)核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的多核苷酸；

(b)核苷酸序列与SEQ ID NO:4所示序列的同源性≥95％(较佳地≥98％)，且具有植物纤维细胞中特异启动功能的启动子活性的多核苷酸；

(c)如SEQ ID NO:4所示多核苷酸的5’端和/或3’端截短或增加1-60个(较佳地1-30，更佳地1-6个)核苷酸，且具有植物纤维细胞中特异启动功能的启动子活性的多核苷酸。

在另一优选例中，所述植物为维管植物。

在另一优选例中，所述单子叶植物包括水稻。

在另一优选例中，所述双子叶植物包括杨树。

在另一优选例中，所述纤维细胞特异性启动子元件为PtrDUF579-9(Potri.005G141300)。

在另一优选例中，所述纤维细胞特异性启动子元件还包括由所述启动子元件融合强启动子元件所得的纤维细胞特异性启动子元件。

在另一优选例中，所述强启动子元件为35S启动子。

在另一优选例中，所述强启动子元件为35S mini启动子。

在另一优选例中，所述35S mini启动子的DNA序列如SEQ ID NO:6所示。

在另一优选例中，所述纤维细胞特异性启动子元件为PtrDUF579-9：35Smini。

在本发明的第四方面，提供了一种植物导管特异性启动子元件，所述启动子元件选自下组：

(a)核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示的多核苷酸；

(b)核苷酸序列与SEQ ID NO:5所示序列的同源性≥95％(较佳地≥98％)，且具有植物导管中特异启动功能的启动子活性的多核苷酸；

(c)如SEQ ID NO:5所示多核苷酸的5’端和/或3’端截短或增加1-60个(较佳地1-30，更佳地1-6个)核苷酸，且具有植物导管中特异启动功能的启动子活性的多核苷酸。

在另一优选例中，所述植物为维管植物。

在另一优选例中，所述单子叶植物包括水稻。

在另一优选例中，所述双子叶植物包括杨树。

在另一优选例中，所述导管特异性启动子元件为PtrXCP1(Potri.004G207600)。

在另一优选例中，所述导管特异性启动子元件还包括由所述启动子元件融合强启动子元件所得的导管特异性启动子元件。

在另一优选例中，所述强启动子元件为35S启动子。

在另一优选例中，所述强启动子元件为35S mini启动子。

在另一优选例中，所述纤维细胞特异性启动子元件为PtrXCP1：35Smini。

在本发明的第五方面，提供了一种核酸构建物，所述构建物含有本发明第二方面所述的多核苷酸以及与所述多核苷酸可操作连接的本发明第三方面所述的启动子元件。

在本发明的第六方面，提供了一种表达盒，所述表达盒从5’至3’依次具有下述元件：本发明第三方面所述的启动子元件、本发明第二方面所述的多核苷酸序列和终止子。

在优选的实施方式中，所述的表达盒还包括选自下组的一种或多种元件：poly(A)元件、增强子、转运元件、或基因靶向元件。

在本发明的第七方面，提供了一种载体，所述载体含有如本发明第二方面所述的分离的多核苷酸或如本发明第五方面所述的核酸构建物。

在本发明的第八方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有如本发明第二方面所述的分离的多核苷酸、如本发明第五方面所述的核酸构建物、如本发明第六方面所述的表达盒或如本发明第七方面所述的载体。

在另一优选例中，所述宿主细胞的染色体具有一个或多个(如1-50个，较佳地2-6个)拷贝的如本发明第二方面所述的分离的多核苷酸、如本发明第五方面所述的核酸构建物或如本发明第六方面所述的表达盒。

在另一优选例中，所述的宿主细胞选自下组：原核细胞(如大肠杆菌、链霉菌属、或农杆菌)、低等真核细胞(如酵母细胞)、或高等真核细胞(如植物细胞)。

在另一优选例中，所述的宿主细胞为植物细胞，更佳地为农作物、蔬菜、或花卉的植物细胞。

在本发明的第九方面，提供了一种如本发明第一方面所述的MYB4突变蛋白、如本发明第二方面所述的多核苷酸、如本发明第五方面所述的核酸构建物或如本发明第六方面所述的表达盒、如本发明第七方面所述的载体或如本发明第八方面所述的宿主细胞的用途，用于抑制植物木质素的基因合成。

在另一优选例中，所述木质素为特异性的纤维细胞中的木质素。

在本发明的第十方面，提供了一种抑制植物木质素的基因合成的方法，所述方法包括步骤：

(a)过表达本发明第一方面所述的MYB4突变蛋白；或

(b)抑制野生型MYB4蛋白的T146和T178位点的磷酸化修饰。

在另一优选例中，所述木质素为植物的纤维细胞中的木质素。

在另一优选例中，所述过表达是指在植物中通过启动子特异性地引入和/或增强外源基因的表达。

在另一优选例中，所述步骤(a)中，向所述植物导入如权利要求8所述的核酸构建物或如权利要求9所述的表达盒。

在另一优选例中，所述步骤(b)中，所述野生型MYB4蛋白是所述植物的内源蛋白。

在另一优选例中，所述步骤(b)中，所述抑制通过向所述植物导入能够磷酸化野生型MYB4蛋白的激酶的抑制剂，和/或对能够磷酸化野生型MYB4蛋白的激酶进行基因敲除将来实现。

在另一优选例中，所述对能够磷酸化野生型MYB4蛋白的激酶进行基因敲除包括：基因编辑的方法进行敲除(例如通过CRISPR/Cas9基因编辑手段敲除MAPKs)。

在另一优选例中，所述能够磷酸化野生型MYB4蛋白的激酶是所述植物的内源蛋白。

在另一优选例中，所述能够磷酸化野生型MYB4蛋白的激酶为MAPK6蛋白。

在另一优选例中，所述能够磷酸化野生型MYB4蛋白的激酶是杨树PdMAPK6蛋白。

在另一优选例中，所述能够磷酸化野生型MYB4蛋白的激酶的抑制剂包括：MAPK6蛋白的阻断性抗体、小分子化合物、反义核酸，或其组合。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1PdMYB4蛋白是转录抑制子，能结合并抑制木质素合成基因的表达。

