KR101370768B1

KR101370768B1 - 식물체 내 액포로부터 세포질로의 자당 수송 증가용 조성물

Info

Publication number: KR101370768B1
Application number: KR1020120005552A
Authority: KR
Inventors: 전종성; 엄준섭; 최상봉; 이상원; 안진흥; 한태룡; 조정일
Original assignee: 명지대학교 산학협력단; 경희대학교 산학협력단
Priority date: 2012-01-18
Filing date: 2012-01-18
Publication date: 2014-03-19
Also published as: KR20130084752A

Abstract

본 발명은 OsSUT2 (Oryza sativa sucrose transporter 2) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는, 식물체의 액포로부터 세포질로의 자당 수송을 증가시키기 위한 조성물 및 식물체의 액포로부터 세포질로의 자당 수송을 증가시키는 방법을 제공한다. 본 발명의 조성물은 식물체의 액포로부터 세포질로의 자당 수송을 증가시켜, 식물체 생장 및 종자 발달에 있어 개선된 표현형을 나타내며, 따라서, 재배 및 곡물 수확 등에서 유리하며, 바이오매스 증대에 기여할 것으로 기대된다.

Description

식물체 내 액포로부터 세포질로의 자당 수송 증가용 조성물{A composition for increasing sucrose transport from vacuole to cytosol in plants}

본 발명은 식물체 내 액포로부터 세포질로의 자당 수송 증가용 조성물 및 식물체 내에서 액포로부터 세포질로의 자당 수송을 증가시키는 방법에 관한 것이다.

이당류 자당은 공급원인 잎에서 만들어지는 광합성의 주된 산물이며, 많은 식물체의 관조직 내에서 운반되는 주된 탄수화물이다. 따라서, 자당의 잘 조직된 생산, 운반 및 저장은 식물의 정상적 성장 및 발단에 필수적이다(Lalonde et al., 2004; Lim et al., 2006; Kuhn and Grof, 2010). 자당 운반은 전체 식물체 및 세포내 수준에서 모두 일어나며, 이러한 자당은 식물종에 따라서 세포막(plasma membrane: PM) 자당 운반체(sucrose transporter: SUT)에 의해 세포벽으로(apoplastically), 또는 플라스모데스마타를 통해 세포질로(symplastically) 체관부까지의 단거리를 거쳐 적재된다(Rennie and Turgeon, 2009). 체관부 적재에 이어, 자당은 저장 조직까지 장거리에 거쳐 운반된다(ap Rees, 1994; Williams et al., 2000; Lalonde et al., 2004; Lim et al., 2006; Sauer 2007). 세포내 수준에서, 자당은 단기간 또는 장기간 저장을 위하여 하위 세포소기관, 특히 액포로 분배된다.

SUT 는 5개 주된 계통군(clade)인 SUT1 내지 SUT5 로 분류되는 식물체 내 소유전자 패밀리에 의해 코딩된다(Kㆌhn and Grof, 2010). SUT1 계통군은 가장 높은 기질 친화력을 갖는 쌍떡잎 SUT 를 대표한다. SUT1 및 단자엽-특이적 SUT3 계통군의 멤버은 PM 에 위치하며, 체관부 적재 또는 저장 조직내로 자당 운반을 담당한다(Riesmeier et al., 1994; Gottwald et al., 2000; Slewinski et al., 2009). 또한, PM에 위치하는 SUT2 계통군 멤버는 특이하게 긴 N-말단 및 중심 루프 서열을 가진다. 최근에, 애기장대(Arabidopsis thaliana) AtSUT4, 보리(Hordeum vulgare) 21 HvSUT2, 벌노랑이 (Lotus japonicus) LjSUT4 및 포풀루스 트레물라 엑스 알바 (Populus tremula x alba) PtaSUT4 와 같은 일부 SUT4 계통군 멤버들이 단백질체학 및/또는 GFP 융합 분석을 통해 액포막(VM)에 할당되었다 (Endler et al., 2006; Reinders et al., 2008; Payyavula 24 et al., 2011). SUT5 계통군은 주로 자당에 대한 더 큰 친화력을 가지는 단자엽식물 자당 운반체의 그룹으로 특징지워지지 않으며, 그 운반체 활성은 SUT3 계통군의 운반체 보다 덜 pH에 민감하다(Sun et al., 2010).

SUT의 기관 및 조직-특이적 발현은 이들이 서로 다른 기능을 갖는 것을 암시한다. SUT1 계통군에서, 감자(Solanum tuberosum) StSUT1(Riesmeier et al., 1994), 담배(Nicotiana tabacum) NtSUT1 (Bㆌrkle et al., 1998) 및 애기장대 AtSUC2(Gottwald et al., 2000)가 잎의 관조직에서 발현되며, 체관부 적재에 필수적이다. 유사하게, SUT3 계통군의 멤버들은 예컨대, 벼 OsSUT1 및 옥수수(Zea mays) ZmSUT1 이 또한 체관부 적재를 담당하는 것으로 생각된다(Aoki et al. 1999; Scofield et 9 al., 2007; Slewinski et al., 2009). 두 계통군에 대하여, 다수의 멤버들의 발현은 또한 저장 조직에서 발견되며, 이는 저장 기관 내로의 자당 운반과 관련하여 추가의 기능을 시사한다. 예를들어, AtSUC1 (Stadler et al., 1999; Sivitz et al., 2008), NtSUT3 (Lemoine et al., 1999) 및 Plantago major SUC1 (PmSUC1 Lauterbach et al., 2007)는 화분관에서 발현되며, 이는 성장중인 화분관에서 이들의 기능을 시사한다. SUT3 계통군으로부터, OsSUT1 은 화분과 주심 돌기(nucellar projection), 및 미성숙 조직의 호분 조직에서 발현되며, 따라서, 저장 기관으로의 세포벽 자당 운반에서 기능하는 것으로 여겨진다(Furbank et al., 2001; Hirose et al., 2010). HvSUT1 은 또한 주로 모계 주심 돌기, 및 보리의 자 운반 세포에서 발현되며(Weschke et al., 2000), 이는 유사한 기능을 가지는 것을 시사한다.

