KR20030072206A - 식물의 유전공학적 변형 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 당류(saccharide), 특히 사카로스 운반자(saccharose transporters)를 코딩하는 핵산 분자에 관련된다. 본 발명은 또한 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터 및 숙주 세포, 그리고 상기 핵산 분자 및 벡터를 사용하여 형질전환된 식물 및 식물 세포에도 관련된다. 본 발명은 식물에서의 당류, 특히 사카로스 운반을 변형시키기 위한 방법에 더욱 관련된다.

Description

식물의 유전공학적 변형 방법{METHOD FOR GENETICALLY MODIFYING A PLANT}

고등 식물은 자가 영양 생물 조직(autotrophic tissue)에 의해 탄수화물이 공급되는 종속 영양 생물 조직(heterotrophic tissue)을 갖는다. 사카로스 및 그 유도체는 탄수화물이 운반되는 주된 형태이다. 종속 영양 생물 조직은 체관부를 통하여 공급되는데, 체관부는 과량의 광순응체, 즉 탄수화물을 공급하는 기관, 및 이들 광순응체를 그 네트 발란스(net balance) 내에서 광순응체를 입수하여야 하는 기관, 즉 소위 싱크 기관(sink organ)으로 출수할 수 있는 기관 -즉, 소위 소스 기관(source organ)-으로 연결된다. 소스 기관은, 예를 들어 성숙된 잎과 발아된 종자이다. 싱크 기관은, 예를 들어 어린 잎, 어린 근경, 뿌리, 열매, 꽃, 그리고 다른 번식 기관이다. 체관은 체 요소(sieve element), 캡 세포(cap cell), 유조직 세포, 및 번들 쉬트 세포(bundle sheet cells)와 같은 여러가지 세포 형태로 구성된다. 체 요소에서는 광순응체의 전치 유동이 출수부로부터 입수부로 이동한다. 체관에 광순응체를 싣고 내리는 것 양자는 이론적으로 아포플라스틱(apoplastic) 및 심플라스틱(symplastic) 경로를 통해 수행될 수 있고, 교차되어야 하는 원형질막, 농도 구배, 삼투율 등의 복수 인자가 싣고 내리는 것에 영향을 줄 수 있다. 따라서, 싱크 기관에 광순응체의 공급 뿐 아니라 체관의 적하는 명백히 복수의 근접되어 상호 연결되고 조절되는 운반 단계를 포함하는 매우 복잡한 과정이다. 이러한 운반 단계는 여러가지 원형질막 단백질, 특히 운반 단백질의 참여와 함께 일어난다. 예를 들어, SUT1(sucrose transporter; 슈크로스 운반자)와 같은 여러 부류의 사카로스 운반자 군(family)이 다양한 식물군에서 발견되는 것으로 알려져 있다. SUT 유전자는 12 개의 트랜스멤브레인 영역을 갖고 헥소스 운반자 군의 구성원으로부터 명백히 구분되는 소수성 단백질을 코딩한다. 라론드 등(Lalondeet al., The Plant Cell(1999) 11, 707-726)은 SUT 군의 구성원이 사카로스에 대한 높은 친화성을 갖는 것으로 추측하도록 하였다. 특히, 리코페르시콘 에스쿨렌툼(Lycopersicon esculentum), 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum), 및 솔라눔 투베로숨(Solanum tuberosum)으로부터의 사카로스 운반자 SUT1은 체관에서의 장거리 운반에 관련되는 것으로 예상된다(Riesmeieret al., Plant Cell(1993) 5, 1591-1598). 국제공개 WO94/00574는 시금치와 감자로부터의 SUT1의 DNA 및 아미노산 서열을 개시하고 있다. 체관의 체 요소의 원형질막에 위치하는 이 사카로스 운반자는, 예를 들어 형질전환된 감자 및 담배 식물의 안티센스 저해 실험에서 나타난 바와 같이 체관 내에서 사카로스의 장거리 운반을 위한 필수 요소이다(Riesmeieret al., EMBO(1994)13, 1-7)(Lalondeet al., op. cit.). SUT1의 발현 패턴, 특히 전체 체관에서의 발현은 SUT1이 적하와 양륙 영역(잎, 즉 싱크 기관) 사이에서 사카로스의 농도 구배를 유지하는데 관여한다는 것을 입증한다. 따라서, SUT1은 소스 기관에서 체관부의 (첫번째) 적하에 덜 관여하고 체관부로부터 나오는 사카로스의 귀환에 더 관여하는 것으로 보인다. 이 기능은 SUT1과 관련된 비교적 높은 친화성 및 낮은 운반 능력에 의하여 더욱 확인된다. 그래서, SUT1은 아포플라스트(뒤)로부터 체관부로 매우 낮은 양의 사카로스를 입수할 수 있고, 이에 따라 아포플라스틱 농도를 낮게 유지한다. 그것은 이러한 낮은 농도에서 기능하므로, 높은 운반율에는 관여할 수 없다. 잎날에서의 사카로스 섭취의 동력학은 이러한 낮은 용량(Vmax 0.7 nmol cm^-2min^-1)과 결합된 고도-친화성(Km 2.7 mM) 섭취를 명백히 밝혀준다(Delrot and Bonnemain,Plant Physiol. (1981) 67, 560-564). 이 시스템은 또한 HAS(high affinity/low capacity system)로서 언급되기도 한다. 그러나, 사카로스 운반의 전체 운반 및 조절 시스템에서 SUT1의 관련은 완전히 불명료하다(Wardet al., Int. Rev. Cytology(1998) 178, 41-71; Kuhnet al., J. Exp. Bot.(1999) 50, 935-953). 이는 또한 존재할 수 있는 두번째 HCS(high capacity/low affinity system) 동력학 요소에 관련된 (첫번째) 적하 캐리어의 확인에 응용되기도 한다. 또한, 여러 식물종(Lalondeet al., op. cit.)과, 전사 및 후-전사 레벨에 영향을 미치는 다수의 잠재적 조절 메카니즘과 요소(Kuhnet al., Science(1997) 275, 1298-1300) 간의 사카로스 운반 메카니즘에는 큰 차이가 있을 가능성이 높다. 라론드 등(Lalondeet al., op.cit.)은 사카로스 운반자에 더하여, 예를 들어 조절자(regulator) 및 센서 요소 등의 추가적인 기능적 요소가 사카로스 운반에 관여하는 것으로 추측한다. 그러나, 사카로스 운반 메카니즘의 극도의 복잡성은 조직적으로 기능에 할당되는 허용되는 구조 뿐 아니라, 특정 특성에 대한 개선된 식물을 얻을 목적으로, 당류 운반, 특히 사카로스 운반에서 조직적인 개입을 허용하는 방식으로 예상되는 그들의 상호작용도 갖지 않는다. 이것은 SUT1의 과도발현이 동화의 할당에서 어떠한 변화도 생산하지 않고, 단지 개화 특성에 영향을 준다는 사실에서 가장 명백하게 보여진다(US 6,025,544; P 44 39 748.8).

본 발명은 당류(saccharide), 특히 사카로스 운반자(saccharose transporters)를 코딩하는 핵산 분자, 이들 핵산 분자를 포함하는 벡터, 및 숙주 세포 뿐 아니라, 여기에 기술되는 핵산 분자 및 벡터를 사용하여 형질전환된 진균(fungi), 식물 세포, 및 식물에 관련된다. 본 발명은 식물에서의 당류 운반 및 특히 사카로스 운반을 변형시키기 위한 방법에 더욱 관련된다.

