KR100827553B1

KR100827553B1 - 애기장대 ＡｔＰＦＰα2 프로모터 및 상기 프로모터로형질전환된 식물

Info

Publication number: KR100827553B1
Application number: KR1020060129577A
Authority: KR
Inventors: 전종성; 임혜민; 조정일; 부성희; 한태룡; 안진흥
Original assignee: 경희대학교 산학협력단
Priority date: 2006-12-18
Filing date: 2006-12-18
Publication date: 2008-05-07

Abstract

본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는, 애기장대 유래의 PFP(pyrophosphate:fructose-6-phosphate 1- phosphotransferase) α2(AtPFP α2) 프로모터, 상기 프로모터를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 식물, 상기 식물의 종자 및 상기 형질전환 식물의 제조 방법에 관한 것이다.

애기장대, AtPFPα2, 프로모터, 식물, 형질전환, GUS

Description

애기장대 ＡｔＰＦＰα2 프로모터 및 상기 프로모터로 형질전환된 식물{Arabidopsis thaliana AtPFPα2 promoter and plant transformed with the same}

도 1은 본 발명에 이용된 AtPFPα2(상단) 유전자 및 AtPFPα2 유전자를 갖는 프로모터::GUS 융합 벡터의 게놈 구조(하단)를 나타낸다.

도 2는 AtPFP α2:: GUS 형질전환 식물에서 GUS 유전자 발현을 나타낸다. AtPFP α2:: GUS 식물의 묘목 (c) 및 꽃 (d). 막대기, 1 mm.

도 3은 야생형(a) 및 3개의 trichome 돌연변이체인 gl1 -2 (b), ttg1 -1 (c) 및 ttg2 -1 (d)에서 AtPFP α2::GUS의 발현 패턴을 보여준다.

도 4는 AtPFP α2 프로모터의 5' 결실 돌연변이체 분석을 보여준다. (a) GUS 리포터 유전자에 융합된 AtPFPα2 프로모터의 5' 결실 돌연변이체의 모식도. (b-i) 5' 결실 구축물인 -1511 (b), -1058 (c), -500 (d), -214 (e), -126 (f), -83 (g), -47 (h) 및 -4 (i)의 조절하의 GUS 리포터 유전자의 발현 패턴. AtPFP α2 프로모터 내의 5' 결실은 전사 개시 부위로부터의 거리를 bp로 나타낸다. ATG 번역 개시 부위는 +78에 해당한다.

도 5는 AtPFP α2 프로모터에서 조절 원소의 동정을 나타낸다. (a) 벡터 구축물의 모식도. (b-e) 부가적인 결실 돌연변이체인 -194 (b), -174 (c), -154 (d), 및 -214 ~ -48 서열의 내부 결실 돌연변이체 (e)의 발현 분석. AtPFP α2 프로모터 내의 결실은 전사 개시 부위로부터의 거리를 bp로 나타낸다.

도 6은 -46 CaMV35S 최소 프로모터를 포함하는, AtPFP α2 유전자 발현에 관련된 주요 조절 원소 PFP α2 (-194 ~ -175) 서열의 조절하의 GUS 발현을 보여준다. (a) 벡터 구축물의 모식도. (b) 20-bp 서열 및 최소 프로모터에 의해 유도된 GUS 융합 구축물의 발현 패턴. 잎에서 trichome-특이적인 GUS 발현을 확대된 이미지로 보여준다. (c) -46 CaMV35S 최소 프로모터에 의해 유도된 GUS 융합 구축물을 갖는 형질전환된 잎. 잎에서의 GUS 발현은 확대된 이미지에서 관찰되지 않았다.

본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는, 애기장대 유래의 PFP(pyrophosphate:fructose-6-phosphate 1-phosphotransferase) α2(AtPFPα2) 프로모터, 상기 프로모터를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 식물, 상기 식물의 종자 및 상기 형질전환 식물의 제조 방법에 관한 것이다.