액포막-위치 SUT를 포함한 SUT4 계통군 멤버들 중, HvSUT2는 잎, 뿌리 및 과피에서 발현되며(Weschke et al., 2000), 또한 잎 엽육세포에서 발현되는 것으로 발견되었다(Endler et al., 2006). H⁺-자당 공동수송체로써 기능하는 AtSUT4(Weise et al., 2000)는 컴패니언 및 잎의 엽육세포에서 발현된다. 따라서, HvSUT2 및 AtSUT4는 광합성에 의해 만들어진 자당의 운반 및 액포 저장에 기능하는 것으로 시사된다(Endler et al., 2006). LjSUT4 는 액포막-위치 H⁺-자당 공동수송체인 것으로 밝혀졌으며, 따라서, 액포막을 거친 액포 루멘으로부터 세포질로의 자당 운반에 기능한 것으로 가정된다(Reinders et al., 2008). 최근, PtaSUT4 발현이 감소된 RNAi 형질전환 포플러 식물체는 잎-대-줄기 바이오매스의 증가된 비율을 나타내며, 이는 자당의 액포 수송과 바이오매스 분배 사이의 연관을 나타낸다(Payyavula et al., 2011). 그러나, 액포 SUT의 기능에 대한 생리학적 증거는 식물 돌연변이체에서 보고된 바 없었다.

벼를 포함한 많은 곡물들이 주로 전분을 저장하는 애기장대를 포함한 다른 식물체 종들과는 달리 일시적 전분에 비해 상대적으로 높은 비율의 자당을 잎에 저장하는 것으로 나타났다(Nakano et al., 1995; Winder et al., 1998; Murchie et al., 2002; Trevanion, 2002; Lee et al., 2008). 자당이 광합성 동화 조직의 액포 내에 일시적으로 저장되는 것(Riens et al., 1991; Winter et al., 1993; Martinoia et al., 2007; Neuhaus, 2007; Linka et al., 2010)을 고려할 때, 이는 식물체 성장에 액포막-위치 SUT의 관여 및 기능을 문제를 제기한다. 벼 게놈은 5개 SUT, OSSUT1 내지 OsSUT5 를 포함한다(Aoki et al., 2003). Aoki et al. 등의 문헌에는 OsSUT2 유전자는 보고되었으나 그 특성은 밝혀진 바 없었다. 현재까지 오직 OsSUT1 의 특성만이 상세히 알려져 있다(Scofield et al., 2007; 17 Hirose et al., 2010; Sun et al., 2010).

미국공개특허공보 US2006/0123505호 (2006.6.8.공개) 미국공개특허공보 US2010/0029489호 (2010.2.4.공개) 미국등록특허공보 US7,288,645호 (2007.10.30.공개) 미국등록특허공보 US7,605,247호 (2009.10.20.공개)

Jung-Il Cho 등, New Phytologist, 2010, 186:657-668 Aoki N 등, Plant Cell Physiol., 2003, March; 44(3):223-32

본 발명자들은 벼의 바이오매스 증대 및 생산성 증가를 위하여 벼의 다양한 유전자를 대상으로 벼의 성장률 등을 예의 연구한 결과, 벼의 자당수송에 관여하는 OsSUT2(Oryza sativa sucrose transporter 2) 단백질이 액포막에 위치하며, 특히 OsSUT2 단백질이 자당의 저장장소인 액포에서 세포질로의 수송을 조절한다는 것을 최초로 확인하고 본 발명을 완성하였다.

상술한 벼 OsSUT2(Oryza sativa sucrose transporter 2) 단백질은 식물체의 세포 내 액포막에 위치하며, 자당의 액포로부터 세포질로 수송하는 기능을 하는 단백질로써, 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어져 있다. 이러한 OsSUT2 단백질의 위치 및 기능은 본 발명자들에 의하여 최초로 확인되었다.

따라서, 본 발명은 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 OsSUT2 (Oryza sativa sucrose transporter 2) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는, 식물체의 액포로부터 세포질로의 자당 수송을 증가시키기 위한 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 OsSUT2 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물체를 형질전환하는 단계를 포함하는, 식물체의 액포로부터 세포질로의 자당 수송을 증가시키는 방법을 제공한다.

상기 OsSUT2 단백질을 코딩하는 유전자의 염기 서열은 당 분야에서 통상적으로 사용되는 분석툴을 이용하여 상기 아미노산 서열로부터 당업자가 용이하게 추론할 수 있으며, 바람직하게는 OsSUT2 단백질을 코딩하는 유전자(이하, 'OsSUT2 유전자'라 함)는 서열번호 1에 기재된 염기서열을 가진다. 또한, OsSUT2 유전자는 서열번호 1에 기재된 염기서열로 이루어진 핵산 뿐 아니라, 그와 기능적으로 동등한 절편 또는 변이체를 포함한다.

본원에서, OsSUT2 유전자와 "기능적으로 동등한 절편"은 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 야생형 OsSUT2 단백질의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 결실 또는 절단된 폴리펩티드를 인코딩하며, 그 폴리펩티드가 야생형 OsSUT2 단백질과 실질적으로 동등한 효과를 나타내는, 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 핵산의 조각 또는 일부분을 의미한다. 이러한 핵산 절편은 서열번호 1에 기재된 염기서열과 비교하여 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 상동성을 가지며, 이러한 핵산 절편은 당업계에 널리 알려진 분자생물학적 방법에 의하여 용이하게 제작될 수 있다.

본원에서, OsSUT2 유전자와 "기능적으로 동등한 변이체"는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 야생형 OsSUT2 단백질의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 변형(예, 치환, 부가 또는 결실)된 폴리펩티드를 인코딩하며, 그 폴리펩티드가 야생형 OsSUT2 단백질과 실질적으로 동등한 효과를 나타내는, 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 핵산의 변이체를 의미한다. 이러한 핵산의 변이체는 서열번호 1에 기재된 염기 서열과 비교하여 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 상동성을 가지며, 이러한 변이체는 당업계에 널리 알려진 분자생물학적 방법에 의하여 용이하게 제작될 수 있다.

또한, 상기 조성물 내 포함되는 OsSUT2 유전자는 재조합 벡터 내에 삽입된 형태로 제공될 수 있다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 의미하며, DNA를 복제하고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 발현벡터는 진핵세포에서 이용가능한 하나 이상의 복제기점, 프로모터, 선택마커, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 서열을 포함할 수 있다. 발현 벡터는 일반적으로 플라스미드 또는 바이러스 DNA로부터 유래하거나, 둘다의 요소를 포함할 수 있다. 따라서, 발현 벡터는 재조합 DNA 또는 RNA 구축물, 예컨대, 플라스미드, 파지, 재조합 바이러스 또는 적절한 숙주 세포 내 도입시, 클로닝된 DNA의 발현을 초래하는 다른 벡터를 의미한다. 적절한 발현 벡터는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 진핵세포 및/또는 원핵세포 내에서 복제가능한 것들 및 에피솜으로 남는 것들 또는 숙주 세포 게놈 내에 통합되는 것들을 포함한다.