(A)EMSA实验显示PdMYB4蛋白能结合Pd4CL1启动子。箭头指示PdMYB4与探针(probe)的结合产物。mu代表突变探针。

(B)和(C)酵母单杂交定性(B)、定量(C)实验结果显示PdMYB4蛋白能结合Pd4CL1启动子PdMYB4。C图结果为六次重复的平均值±标准误。

(D)PdMYB4-mCherry定位在细胞核。4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)一种DNA荧光染料。

(E)和(F)利用酵母单杂交系统分析PdMYB4转录激活活性。定性(E)、定量(F)实验结果显示PdMYB4蛋白具有转录抑制功能。F图结果为六次重复的平均值±标准误。

图2PdMYB4突变增强木质素在木质部沉积。

(A)移栽两个月的PdMYB4及其同源基因突变体植株表型。突变体通过CRISPR/Cas9基因编辑技术获得。“-”代表突变，“+”代表没有突变。比例尺为10cm。

(B)第十一节间切片染色观察。包括间苯三酚染色(上排)；石蜡包埋切片紫外光下自发荧光(中排)和甲苯胺蓝染色(下排)。比例尺为200μm。

(C-E)细胞壁组分木质素、结晶态纤维素和木糖在移栽两个月杨树茎杆中的含量。

(F)次生细胞壁合成相关基因表达QRT-PCR定量分析。

图3水稻MYB4及其同源基因CRISPR-Cas9突变体表型。

应用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得OsMYB4、OsMYB7单基因突变体(osmyb4,osmyb7)及OsMYB4和OsMYB7双基因突变体(osmyb4osmyb7)。osmyb7株型直立、茎秆强壮；osmyb4osmyb7双突植株变矮、茎秆变硬，抗倒伏。

图4杨树PdMYB4过表达(PdMYB4OE)表型、细胞壁组分分析。

(A)移栽2个月的PdMYB4过表达转基因杨树表型。比例尺为10cm。

(B)移栽8个月的PdMYB4过表达转基因杨树表型。比例尺为10cm。

(C)第十一节间木质部间苯三酚染色。比例尺为50μm。

(D-F)木质素、结晶态纤维素和木糖在移栽2个月和8个月杨树茎杆中的含量。

(G)PdMYB4在对照(Control)和PdMYB4OE株系中的表达量QRT-PCR分析。

(H)移栽人工气候室2个月和移栽温室8个月的PdMYB4OE株系中PdMYB4蛋白定量分析。

图5内源PdMYB4蛋白磷酸化位点筛选的LC-MS/MS检测结果。

图6过表达PdMYB4^T146/178A影响杨树生长抑制木质素合成。

(A)移栽2个月的PdMYB4^T146/178A过表达(PdMYB4^T146/178AOE)转基因杨树表型。比例尺为10cm。

(B)移栽8个月的PdMYB4^T146/178A过表达转基因杨树表型。比例尺为10cm。

(C)PdMYB4^T146/178A过表达株系株高统计。

(D)PdMYB4^T146/178A过表达株系直径统计。

(E)PdMYB4^T146/178A过表达株系节间长统计。

(F)第十一节间木质部间苯三酚染色。比例尺为100μm。

(G)移栽2个月杨树茎杆木质素含量分析。

(H)移栽2个月杨树茎杆结晶态纤维素含量分析。

(I)移栽2个月杨树茎杆木糖含量分析。

(J)移栽2个月杨树PdMYB4在对照(Control)和PdMYB4^T146/178AOE株系中的表达量QRT-PCR分析。

(K)移栽8个月杨树PdMYB4在对照(Control)，PdMYB4OE和PdMYB4^T146/178AOE株系中的表达量QRT-PCR分析。

(L)移栽2个月的PdMYB4OE株系11(#11)和PdMYB4^T146/178AOE株系3(#3)中PdMYB4蛋白定量分析。

图7磷酸化位点突变的PdMYB4(PdMYB4^T146/178A)蛋白比PdMYB4更加稳定。

体外蛋白降解实验显示，PdMYB4蛋白在杨树茎杆总蛋白提取液中快速降解；而蛋白酶体抑制剂MG132和磷酸酶FastAP均能抑制PdMYB4蛋白的降解。(A)和(B)为原核表达纯化的PdMYB4和PdMYB4^T146/178A蛋白。(C)和(D)为从过表达PdMYB4和PdMYB4^T146/178A杨树植株中提取的PdMYB4和PdMYB4^T146/178A蛋白。

图8PdMPK6直接结合并磷酸化PdMYB4。

(A-C)酵母双杂交(A)、双分子荧光互补(BiFC)(B)和免疫共沉淀(Co-IP)(C)实验证实PdMPK6与PdMYB4直接相互作用。

(D)体外磷酸化显示，PdMYB4蛋白中146和178位的苏氨酸被PdMPK6磷酸化。原核表达纯化获得PdMYB4，PdMYB4^T146/178A，PdMPK6和组成性激活形式的PdMKK4(PdMKK4^DD)蛋白。PdMYB4能被激活的PdMPK6磷酸化，而PdMYB4^T146/178A几乎检测不到磷酸化。Autorad，放射自显影；CBB，考马氏亮蓝染色。

图9损伤激活的蛋白激酶PdMPK6促进PdMYB4蛋白降解。

(A-C)机械损伤处理4天后，野生型(A)，PdMYB4OE(B)和PdMYB4^T146AT178AOE(C)茎杆伤口处木质素沉积间苯三酚染色。

(D)QRT-PCR分析木质素合成相关基因在野生型，PdMYB4OE和PdMYB4^T146AT178AOE机械损伤植株中的表达。

(E)PdMPK6能被机械损伤激活。

(F)和(G)机械损伤加速PdMYB4蛋白降解。

图10导管和纤维细胞特异性启动子的筛选、鉴定结果。

其中，Ph为韧皮部，Ca为形成层，Xy为木质部，F为韧皮纤维，V为导管。PtrXCP1(Potri.004G207600)在导管中特异性表达(A)；而PtrDUF579-9(Potri.005G141300)在纤维细胞中特异性表达(B)。