세포질에서 주요 탄수화물 대사 동안, 프럭토오스-6-포스페이트 (Fru-6-P) 및 프럭토오스-1,6-비스포스페이트 (Fru-1,6-bisP) 사이의 전환은 해당과정 및 글루코스신 합성 양자에서 율속 단계이다. 상기 반응은 많은 고등 식물에서 2가지 기작에 의해 촉매된다 (Carlisle et al., (1990) J Biol Chem 265:18366-18371; Nielsen et al., (2004) Trends Plant Sci 9:556-563; Nielsen and Stitt (2001) Planta 214:106-116; Todd et al., (1995) Gene 152:181-186). 상기 기작 중의 하나는 2가지 효소, 즉, Fru-6-P의 Fru-1,6-bisP로의 해당과정 전환을 촉매하는 ATP-의존성 포스포프럭토키나아제 (PFK), 및 역 글루코스신합성 반응을 촉매하는 세포질 프럭토오스-1,6-비스포스파타아제(FBPase)에 의해 조절된다.

대안적인 경로로, 양방향 효소인 피로포스페이트:프럭토오스-6-포스페이트 1-포스포트랜스퍼라아제(PFP)는 가역 반응을 촉매한다. 식물은 PFP 및 PFK 양자를 포함하는 반면, 박테리아 및 원생동물은 둘 중에 하나를 포함하나, 양자를 포함하지는 않으며, 효모 및 동물은 단지 PFK를 이용한다 (Alves et al., (1996) J Bacteriol 178:149-155; Mertens E (1990) Mol Biochem Parasitol 40:147-149).

PFP는 다양한 식물 조직에 존재하며, 이의 활성은 PFK의 활성과 동일하거나 또는 종종 초과한다. 그러나, PFP의 정확한 기능 및 중요성은 여전히 불명확하며 논쟁의 여지가 있다. 식물 대사 동안 PFP의 중요성에 대한 간접적인 증거로서, 상기 효소의 활성은 발생 단계 및 성장 조건에 의존하는 것으로 밝혀졌다. 지금까지, PFP의 다양한 역할은 또한 수개의 경로, 예를 들면, 해당과정 (Hajirezaei et al., (1994) Planta 192:16-30), 글루코스신합성 (Fahrendorf et al., (1987) Plant Physiol 84:182-187), 헥소오스- 및 트리오스-포스페이트 풀의 평형화 (Dennis and Greyson (1987) Physiol Plant 69:395-404), 및 스트레스 조건에 대한 일반적인 적 응력 (Black et al,, (1987) Physiol Plant 69:387-394)에서 제안되어 왔다.

많은 식물 조직에 존재하는 PFP의 천연 형태는 독특한 α 및 β 서브유닛으로 이루어진 복수 형태, 통상적으로 β₂ 및 α₂β₂로 존재한다(Kruger & Dennis (1987) Arch Biochem Biophys 256:273-279; Wang & Shi (1999) FEBS Lett 459:448-452). 또한, β 서브유닛은 촉매 자리를 가지는 반면, α 서브유닛은 프럭토오스-2,6-비스포스페이트 (Fru-2,6-bisP)의 촉매 활성을 조절한다. Fru-2,6-bisP는 PFP를 활성화시키나, 세포질 FBPase를 강력하게 저해하여, Fru-6-P 및 Fru-1,6-bisP 사이의 유동을 조절한다.

애기장대 게놈은 각각 AtPFP α1 및 AtPFP α2, AtPFP β1 및 AtPFP β2로 표시되는 2개의 PFP α 및 2개의 PFP β 유전자를 가지고 있는 것 같다(Nielsen et al., (2004) Trends Plant Sci 9:556-563).

잎의 trichome는 그 상피 세포층으로부터 유도된 특수화된 구조이다. 그것은 곤충의 공격으로부터 그 식물을 보호하는 방어적인 생리적인 구조로서 기능을 할 수도 있다. 더욱이, 인위적인 피해와 자스몬산(JA), 방어신호분자는 애기장대 trichome의 유도를 야기하는 것으로 발견되었다. Trichome 특이적 프로모터는 해충과 병원균으로의 식물 저항성 향상에 대한 잠재적인 단백질의 직접적인 발현에 관여할 뿐만 아니라 trichome-분비 시스템을 이용한 유용한 성분의 효율적인 생산에도 관여할 것이다. 목화의 지질 이전 단백질 유전자인 LTP3, 담배의 CYP71D16와 같은 trichome 특이적인 유전자는 이미 동정되었다.