본원에서는, 형질전환되는 식물체에 도입되어 OsSUT2 단백질을 발현할 수 있는 임의의 식물 발현 벡터가 이용가능하며, 이러한 재조합 식물 발현 벡터는 당업계에 알려진 통상적 기술을 이용하여 제작될 수 있다.

본 발명에서 이용되는 식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)가 현재 식물세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 이원(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 OsSUT2 유전자를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

본 발명의 식물 발현 벡터는 또한 선택마커, 프로모터 및 터미네이터를 포함한다.

본 발명에서 사용가능한 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 포스포만노스 이소머라제(PMI) 유전자, 글리포세이트(glyphosate), 포스피노트리신과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신, G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 사용가능한 프로모터는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터로서, CaMV35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, 히스톤 프로모터, 옥수수 Ubi1 프로모터 등이 있으며, 바람직하게는 옥수수 Ubi1 프로모터가 사용된다.

본 발명에서 사용가능한 터미네이터는 당업계에서 통상적으로 사용되는 터미네이터일 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS) 터미네이터, 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터, 대장균의 rrnB1/B2 터미네이터 등이 있으며, 바람직하게는 NOS 터미네이터가 사용된다.

본 명세서에서 유전자와 프로모터가 작동가능하게 연결되었다고 함은 핵산 서열들이 이들의 의도된 기능을 수행하도록 연결된 상태를 지칭한다. 예를 들어, 프로모터 서열을 목적하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결시킨다는 것은 프로모터 서열이 목적하는 뉴클레오티드 서열의 전사를 지시할 수 있게 하는 방식으로 프로모터 서열과 목적하는 뉴클레오티드 서열을 연결하는 것을 의미한다.

상기 재조합벡터는 당업계에 알려진 재조합 DNA 기술을 이용한 재조합 수단에 의하여 제조될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 OsSUT2 발현용 재조합 벡터는 선택마커로써 포스포만노스 이소머라제(PMI) 유전자, 옥수수 Ubi1 프로모터, Nos 터미네이터와 OsSUT2 유전자가 작동가능하게 연결된 벡터이다.

상기한 재조합 벡터는 감염, 형질도입, 트랜스펙션, 전기천공 및 형질전환과 같은 주지된 기술을 이용하여 배양된 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 숙주의 대표적인 예는 박테리아 세포, 예를 들면, 대장균, 스트렙토마이세스 및 살모넬라 티피무리움 세포; 및 식물 세포를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

식물의 형질전환에 이용되는 "식물 세포"는 임의의 식물 세포가 이용가능하다. 식물 세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양기관 또는 전체 식물, 바람직하게는 배양 세포, 배양 조직 또는 배양 기관 및 더욱 바람직하게는 배양 세포의 어떤 형태도 가능하다. "식물 조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 뿌리, 줄기, 잎, 꽃가루, 종자, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다.

숙주 세포에 대한 적당한 배양 배지 및 조건은 당업자에게 널리 알려져 있다. 본 발명에서는 식물체 형질전환에 사용하기 위하여 아그로박테리움 속 미생물을 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 재조합 벡터에 의한 식물체의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키기 위한 당업계에 알려진 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및 (또는) 조직 배양기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 예를 들어, 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316 호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 바람직하게는 아그로박테리움 매개 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.

아그로박테리움 벡터에 의한 식물체의 형질전환을 위한 최적 절차는 형질전환될 식물체의 종류에 따라 다양하다. 아그로박테리움 매개 형질전환을 위한 대표적인 방법은 멸균된 묘목 및/또는 작은 식물체로부터 유래된, 배축, 정단(shoot tip), 줄기 또는 잎 조직의 외식편의 형질전환을 포함한다. 그와 같은 형질전환된 식물체는 유성생식으로 또는 세포 또는 조직 배양에 의해 번식될 수 있다. 아그로박테리움 매개 형질전환은 이전에 다수의 상이한 종류의 식물체를 위해 기재되었으며 그와 같은 형질전환을 위한 방법은 당업계에 공지된 문헌에서 찾을 수 있다.

본 발명에서 사용가능한 식물 형질전환용 아그로박테리움 균주로는 통상 이용되는 어떠한 균주라도 사용이 가능하다. 구체적으로 본 발명에서는, 식물시료에 침투하여 외래 유전자를 전달하는데 필요한 병원성이 큰 것으로 알려진 아그로박테리움 투메파시엔스, 더욱 바람직하게는, 아그로박테리움 투메파시엔스 LB4404(Agrobacterium tumefaciens LB4404)를 사용할 수 있다.

본 발명은 당업자의 기술 수준의 범주 내에서 본 실시예에서 사용된 벼(Oryza sativa L.)를 포함한 단자엽식물 뿐만 아니라 쌍자엽 식물에 대하여도 확장하여 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 OsSUT2 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물체를 형질 전환한 다음 통상적인 방법에 따라 캘러스의 유도, 발근 및 토양 순화의 과정인 무성번식 방법을 통해 수득할 수 있다. 즉, OsSUT2 유전자가 포함된 재조합 벡터로 형질 전환된 아그로박테리움을 켈러스 유도 절편체에 공급한다.

본 발명은 또한 벼의 액포로부터 세포질로의 자당 수송을 증가시키기 위한, OsSUT2 유전자를 가지는 재조합 벡터를 제공한다. 이러한 벡터는 당 분야에 알려진 방법에 의하여 재조합적으로 제조될 수 있으며, 바람직하게는, 도7의 개열지도를 가지는 OsSUT2 유전자 발현용 재조합 벡터일 수 있다.

상기 재조합 벡터에 의하여 형질전환된, OsSUT2 유전자 발현 수준이 증가된 형질전환 벼는 액포로부터 세포질로의 자당 수송이 증가되어, 자당의 잎에서 저장 기관으로의 수송 증가, 및 식물체 생장 및 종자 발달에 있어 개선된 표현형을 나타낼 수 있다.