이하, 다음 실시예 및 부속 도면에 근거하여 본 발명이 설명될 것이다.

도 1 내지 4는 본 발명에 따라 사용되는 유전자 구조를 모식적으로 나타낸 것을 보여준다.

도 5 및 6은 SUT4의 단백질 활성을 그래프로 나타낸 것을 보여준다.

도 7은 키메릭 SUT2와 SUT1 유전자 구조를 보여준다.

이에 따라, 본 발명에 깔려있는 기본적인 기술적 문제는, 예를 들어 싱크 기관, 특히 수확 기관에서 증가된 당 함량과 같은 개선된 특성을 갖는 식물이 생성될 수 있는 방식으로, 식물의 당류 운반 유동, 특히 사카로스 운반 유동에서 제어된 개입을 허용하는 유전공학적 수단에 의하여 변형된 식물을 제조하기 위한 방법 및 수단을 제공하는 것이다.

본 발명은 이 문제를, 낮은 당류 친화성을 갖지만 높은 당류 운반 능력을 갖는 당류 운반자의 변형된 활성이 식물에 유발되도록, 식물의 조직에서 당류 유동 및/또는 당류 농도, 특히 사카로스 유동 및/또는 사카로스 농도를 변형하기 위한 방법을 제공하는 것에 의하여 해결한다. 본 발명의 교시는 또한 낮은 당류 친화성과 높은 당류 운반 능력을 갖는 당류 운반자의 활성을 변형-즉, 이 과정 중에 변형된 식물이 생산되도록 변형-시키는 것에 의해 식물의 여러 조직에서 당류 유동 및당류 농도에 조직적으로 영향을 주기 위한 수단 및 방법을 처음으로 제공한다. 본 발명은 처음으로, 특히 식물의 미세 맥관에서 발현되는, HCS 시스템-즉, 사카로스를 위한 높은 운반 능력을 갖지만 사카로스에 대한 낮은 친화성을 갖는 사카로스 운반 시스템-을 제공한다.

본 발명에 있어서, 특히 당류 운반자에 의한 당류 운반 활성의 변형은 야생형 활성에 대한 정상적 활성에 있어서의 변화, 예를 들어 활성의 완전한 억제, 감소 또는 증가를 의미하는 것으로 이해된다. 이러한 활성에 있어서의 증가는, 인산화 또는 탈인산화와 같은 전사후 변형에 의하여 야기되는 단백질 자체의 변형된 활성에 기인할 수 있다. 그러나, 그것은 또한 코딩 유전자의 변형된 발현율, 형성된 mRNA의 변형된 안정성 또는 번역율, 또는 유사한 이유, 따라서 조직에 존재하는 당류 운반자의 양에 있어서의 변화에 의하여 야기될 수도 있다. 당류 운반자의 활성의 변형은 또한 당류 운반자의 활성을 제어 또는 조절하는 요소, 예를 들어 센서 또는 조절 단백질의 활성의 변형에 기인할 수도 있다.

바람직한 실시예에서 당류는 사카로스를 의미하는 것으로 이해되고, 달리 언급되지 않으면, 당류 운반자는 사카로스 운반자, SUT4(슈크로스 운반자 4), 즉 사카로스에 대한 낮은 친화성과 사카로스에 대한 높은 운반 능력을 갖는 운반자를 의미하는 것으로 이해된다.

본 발명에 관련해서 이해되는 바 약간의 또는 낮은 친화성은 SUT1 친화성 보다 낮은 친화성, 예를 들어 SUT1의 친화성 보다 약 50 %, 바람직하게는 80 %, 100%, 200 %, 300 %, 또는 400 % 낮은 것, 예를 들어 친화성 K_m>2.7 mM, 바람직하게는 >4 mM, >6 mM, >8 mM, >10 mM, >15 mM, >20 mM 및 바람직하게는 >25 mM, 더욱 바람직하게는 26 mM을 의미하는 것으로 이해된다. 높은 운반 능력은 본 발명에서 SUT1의 운반 능력 위에 있는 운반 능력, 예를 들어 SUT1의 것의 50 %, 100 %, 150 %, 200 %, 300 %, 400 %, 또는 500 %를 의미하는 것이라 이해된다. 운반 능력은 V_max>0.7, 바람직하게는 >1, >1.5, >2, >3, >3.5, 보다 바람직하게는 3.6 nmol cm^-2min^-1.

본 발명은 단지 내생적으로만 존재할 수 있는 상기 당류 운반자의 활성에 영향을 주기 위해, 또는 이러한 활성을 식물에 도입하기 위해, 기술적 수단, 특히 유전공학적 수단이 사용될 수 있다는 것으로부터 유래된 발견 및 교시에 기초하고 있다.

본 발명에 있어서, 싱크 기관(sink organ)은 그들의 네트 발란스 면에서 광순응체를 입수해야 하는 식물의 기관 또는 조직을 의미하는 것으로 이해된다. 이와 같은 식물 기관 또는 조직으로는 잎, 근경, 열매, 뿌리, 꽃, 번식 기관, 목질부, 지지 조직, 싹, 종자, 구근 등이 있다.

본 발명에 있어서, 소스 기관(source organ)은 그들의 네트 발란스에 있어서 과량의 광순응체를 갖고 상기 광순응체를 출수할 수 있는 식물의 기관 또는 조직을 의미하는 것으로 이해된다. 소스 기관으로는, 예를 들어 성숙된 잎과 발아하는 종자, 근경, 및 구근이 있다.

본 발명에서는, 예를 들어 캡 세포(cap cells) 및/또는 체 요소(sieve elements)에서, 본 발명에 따라 변형된 당류 운반자의 증가된 발현율, 및 증가된 운반율이 각각 체관부의 당류 적하, 특히 체관부의 사카로스 적하를 특히 높은 광 강도 또는 높은 CO₂농도에서 실질적으로 증가시키는데, 이에 의해 증가된 사카로스 함량을 나타내는 수확 기관을 갖는 식물이 바람직하게 얻어질 수 있음을 예시하고 있다. 본 발명은 특히 식물의 조직에서 당류 유동 및/또는 당류 농도를 변형시키는 방법을 제공하는 것에 의하여 이 문제를 해결하는데, 여기에서 당류에 대한 낮은 친화성과 당류에 대한 높은 운반 능력을 갖는 당류 운반자의 활성이, 당류 운반자의 변형을 허용하는 염기서열을 포함하는 적어도 하나의 벡터를 사용하여 적어도 하나의 식물 세포를 형질전환시키는 것에 의하여 변형되고, 또한 여기에서 안정적으로 통합된 형태로 상기 염기서열을 포함하는 식물 세포는 각 경우, 본 발명에 따라 형질전환되지 않은 식물을 의미하는 야생형 식물과 비교하여 그의 조직에서 변형된 당류 유동 및/또는 변형된 당류 농도가 존재하는 식물을 형성하도록 재생된다. 따라서, 본 발명은 유전공학적 기술의 응용을 통해 식물을 조작하는 수단에 의해 달성된 이러한 변형으로, 당류를 위한 높은 운반 능력과 당류에 대한 낮은 친화성을 갖는 당류 운반자의 변형을 교시한다.

본 발명에서, 이것은 식물 세포가 당류 운반자의 코딩 염기서열을 포함하는 적어도 하나의 벡터에 의하여 형질전환될 때, 그리고 이 벡터가 형질전환된 세포의게놈 내에서 염기의 안정된 통합 후 형질전환된 조직에서 당류 운반자의 과도 발현을 허용할 때 일어날 수 있다.