图11细胞特异性过表达PdMYB4T146AT178A植株表型及木质素染色。导管特异性启动子PdXCP1P融合35S mini启动子(PdXCP1P-35S mini)和纤维细胞特异性启动子融合35Smini启动子(PdDUF579-9P-35S mini)驱动PdMYB4T146AT178A基因过表达转基因杨树株系表型(上排)。导管(PdXCP1P-35S mini:PdMYB4T146AT178A)和纤维细胞(PdDUF579-9P-35Smini:PdMYB4T146AT178A)特异性过表达株系第11节间木质素间苯三酚染色。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，经过大量的筛选，首次意外地开发了一种在不影响植物生长的情况下特异性地调控植物中木质素含量的方法。实验表明，杨树PdMYB4蛋白特异性地调控木质素含量，并且通过生物技术改造的PdMYB4蛋白能有效控制细胞壁木质素含量。

具体地，本发明人发现，PdMYB4蛋白受到磷酸化调控，对PdMYB4进行工程化改造PdMYB4^T146/178A(即将其氨基酸序列的第146位和第178位的两个络氨酸T双突变为丙氨酸A)，能够使该蛋白稳定调控木质素合成基因，控制木质素在生物质材料中的含量。并且，利用纤维细胞特异性启动子驱动PdMYB4^T146/178A基因过表达，可特异性调控特定类型细胞的木质素含量，从而能够在不影响或几乎不影响植物的生长、维持正常的植物生物量的情况下，实现木质素含量的显著降低。在此基础上完成了本发明。

术语

MYB4突变蛋白

如本文所用，“本发明的突变蛋白”、“MYB4突变蛋白”、“突变蛋白”可互换使用，是指基于植物野生型MYB4蛋白序列(SEQ ID NO:1)中，位点T146和位点T178的氨基酸残基被突变为不能被磷酸化的氨基酸残基(即除了丝氨酸、苏氨酸和络氨酸之外的其他氨基酸残基)，所形成的的突变蛋白。

本发明涉及一种调控植物木质素基因合成的MYB4突变蛋白及其变体，在本发明的一个优选例中，所述突变蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，具体地，是杨树PdMYB4突变蛋白。本发明的突变蛋白能够有效控制植物木质素的基因合成。

本发明还包括与本发明的SEQ ID NO:2所示序列具有50％或以上(优选60％以上，70％以上，80％以上，更优选90％以上，更优选95％以上，最优选98％以上，如99％)同源性的具有相同或相似功能的多肽或蛋白。

所述“相同或相似功能”主要是指：“控制植物木质素的基因合成”。

本发明的突变蛋白可以是重组蛋白、合成蛋白。本发明的突变蛋白可以是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的突变蛋白可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的突变蛋白还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括具有MYB4突变蛋白活性的MYB4突变蛋白片段和类似物。如本文所用，术语“片段”和“类似物”是指基本上保持本发明的MYB4突变蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。

本发明的突变蛋白片段、衍生物或类似物可以是：(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的；或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽；或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽；或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

本发明中，所述的突变蛋白变体是如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，经过若干个(通常为1-60个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)取代、缺失或添加至少一个氨基酸所得的衍生序列，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在所述蛋白中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能，在C末端和/或\末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。这些保守性变异最好根据表1进行替换而产生。

表1

本发明还包括所要求保护的突变蛋白的类似物。这些类似物与SEQ ID NO:2的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些突变蛋白的类似物包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分了生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的突变蛋白并不限于上述例举的代表性的蛋白。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外蛋白的化学衍生形式如乙酸化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在蛋白质合成和加工中进行糖基化修饰。这种修饰可以通过将蛋白暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。

特异性启动子

在本发明中，提供了两种特异性启动子，分别为纤维细胞特异性启动子和导管特异性启动子。

本发明的纤维细胞特异性启动子能够高效、专一地在杨树纤维细胞中特异性表达，而在其他组织中不表达；本发明的导管特异性启动子能够高效、专一地在杨树导管中特异性表达，而在其他组织中不表达。

木质素主要沉积在导管和纤维细胞中，木质素大量降低通常造成导管塌陷，影响导管输导能力，严重影响植物生长及生物量的累积。使用本发明的纤维细胞特异性启动子与本发明第一方面所述的MYB4突变蛋白的编码基因进行融合并导入植物(如杨树)中，能够特异性地使得植物纤维细胞中的木质素含量显著降低，而不影响植物导管中的木质素含量。因此，可在维持植物正常生长的情况下，降低植物中的木质素总含量。

本文所用的术语“启动子”或“启动子区(域)”是指一种准确有效起始基因转录功能的核酸序列，引导基因核酸序列转录为mRNA，其通常存在于目的基因编码序列的上游(5’端)，一般地，启动子或启动子区域提供RNA聚合酶和正确起始转录所必需的其它因子的识别位点。

在本文中，所述启动子或启动子区(域)包括启动子的变体，启动子变体可以通过插入或删除调控区域，进行随机或定点突变等来获得。

在一个优选的实施方式中，所述纤维细胞特异性启动子为源于杨树的纤维细胞的启动子元件，其序列如SEQ ID NO:4所示。

在另一个优选的实施方式中，所述导管特异性启动子为源于杨树的导管的启动子元件，其序列如SEQ ID NO:5所示。

鉴于本发明的教导和现有技术，本领域普通技术人员应理解，尽管本发明的实施例中提供的启动子的序列如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示，但本发明还应包括与本发明的启动子序列(SEQ ID NO:4和5)具有50％或以上(优选60％以上，70％以上，80％以上，更优选90％以上，更优选95％以上，最优选98％以上，如99％)同源性的核酸，只要所述核酸也具有在杨树纤维细胞/导管中特异性表达的功能。“同源性”是指按照位置相同的百分比，两条或多条核酸之间的相似水平(即序列相似性或同一性)。

本文所用的术语“特异性表达”是指目的基因在植物中特定的时间和/或特定的组织的表达。具体地说，本文所述的“杨树纤维细胞中特异性的表达”是指在本发明的启动子调控下，目的基因高度特异性和专一性地在杨树纤维细胞中表达；本文所述的“杨树导管中特异性的表达”是指在本发明的启动子调控下，目的基因高度特异性和专一性地在杨树导管中表达。