상기한 식물체에서 OsSUT2 유전자의 과발현은 OsSUT2 유전자를 가지는 재조합 벡터를 직접 식물체 내에 도입하거나, 그에 의해 형질전환된 미생물을 매개로 식물체 내에 도입하여 달성될 수 있으며, OsSUT2 유전자의 식물체 내 도입은 당 분야의 통상의 지식을 가진 자의 기술 수준의 범위 내에 있다.

본 발명은 또한 식물체 내 OsSUT2 유전자 발현을 증가시키는 것을 포함하는, 식물체의 액포로부터 세포질로의 자당 수송을 증가시키는 방법을 제공한다. OsSUT2 유전자 발현 수준이 증가된 형질전환 벼는 식물체 발달, 특히 식물체 생장 및 종자 발달에 있어 향상된 표현형을 나타낼 수 있다.

본 발명은 또한 식물체 내 OsSUT2 유전자 발현을 증가시키는 것을 포함하는, 식물체의 생장 및 종자 발달을 향상시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 22에 기재된 OsSUT2syn 유전자를 포함하도록 형질 전환된 효모를 제공한다. 상기 형질 전환 효모는 벼의 단백질인 OsSUT2 단백질의 자당 운반 기능 및 기전을 확인하는데 유용한 시스템이 된다.

본 발명의 조성물은 식물체의 액포로부터 세포질로의 자당 수송을 증가시키는 작용효과를 나타낸다. 따라서, 식물체 생장 및 종자 발달에 있어 개선된 표현형을 나타내며, 따라서, 재배 및 곡물 수확 등에서 유리하며, 바이오매스 증대에 기여할 것으로 기대된다.

도 1은 잎 엽육 원형질 내 OsSUT2-GFP 융합 단백질의 세포이하 위치를 확인한 도이다. (GFP 신호: 녹색, 엽록소자가형광: 적색)
도 2는 pBI101 벡터 지도를 나타낸 도이다.
도 3은 pOsSUT2:GUS 구축물을 갖는 형질전환 벼의 잎, 뿌리, 꽃, 종자에서 발현되는 GUS 발현의 패턴을 확인한 조직화학 분석 결과이다. (A, B: 잎날단면, C:입집 단면, D:뿌리, E: 수정전 이삭, F: 수정후 이삭, G: 수정후 3-4일 미성숙 종자, H: 수정후 7-8일 종자, I: 수정후 7-8일 종자의 횡단면, J: 수정후 7-8일 종자의 종단면; 그림 중 기호의 설명: BS: 유관속초세포, C: 교차세포층, E: 표피, En: 배젖, I: 외피, L: 곁뿌리, M: 엽육세포, MC: 중과피, N: 주심표피, NP: 주심돌기, P: 체관부세포, Pd: 꽃자루, T: 관상세포층, V: 주유관속, X: 후생물관부)
도 4는 pENTR221 벡터 지도를 나타낸 도이다.
도 5는 효모에서 OsSUT2 단백질의 자당 운반을 측정한 도이다.
도 6은 ossut2 돌연변이체 제작을 위한 벡터 지도를 나타낸 도이다.
도 7은 OsSUT2 유전자 발현용 재조합 벡터 (pJJ2521)를 나타낸 도이다.
도 8은 야생형, ossut2 돌연변이체, ossut2 보상 라인에서 OsSUT2 전사 수준을 확인한 결과이다.
도 9는 야생형, ossut2 돌연변이체, ossut2 보상 라인의 성장 표현형을 확인한 결과이다.
도 10은 야생형, ossut2 돌연변이체, ossut2 보상 라인에서 분얼수, 식물체 신장, 1000-낟알 중량, 뿌리 중량을 나타낸 도이다.
도 11은 야생형, ossut2 돌연변이체, ossut2 보상 라인에서 낟알 크기를 나타낸 사진이다.
도 12는 ossut2 돌연변이체 내 잎 가용성 당류 및 전분 함량을 확인한 도이다.
도 13은 ossut2 돌연변이체의 당 수출 활성을 정량한 결과를 나타낸 도이다.

이하에서는, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 아래의 실시예는 발명의 이해를 돕기 위한 예시일 뿐, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.

[ 제조예 ]

< 제조예 1> 식물체 재료(벼)의 준비

야생형 벼[Oryza sativa cultivar (cv.) Hwayoung]를 주간 30℃로, 야간 20℃로, 14시간:10시간의 광-암주기로 온실에서 성장시키거나, 여름 동안 자연 환경의 경희대학교 실험 토양에서 재배하였다.

하기 실시예의 실험을 위하여, 온실에서 성장한 4주령 식물체로부터 잎을 채취하여 주된 탄소 대사물 및 당 수출 능력을 분석하고, 온실에서 성장한 4-주령 식물체로부터 뿌리를 수집하여 건중량을 측정하고, 벼 본답에서 성장한 성숙한 식물체를 이용하여 식물체 신장, 분얼수, 1000-낟알 중량 측정하였다.

< 제조예 2> OsSUT2 전장 cDNA 클론의 클로닝

4주령 벼 (O. sativa cv. Dongjin) 식물체로부터 OsSUT2의 전장 cDNA를, 번역 개시코돈 및 3' 미번역 지역 (UTR)를 포함하는 유전자-특이적 프라이머: 5'-CTCTTCTGAACTAACCCAAAGAT-3' 및 5'-AACTCCTGCAACTTTTATTCACTA-3'를 이용하여 RT-PCR로 분리하였다. 상기 PCR은 Applied Biosystems 사의 GeneAmp PCR system 9700 기기를 이용하여 96℃에서 30초 동안 변성시킨 후, [94℃ 30초, 56℃ 30초, 72℃ 30초] 30주기 반응시키고, 72℃ 7분으로 수행하여 반응을 종료하였다. 이어서, cDNA를 pGEM-T 이지 벡터 (프로메가, 메디슨, WI) 내로 서브클로닝하고, 서열분석하여 확인하였다. 이렇게 확인한 OsSUT2 cDNA 서열을 NCBI 데이터 베이스에 접속번호 HQ540307호 (서열번호 1)로 기탁하였다.

[ 실시예 ]

< 실시예 1> 벼 액포 자당 운반체 OsSUT2 의 확인- 세포내 위치( subcellular localization) 확인

(1) OsSUT2 - GFP 융합 벡터 구축

벼에서 OsSUT2의 세포내 위치를 확인하기 위하여, CaMV35S 프로모터 하위에 OsSUT2-GFP 융합 구축물을 발현하는 형질전환 벼 식물체를 제조하였다.