본 발명에서 사용되는 상기 당류 운반자의, 예를 들어 캡 세포의 체 요소에서의 염기서열의 과도 발현은 증가된 사카로스가 체관부에 적하되는 것을 야기한다. 본 발명의 방법을 사용하여 생산된 식물은, 예를 들어 뿌리, 열매, 근경, 꽃, 또는 종자와 같은 싱크 기관에서 더 높은 탄수화물 함량을 갖는다. 증가된 탄수화물 함량은, 특히 싱크 기관이 대부분인 식물의 수확 기관에서 바람직한 방식을 야기한다. 만약 본 발명의 방법이 예를 들어 평지씨(rapeseed)와 같은 오일 함유 식물과 함께 특히 바람직한 실시예에서 사용된다면 수확 기관에서 증가된 오일 함량이 관찰될 수 있다. 수확 기관의 수가 증가되고, 또한 이들의 중량이 증가될 수 있다는 관찰은 특히 유리하다.

본 발명에서 제공되는 바와 같이 상기 언급된 방식으로 소스 기관에서 당류 운반자의 과도 발현은 형질전환된 식물의 개화 시기를 변화시키는 원인이 된다.

체관부에서 당의 운반은 종종 체관부에서 아미노산의 운반과 상호적인 방법(reciprocal manner)으로 연결되기도 하므로, 본 발명에서 제공되는 바와 같은 체관부에서 당류 함량의 증가는 싱크 기관, 예를 들어 감자 근경 또는 사탕무우의 줄기뿌리에서 요망되지 않는 아미노산 함량을 감소시킬 수도 있다. 최종적으로, 본 발명의 방법은 식물에서 내생적으로 존재하는 물질, 또는 제노바이오틱스 (xenobiotics)와 같이 식물에 외인적으로 도입되는 물질의 글리코실화율을 증가시킬 수 있다.

본 발명의 특히 바람직한 실시예에서, 상기 언급된 소스 기관의 과도발현은 소스-특이적 프로모터, 즉 특히 잎-특이적 및/또는 캡-세포-특이적 프로모터의 제어 하에 벡터로 클로닝된 SUT4-코딩 염기서열로 적어도 하나의 식물 세포를 형질전환하고, 그리고 이들을 식물 세포의 게놈에 바람직하게는 안정적인 방식으로 통합시키는 것에 의하여 달성된다.

본 발명의 다른 실시예에서는, 35SCaMV 프로모터, 아그로박테리움으로부터의 캡-세포-특이적 rolC 프로모터 또는 강화된 PMA4 프로모터(Morianet al., Plant J(1999) 19, 31-41)와 같이 구조적으로 발현하는 프로모터가 사용될 수 있다.

추가의 바람직한 실시예에서, 당류 운반의 변형은 잎의 실질조직(mesophyll) 및/또는 잎의 상피에서 과도 발현을 통해 당류 운반자의 활성을 변형시키는 것에 의해 달성된다. 이들 조직에서 SUT4-코딩 염기서열의 특이적 발현은 체 요소에서 활성이 있는 내생적 사카로스 운반자에 대한 경쟁적 효과를 야기하여, 잎에서의 탄수화물 함량이 증가한다. 이러한 방식으로 생산된 식물은 더 큰 잎을 갖는데, 이는 부수적으로 병원균에 대한 개선된 보호를 가져온다. 이에 대한 하나의 이유는 방어 기능을 갖는 유전자가 증가된 당 함량에 의하여 활성화된다는 것이다. 또한, 더 두꺼운 표피와 더 높은 이차 대사물 함량은, 다른 것들 중에서도 PHA(polyhydroxy alcanoates)와 같이 생분해가능한 플라스틱의 생산을 위한 전구체로서 사용될 수 있는 물질을 생성한다. 이러한 바람직한 실시예에서 제공되는 잎의 엽육 및 표피에서의 발현은 특히 바람직한 실시예에서 SUT4-코딩 염기서열을 발현하기 위해 프로모터 StLS1/L700(Stockhauset al., Plant Cell(1989) 1, 805-813), 다른 표피-특이적 프로모터, 또는 PFP 프로모터(palisade-parenchyma)(WO98/18940)의 사용을 통해 달성될 수 있다.

본 발명의 다른 바람직한 실시예에서, 당류 운반자의 과도 발현은 싱크 세포 또는 기관, 특히 식물에서 발생되는 종자에 특이적으로 제공된다. 종자에서 탄수화물과 특히 오일 함량이 증가하기 때문에, 이는 다른 것들 중에서도 개선된 발아율을 야기한다.

종자 조직에서 SUT4-코딩 염기 시스템의 발현을 위해 본 실시예에서 그 용도가 바람직한 조직-특이적 프로모터는, 예를 들어 피숨 사티붐(Pisum sativum)으로부터의 비실린(vicilin) 프로모터이다(Newbiginet al., Planta(1990) 180, 461-470).

본 발명의 또한 바람직한 실시예에서 상기 방법은, 당류 운반자의 과도 발현이 싱크 기관의 표피 및 유조직을 위한 조직-특이적 조절 요소를 이용하는 것에 의하여 달성되는 것으로 제공된다. 본 발명에 따라 싱크 기관에서 사용된 당류 운반자의 증가된 발현은 당류를 접수하는 그들의 능력을 증가시키고 싱크 조직으로의 당류 유동을 증가시킨다. 따라서, 본 발명에 따라 생산된 식물은, 예를 들어 더 크고, 더 다양한 색의 꽃 및/또는 증가된 수의 꽃, 더 큰 종자, 더 큰 근경, 또는 더 큰 줄기뿌리를 갖는다. 싱크 기관은 또한 더 높은 탄수화물 함량 및 더 높은 오일 함량, 특히 강도에서 개선된 구조, 더 빠른 성장, 및/또는 삼투적으로 활성 성분의 더 높은 함량에 근거하여 추위에 대해 임의로 개선된 내성을 갖는다. 또한, 개화 시기와 기간 뿐 아니라 열매의 발달도 영향을 받을 수 있다.

특히 바람직한 실시예에서 본 발명은, 싱크 표피 및 유세포에서의 상기 과도 발현을 위하여 AAP-1(amino acid permease 1) 프로모터, 예를 들어 아라비돕시스 (arabidopsis) 프로모터 AtAAP1(정자내 및 초기 배아 발달 중의 발현), 또는 AtAAP2(주병의 체관부에서의 발현)(Hirneret al., Plant J.(1998) 14, 535-544), B33(patatin) 프로모터(Rocha-Sosaet al., EMBO J.(1998) 8, 23-29)(액세스 번호: S14483; 여기에 언급되는 모든 액세스 번호는 달리 지칭하지 않는 한 다음의 유전자 은행과 관련된다: National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine, Bethesda, MD 20894, USA) 특히 구근과 줄기뿌리를 위해서는 피숨 사티붐(Pisum sativum)으로부터의 비실린(저장 단백질) 프로모터 (Newbiginet al., Planta(1990) 180, 461-470)(액세스 번호: M73805) 및/또는 종자 및 꽃-특이적 프로모터를 제공한다.

본 발명은 또한 식물의 조직에서 당류 운반 활성의 변형과도 관련되는데, 여기에서 사카로스를 위한 높은 운반 능력과 사카로스에 대한 낮은 친화성을 갖는 당류 운반자, 특히 사카로스 운반자의 활성은 억제 또는 감소, 특히 저해 또는 공동 억제된다.