本发明的启动子可以可操作地与外源基因连接，该外源基因相对于启动子可以是外源(异源)的。本文所述的外源基因(或目的基因)没有特别限制，可以是RNAi基因或编码具有特定功能蛋白的基因，例如某些在植物生长或特定成分含量的改良上有重要特性或功能的蛋白。

本文所用的“外源的”或“异源的”是指不同来源的两条或多条核酸或蛋白质序列之间的关系。例如，如果启动子与目的基因序列的组合通常不是天然存在的，则启动子对于该目的基因来说是外源的。特定序列对于其所插入的细胞或生物体来说也是“外源的”。

所述外源基因的代表性例子包括(但不限于)：抗性基因、筛选标记基因、抗原蛋白基因及生物制剂基因、或植物品质相关基因。

所述的抗性基因选自下组：抗除草剂基因、抗病毒基因、耐寒基因、耐高温基因、抗旱基因、抗涝基因、或抗虫基因。所述的筛选标记基因选自下组：gus(β-葡萄糖苷酸酶)基因、hyg(潮霉素)基因、neo(新霉素)基因、或gfp(绿色荧光蛋白)基因。所述的抗原蛋白基因及生物制剂基因选自下组：细菌类抗原蛋白(如霍乱毒素B，破伤风毒素等)、病毒类抗原蛋白(如犬细小病毒)、原生动物类抗原蛋白(阿米巴病原LecA)、自身抗原蛋白(如I型糖尿病的CTB–pins)、或生物制剂(如α2b干扰素，胰岛素样生长因子等)。所述的植物品质相关基因选自下组：氨基酸改良相关基因、脂肪改良相关基因、淀粉改良相关基因或雄性不育相关基因。

本发明的载体、表达盒以及宿主细胞

在本发明中，提供了一种载体，其包含本发明的纤维细胞特异性启动子和编码本发明突变蛋白的多核苷酸。在优选的实施方式中，所述载体的启动子(即本发明的纤维细胞特异性启动子)下游包含多克隆位点或至少一个酶切位点。将目的基因(即编码本发明突变蛋白的多核苷酸)连接入适合的多克隆位点或酶切位点，从而可操作地连接目的基因与启动子。在另一优选的实施方式中，所述载体在5’到3’方向上包括：启动子，目的基因和终止子。如果需要，所述载体还可以包括以下元件：3’多聚核苷酸化信号；非翻译核酸序列；转运和靶向核酸序列；抗性选择标记；增强子；或操作子。

用于制备载体的方法是本领域普通技术人员所熟知的。表达载体可以是细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要其能够在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都是可以被采用的。

本领域普通技术人员可以采用熟知的方法构建含有本发明启动子和/或目的基因序列的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。

本发明还提供了一种基因表达盒，所述表达盒从5’-3’依次具有下列元件：本发明的纤维细胞特异性启动子、基因ORF序列和终止子。优选地，所述启动子序列如SEQ ID NO:4所示或与SEQ ID NO:4所示序列的同源性≥95％，较佳地≥98％，更佳地≥99％。

本发明的纤维细胞特异性启动子、表达盒或载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使宿主表达蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞，如大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌：或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体和宿主细胞。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物(如大肠杆菌)时，可以用CaCl₂法处理，也可用电穿孔法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法(如显微注射、电穿孔、脂质体包装等)。转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法、幼胚转化法、花芽浸泡法等。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得转基因的植物。

本发明所提供的载体、表达盒以及宿主细胞，能够特异性地控制杨树纤维细胞中的木质素的基因合成，而不影响杨树导管中的木质素含量。因此实现了在维持植物正常生长的情况下，降低植物中的木质素总含量。

本发明的方法

在本发明中，提供了一种抑制植物木质素的基因合成的方法。具体地，所述方法包括两种方式来调控植物的木质素的基因合成：(a)过表达本发明第一方面所述的MYB4突变蛋白；和(b)抑制野生型MYB4蛋白的T146和T178位点的磷酸化修饰。

在所述方法包括步骤(a)时，具体地是通过使用本发明所述的纤维细胞特异性启动子结合编码本发明第一方面所述的MYB4突变蛋白的基因、本发明提供的载体、表达盒以及宿主细胞来实现的。

在所述方法包括步骤(b)时，具体地，通过抑制或阻断或敲除植物体中能够将植物内源性的MYB4蛋白的T146和T178进行特异性地磷酸化的MAPK。

在一个优选的实施方式中，所述的MAPK是MAPK6，更具体地，是杨树PdMAPK6蛋白。

在一个优选的实施方式中，所述的抑制或阻断或敲除MAPK包括向植物导入MAPK(优选地MAPK6)的抑制剂；所述抑制剂包括：MAPK(MAPK6)蛋白的阻断性抗体、小分子化合物、反义核酸，或其组合。

在一个优选的实施方式中，所述的抑制或阻断或敲除MAPK包括使用基因编辑的方法将MAPK(优选地MAPK6)蛋白进行敲除。在一个优选的实施方式中，所述基因编辑的方法为CRISPR/Cas9基因编辑方法。

本发明的主要优点包括：

(1)首次发现PdMYB4蛋白稳定性的调控机制。具体地，PdMYB4蛋白受到磷酸化调控，PdMYB4蛋白的T146和T178位点的磷酸化影响其蛋白稳定性。

(2)首次筛选到导管(PdXCP1)、纤维细胞(PdDUF579-9)特异性表达的启动子。将这两个启动子分别融合35Smini启动子，可以不改变这两个启动子的细胞类型特异性表达的特性。

(3)用导管(PdXCP1P:35Smini)、纤维细胞(PdDUF579-9:35Smini)特异性驱动基因工程改造过的PdMYB4蛋白，可以降低特定细胞类型中的木质素含量及其单体组成，同时不影响植物的生长。其中，纤维细胞特异性降低木质素含量，可以在不影响植物生长的情况下，显著提高木质纤维质的糖化效率。