구체적으로, 정지 코돈이 없는 전체 오픈 리딩 프레임을 PCR로 증폭하였다.

증폭된 산물을 XbaI 및 XhoI으로 소화시킨 후, JJ461 이원벡터(조 등, 2009)의 CaMV35S 프로모터 및 GFP 사이의 영역 내에 클로닝하였다. 사용된 프라이머는 다음과 같았다 (밑줄 친 서열은 각각 XbaI 및 XhoI 위치를 나타냄):

5'- GCTCTAGACTCTTCTGAACTAACCCAAAGAT-3'

5'- CCCTCGAGATCGGTGACCTCTCCTCCTTGAT-3'

이렇게 제작된 구축물을 CaMV35S : OsSUT2 - GFP (pJJ1747)라 지정하였다.

(2) 아그로박테리움-매개 벼 형질전환

상기 제작된 CaMV35S : OsSUT2 - GFP 구축물을 발현하는 형질전환 벼 (O. sativa cv. Hwayoung) 식물체를 제조하기 위하여, 상기 벡터를 운반하는 아그로박테리움 투메파시엔스 LBA4404 균주를 25 mg L^-1 카나마이신으로 보충된 AB 배지상 에서 28℃, 3일 동안 성장시키고, 형질전환 캘리(calli)를 알려진 방법으로 아그로박테리움-매개 공동배양(Jeon et al., 2000)을 통해 얻었다. 형질전환 벼 식물체를 50 mg L^-1 하이그로마이신 및 250 mg L^-1 세포탁심을 함유하는 선택배지 상에서 형질전환 캘리로부터 재생하였다.

(3) OsSUT2 의 세포내 위치 관찰

CaMV35S : OsSUT2 - GFP 형질전환 벼 식물체로부터 잎 또는 분리된 원형질을 공초점 현미경 (LSM 51- META, Zeiss)으로 측정하였다(도 1). 엽록소 자가형광을 엽록체 마커로써 이용하였다. OsSUT2의 액포막-위치는 OsSUT2 - GFP 형질전환 벼의 엽육세포로부터 분리된 원형질에서 설명되었다. GFP 신호는 액포막에서 명확히 나타났으며, 이는 엽록체의 내부 및 주변부에서 나타났다(도 1A).

형질전환 식물체 중, OsSUT2-GFP 를 발현하는 재생성 알비노 식물체를 이용한 경우, 배지상태에서 양분을 제공해주면서 유식물상태로 키워, 원형질체를 분리하여 공초점 현미경으로 관찰하였다. GFP 신호는 핵 내부에서 나타났으며, 이는 OsSUT2가 세포막(PM)이 아닌 액포막에 있음을 확인하였다(도 1B). 이러한 결과는 OsSUT2 가 액포막에 존재하는 것을 명확하게 밝힌 것이다.

< 실시예 2> OsSUT2 의 발현 패턴 확인

(1) pOsSUT2 : GUS 융합 벡터의 구축

OsSUT2 유전자의 5' 상위 영역 약 2 kb 를 게놈 DNA를 주형으로 PCR 증폭하였다. 프라이머는 5'-TACAATCCAATACTCCAGTAGAC-3' 및 5'-CTTCTTCTCGTGTTTGCCTCCG-3' 를 이용하였다. 증폭된 산물을 pGEM T-이지 벡터 (프로메가, 메디슨, WI) 내로 서브클로닝하고, 서열분석을 통해 확인하였다. 이어서, 클로닝된 절편을 pBI101 (도 2, 제퍼슨, 1987)의 프로모터-부재 β-글루쿠로니다제 (GUS) 리포터 유전자의 앞에 삽입하였다. 결과적으로, OsSUT2 유전자의 프로모터 영역을 노팔린 신타제 (nos) 유전자인 터미네이터에 연결된 GUS 유전자에 융합시켰다. 이 구축물을 pOsSUT:GUS 라 지정하였다.

(2) 아그로박테리움-매개 벼 형질전환

상기 제작된 pOsSUT2 : GUS 구축물을 발현하는 형질전환 벼 (O. sativa cv. Hwayoung) 식물체를 제조하기 위하여, 상기 벡터를 운반하는 아그로박테리움 투메파시엔스 LBA4404 균주를 25 mg L^-1 카나마이신으로 보충된 AB 배지상 에서 28℃, 3일 동안 성장시키고, 형질전환 캘리(calli)를 알려진 방법으로 아그로박테리움-매개 공동배양(Jeon et al., 2000)을 통해 얻었다. 형질전환 벼 식물체를 50 mg L^-1 하이그로마이신 및 250 mg L^-1 세포탁심을 함유하는 선택배지 상에서 형질전환 캘리로부터 재생하였다.

(3) 조직화학 GUS 분석

pOsSUT2 : GUS 형질전환 식물체로부터 다양한 조직(잎, 뿌리, 꽃, 종자)을 수집하여, 조 등(2010)에 의해 알려진 방법으로, 0.2M 인산나트륨(pH 7.0), 10 mM EDTA, 20% 메탄올, 2% DMSO, 0.1% 5-브로모-4-클로로-3-인돌 ㅯ-글루쿠로니드 (X-Gluc)를 함유하는 GUS 반응용액에서 염색하였다.

요약하면, 시료를 37℃에서 밤새 인큐베이션하고, 이어서, 70% 에탄올로 옮겨 엽록소를 제거하였다. 상기 GUS 반응용액으로 염색 후, 시료를 50% 에탄올, 5% 아세트산 및 3.7% 포름알데히드를 함유하는 용액 내에 고정하였다. 염색된 시료를 해부현미경(SZX12, 올림푸스, 도쿄, 일본)으로 관찰하였다. 종단 및 횡단 절단을 위하여, 염색된 시료를 파라플라스트 플러스 (시그마, 세인트 루이스, MO)에 끼워넣고, 10 μm 절편을 마이크로톰(마이크롬 HM360, 울도르프, 독일)를 이용하여 제조하였다. 상기 절편을 슬라이드 위에 놓고 복합 현미경으로 관찰하였다.