특히 바람직한 실시예에서, 당류 운반자의 활성은 프로모터에 대한 배향에서 안티센스 억제를 위해 본 발명에서 사용되는 당류 운반-코딩 염기서열 또는 이들의 충분한 일부를 갖는 벡터를 사용하여 식물 세포를 형질전환시키는 것에 의하여 억제 또는 감소될 수 있고, 바람직하게는 식물 세포의 게놈으로 안정된 방식으로 통합된다. 안티센스 RNA의 발현은 상기 내생적으로 존재하는 당류 운반자의 형성을억제 또는 감소시켜, 이 운반자에 의하여 야기되는 당류 유동이 조작될 수 있다.

또 바람직한 실시예에서, 이 당류 운반자의 활성은 식물로 도입되는 공동 억제 효과에 의하여 감소 또는 억제될 수 있다. 이들 공동 억제 효과를 달성하기 위하여, 바람직한 실시예에서는 복수 카피의 벡터가 적어도 하나의 식물 세포로 안정된 방식으로 그들의 게놈 내로 도입되는데, 상기 벡터는 당류-운반자-코딩 염기서열 또는 이들의 일부를 포함하여, 이에 의해 상기 카피가 게놈 내에서 통합된다.

더욱 바람직한 실시예에서, 당류 운반자의 활성은 바람직하게는 본 발명에 따라 사용되는 당류 운반자의 조직-특이적 내생적으로 존재하는 염기서열, 즉 비-형질전환된 야생형에 이미 존재하는 염기서열을 돌연변이 유도하는 것에 의하여, 예를 들어 트랜스포손(transposon) 돌연변이유도에 의하여 억제 또는 감소될 수 있다.

최종적으로, 본 발명은 RNA-이중 스트랜드 억제에 의해 사카로스 운반자의 활성 또는 발현을 감소 또는 억제시키도록 사용될 수 있다.

본 발명의 특히 바람직한 실시예에서, 사카로스에 대한 낮은 친화성을 갖지만 높은 사카로스 운반 능력을 갖는 당류 운반자의 활성을 억제 또는 감소하기 위한 상기 기술은, 예를 들어 잎과 같은 소스 조직에 더 높은 탄수화물 함량, 특히 더 높은 사카로스 함량을 생산하도록 사용될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서, 이것은 상기 언급한 바와 같은 소스 기관에서 당류 운반 능력의 감소 또는 억제를 통하여 달성될 수 있다. 이는 소스 기관에서 사카로스 또는 탄수화물 함량이 증가하는 동안 싱크 기관의 구조와 강도를 감소시킨다. 이것이 의미하는 바에의해, 그의 잎이 식품으로 사용되는 어떤 식물-예를 들어 양상추 또는 시금치-의 소스 기관의 당도가 증가될 수 있다. 또한, 경쟁을 통해 얻어진 이점은 상기 언급한 바와 같이 잎의 엽육과 표피에서 당류 운반자의 과도 발현을 위하여 달성될 수 있다. 최종적으로, 식물의 줄기에서 감소된 사카로스 유동의 결과로서 그 길이가 감소될 수 있는데, 이는 예를 들어 어떤 종류의 사과 등의 경우에 식물의 소형판을 생산하는데 특히 바람직하다.

더욱 바람직한 실시예에서는, 가드 세포(guard cells)에서 당류 운반자의 활성이, 예를 들어 가드 세포에서 당류 운반자를 코딩하는 내생적으로 존재하는 염기서열의 돌연변이 생성에 의하여 공동 억제 효과, RNA 이중 스트랜드 저해, 또는 안티센스 구조의 사용을 통해 억제 또는 감소될 수 있다. 당류 운반 과정을 변형시키는 것에 의해, 그리고 가드 세포 내에서 이들과 관련된 삼투적으로 활성 물질 및 에너지 유용성의 변화에 의해, 기공을 개방 또는 폐쇄하는 능력이 변경, 특히 증가 또는 감소될 수 있다. 더 높은 기공 개방율은 CO₂공급의 증가를 허용하여 광합성율을 개선시킨다. 본 발명이 기공의 개방을 저해 또는 개방 빈도를 감소하도록 사용된다면, 식물의 건조에 대한 저항이 증진될 수 있다. 특히 바람직한 방식에서는, 상기 효과를 달성하기 위하여 벡터가 사용된다. 그리고, 이 벡터에서 사용되는 당류-운반자-코딩 염기서열은, 예를 들어 가드 세포-특이적 프로모터, 예를 들어 KAT1 프로모터에 의하여 제어되는 센스 또는 안티센스 방향으로 존재할 수 있다(Nakamuraet al., Plant Physio.(1995) 109, 371-374).

당류 운반자 SUT4는 싱크 기관에서도 발현되므로, 본 발명은 싱크 세포 또는 기관으로, 또는 바람직하게는 어떤 싱크 세포 또는 기관으로, 더욱 바람직하게는 꽃으로 당류의 입수를 감소시키도록 사용될 수 있다. 이는 다른 합성 경로에서 유용한 탄수화물이 소스 세포 또는 기관에 축적되도록 하는데 사용될 수 있고, 개별적인 싱크 세포의 비교 활성은 다른 싱크 세포에 유리하게 이동될 수 있어, 수율을 질적으로 양적으로 개선시킨다.

본 발명의 특히 바람직한 실시예에서, 상기 방법은 본 발명에서 사용되는 당류 운반자, 바람직하게는 사카로스 운반자에 추가 또는 대신하여 수행될 수 있는데, 특히 SUT4-코딩 염기서열, 추가의 염기서열이 형질전환을 위하여 사용될 수 있다. 이들 추가의 염기서열은 식물의 조직에서 사카로스 농도 및 사카로스 유동과 기능적인 관련을 갖는다.

특히 바람직한 실시예에서, 이들은 SUT1 또는 SUT2를 코딩하는 염기서열, 예를 들어 게놈 또는 cDNA-염기서열이다.

SUT1 게놈 및 cDNA 서열은 예를 들어 WO94/00574 (감자, 시금치), Riesmeieret al., op. cit. (감자), Riesmeieret al.(EMBO J. (1992) 11, 4705-4713 (시금치)), Burkleet al., (Plant Physio.(1998) 118, 59-68 (담배)), Hiroseet al.(Plant Cell Physiol. (1997) 38, 1389-1396 (쌀)), Weig 및 Komor(J. Plant Physiol. (1996) 147, 685-690 (피마자)), Weberet al.(The Plant Cell(1997) 9, 895-908 (Vicia faba)), Shakya 및 Sturm(Plant Physiol. (1998) 118, 1473-1480 (당근)), Tegederet al.(The Plant Journal(1999)Plant J.(1999) 18, 151-161(Pisum sativum)), Noiraudet al.(Poster abstract 11^thInter. Workshop on Plant Membrane Biology, Cambridge, UK (1998) (Apium graveolens)), Picaudet al.(Poster abstract 11^thInter. Workshop on Plant Membrane Biology, Cambridge, UK (1998) (Vitis vinifera)) 및 사탕무우(액세스 번호: X83850)에 개시되는데, 염기서열과 관련하여 SUT의 아미노산 서열 및 이들의 회수는 본 교시의 개시된 내용에 충분히 도입되고, 본 교시와 관련하여 보호된다. 본 발명에 따라 사용되는 SUT1-코딩 염기서열 뿐 아니라 이들로부터 유도되는 아미노산 서열은 서열번호 22 및 23(SEQ ID nos. 22 &23)으로 표시되어 본 발명의 요지로 포함된다. SUT1은 사카로스에 대한 높은 친화성을 갖지만 사카로스에 대한 낮은 운반 능력을 갖는 사카로스 운반자를 나타낸다. 동일한 조직에서-예를 들어 체 요소에서-사카로스에 대해 다른 친화성을 갖는 사카로스 운반자의 공동 억제는 사카로스 유동이 제어되고 식물에서 실제로 존재하는 조건에 맞는 방식으로 조작되도록 허용한다.