(4)能实现木质素含量的精准调控，从而推动能源植物优异种质的分子设计育种。

(5)本发明发现的这种简单、有效降低木质素含量的方法，可拓展应用于其他物种中。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

如无特别说明，实施例所用的材料和试剂均为市售产品。

实施例1：调控木质素合成的转录因子的筛选

在本实施例中，利用酵母单杂交系统，以林木模式植物杨树的木质素合成途径关键基因对香豆酸辅酶A连接酶家族成员Pd4CL1启动子片段，筛选Pd4CL1基因的调控蛋白。在酵母单杂交实验的结果中，筛选到了一系列可能调控木质素合成的转录因子，包括PdMYB4。

随后，以PdMYB4为对象进行后续功能研究。

结果如图1所示。凝胶电泳迁移率实验(EMSA)和酵母单杂交实验表明，PdMYB4能直接结合Pd4CL1启动子序列。亚细胞定位显示，PdMYB4是一个核定位蛋白；转录激活分析显示，PdMYB4具有转录抑制活性。

结果表明，PdMYB4是一个能直接结合到木质素合成基因启动子上的负调控因子。

实施例2：测试PdMYB4及其同源基因的突变是否促进木质素合成

在本实施例中，通过CRISPR-Cas9基因编辑技术对杨树PdMYB4及其同源基因PdMYB7，PdMYB32进行基因编辑。对编辑纯合突变体进行生理指标测定、细胞壁组分进行分析。

结果如图2所示，PdMYB4突变体株高略矮、茎杆变硬、细胞壁组分中木质素含量显著增加。这表明PdMYB4通过特异性抑制木质素合成基因表达，负调控木质素合成。

在本实施例中，为了探索MYB4基因调控木质素合成机制的普遍性，还对单子叶粮食作物水稻中的同源基因OsMYB4和OsMYB7应用CRISPR-Cas9技术进行敲除。

结果如图3所示，OsMYB4和OsMYB7双突变体，株高略矮、茎杆变硬，抗倒伏能力增强。

这些结果表明，通过人工编辑PdMYB4基因，可获得株高略矮、茎杆变硬的抗倒伏新种质，为抗倒伏育种提供重要基因资源。

实施例3：测试过表达PdMYB4是否降低木质素含量

在本实施例中，通过35S启动子组成性过表达的方法，对杨树的PdMYB4基因进行过表达。观察PdMYB4-OE(过表达PdMYB4)转基因株系植株及野生型分别在移栽2个月和8个月的表型，比较在移栽2个月和8个月时其木质素、结晶态纤维素和木糖的含量，并对其核酸以及蛋白进行定量分析。

结果如图4所示，PdMYB4-OE转基因株系植株的高度、形态与野生型相比，其表型可分为三类：与野生型相似；株高正常、茎杆变软；植株严重矮化(图4A)。此外，随着杨树的生长，PdMYB4-OE中植株严重矮化的表型逐渐变弱(图4B)。转基因阳性株系中PdMYB4基因在转录水平均高表达(图4G)。对PdMYB4进行进一步蛋白水平的检测，结果发现转基因植株表型严重程度与检测到的PdMYB4蛋白呈正相关(图4H，I)，但与PdMYB4转录水平的表达相关性较低。

因此，以上结果证明，PdMYB4存在蛋白水平的调控，从而调节PdMYB4蛋白稳定性，影响转基因植株表型稳定性。

实施例4：PdMYB4蛋白稳定性的调控机制的研究

1.PdMYB4蛋白的修饰形式的测定

首先，通过蛋白质组学分析PdMYB4蛋白可能的修饰形式。通过构建35S:PdMYB4-3Flag载体转化杨树。筛选转基因阳性苗中PdMYB4-3Flag高表达的株系，利用免疫沉淀技术，富集PdMYB4蛋白。并用对富集的PdMYB4蛋白用液相色谱质谱联用技术liquidchromatography-tandem mass spectrometry(LC-MS/MS)检测PdMYB4蛋白磷酸化位点。

结果如图5所示。其中，图A显示了PdMYB4蛋白中肽段GIDPATHRPLNEPAQEASTTISFSTT(pT)PAK(SEQ ID NO:7)中的苏氨酸(Thr 146)发生磷酸化修饰；图B显示了PdMYB4蛋白中肽段EEK(pT)PVQER(SEQ ID NO:8)中的苏氨酸(Thr 178)发生磷酸化修饰。

2.PdMYB4蛋白磷酸化修饰与PdMYB4蛋白稳定性的关系

随后，构建了磷酸化位点突变型PdMYB4(PdMYB4^T146/178A)，组成型过表达杨树。

表型分析结果如图6和图7所示，PdMYB4^T146/178A过表达株系植株严重矮化、茎秆柔软、分支增多。PdMYB4在转录水平和蛋白水平表达分析表明PdMYB4^T146/178A比PdMYB4蛋白更稳定。

3.寻找PdMYB4磷酸化修饰水平的调控蛋白

通过酵母双杂交的方法，筛选PdMYB4的互作蛋白。

在一系列PdMYB4互作候选蛋白中，本发明人发现一个蛋白激酶丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase)PdMAPK6。通过酵母双杂交、双分子荧光互补实验和免疫共沉淀等实验证实，PdMYB4与PdMAPK6存在直接相互作用(图8A-C)。体外磷酸化实验表明，PdMYB4蛋白的T146和T178位点被PdMAPK6磷酸化(图8D)。进一步地，通过遗传实验证实，蛋白激酶PdMPK6促进木质素的合成是通过使PdMYB4蛋白降解从而解除PdMYB4蛋白对木质素合成基因的抑制(图9)。

实施例5：蛋白PdMYB4^T146/178A的特异性过表达

木质素主要沉积在导管和纤维细胞，而导管和纤维细胞在生理功能上具有不同的分工。

在本实施例中，首先对导管和纤维细胞特异性启动子进行了筛选和鉴定。通过对多个基因的启动子构建GUS转化杨树，对这些启动子在杨树各组织中的表达进行染色，筛选导管、纤维细胞特异性表达的的启动子。