본 발명에서는 AtPFP α2 유전자의 5' 상류 서열 유래의 20 bp의 cis 조절 요소를 분리하였으며, 상기 서열이 애기장대에서 AtPFP α2 유전자의 정상적인 발현을 유도한다는 것을 보여주었다. 또한, 본 발명에서는 -46 CaMV35S 최소 프로모터와 융합된 cis 요소는 AtPFP α2 유전자의 발현에 특징적인 방식으로 애기장대 잎의 trichome에서 GUS 리포터 유전자의 강력한 발현을 유도하기에 충분하다는 것을 보여주었다.

본 발명의 목적은 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는, 애기장대 유래의 PFP(pyrophosphate:fructose-6-phosphate 1-phosphotransferase) α2(AtPFPα2) 유전자의 프로모터를 제공한다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 프로모터를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 식물을 제공한다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 형질전환된 식물의 종자를 제공한다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 형질전환 식물의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는, 애기장대 유래의 PFP(pyrophosphate:fructose-6-phosphate 1- phosphotransferase) α2(AtPFPα2) 유전자의 프로모터를 제공한다.

애기장대 게놈은 AtPFPα1 및 AtPFPα2의 2개의 PFPα 유전자를 가지고 있는데, 본 발명에서는 AtPFPα2 유전자의 프로모터를 분리하였다. 상기 프로모터를 분리하기 위해, 애기장대 게놈 DNA를 주형으로 하여, 적당한 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 분리된 프로모터 부위 중에서 결실 돌연변이체 분석을 통해 AtPFPα2 유전자의 발현에 가장 필수적인 부위로 여겨지는 20bp를 분리하였으며, 이는 AtPFPα2 유전자의 -194 ~ -175 영역에 해당한다. 이의 서열은 5'-CGAAAAAGGTAAGGGTATAT-3'(서열번호 1)이다.

본 발명에서, 용어 "프로모터"는 구조 유전자로부터의 DNA 상류 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 중합효소가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다.

본 발명의 일 구현예에 따른 유전자에서, 상기 프로모터는 애기장대에서 잎의 털(trichome), 떡잎 정맥(cotyledon vein), 뿌리, 및 잎의 수술 및 암술에서 특이적으로 발현될 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따른 유전자에서, AtPFPα2 유전자의 프로모터는 서열번호 1의 염기 서열을 포함한다. 또한, 상기 프로모터는 서열번호 1의 염기 서열과 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 더 더욱 바람직하게는 99% 이상의 서열 상동성을 가질 수 있다.

폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다. 상기 %는 동일한 핵산 염기가 두 서열 모두에 존재하는 위치의 수를 확인하여 정합 위치의 수를 산출하고, 그 정합 위치의 수를 비교 영역 내의 위치의 총 수로 나누고, 그 결과에 100을 곱하여 서열 상동성 %를 산출함으로써 계산된다. 비교를 위한 서열의 최적 배열은 공지된 연산방식의 컴퓨터에 의한 임플러먼테이션에 의해(예를 들면, GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFAST in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, WI, or BlastN and BlastX available from the National Center for Biotechnology Information), 또는 검사에 의해 이루어질 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 AtPFPα2 프로모터를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터를 제공한다.

본 발명에서는 식물 발현 벡터 중의 하나인 pBI101.1 벡터를 이용하였다. 식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 이원(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 진핵세포 배양에 대해 디히드로폴레이트 환원효소 또는 네오마이신 내성을 포함한다. 가장 널리 이용되는 식물 형질전환 마커는 Tn5로부터 분리된 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 II(nptII) 유전자이며, 또 다른 마커 유전자는 항생제 하이그로마이신에 내성을 부여하는 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라아제 유전자이다.

본 발명의 일 구현예에 따른 식물 발현 벡터에서, 터미네이터는 노팔린 신타아제(NOS) 또는 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알고 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다. 본 발명에서는 NOS 터미네이터를 이용하였다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 벡터로 형질전환된 식물을 제공한다. 상기 식물은 바람직하게는 애기장대일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