본 발명의 특히 바람직한 실시예에서는, 적어도 하나의 식물 세포를 형질전환시키고 SUT2-코딩 염기서열을 포함하는 벡터가 사용된다. 본 발명에 따라, SUT2는 특히 조절자 및 센서로서 기능한다. SUT2는 또한 낮은 친화성 사카로스 운반을 생산하는 생물학적 활성을 갖는다. 이 SUT2의 운반율 또한 낮다. 이론에 제한되지 않고, SUT2는 특히 그 자신의 운반 활성을 결정하고 그것을 통과시킬 수 있는 사카로스 운반자의 조절자(regulator) 및/또는 센서이다. 그 운반 활성은 그의 센서 활성의 기능적 요소로서 볼 수 있고, 다른 한편으로 그의 센서 활성은 그의 운반 활성의 기능적 요소로서 볼 수 있다. 사카로스에 대한 그의 낮은 친화성과 함께 SUT2는, 본 발명에 따라, 기질, 즉 사카로스를 운반할 가능성이 있고 시그널 캐스케이드, 또는 그의 일부를 이용하고, 운반율을 결정하는 유동 센서이다. 사카로스에 대한 SUT2의 친화성은 SUT4의 그것보다 낮다. 본 발명의 특히 바람직한 실시예에서, SUT/SUC 유전자 군의 단백질의 N-말단은 그들의 기질, 특히 사카로스와 관련하여 변형된 친화성을 나타내는 것으로 보인다. 특히, SUT2의 N-말단과 SUT1의 말단도 변형된 사카로스 친화성-SUT2의 경우 사카로스에 대해 더 낮은 친화성, 그리고 SUT1의 경우 더 높은 친화성을 나타낸다.

따라서, 본 발명은 또한 식물에서 사카로스 운반과 사카로스 감지를 변형시키기 위하여, 특히 식물에서 사카로스에 대한 변형된 친화성을 갖는 변형된 사카로스 운반자 및 센서를 제조하기 위하여, 사카로스 운반자, 특히 식물 사카로스 운반자의 N-말단의 사용, 그리고 이를 수용하는 염기서열에도 관련된다.

본 발명은 또한, 특히 식물 도는 식물 세포에서, 특히 SUT4 및/또는 SUT1 활성을 조절하기 위하여, SUT2 및/또는 SUT2-코딩 DNA 서열, 특히 조절자 및 센서로서 SUT2 루프의 사용에도 관련된다. 더우기, 본 발명은 SUT2가 사카로스에 의해 유도될 수 있음을 밝혔다. SUT2는 동일한 세포 타입에, 예를 들어 체 요소에 존재하는 사카로스 운반자의 상대적 활성을 조절한다. SUT2는 특히, 높은 사카로스 친화성을 갖지만 낮은 운반 능력을 갖는 사카로스 운반자 SUT1 및 높은 사카로스 운반 능력을 갖지만 낮은 사카로스 친화성을 갖는 SUT4 사카로스 운반자의 활성을 제어한다. 이러한 제어는 단백질 활성의 발현을 제어하는 것에 의하여, 예를 들어 단백질 변형에 의하거나 mRNA 또는 단백질의 전환율을 제어하는 것에 의해, 활성에 있어서의 증가 또는 감소를 유도함으로써 달성될 수 있다. SUT2는 식물에서, 특히 성숙한 잎의 대형 잎맥, 꽃, 및 싱크 기관에서 발현된다.

따라서, 본 발명은 또한 상기 N-말단 및 중앙 루프(central loop), 각각 SUT/SUC 유전자 군, 특히 SUT1, SUT2 및/또는 SUT4로부터의 단백질의 루프뿐 아니라 이들 영역을 코딩하는 염기서열에도 관련된다. 이들 서열은 바람직한 실시예에서 SEQ ID nos. 24, 25 및 26으로 나타낸다. LeSUT2(Lycopersicon esculentum) 및 StSUT2(Solanum tuberosum)의 N-말단은 단백질의 첫번째 62 아미노산을 포함하고 각각 SEQ ID no. 4(Lycopersicon esculentum) 및 SEQ ID no. 29(Solanum tuberosum)의 염기 1 내지 186에 의하여 코딩된다. LeSUT2의 중앙 루프는 SEQ ID no. 4의 염기 844 내지 1131에 의하여 코딩되고; StSUT2는 SEQ ID no. 29의 염기 847 내지 1134에 의하여 코딩된다.

특히 바람직한 실시예에서, SUT1-, SUT4-, 및/또는 SUT2-코딩 서열은 바람직하게는 벡터에 위치하고 적어도 하나의 조절 요소, 특히 프로모터에 대하여 센스 또는 안티센스 배향으로 위치하고, 예를 들어 상기 프로모터의 바람직한 조직 특이성에 따라 식물 세포에 형질전환 되는데, 여기에서 게놈의 통합성과 산물의 발현에 따라 공동 형질전환 되고/되거나 내생적으로 존재하는 SUT4가 변형된다.

본 발명의 특히 바람직한 실시예에서, 이것은 상기 과정과 관련되는데, 여기에서 벡터는 식물 세포로 형질전환되고 이 벡터는 SUT2-코딩 염기서열을, 바람직하게는 조절 요소, 특히 프로모터의 작동적 제어 하에 센스 또는 안티센스 방향으로포함한다. SUT2-코딩 염기서열을 포함하는 이 벡터는 예를 들어 SUT4- 또는 SUT1-코딩 염기서열을 포함하는 추가의 벡터 없이 형질전환될 수 있다. SUT2-코딩 염기서열의 형질전환, 통합 및 발현은 본 발명의 교시를 근거로 SUT2, 특히 상기 운반자 특성을 갖는 사카로스 농도 센서와 조절자 뿐 아니라 사카로스 유동 센서와 조절자인 것을 유도하고. 형질전환된 식물에서 이 사카로스 운반의, 특히 내생적으로 존재하는 운반자, 특히 SUT4 및/또는 SUT1의 활성의 변형으로 유도한다. 이러한 조절은 전사 또는 전사후 레벨에서, 예를 들어 직접적 단백질 상호작용 또는 간접적으로 형질도입으로 일어날 수 있다.

물론, 본 발명은 또한 식물 세포의 형질전환을 위하여, SUT2-코딩 염기서열 또는 이의 절편, 특히 N-말단 단백질 영역을 코딩하는 염기서열의 용도와도 관련되며, 이에 의해 상기 세포는 SUT1 및/또는 SUT4-코딩 염기서열과 함께 형질전환될 수 있다. 이 경우에도, SUT2의 과도 발현, 공동 억제(cosuppression) 또는 안티센스 억압(repression)은 SUT1 및/또는 SUT4의 활성을 변형, 즉 이들을 증가 또는 감소시킬 수 있다. 본 발명의 특히 바람직한 실시예에서, SUT2-코딩 염기서열의 일부, 특히 N-말단 단백질 영역을 코딩하는 SUT2(SEQ ID no. 24)의 염기서열 또는 중앙, 세포질 루프(cytoplasmatic loop)(SEQ ID no. 26)를 코딩하는 염기서열은, 사카로스 운반자의 생물학적 활성을 갖는 단백질을 코딩하고, 예를 들어 중앙 영역과 C-말단에, 예를 들어 N-말단으로서 SUT2-코딩 염기서열, 다른 사카로스 운반자, 예를 들어 SUT1 또는 SUT4의 염기서열을 갖는 키메릭 유전자 구조와 관련하여 사용될 수 있다. SUT1 또는 이의 일부를 포함하는 이러한 SUT2 염기서열은 본 발명에서 변형된 SUT2 염기서열로서 확인될 수도 있다.