筛选和鉴定结果如图10所示，其中，PtrXCP1(Potri.004G207600)在导管中特异性表达(A)；而PtrDUF579-9(Potri.005G141300)在纤维细胞中特异性表达(B)。

其次，为了克服组成型过表达PdMYB4^T146/178A基因对杨树生长的影响，本实施例中利用导管和纤维细胞特异性启动子驱动PdMYB4^T146/178A基因过表达，探索生物质资源木质素改造的有效途径。

结果如图11所示，其中，导管特异性过表达PdMYB4^T146/178A杨树株高严重矮化、节间缩短、叶片变小、分支增多等表型；而纤维细胞特异性过表达PdMYB4^T146/178A杨树生长不受影响，仅表现为茎杆变软。茎杆切片显示，导管特异性过表达PdMYB4^T146/178A杨树的导管塌陷；纤维细胞特异性过表达PdMYB4^T146/178A杨树的纤维细胞木质素含量显著降低。

因此，本发明通过人工改造PdMYB4蛋白(PdMYB4^T146/178A)结合细胞特异性启动子，可精准控制木质素含量，为定向改造生物质资源提供有效支撑。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国科学院上海生命科学研究院

<120> 一个调控木质素合成的基因及应用

<130> P2018-1245

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 268

<212> PRT

<213> 杨树(Populus alba)