재조합 구축물은 감염, 형질도입, 트랜스펙션, 트랜스벡션, 전기천공 및 형질전환 과 같은 주지된 기술을 이용하여 배양된 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 숙주의 대표적인 예는 박테리아 세포, 예를 들면, 대장균, 스트렙토마이세스 및 살모넬라 티피무리움 세포; 진균 세포, 예를 들면, 효모 세포; 곤충 세포, 예를 들면, 초파리 S2 및 스포돕테라 Sf9 세포; 동물 세포, 예를 들면, CHO, COS 및 Bowes 흑색종 세포; 및 식물 세포를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 숙주 세포에 대한 적당한 배양 배지 및 조건은 당업계에 공지되어 있다. 본 발명에서는 AtPFP α2 유전자 프로모터를 포함하는 재조합 벡터를 이용하여 아그로박테리움 튜머파시엔스 매개 형질전환을 이용하여 애기장대를 형질전환시켰다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 형질전환 식물의 종자를 제공한다. 바람직하게는, 상기 식물은 애기장대이나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계; 및

상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 형질전환 식물의 제조 방법을 제공한다.

식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.

본 발명의 방법은 본 발명에 따른 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계를 포함하는데, 상기 형질전환은 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefiaciens)에 의해 매개될 수 있다. 식물의 형질전환에 이용되는 "식물 세포"는 어떤 식물 세포도 된다. 식물 세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양 기관 또는 전체 식물, 바람직하게는 배양 세포, 배양 조직 또는 배양 기관 및 더욱 바람직하게는 배양 세포의 어떤 형태도 된다.

또한, 본 발명의 방법은 상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함한다. 형질전환 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따른 방법에서, 상기 식물 세포는 애기장대 유래이나, 이에 제한되지 않는다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예

재료 및 방법

식물 재료

애기장대 생태형 콜럼비아 및 형질전환 종자를 제어된 환경(120μmolm^-2sec^-1, 22℃, 16/8h 명/암 광주기)에서 발아시켰다. 식물을 이어서 제어된 기후 챔버에서 상단 토양, 페라이트 및 버미큘라이트(2:1:1)에서 키웠다. 3개의 trichome 돌연변이체인 gl1-2 (CS3126), ttg1-1 (CS89) 및 ttg2-1 (CS277)은 ABRC (Ohio State University, Columbus, OH; http://www.biosci.ohiostate.edu/~plantbio/Facilities/abrc/abrchome.htm)에서 공급 받았다.

AtPFPα2 의 5' 상류 DNA 단편의 PCR 클로닝

주형으로서 게놈 DNA를 이용하여, AtPFPα2의 5' 상류 유전자를 PCR로 증폭하였다. 이들은 5' 상류 영역의 약 2kb 정도의 크기를 가지며 엑손과 인트론 서열을 포함한다. AtPFPα2 유전자의 5' 단편을 증폭하기 위해, PCR 프라이머는 5'-CCGTCGACCAAACGCTGTCGCTTCCTTCAC-3'(서열번호 2) 과 5'-GCTCTAGAGGTTCCATCACCAAGTTCAAC-3'(서열번호 3)을 이용하였다. SalI와 XbaI 효소 자리를 프라이머 내로 혼입하여, pGEM-T Easy 벡터 (Promega, USA; http://www.promega.com/default.asp) 내로 클로닝 및 이은 서열결정을 용이하게 하였다.

AtPFPα2의 클로닝된 게놈 DNA는 BAC 클론 NC003070의 62,654-64,819 bp 영역(2166 bp)과 일치하였다.