pOsSUT2 : GUS 를 발현하는 독립적 형질전환 벼 식물체 중에서는 GUS 발현에 중요한 변화가 발견되지 않았다. 가장 높은 GUS 강도를 갖는 대표적 라인을 선택하여 다음의 분석을 실시하였다. 이 라인에서, GUS 활성은 잎, 줄기, 뿌리, 꽃(잔이삭) 및 미성숙 종자를 포함한 모든 시험 벼 조직에서 검출되었다(도 3).

pOsSUT2 : GUS 라인의 잎날에서, GUS 활성은 엽육세포 및 유관속초세포에서 높았으나, 체관부 반세포 및 성숙한 후생물관부 세포를 포함한 관다발에서는 발견되지 않았다 (도 3A 및 3B). 상피 세포에서, GUS 발현은 거의 검출되지 않았다. 잎집에서 GUS 발현 패턴은 잎날에서 발현 패턴과 유사하였으나, 더 높은 수준의 GUS 활성은 유관속초세포에서 발견되지는 않았다(도 3C). 뿌리에서, GUS 발현은 돌출하는 곁뿌리 주변부에서만 검출되었다(도 3D). 수정 전 잔이삭에서, 내화영 및 외화영의 가장자리에서 약한 GUS 활성이 검출되었으나, 꽃의 수술을 포함한 꽃의 기관에서는 검출되지 않았다(도 3E). 반대로, 수정 후, 잔이삭의 꽃자루 지역은 높은 GUS 활성을 나타냈다(도 3F). 벼에서 종자는 전-저장기 동안 (수정후 1-6일) 배젖 세포의 세포화 및 증식과 함께 길이방향으로 길어지고, 전분-충전 우유기(starch-filling milky phase) 동안 두꺼워진다. 발달중인 형질전환 pOsSUT2 : GUS 라인의 미성숙 종자에서, 높은 GUS 활성이 초기 전분-충전 단계 7-8 DAF 종피에서 관찰된 반면, 전-저장기 종자에서 3-4 DAF에서는 낮은 활성이 관찰되었다(도 3G, H). 미성숙 종자에서 OsSUT2 발현을 추가로 시험하기 위하여 염색된 종자를 종단 및 횡단 방향으로 절단하였다. 7-8 DAF 미성숙 종자에서, OsSUT2 는 교차 세포층에서 높게 발현되었으나, 주관조직, 주심 돌기, 또는 배젖세포에서는 발현되지 않았다(도 3I, 3J).

OsSUT2는 광합성 조직인 잎날, 유관속초의 엽육세포와 유관속초 세포에서 강한 발현을 보이고, 관다발조직인 체관부와 반세포에서는 발현이 없음을 확인하였다. 또한 비광합성 조직인 뿌리와 종자에서도 발현되고 있음을 확인하였다. 이는 광합성 조직에서의 자당분배와 비광합성 조직에서의 자당분배 모두에 OsSUT2가 관여함을 나타낸다.

< 실시예 3> 효모에서 OsSUT2 의 자당 수송 활성 확인-효모 내 자당 운반 실험

OsSUT2 가 자당 운반 활성을 갖는지 확인하기 위하여, 방사성동위원소-표지된 ¹⁴C-자당을 이용하여 벼 OsSUT2 cDNA를 발현하는 효모세포를 가지고 분석을 수행하였다. 이 실험에서, OsSUT2의 발현-최적화 합성 오픈 리딩 프레임(ORF) (OsSUT2 _syn -이라 언급)을 또한 시험하였다.

발현-최적화 OsSUT2 클론 (GenBank 접속번호. HQ830493; 서열번호 22)를 블루 헤론 바이오테크놀로지(보델, WA)사에 의뢰하여 합성하고, 게이트웨이 엔트리 벡터 (Gateway entry vector) pENTR221 (도 4) 내에 삽입하였다. 상기 클론의 아미노산 서열은 벼로부터 분리한 cDNA 로부터 결정된 서열과 동일했다. 효모 내 발현을 위하여, 상기 엔트리 클론을 게이트웨이 목적 벡터(Gateway destination vector) pDR196/GW (CA, 카네기연구소, 울프 프롬머 박사 제공)를 이용하여 시험관내에서 재조합하였다. OsSUT2 _syn 이라 명명한 이 구축물과 천연 벼 OsSUT2 코딩 영역, 감자 자당 운반체 StSUT1 및 빈 벡터를 이용하여 효모균주 SEY6210 (MAT α leu2-3, 22 112 ura3-52 his3-Δ200 lys2-801 trpl-Δ901 suc2-Δ9; Brown and Bussey, 1993)을 형질전환하였다. 방사성동위원소-표지된 ¹⁴C-자당의 효모세포 내 섭취는 종래에 알려진 방법으로 결정하였다 (레인더스 및 와드, 2001).

발현-최적화 OsSUT2 _syn 를 발현하는 효모세포 내로 자당 운반은 1 내지 5분 사이에 선형으로 나타났으며, 5분 후 빈 벡터로 형질전환한 효모 세포 내 흡수 수준 보다 대략 14배 더 높은 수준이었다 (도 5A). 반대로, 천연 OsSUT2 벼 cDNA 는 합성, 발현-최적화 클론과 동일한 단백질을 코딩하는데도 불구하고 효모에서 작동적인 것으로 발견되지 않았다. 따라서, OsSUT2 _syn 클론을 이후 모든 분석에서 이용하였다.

OsSUT2 에 의한 자당 운반은 프로토노포어 카보닐 시아나이드 m-클로로페닐히드라존(CCCP) 에 의하여 강력히 억제되었다(도 5B). 이는 OsSUT2 가 H⁺-자당 공동운반체로써 기능함을 나타낸다. 감자 H⁺-공동운반체 StSUT1에 의한 자당 운반은 CCCP에 유사하게 민감하였다. OsSUT2 를 발현하는 효모 세포 내로 ¹⁴C-자당 흡수의 반응속도 분석에 의하여, pH 4.0 에서 OsSUT2 의 K_m 은 1.86 ± 0.38 mM 이고, V_max 는 2.30 ± 0.06 nmol 자당 분^-1 (10⁸ 세포)^- ¹ 인 것으로 결정되었다 (도 5C).

이로써, OsSUT2 단백질이 실제로 자당을 수송하는 수송체의 기능을 수행하는 것을 확인하였다. 즉, OsSUT2 단백질이 공동수송(symport)을 통해 액포 내에서 자당과 H⁺(proton)을 같은 방향으로 수송하는 symporter이고, 실제 식물체내에서 자당은 액포에 저장된 후, OsSUT2 단백질에 의해서 세포질로 수송하여 사용되는 것을 확인하였다.