<400> 1

Met Gly Arg Ser Pro Cys Cys Glu Lys Ala His Thr Asn Lys Gly Ala

1 5 10 15

Trp Thr Lys Glu Glu Asp Asp Arg Leu Ile Ala Tyr Ile Arg Thr His

20 25 30

Gly Glu Gly Cys Trp Arg Ser Leu Pro Lys Ala Ala Gly Leu Leu Arg

35 40 45

Cys Gly Lys Ser Cys Arg Leu Arg Trp Ile Asn Tyr Leu Arg Pro Asp

50 55 60

Leu Lys Arg Gly Asn Phe Thr Glu Glu Glu Asp Glu Leu Ile Ile Lys

65 70 75 80

Leu His Ser Leu Leu Gly Asn Lys Trp Ser Leu Ile Ala Gly Arg Leu

85 90 95

Pro Gly Arg Thr Asp Asn Glu Ile Lys Asn Tyr Trp Asn Thr His Ile

100 105 110

Arg Arg Lys Leu Leu Asn Arg Gly Ile Asp Pro Ala Thr His Arg Pro

115 120 125

Leu Asn Glu Pro Ala Gln Glu Ala Ser Thr Thr Ile Ser Phe Ser Thr

130 135 140

Thr Thr Pro Ala Lys Glu Glu Ser Leu Ser Ser Val Lys Glu Glu Ser

145 150 155 160

Asn Lys Glu Lys Ile Ile Ser Ala Gly Ala Phe Ile Cys Lys Glu Glu

165 170 175

Lys Thr Pro Val Gln Glu Arg Cys Pro Asp Leu Asn Leu Glu Leu Arg

180 185 190

Ile Ser Leu Pro Cys Gln Asn Gln Pro Asp Arg His Gln Ala Phe Lys

195 200 205

Thr Gly Gly Ser Thr Ser Leu Cys Phe Ala Cys Ser Leu Gly Leu Gln

210 215 220

Asn Ser Lys Asp Cys Ser Cys Ser Val Ile Val Gly Thr Ile Gly Ser

225 230 235 240

Ser Ser Ser Ala Gly Ser Lys Thr Gly Tyr Asp Phe Leu Gly Met Lys

245 250 255

Ser Gly Val Leu Asp Tyr Arg Gly Leu Glu Met Lys

260 265

<210> 2

<211> 268

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 2

Met Gly Arg Ser Pro Cys Cys Glu Lys Ala His Thr Asn Lys Gly Ala

1 5 10 15

Trp Thr Lys Glu Glu Asp Asp Arg Leu Ile Ala Tyr Ile Arg Thr His

20 25 30

Gly Glu Gly Cys Trp Arg Ser Leu Pro Lys Ala Ala Gly Leu Leu Arg

35 40 45

Cys Gly Lys Ser Cys Arg Leu Arg Trp Ile Asn Tyr Leu Arg Pro Asp

50 55 60

Leu Lys Arg Gly Asn Phe Thr Glu Glu Glu Asp Glu Leu Ile Ile Lys

65 70 75 80

Leu His Ser Leu Leu Gly Asn Lys Trp Ser Leu Ile Ala Gly Arg Leu

85 90 95

Pro Gly Arg Thr Asp Asn Glu Ile Lys Asn Tyr Trp Asn Thr His Ile

100 105 110

Arg Arg Lys Leu Leu Asn Arg Gly Ile Asp Pro Ala Thr His Arg Pro

115 120 125

Leu Asn Glu Pro Ala Gln Glu Ala Ser Thr Thr Ile Ser Phe Ser Thr

130 135 140

Thr Ala Pro Ala Lys Glu Glu Ser Leu Ser Ser Val Lys Glu Glu Ser

145 150 155 160

Asn Lys Glu Lys Ile Ile Ser Ala Gly Ala Phe Ile Cys Lys Glu Glu

165 170 175

Lys Ala Pro Val Gln Glu Arg Cys Pro Asp Leu Asn Leu Glu Leu Arg

180 185 190

Ile Ser Leu Pro Cys Gln Asn Gln Pro Asp Arg His Gln Ala Phe Lys

195 200 205

Thr Gly Gly Ser Thr Ser Leu Cys Phe Ala Cys Ser Leu Gly Leu Gln

210 215 220

Asn Ser Lys Asp Cys Ser Cys Ser Val Ile Val Gly Thr Ile Gly Ser

225 230 235 240

Ser Ser Ser Ala Gly Ser Lys Thr Gly Tyr Asp Phe Leu Gly Met Lys

245 250 255

Ser Gly Val Leu Asp Tyr Arg Gly Leu Glu Met Lys

260 265

<210> 3

<211> 807

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 3

atgggaaggt ctccttgctg tgaaaaagct catacaaaca aaggcgcatg gactaaggaa 60

gaagatgatc gccttattgc ttacattaga acccacggtg aaggttgctg gcgttcactt 120

cctaaagctg ctggccttct aagatgtggc aagagctgca ggcttcgttg gatcaactat 180

ttaagacctg accttaaacg tggcaatttt actgaagaag aagatgagct cattatcaaa 240

ctccatagtc tcctcggcaa caaatggtca cttatagccg gaagattacc agggagaaca 300

gataatgaga taaagaatta ttggaacaca catataagaa ggaagctctt gaatagaggc 360

atagatcctg cgactcatag gccactcaat gaaccagccc aagaagcttc aacaacaata 420

tctttcagca ctactgcccc agctaaagaa gagtcgttga gttctgttaa agaggaaagt 480

aataaggaga agataattag cgcaggtgct tttatatgca aagaagagaa agccccagtt 540

caagagaggt gtccagactt gaatcttgaa cttagaatta gccttccttg ccaaaaccag 600

cctgatcgtc accaggcatt caaaactgga ggaagtacaa gtctttgttt tgcttgcagc 660

ttggggctac aaaacagcaa ggactgcagt tgcagtgtca ttgtgggtac tattggaagt 720

agcagtagtg ctggctccaa aactggttat gacttcttag ggatgaaaag tggtgtgttg 780

gattatagag gtttggagat gaaatga 807

<210> 4

<211> 1915

<212> DNA

<213> 杨树(Populus alba)

<400> 4

catcttatct agttttatat tttctttttc tttttctatt tatcaaaaga atataaaatt 60

gttgagaatg attaagtcgt caactaattt aaaatatagt gataaaatga atatatattt 120

tccgaaacta cgagaattag aatattaatg actgatttac aactaattta aagatggcgt 180

ctttttgcaa agcagatctc aactgcacca ccgtctttcc aagcctacga atgcacttac 240

aagtcacaaa cacttgccct ctttgctttt tctttttatg ctcgttttct taaacactac 300

ttagcccaaa caattagtga accgtggatc cggggttgga actgagttgg gttaaaaaaa 360

atagggaaag aaaaaacccg gtgcccggta tgacccggcg acctggttga cacagcaaga 420

cccggtcaaa aacccgatta caaccatttt tgttttttta ctaaaatgat gtggttttaa 480

ttttttttta aaaaagaatt gacccggtta aagcccagaa tctgacccgg aacccgggtc 540

ttagatcaga ccgggtctaa aaactataag tctaggtgtc aagattaaaa aataatattt 600

tttaaaaaat aggaaactaa gttacattct tagactaccg taaaaacaca tctctcatat 660

caatctagta tattaaaaga aacttaataa taaattattt tgagtgctgc ctcgagattt 720

aaactaaaaa agaaaaagaa aaaaaagaac atacttcctt aatcaccata ccaatcatta 780

agattaaaaa taatagaatc tctaaagtaa ttgtttagcc tcttaccaac cgagaagtcc 840

atttgttttg gtcctttttt atttttattt ttgagaagga gaacaatata attgagcctt 900

aagctggaat aacatgggtt ggcagggaac taggaacagg atgtctaatg tcaaaggttt 960

tgaacacaag gcaagatcag taaacaccgt ggctacttca ggatctcctc cgtcttcccg 1020

ctgcactact ctctcatgaa caattaaatt aaccattaaa gagtaattta attggttaga 1080

ttttaaattt gtttttttaa agatcaccag ttcgagtctt ataaatttta ggaccactga 1140

aagcttacat gatcgttaac ttcagattca taagattagt caatatacgt gcaagctagc 1200

ccgaacaatc acattaatcc aaaaaaaaaa aaaatctccc gtgcttcaac taatcagcaa 1260

ctacaggagg tgggatgtgg catatataat ccaacggttg cttttggaca ggaatctttt 1320

gcaggtaaat ggtctctctc agaaggtaac taccatttta agaaatgata ttgtataata 1380

gaggttgctt gagaactaaa actaagatga agaaggaaaa gcgacttctg acttgtaatt 1440

agttatgggg tcgctggaga cacaccagct acggctagct ccagcccaac cactttgcgt 1500

cttgctccta ttgcacatca aatgtggacg gatttccctg ttcttttcca tgaccatgaa 1560

aaaaaaaaga aaaaaaaagg agtcgtttgg ccaatcgtaa ttgcattttt taaataaaat 1620

aaatcagtgc aaattaatat cagctcccaa atatgaggta attatttctc ttcaatggta 1680

gcattaggtt catttgaaat gtgattaaca tgtcattgtt cgtacttggc tgagctccat 1740

ctcctgttgc ttcaaacatt gatatgctgc cttgagctag ctaaccccat ctttaaaatc 1800

attctctctt ttctcatttc catcaagatt caagatcttg accaccacag cacagccaga 1860

tcagagattt cacgcttaca cttctctctc tcttcctctc cctctcactc aaaaa 1915

<210> 5

<211> 2068

<212> DNA

<213> 杨树(Populus alba)