AtPFPα 2 프로모터의 결실 구축물의 제조

AtPFPα2 프로모터의 단계적인 5' 결실 및 내부 결실은 PCR을 이용하였다. 10개의 결실 구축물의 제조에 이용된 각각의 정방향 서열은 다음과 같다. -1058-F, 5'-CCGTCGACATAAGGTAGTTGAGATAAGCAC-3'(서열번호 4); -500-F, 5'-CCGTCGACCTCTCGCTATTTCCGTATTTAC-3'(서열번호 5); -214-F, 5'-CCGTCGACCTAACCAAACATTACCAAACCG-3'(서열번호 6); -194-F, 5'-CCGTCGACCGAAAAAGGTAAGGGTAT-3'(서열번호 7); -174-F, 5'-CCGTCGACATTTATATCCAATGGCAT-3'(서열번호 8); -154-F, 5'-CCGTCGACTCGTAAATAACCAGAATAAC-3'(서열번호 9); -126-F, 5'-CCGTCGACATCGAGAAAAAGCGTGGAC-3'(서열번호 10); -83-F, 5'- CCGTCGACAAATTTTGGCTGTTTGGTTG-3'(서열번호 11); -47-F, 5'- CCGTCGACCCCCCGCATACTATATAAATAC-3'(서열번호 12); 및 -4-F, 5'-CCGTCGACAACTTTCTCTGAATCTTCTCTG-3'(서열번호 13). 하나의 역방향 프라이머로 578-R, 5'-GCTCTAGAGGTTCCATCACCAAGTTCAAC-3'(서열번호 14)은 각각의 경우에 이용하였다. PCR 증폭 후에, DNA를 SalI와 XbaI 클로닝 자리를 이용하여 pBI101.1 벡터에 삽입하였다. AtPFPα2 프로모터의 내부 결실 돌연변이체를 제조하기 위해, 상기 유전자의 -500 bp에서 -215 bp과 -47 bp에서 -578 bp 영역에 해당하는 PCR 단편을 융합하고, pBI101.1 벡터의 HindIII와 SalI 자리에 클로닝하였다. 내부 결실 인서트 제조에 사용한 프라이머는 하기이다: -47-F와 578-R, 및 -500-HindIII-F, 5'-CCAAGCTTCTCTCGCTATTTCCGTATTTAC-3'(서열번호 15) 및 -215-SalI-R, 5'-CCGTCGACTGACCAAATTGTCTAATTCG-3'(서열번호 16).

GUS 융합 벡터의 구축

AtPFPα 유전자의 분리된 5' 상류 서열을 pBI101.1 벡터의 GUS 유전자에 융합하였다. 생성된 플라스미드는 AtPFPα2 프로모터::GUS 융합을 포함하였으며, 이를 AtPFPα2::GUS로 표시하였다. 유사하게, 결실 돌연변이체 인서트의 각각을 pBI101.1에서 GUS의 상류에 위치하였다. -46 CaMV35S 최소 프로모터::GUS 융합 벡터인 pGA2406은 35S 프로모터 DNA를 주형으로 PCR로 프라이머 5'-AGTGGATCCAAGACCCTTCCTCTATATA-3'(서열번호 17) 및 5'-CAGCCCGGGTCCTCTCCAAATGAAATGAA-3'(서열번호 18)을 이용하여 제조하였다. 이것을 pGA2406 벡터와 융합하여 -46 CaMV35S 프로모터::GUS를 만들었다. AtPFP α2 유전자 발현의 중요한 조절 요소인 -194에서 -175 부분을 pGA2406 벡터의 XbaI과 BamHI 자 리에 삽입하였다. -46 CaMV35S 최소 프로모터, 20-bp 어댑터, GUS 유전자, Nos 종결자로 이루어진 전체 카세트를 이원(binary) 벡터 pBI101.1의 HindIII과 EcoRI 자리에 클로닝하였다. -194에서 -175 영역의 어댑터를 만들기 위해 사용한 프라이머는 5'-CTAGACGAAAAAGGTAAGGGTATATG-3'(서열번호 19) 및 5'-GATCCATATACCCTTACCTTTTTCGT-3'(서열번호 20)이다.

과발현 벡터의 구축

세 trichome 발생 관련 유전자, TRANSPARENT TESTA GLABRA1 ( TTG1 ), TRANSPARENT TESTA GLABRA2 ( TTG2 ) 및 GL1의 전장 cDNA를 PCR로 분리하고, pGEM-T easy 벡터에 클로닝하였다. TTG1 , TTG2 , GL1의 과발현 구축물은 각각의 cDNA를 CaMV35S 프로모터와 Nos 종결자를 포함하는 pPZP2Ha3(+) 벡터에 클로닝하였다. 35S:: TTG1 , 35S:: TTG2 , 35S:: GL1의 과발현 벡터의 구축에 이용된 프라이머는 다음과 같다: TTG1, TTG1-F 5'-TCTAGAATGGATAATTCAGCTCCAGATTCG-3'(서열번호 21) 및 TTG1-R 5'-CTCGAGTCAAACTCTAAGGAGCTGCATTTTG-3'(서열번호 22); TTG2, TTG2-F 5'-GGATCCATGTCTTGTGATGATGATTCAG-3'(서열번호 23); TTG2-R 5'-CTCGAGTCAAATTGTTTGCTTAGAAAGTTG-3'(서열번호 24); GL1, GL1-F 5'-GGATCCATGAGAATAAGGAGAAGAGATG-3'(서열번호 25); GL1-R 5'-CTCGAGCTAAAGGCAGTACTCAACATCTCC-3'(서열번호 26). 이들 구축물을 AtPFP α2:: GUS 형질전환 식물에 다시 형질전환하였다.