< 실시예 4> OsSUT2 돌연변이체 비교 실험

(1) OsSUT2 돌연변이체의 분리

T-DNA-태그 OsSUT2 돌연변이 ossut2 (OsSUT2 유전자의 널(null) 돌연변이체)를 벼 T-DNA 삽입 서열 데이터베이스를 검색하여 분리하였다(An et al., 2005a, 2005b; Jeong et al., 2006; http://www.postech.ac.kr/life/pfg/risd/index.html). 상기 분리된 돌연변이 대립유전자, ossut2는 OsSUT2 의 5번째 엑손 내 T-DNA 삽입을 가진다 (도 6). 동형접합 돌연변이체 (O. Sativa cv. Hwayoung)를 게놈 DNA PCR 분석으로 분리하였다. ossut2의 유전자형을 위하여 이용되는 유전자-특이적 프라이머는 다음과 같았다: 5＇-TGCTGTATCCTAAAATAACCTGTTGATGG-3＇ 및 5＇-CATTTCATACACACACCTTAACACAGCAC-3＇. 사용된 T-DNA-특이적 프라이머는 5＇-GACCAGAAAGCCCATAAACCTTGGAGGC-3＇이었다.

돌연변이체 제작은 상기 기재된 클로닝 방법과 같았다.

(2) 유전자 상보성 실험- 보상 라인( complementation line )의 제조

ossut2 돌연변이를 보상하기 위하여, 전장 OsSUT2 cDNA를 다음의 프라이머를 이용하여 PCR 증폭하였다: 5'-GGATCCCTCTTCTGAACTAACCCAAAGAT-3' 및 5'- GGTACCAACTCCTGCAACTTTTATTCACT-3' (밑줄친 서열은 BamHI 및 KpnI 위치를 각각 나타냄). 이어서, PCR 산물을 pGEM-T 이지 벡터(프로메가, 메디슨, WI) 내로 서브클로닝하고, 서열분석으로 확인하였다. BamHI 및 KpnI 으로 소화한 삽입물을 추가로 선택마커로써 포스포만노스 이소머라제(PMI) 유전자를 갖는 Ubi/NC4300 이원벡터(CA, 데이비스, 캘리포니아 대학의 파멜라 로날드 박사 제공)의 옥수수 Ubi1 프로모터와 Nos 터미네이터 사이에 서브클로닝하였다. 생성된 구축물 Ubi - OsSUT2 (pJJ2521, 도 7)을 이용하여 ossut2 돌연변이체를 종래 알려진 방법(루까 등, 2001)으로 형질전환하였다.

(3) ossut2 및 형질전환 라인의 재배

상기 제조예1에 기재된 바와 같이, 위 제조된 ossut2 및 형질전환 라인 식물체를 재배하였다.

(4) RNA 분리 및 PCR 분석

ossut2 및 형질전환 라인의 RT-PCR 분석을 위하여, 전체 RNA 를 트리졸 시약을 이용하여 수확 샘플(4주령 잎)로부터 준비하고, iScript cDNA 합성 키트 (바이오-래드, 헤르귤레스, CA)를 이용하여 역전사하였다. 최초, cDNA 가닥을 이용하여 유전자-특이적 프라이머 및 하우스키핑 유전자 Act1 (맥엘로이 등, 1990) 및 OsUBQ5 (제인 등, 2006)에 대한 콘트롤 프라이머를 가지고 RT-PCR을 수행하였다.

종래 기술된 방법 (조 등, 2005)을 이용하여 RT-PCR 분석을 3회 이상 반복하여, 유사한 결과를 얻었다.

요약하면, 정량적 실시간 PCR을 위하여, 전체 RNA 를 트리졸 시약을 이용하여 배젖 및 종피 cDNA 를 조 등(2005)에 기재된 방법에 따라 수정 6-10 일후 (DAF) 수확된 종자로부터 준비하였다. OsUBQ5의 발현수준을 실시간 PCR 결과의 정규화를 위하여 사용하였다 (지안 등, 2006). 모든 반응을 핫스타트-IT SYBR 그린 qPCR 마스터 믹스 (USB) 및 7500 실시간 PCR 시스템 (어플라이드 바이오시스템스, 칼스바드, CA)를 이용하여 제조자 설명서에 따라 3회 수행하였다. 유전자 발현의 변화를 비교 주기 역치 방법(comparative cycle threshold method) 및 서열 검출기 시스템스 V1.2 소프트웨어 (어플라이드 바이오시스템스)로 분석하였다. 정량적 실시간 PCR을 위한 유전자-특이적 프라이머는 다음과 같았다:

OsSUT2, 5＇-TGTGGCAAAGAATATGGATTAT-3＇ 및 5＇-CTACCCAGTGACACAATAACCT-3＇

OsUBQ5, 5＇-GACTACAACATCCAGAAGGAGTC-3＇ 및 5＇-TCATCTAATAACCAGTTCGATTTC-3＇

Act1, 5＇-GGAACTGGTATGGTCAAGGC-3＇ 및 5＇-AGTCTCATGGATACCCGCAG-3＇

OsSUT2-특이적 프라이머 및 T-DNA-특이적 프라이머를 사용하여, 상기 삽입에 대하여 동형접합체인 돌연변이체를 분리 세대로부터 분리하였다. RT-PCR 분석은 내인성 OsSUT2 전사물이 ossut2 에서 부재함을 나타냈으며, 이는 널 돌연변이를 확인한 것이다(도 8).

(5) 표현형 비교

ossut2 돌연변이는, 상토에 뿌린 후 온실조건 하에서 4주간 큰 식물체 성장 감소를 나타내었다(도 9).

동일한 효과를 벼 본답에서 성장한 성숙한 식물체에서 관찰하였다. ossut2의 성장을 야생형 분리 대조군과 분얼수, 식물체 신장, 1000-낟알 중량 및 뿌리 중량을 비교하였다(도 10). ossut2의 평균 분얼수는 6.1로, 야생형 식물체의 그것(14.8)보다 58.8% 더 낮았다 (도 10A). 유사하게, 평균 신장은 대조군 식물체에서 112.8 cm 이었으며, ossut2에서 91.4 cm 에 불과했으며, 약 19% 감소한 것이다 (도 10B). 1,000 낟알의 평균 중량은 ossut2 및 대조군 각각 16 g, 19.1 g 으로, ossut2에서 약 16% 감소하였다 (도 10C). 결과적으로, ossut2 돌연변이 낟알은 대조군 식물체 종자와 비교하여 가시적으로 작았다 (도 10). 또한, 뿌리 건중량은 대조군 (식물체 당 78.0 mg)과 비교하여 ossut2 (식물체 당 35.5 mg)에서 54.5% 감소하였다(도 10D).