조절자로서, SUT2는 다른 단백질, 특히 조절자(regulator), 신호 변환 인자, 및 다른 사카로스 운반자와 상호작용한다. 따라서, SUT2가 사용될 때, 추가의 조절자가 상호작용 클로닝을 통하여 확인될 수 있다. 보호는 또한 이들 추가의 조절자에도 요구된다.

본 발명은 또한 바람직하게는 분리 및 정제된 조절 단백질 및 센서 단백질 뿐 아니라 이들 단백질을 코딩하는 염기서열과도 관련되는데, 이들은 SUT2의 중앙 세포질 루프, 특히 다른 사카로스 운반자로부터의 N- 및 C-말단 영역을 갖는 키메릭 단백질 및 핵산, 이를 코딩하는 각 염기서열을 포함하며, 여기에서 상기 키메릭 단백질과 핵산은 각각 SUT2의 중앙 루프를 포함한다. 중앙 세포질 루프는 조절 요소 및/또는 센서 및/또는 신호 변환자로서 생물학적 활성을 갖는다.

바람직한 실시예에서, 본 발명은 개선된 형질전환 식물을 생산하고 변형을 달성하기 위하여, 공지의 또는 변형된 SUT4-, SUT1-, 및/또는 SUT2-코딩 염기서열에 비하여 사카로스에 대한 낮은 친화성을 갖지만 사카로스에 대한 높은 운반 능력을 갖는 사카로스 운반자의 활성을 변형시키기 위한 상기 방법과 관련된다.

따라서, 바람직한 실시예에서 본 발명은 또한 상기 사카로스 운반자의 변형된 활성을 갖고, 또한 게놈 내에서 안정된 방식으로 통합된 변형된 SUT1, SUT2 및/또는 SUT4 염기서열을 포함하는 형질전환된 변형된 식물을 제조하는 방법에도 관련된다. 본 발명은 또한 상기 사카로스 운반자의 변형된 활성을 특징으로 하고, 염기서열, 특히 SUT 및 SUC 유전자와 같은 당류 운반자, 바람직하게는 SUT1; SUT2;SUT4; SUT1 및 SUT2; SUT1 및 SUT4; SUT2 및 SUT4; SUT1 및 SUT2, 및 SUT4에 대한 유전자를 포함하는 그룹으로부터 선택된 상기 염기서열의 적어도 하나를 포함하는 방식으로 생산된 식물 및 기관의 일부, 기관, 식물 세포, 형질전환 식물에도 관련된다. 본 발명과 관련하여, 변형된 염기서열은 야생형 서열, 특히 야생형 유전자로부터 편향된 염기서열을 의미하는 것으로 이해되며, 여기에서 편향(deviation)은 예를 들어 염기 삽입, 역전, 결실, 치환, 부가, 또는 유사한 과정에 의한 것이다. 예를 들어, 변형된 염기서열은 또한 야생형으로부터의 코딩 염기서열을 포함하는 이들 유전자도 나타내는데, 여기에서 상기 코딩 염기서열은 예를 들어 조직-특이적 또는 구조성 발현 프로모터인 이종 프로모터와 센스 또는 안티센스 방향으로 작동적으로 연결된다. 본 발명과 관련하여, 변형된 염기서열은 또한 야생형 서열과 정확히 일치할 경우에도 존재할 수 있다. 그러나, 이는 비록 추가적인 수의 복제와 함께 및/또는 유전자의 다른 장소이기는 하지만, 자연적으로 생겨나는 서열로서 존재한다.

변형된 염기서열은 또한 내생적인 형태로 자연적으로 생겨나는 염기서열이 돌연변이 유도, 예를 들어 트랜스포존(transposon) 돌연변이 유도에 의해 변형될 때에도 존재한다. 본 발명과 관련하여, 변형된 유전자는 그의 조절 및/또는 단백질 코딩 영역의 염기서열에서 야생형 서열에 대한 편향, 예를 들어 삽입, 부가, 결실, 치환 등을 포함하고, 따라서 돌연변이체, 유도체, 또는 기능적 동등체로서 언급될 수 있는 이들 염기서열을 의미하는 것으로 이해된다. 변형된 염기서열 및 변형된 유전자는 각각 키메릭 염기서열 또는 유전자, 예를 들어 자연적으로 함께 일어나지않는 두 개 이상의 염기서열을 포함하는 이러한 단백질-코딩 영역으로, 예를 들어 N-말단 염기서열로서 SUT2-코딩 서열(SEQ ID no. 24)을 갖는 구조 및 중앙 및 3'-말단 영역으로서 SUT1-코딩 서열을 갖는 구조일 수 있다. 본 발명과 관련하여, 변형된 유전자는 5'-코딩 영역으로서 SUT1 유전자(예를 들어 SEQ ID no. 25)의 서열을 포함하고 중심 범위 및/또는 3'-영역으로서 SUT2 유전자의 서열을 포함하는 것을 의미하는 것으로 이해된다.

따라서, 변형된 유전자는 예를 들어 야생형 코딩 서열 및 다른 유기체 또는 다른 유전자로부터의 이종 프로모터를 포함할 수 있다.

본 발명과 관련하여, 유전자는 적어도 하나의 조절 요소의 작동적 제어 하에 있는 단백질-코딩 염기서열을 의미하는 것으로 이해된다.

본 발명은 또한 사카로스 운반을 변형시기는 수단과도 관련된다. 이들 수단은 다음을 포함하는 그룹으로부터 선택되는, 낮은 당류 친화성 및 당류에 대한 높은 운반 능력을 갖는 당류, 특히 사카로스 운반자를 코딩하는 핵산 분자 또는 이의 일부이다:

a) 서열번호 1, 2, 또는 27로 나타내는 염기서열, 이의 일부, 또는 이의 상보적 스트랜드를 포함하는 핵산 분자,

b) 서열번호 5, 6, 또는 28로 나타내는 아미노산서열을 갖는 단백질을 코딩하는 핵산 분자, 그리고

c) a) 및 b)에서 인용된 핵산 분자의 하나와 융합하는(hybridize) 핵산 분자.

특히 바람직한 실시예에서, 당류 운반자는, 예를 들어 아라비돕시스 (Arabidopsis thaliana, At), 토마토(Lycopersicon esculentum, Le), 또는 감자 (Solanum tuberosum, St)로부터의 사카로스 운반자, 특히 SUT4이다. 상기 핵산 분자는 또한 SUT4-코딩 서열로서 특징지어진다.