애기장대 형질전환

모든 형질전환 식물은 25 mg/L 카나마이신을 포함하는 Gamborg B5 배지에서 선별 하였고, 35S:: GL1 , 35S::TTG1, 35S:: TTG2를 포함하는 AtPFP α2:: GUS 식물체만 25 mg/L 하이그로마이신을 포함하는 배지에서 선별하였다.

조직화학적 GUS 분석

조직화학적 GUS 분석은 식물체를 0.2 M 인산나트륨 (pH 7.0), 10 mM EDTA, 20% 메탄올, 2% DMSO, 0.1% 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 β-D-글루코피라노시드 (X-Gluc)를 포함하는 용액에서 반응을 시켰다. GUS 발현 양상은 SZX12 (Olympus, Japan; http://www.olympus.co.jp/en/)로 관찰하였고, ImagePro Express (Olympus, Japan)로 촬영하였다.

실시예 1: AtPFP α2 유전자의 5' 상류 서열의 분리

식물체 내에서의 애기장대 PFP α2 유전자의 발현 양상을 알아보기 위해, 5' 상류 DNA 조절 부분을 게놈 PCR로 분리하였다. AtPFP α2 (2166 bp)의 5' 상류 부분을 각각 GUS 리포터 유전자와 전사적으로 융합하였다(도 1). 그리고 나서, 이 구축물을 애기장대로 아그로박테리움을 이용하여 형질전환한 후, 애기장대로 형질전환하였다.

실시예 2: GUS 형질전환 식물체의 제조

AtPFP α2:: GUS를 가진 GUS 형질전환 식물체의 1 세대를 13개 얻었다. 이들 형질전환 식물체를 조직화학적 GUS 분석을 이용하여 다양한 조직에서 분석하였다. 가장 많이 GUS 염색이 되는 AtPFP α2:: GUS의 A2-2 라인을 동형접합체 선별을 하였다. 동 형접합체로 선별된 A2-2-3은 그 이후의 분석에 주로 이용하였다.

실시예 3: 형질전환된 애기장대에서 GUS 발현의 분석

AtPFP α2 프로모터는 잎의 trichome, 자엽 정맥, 꽃의 수술, 암술 등 특이적인 부분에서 GUS가 발현되었다(도 2c-d). AtPFP α2 프로모터의 trichome 특이적 GUS 발현 양상은 잎 전체에 활성이 있는 AtPFP α1 프로모터와는 대조적이다.

실시예 4: trichome 돌연변이체에서 AtPFP α2:: GUS 의 발현

AtPFPα2 프로모터의 잎 trichome 특이적 발현을 확인하기 위해, AtPFP α2:: GUS를 trichome 돌연변이 식물체에 형질전환하였다. AtPFP α2:: GUS 구축물을 MYB, WD40, WRKY 전사인자를 암호화하는 GL1 , TTG1 , TTG2 (gl1 -2, ttg1 -1, ttg2 -1) 돌연변이체에 형질전환 하였다. 이 세 trichome 돌연변이체 중에서, Gl1-2는 약간의 trichome를 가진다. 실험 결과, trichome 특이적 GUS 발현이 잎의 일부에서 발생되는 돌연변이체의 일부의 trichome에서 관찰되었다(도 3b). Trichome 특이적 GUS 발현은 ttg1-1과 ttg2-1 돌연변이체에서는 전혀 없었고, 이에 비해 AtPFP α2: GUS 구축물이 삽입된 야생형 식물체에서는 발현되었다(도 3a,c-d). 또한, ttg1-1과 ttg2-1의 잎맥의 높은 GUS 발현은 아마도 trichome 특이적 유전자 발현이 없기 때문일 것이다. 이 결과로 AtPFP α2 5' 상류 부분은 잎의 trichome의 특이적 유전자 발현에 직접적으로 필요하다는 것이다.