이러한 식물체 성장 감소가 실제로 ossut2 돌연변이에 기인한 것인지 확인하기 위하여 옥수수 Ubi 프로모터 아래 야생형 OsSUT2 cDNA 로 상기 돌연변이 라인을 형질전환하였다. 10 초과의 독립적 형질전환 벼 식물체가 수득되었으며, 그중 OsSUT2 의 높은 발현을 나타내는 2개를 Comp-3 및 Comp-4라 지정하고, 이후 실험에 이용하였다.

RT-PCR 분석 결과, 이들 두 라인이 야생형 대조군 보다 더 높은 수준으로 OsSUT2 를 발현하는 것을 나타내었다(도 8). Comp-3 및 Comp-4 의 표현형 분석에서, 분얼수, 식물체 신장, 1000-낟알 중량, 낟알 크기, 및 뿌리 건중량 모두가 대조군 식물체와 유사한 수준으로 회복되는 것으로 발견되었다 (도 10 및 11). 이러한 유전적 보충 실험은 ossut2 돌연변이가 성장 결함 표현형에 관련이 있음을 설명하며, 이는 OsSUT2의 기능이 벼 식물체의 정상 성장 및 발달에 필수적임을 시사한다.

본 실험 결과는 OsSUT2가 식물 생장 및 종자발달에 매우 중요한 역할을 한다는 것을 보여준다.

< 실시예 5> OsSUT2 의 주된 탄소 대사물 관련성 확인

온실에서 성장한 4-주령 식물체로부터 잎날 약 100 mg 을 낮과 밤의 종료시점에 수확하였다. 자당, 포도당, 과당 및 전분을 에탄올 물 추출물의 가용성 및 잔류 분획에서 NAD(P)H-결합 효소적 방법(리 등, 2005)을 이용하여 측정하였다. 측정된 대사물 함량을 잎 생중량에 대해 정규화하였다.

자당은 대조군, 분리 야생형 및 보충된 라인에 비하여 ossut2 잎에서 현저히 증가하였다 (도 12A). 즉, ossut2 돌연변이체는 잎에 높은 자당 함량을 나타내었다. ossut2 돌연변이체에서, 자당 함량은 대조군과 비교하여 낮 종료시점에 약 2배 더 높았고, 밤 종료시점에 약 4배 더 높았다. 유사하게, 포도당 및 과당의 수준은 대조군과 비교하여 ossut2에서 증가하였다 (도 12B, 12C). 반대로, ossut2 돌연변이 잎에서 일시적 전분 수준은 대조군과 다르지 않았다 (도 12D). 보충된 라인은 모두 분리 야생형 식물체와 비교하여 유사한 가용성 당류 함량을 나타내었다.

< 실시예 6> OsSUT2 의 당 수출 활성 확인

벼에 적합하게 일부 변경하여 Wingenter 등 (2010)에 의해 알려진 바와 같이 당류 수출 측정을 수행하였다.

요약하면, 온실에서 재배한 4-주령 식물체의 성숙한 잎날을 낮 종료시점에 잎날의 바닥을 잘라 수집하고, 자른 부위를 15mM EDTA 용액 (pH 7.25) 내에 담갔다. 절단 끝 부분의 막힘을 피하기 위하여, 각 1mm 의 최말단부를 완충액에서 연속하여 일분 간격으로 4회 다시 잘라냈다. 이어서, 잎날 말단을 동일한 완충액 500 μL로 채운 반응 튜브로 즉시 옮기고, 암조건에서 16h 인큐베이션하였다. 이어서, 자당은 단당류로 가수분해되기 때문에, 삼출물을 함유하는 용액을 수집하여 자당, 및 또한 포도당, 과당을 포함한 전제 가용성 당류를 정량하였다.

당류를 온도-제어 컬럼 챔버와 자동-샘플러 및 굴절 지수 검출기(아질런트 테크)를 장착한 고성능액체크로마토그래피 시스템 (HPLC; 아질런트 테크. 1200 시리즈, 산타 클라라, CA)을 이용하여 분석하였다. HPLC 시스템 및 검출기를 조절하고, 결과를 켐스테이션 소프트웨어 (아질런트 테크)를 이용하여 계산하였다. 탄수화물 컬럼 (5μm, 4.6ㅧ250mm; 아질런트 테크)을 이용하여 삼출물 내 당류를 분리하였다. 제조된 시료를 아세토니트릴 (1:1, v/v) 과 혼합하고 0.2 μm 스마트포르 주사 필터(웅지 과학 주., 서울, 대한민국)를 통해 여과한 후, 1.4 mL 분^-1 의 속도로 75% 아세토니트릴 용액 내 이동상을 갖는 100 μL 부피에 주입하였다. 피크를 표준 당류의 체류 시간과 비교하여 확인하였다 (도 13). 본 실험을 3회 반복하였다.

암기 동안, 분리된 야생형 잎은 25.1 μ몰 C6 유닛 g^-1 생중량을 수출한 반면, ossut2 돌연변이 잎은 당 수출에서 약 54% 감소 (11.6 μ몰 C6 유닛 g-1 생중량)를 나타내었다. 두 보충된 라인 모두 야생형과 비교하여 유사한 당 수출 능력 수준 (각각, Comp-3 및 Comp-4의 27.4 및 31.1 μ몰 C6 유닛 g^-1 생중량)을 나타냈다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

서열번호 4에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 OsSUT2 (Oryza sativa sucrose transporter 2) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는, 식물체의 액포로부터 세포질로의 자당 수송을 증가시키기 위한 조성물.
제1항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 1에 기재된 염기서열로 이루어진 조성물.
제1항에 있어서, 상기 유전자는 재조합 벡터 내에 함유된 조성물.
제3항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 도 7의 개열지도를 가지는 조성물.
서열번호 4에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 OsSUT2 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물체를 형질전환하는 단계를 포함하는, 식물체의 액포로부터 세포질로의 자당 수송을 증가시키는 방법.
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