본 발명은 또한 다음을 포함하는 그룹으로부터 선택되는, 식물에서 사카로스 운반을 위한 센서 및/또는 조절자를 코딩하고, 낮은 운반율을 갖는 저-친화성 사카로스 운반자의 특성을 갖는 핵산 분자 또는 이의 일부이다:

a) 서열번호 3, 4, 24, 26, 또는 29로 나타내는 염기서열, 이의 일부, 또는 이의 상보적 스트랜드를 포함하는 핵산 분자,

b) 서열번호 7, 8, 또는 30으로 나타내는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩하는 핵산 분자, 그리고

c) a) 및 b)에서 열거된 핵산 분자의 하나와 융합하는(hybridize) 핵산 분자.

특히 바람직한 실시예에서, 당류 센서 및/또는 당류 조절자는 예를 들어 감자, 토마토, 또는 아라비돕시스 식물로수터의 사카로스 센서 및/또는 조절자, 특히 SUT2이다.

본 발명의 핵산 분자, 또는 본 발명에 따라 사용되는 것은 자연 원료(source), 예를 들어 감자 식물로부터 분리 및 정제되거나, 또는 공지의 방법을 사용하여 합성될 수 있다. 본 발명의 핵산 분자에 또는 본 발명에 따라 사용된 이미 알려진 핵산 분자로 여러 가지 돌연변이를 삽입하여 변형된 생물학적 특성을가질 수 있고 본 발명의 요지에 포함될 수도 있는 단백질의 합성을 야기하기 위해 공지의 분자 생물학적 기술이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 돌연변이는 또한 단축된 단백질을 생성하는 모든 결실 돌연변이와도 관련된다. 예를 들어, 활성의 변형 및 단백질의 조절은 삽입, 중복, 치환, 유전자 융합, 핵산 변경과 같은 다른 분자 메카니즘에 의하여, 또는 다른 균주의 미생물과 다른 수단 사이의 유전자 전달을 통해서도 달성될 수 있다. 이러한 방법에서, 돌연변이 단백질은, 예를 들어 다른 운반 능력 또는 다른 사카로스 친화성을 갖도록, 그리고/또는 세포에 정상적으로 존재하는 조절 메카니즘에 더이상 지배되지 않거나 상기 메카니즘에 다른 방식으로 지배되도록 생산될 수 있다. 추가적으로, 본 발명에 따른 돌연변이 단백질은 변형된 안전성, 기질 특이성, 또는 변형된 효과기 패턴(또는 변형된 활성, 온도, pH, 및/또는 농도 프로필)을 갖도록 제조될 수 있다. 또한, 본 발명의 교시는 변형된 활성 단백질 농도, 전사 전- 및 전사 후-변형을 갖는 단백질, 예를 들어 신호 및/또는 운반 펩티드, 및/또는 다른 관능기에 적용된다.

본 발명은 또한 상기 본 발명의 핵산 분자와 융합하는 핵산 분자와도 관련된다. 본 발명과 관련하여, 융합(hybridization)은 Sambrooket al.(Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed., 1989)에 기술된 것과 같은 통상의 융합 조건 하의, 바람직하게는 엄격한 조건 하의 융합을 의미한다. 본 발명에서, 융합이란 용어는 2×SSC 및 0.1 % SDS로 52 ℃, 바람직하게는 60 ℃, 더욱 바람직하게는 65 ℃에서 15 분 동안, 바람직하게는 0.5×SSC 및 0.1 % SDS로 52 ℃, 바람직하게는 60 ℃, 더욱 바람직하게는 65 ℃에서 15 분 동안 세척 후 포지티브 융합 신호가 관찰될 경우에 사용된다. 이러한 세척 조건 하에서 서열목록에 언급된 염기서열의 하나와 융합하는 염기서열은 본 발명의 염기서열이다.

이러한 핵산 분자의 확인 및 분리는 본 발명의 핵산 분자나 이들 분자의 일부, 또는 상보적 스트랜드를 사용하여 수행될 수 있다. SEQ ID nos. 1, 2, 3, 또는 4에 나타낸 염기서열을 갖거나 이들 서열에 본질적으로 일치하거나, 또는 이들 서열의 일부를 갖는 핵산 분자가 예를 들어 융합 샘플로서 사용될 수 있다. 융합 샘플로서 절편(fragments)이 사용될 때, 이러한 절편은 통상의 합성 기술의 도움으로 제조된, 그 서열이 본 발명의 핵산 분자의 그것과 본질적으로 일치하는 합성 절편일 수 있다. 본 발명의 핵산 분자와 융합하는 분자는 또한 본 발명의 단백질을 코딩하는 상기 언급된 핵산 분자의 절편, 유도체, 및 대립형질 이형을 포함한다. "절편"이라는 용어는 상기 단백질을 코딩하는데 충분히 긴 핵산 분자의 일부를 의미하는 것으로 이해된다. 본 발명과 관련하여 사용될 때 "유도체"의 표현은 분자의 서열이 기술된 핵산 분자로부터의 서열과 하나 이상의 위치에서 다르지만 이들 서열과 높은 정도의 상동성(homology)을 갖는 것을 의미한다. 상동성은 핵산 레벨에서 적어도 70 %의 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 75 %의 동일성, 더욱 바람직하게는 80 % 보다 큰 것, 그리고 훨씬 더 바람직하게는 90 % 이상, 95 %, 97 %, 또는 99 %인 것을 의미한다. 이들 핵산 분자에 의하여 코딩되는 단백질은 아미노산 레벨 상에서 SEQ ID nos. 5, 6, 7, 또는 8에 주어진 아미노산 서열과 적어도 80 %, 바람직하게는 85 %, 그리고 더욱 바람직하게는 90 % 이상, 95 %, 97 %, 및 99 %의 서열동일성을 갖는다. 상기 기술된 핵산 분자로부터의 편향은, 예를 들어 결실, 치환, 삽입, 또는 재조합으로부터 야기될 수 있다. 이들 변형은, 예를 들어 다른 유기체 또는 돌연변이로부터의 서열로부터 자연적으로 일어날 수 있으며, 상기 돌연변이는 자연적 수단을 통하거나, 또는 조직적 돌연변이 유도(UV 또는 X-선 조사, 화학약품 등)을 통하여 일어날 수 있다. 또한, 이 변형은 합성적으로 생산된 서열을 포함할 수 있다.

대립형질 변이는 합성적으로 제조된 변이 또는 재조합 DNA 기술에 의하여 생산된 변이 뿐 아니라 자연적으로 존재하는 변이일 수 있다. 본 발명의 핵산 분자의 여러 가지 변이에 의하여 코딩되는 단백질은 활성, 활성 단백질 농도, 번역후 변형, 기능적 그룹, 분자량, 면역 반응성, 형태와 같은 어떤 공유된 특성 및/또는 겔 전기영동에서의 이동, 크로마토그래피에서의 행동, 침강계수, 용해성, 분광학적 특성, 안정성, 최적 pH, 등전점 pH, 최적 온도 및/또는 다른 것들과 같은 물리적 특성을 갖는다.

본 발명의 핵산 분자는 DNA 및 RNA 분자일 수 있다. 본 발명의 DNA 분자는 예를 들어 게놈 DNA 또는 cDNA 분자이다.

본 발명은 또한 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 벡터와도 관련된다.

본 발명과 관련하여, 벡터는 예를 들어 플라스미드, 리포좀, 코스미드 (cosmids), 바이러스, 박테리오파지, 셔틀 벡터, 및 유전자 기술에서 통상적으로 사용되는 다른 벡터일 수 있다. 벡터는 숙주 유기체에서 벡터의 안정화 및/또는 복제를 야기하거나 복제에 기여하는 추가의 기능적 유닛을 갖는다.