실시예 5: AtPFP α2 5' 상류 서열의 외부 결실 분석

AtPFP α2의 잎의 trichome 특이적 발현을 시키는 조절 서열을 알아보기 위해, AtPFP α2 5' 상류 서열을 절단하여 7개의 결실 돌연변이체인 -1058, -500, -214, -126, -83, -47 및 -4를 만들었다(도 4a). 모든 돌연변이체는 GUS 리포터 유전자와 융합시켰다. AtPFP α2 프로모터 영역과 EST(AU238059)를 가진 서열 비교를 기초로 해서, TATA-like 부분이 -36에서 -29로 예측되었다. 그리하여, -4 결실을 promoterless :: GUS 융합 대조군으로서 구축하였다.

-1058, -500 및 -214는 -1511 구축물과 GUS 발현 수준이 비슷한 것으로 GUS 분석을 통하여 형질전환 식물체에서 확인하였다. 대조적으로, 4개의 결실 구축물인 -126, -83, -47 및 -4는 다양한 다른 영역에서 GUS 발현이 없었다(도 4f-i). 이것은 -214에서 -127 영역이 잎의 trichome과 자엽 정맥과 뿌리에서 AtPFP α2:: GUS 발현을 유도하데 충분하다는 것을 나타낸다.

실시예 6: -214에서 -127 AtPFP α2 프로모터 영역의 분석

3개의 외부 결실 구축물인 -194, -174 및 -154는 -1511 부분에서부터 절제하였다. -214에서 -48까지를 절제한 1개의 내부 결실 구축물을 제조하여, -214에서 -127 서열이 AtPFP α2 유전자의 정상적인 발현에 필요하다는 알 수 있었다. 이들 돌연변이체를 애기장대로 형질전환하여 1차 형질전환 식물체를 얻어 GUS 분석을 하였다(도 5). 그 결과, -174 결실 돌연변이체는 GUS 유전자가 발현되지 않은 반면, -194 돌연변이체는 정상적인 AtPFP α2 발현 양상을 보였다. 이것은 -194에서 -175 사이의 서열이 이 유전자의 내재하는 발현에 필요하다고 할 수 있다. -214에서 -48까지의 내부 결실 돌연변이체 역시 GUS 유전자가 발현되지 않았다. 이것은 -214에서 -127 까지의 부분이 AtPFP α2 유전자 발현에 있어 필수적인 조절 서열임을 재확인해 주는 것이다.

-194에서 -175 서열인 5'-CGAAAAAGGTAAGGGTATAT-3'이 AtPFP α2 유전자 발현을 유도하는데 충분한지를 조사하기 위해, 이 20-bp 서열을 GUS 유전자와 융합된 -46 CaMV35S 최소 프로모터에 삽입하였고, 애기장대에 형질전환하였다(도 6). 형질전환 식물체의 GUS 분석 결과, -46 CaMV35S 최소 프로모터::GUS와 융합된 PFP α2는 GUS 발현을 나타낸 것으로 보아, AtPFP α2 유전자 발현의 조절 요소임을 알 수 있었다. 이 연구 결과, PFP α2 서열은 AtPFP α2 유전자 발현에 있어 중요한 조절 요소이며, DNA 결합 인자를 분리하는데 유용한 수단이 될 것이다.

본 발명에 따르면, PFPα2 프로모터 서열은 AtPFPα2 유전자 발현에 있어 중요한 조절 요소이며, DNA 결합 인자를 분리하는데 유용한 수단이 될 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

서열번호 1의 염기서열로 이루어지며, 애기장대에서 잎의 털(trichome), 떡잎 정맥(cotyledon vein), 뿌리, 또는 잎의 수술 및 암술에서 특이적으로 발현을 유도하는, 애기장대 유래의 PFP(pyrophosphate:fructose-6-phosphate 1-phosphotransferase) α2(AtPFPα2) 유전자의 프로모터.
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제1항의 프로모터를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터.
제 4항의 재조합 벡터로 형질전환된 식물.
제 5항에 있어서, 상기 식물은 애기장대인 것을 특징으로 하는 식물.
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제 4항에 따른 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계; 및 상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 형질전환 식물의 제조 방법.
제 8항에 있어서, 상기 식물은 애기장대인 것을 특징으로 하는 방법.