<400> 5

taggttgtgc atttactata tgcacgacta gtgattgtgt atatagtaca tgcgcaacca 60

ctaggtcgtg aatatagtac atgtgcaata tatggatgtg tatataacaa attcatgtct 120

ctataggtcg tgcatgtact acatgtgcga ctattgtttt tgtgctagaa tatgaattac 180

ttttttaatt gtgatagttt gggaataagt ttgctcactt tgctagtgtg ggaaaaaact 240

cccagaaaaa tagtaataga ttgcattgta tcttcacacc gcctctacct cctttctcca 300

agaaagtcat aattaaagca aatttcaatc caattagtta cttgattgat gtgcggtttg 360

attgaatgag agatcgaagg catatatata tagatgtttt ttaagtaatt aatttatttt 420

taggttctac ttttggaatc attattctct taaatattca aaatcaatca atattaaaac 480

aagtttctaa aatcatgaat ttagagtaat gcaattaaaa aatctaaaga tatttataaa 540

agtgaaaata ataataataa taataataac aacaataaag acaattaaaa aggaaaaaaa 600

aaggtttgct ttctctgtgg tctcaggttc gagccctgtg gttgctcata tgatggccac 660

tggaggctta catggtcgtt aacttcaggg cccgtgagat tagtcgaggt gcgcgcaagt 720

aggcccggac acccacgtta aactaaaaaa aaaaaaaaag attaggagaa aattttataa 780

gttttaaaga gtaattagtg atattctatt tgactatcaa gagtgataaa aaaacatctt 840

tatatattat ttttctataa aataaactca aataataatt aatataagac cgctagctgc 900

tatttttaac attataaaat ttctcaggaa gtcacagcgg tatgtatata aaattcttgg 960

tatagtggcc aaaacgccca gcaaagaatt atcggggaac agagccttta aaatcagccc 1020

aaaacccagg ctagaccata accctatagg acgtgacgaa gcaaaggaga gttcattgat 1080

aattaatcgg gccccatcaa ttttcagtgg cccgttttcg tctttcaaga ttccaattat 1140

gctctcctct tctgtaaatc caacggctag tgtgtttgcg agtgcttttt aaataatttt 1200

tcgtgtcaaa atgcatgtca atgatgtttt ttcatttttt aaaaattatt ttcaccatga 1260

agctaaatga ttaatgctat gttggagtct atttttatgt attacggtga cctttgcggt 1320

ttgaaaaaaa taaaattata aatcatagtt ttttttaatc aagattttaa aaaatagttt 1380

ttttatgata tttatctaaa attatagtgt atttcaatgt aatagaaaca aaatatagat 1440

cgcatcacat catactacaa aaacaaacat agccttagag cgtttttagt aatacggtgc 1500

aaagagtgtt tcagaagttt tttttattaa aaatacatta aaactatgtt cttttcataa 1560

tatatttttt tatttttgat atcaatacat taaaaccata aaaaaatctt aaaaagtatc 1620

aatttaatat atttttaatt aaaaaacaac tcgaaaagca ttttgaatgt gtttggtatt 1680

atgatagttt ttatattgcg gcaagtgttt ttgagcgatt atcattaatg caatgctctt 1740

ttcttcaaga agaaaagatc aacgcatgtc tctcatgttg gtttatacaa ttatggttct 1800

cttgtctctc atttagaaat cgaaataact gagcttctag tctccattgt aagaaaaatg 1860

aaaatgcttg gagcaaaagc aatccaaata atgaacaaat cgtaaaggct gagtttgatt 1920

tgaaaattta ttcaaccaac ttcacttgaa agctaacata tgagaccaaa gctatatata 1980

actaccccgc ccccttcctc atctctcatc catctcttct actgctctgt tcttacctct 2040

cattttactg tctaatctct caatctcc 2068

<210> 6

<211> 133

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 6

ccaaccacgt cttcaaagca agtggattga tgtgatatct ccactgacgt aagggatgac 60

gcacaatccc actatccttc gcaagaccct tcctctatat aaggaagttc atttcatttg 120

gagaggacac gct 133

<210> 7

<211> 30

<212> PRT

<213> 杨树(Populus alba)

<400> 7

Gly Ile Asp Pro Ala Thr His Arg Pro Leu Asn Glu Pro Ala Gln Glu

1 5 10 15

Ala Ser Thr Thr Ile Ser Phe Ser Thr Thr Thr Pro Ala Lys

20 25 30

<210> 8

<211> 9

<212> PRT

<213> 杨树(Populus alba)

<400> 8

Glu Glu Lys Thr Pro Val Gln Glu Arg

1 5

Claims

1.一种MYB4突变蛋白，其特征在于，所述MYB4突变蛋白基于SEQ ID NO: 1所示的野生型MYB4蛋白序列，其T146和T178位点的核心氨基酸突变为不能被磷酸化的氨基酸残基Ala；并且，所述MYB4突变蛋白具有负调控杨树木质素基因合成的活性。

2.如权利要求1所述的MYB4突变蛋白，其特征在于，所述MYB4突变蛋白的序列如SEQ IDNO: 2所示。

3.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码权利要求1所述的MYB4突变蛋白。

4.如权利要求3所示的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的序列如SEQ ID NO: 3所示。

5.一种核酸构建物，其特征在于，所述构建物含有权利要求3所述的多核苷酸以及与所述多核苷酸可操作连接的启动子元件，所述启动子元件选自下组：植物纤维细胞特异性启动子元件、植物导管特异性启动子元件。

6.如权利要求5所述的核酸构建物，其特征在于，所述植物纤维细胞特异性启动子元件的核苷酸序列如SEQ ID NO: 4所示。

7.如权利要求5所述的核酸构建物，其特征在于，所述植物纤维细胞特异性启动子元件还包括由所述启动子元件融合强启动子元件所得的植物纤维细胞特异性启动子元件。

8.如权利要求7所述的核酸构建物，其特征在于，所述强启动子元件为35S mini启动子，所述35S mini启动子的DNA序列如SEQ ID NO: 6所示。

9.如权利要求5所述的核酸构建物，其特征在于，所述植物导管特异性启动子元件的核苷酸序列如SEQ ID NO: 5所示。

10.一种表达盒，其特征在于，所述表达盒从5’至3’依次具有下述元件：启动子元件、权利要求3所述的多核苷酸序列和终止子，所述启动子元件选自下组：植物纤维细胞特异性启动子元件、植物导管特异性启动子元件。

11.一种载体，其特征在于，所述载体含有如权利要求3所述的分离的多核苷酸或如权利要求5所述的核酸构建物。

12.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有如权利要求3所述的分离的多核苷酸、如权利要求5所述的核酸构建物、如权利要求10所述的表达盒或如权利要求11所述的载体。

13.一种如权利要求1所述的MYB4突变蛋白、如权利要求3所述的多核苷酸、如权利要求5所述的核酸构建物或如权利要求10所述的表达盒、如权利要求11所述的载体或如权利要求12所述的宿主细胞的用途，其特征在于，通过过表达如权利要求1所述的MYB4突变蛋白，从而降低杨树木质素的含量。

14.一种降低杨树木质素的含量的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：过表达权利要求1所述的MYB4突变蛋白。