본 발명의 바람직한 실시예는 또한 벡터를 포함하는데, 여기에서 상기 벡터에 포함된 핵산 분자는 원핵 및/또는 진핵 세포에서 번역 가능한 핵산 분자의 전사 및 합성을 생산하는 적어도 하나의 조절 요소에 작동적으로 부착된다. 이러한 조절 요소는 프로모터, 인핸서, 오퍼레이터 및/또는 전사 종결 신호일 수 있다. 언급할 필요도 없이, 벡터는 항생물질 저항 유전자, 제초제 저항 유전자, 따라서 예를 들어 선택 표지를 포함할 수도 있다.

바람직한 실시예에서 본 발명은 또한 상기 벡터와도 관련되는데, 여기에서 상기 벡터는 적어도 하나의 조절 요소의 제어 하에 있고 본 발명에 따라 SUT4 및/또는 SUT2를 코딩하는 핵산 서열 뿐 아니라 SUT1을 코딩하고 또한 적어도 하나의 조절 요소의 제어 하에 있는 핵산 서열을 포함한다. 따라서 이러한 벡터는 운반자 사카로스에 포함된 적어도 두 개의 단백질에 대한 유전적 정보를 갖는다. 이러한 벡터는 식물에서 사카로스 운반이 제어되고 광범위한 방식으로 용이하게 변형되도록 허용한다.

본 발명은 또한 본 발명의 핵산 분자의 하나 또는 본 발명의 벡터의 하나를 안정적인 방식으로 통합하거나, 또는 상기 분자 또는 벡터를 일시적인 방식으로 포함하거나, 또는 이들로 형질전환되고 바람직하게는 SUT4를, 그리고 임의로 SUT1 및/또는 SUT2를 발현할 수 있는 숙주 세포와도 관련된다. 본 발명은 또한 본 발명의 핵산 분자 또는 본 발명의 벡터로 형질전환된 숙주 세포로부터 유전된 숙주 세포와도 관련된다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 핵산 분자 또는 본 발명의 벡터를 포함하는 숙주 세포와 관련되는데, 여기에서 숙주 세포는 생체 외에서 재조합 핵산분자를 받아들일 수 있고, 임의로 본 발명의 핵산 분자에 의하여 코딩되는 단백질을 합성할 수 있는 유기체를 의미하는 것으로 이해된다. 바람직하게는, 이들 세포는 원핵 또는 진핵 세포이다. 무엇보다도, 본 발명은 본 발명의 벡터, 벡터의 일부 또는 유도체를 포함하고 상기 벡터, 벡터의 일부 또는 유도체가 사카로스 운반 활성을 갖는 단백질을 합성하도록 허용하는 미생물과 관련된다. 본 발명의 숙주 세포는 또한 본 발명에 따라 도입된 핵산 분자가 형질전환된 세포에 대하여 이원적-이는 자연적으로 세포 내에 존재하지 않는 것을 의미한다-이거나, 또는 게놈 내에서 대응하는 자연적으로 존재하는 서열과 다른 복제 수 또는 다른 영역에 위치한다는 사실을 특징으로 할 수도 있다.

본 발명의 한 실시예에서, 이 숙주 세포는 원핵 세포, 바람직하게는 그람 음성 원핵 세포, 더욱 바람직하게는 장내세균(enterobacteria) 세포이다. 원핵 세포의 외원성 핵산 서열의 형질전환은 분자생물학의 본 분야에서 숙련된 당업자에게 익숙한 것이다.

그러나, 본 발명의 다른 실시예에서, 본 발명의 세포는 식물 세포, 진균 세포, 예를 들어 효모, 또는 동물 세포와 같은 진핵 세포일 수도 있다. 외원성 핵산 서열로 진핵 세포를 형질전환, 및 형질감염시키는 방법은 분자생물학의 본 분야에서 숙련된 당업자에게 익숙한 것이다.

본 발명은 또한 본 발명의 적어도 하나의 숙주 세포를 갖는 세포 배양물 (cell cultures) 또는 유합 조직(callus tissue)과도 관련되는데, 여기에서 본 발명의 세포 배양물 또는 유합 조직은 특히 사카로스 운반 활성을 갖는 단백질을 생산할 수 있다.

본 발명의 한 실시예에서, 본 발명에 따라 사용되는 핵산 서열은 단백질을 다른 세포 구획 또는 원형질막으로 운반하기 위한 기능적 신호 서열을 코딩하는 핵산 분자와 벡터 내에서 연결된다. 이 변형은 예를 들어 더 높은 레벨의 식물로부터의 N-말단 서열의 부가로 구성될 수 있지만, 서열이 코딩되는 단백질과 융합하도록 하는 다른 변형도 본 발명의 주제에 포함된다.

본 발명의 핵산 분자의 원핵 세포 내, 예를 들어 대장균(Escherichia coli) 내, 또는 진핵 세포, 예를 들어 효모 내에서의 발현은, 예를 들어 보다 정확한 방식으로 이 분자에 의해 코딩되는 단백질의 활성을 특징화하는 것이 가능하다는 것이 흥미롭다.

본 발명의 또 다른 실시예는 바람직하게는 본 발명의 염기서열에 의하여 코딩되는 바람직하게는 정제되고 분리된 펩티드 또는 단백질로서, 바람직하게는 SEQ ID nos. 5 내지 8, 23 내지 26, 28 또는 30의 아미노산 서열을 갖고, 바람직하게는 사카로스 운반자의 활성을 갖는, 바람직하게는 사카로스에 대한 낮은 친화성과 사카로스에 대한 높은 운반 능력을 갖는, 그리고 각각 사카로스의 운반 및 이들의 제조를 위한 센서 또는 조절자의 활성을 갖는 사카로스 운반자를 포함하는데, 여기에서 본 발명의 숙주 세포는 합성된 단백질을 허용하는 조건 하에서 배양되고 이 단백질은 배양된 세포 및/또는 배양 배지로부터 분리된다.

본 발명은 또한 이들 단백질과 특이적으로 반응하는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체와 관련된다.

본 발명의 핵산 분자를 제조하는 것에 의하여, 유전공학적 방법의 도움을 받아 어떠한 주어진 식물의 조직에서 통상적인 방법으로는 식물에서 가능하지 않은 방법-예를 들어 번식에 의하여-으로 사카로스 운반을 변형시키고, 또한 식물의 어떤 조직에서 사카로스 농도를 선택적으로 변화시키는데 사용될 수 있는 방식으로 운반을 변형시키는 것이 가능하다. 본 발명의 단백질의 활성을 증가시키는 것에 의하여, 예를 들어 적절한 핵산 분자의 과도발현에 의하여, 또는 세포의 자체적인 조절 메카니즘에 의하여 더 이상 제어되지 않고/않거나 이들의 활성에 대하여 다른 온도 의존성을 갖는 변이체를 제공하는 것에 의하여, 유전공학을 통해 이러한 방식으로 변형된 식물에서 수율을 증가시키는 것이 가능하다. 따라서, 본 발명에 따라 사용되는 핵산 분자는 대응하는 사카로스 운반자의 활성을 증가시키기 위하여 식물에서 발현될 수 있고, 또는 정상적으로 이 단백질을 발현하지 않는 세포에서 이들을 발현시키는 것이 가능하다. 또한, 더이상 세포의 자체적인 조절 메카니즘에 지배되지 않거나, 또는 변형된 온도 의존성 또는 기질/산물 특이성을 갖는 본 발명의 단백질을 얻기 위하여 본 분야의 숙련된 당업자에게 알려진 방법을 사용하여, 본 발명에 따라 사용되는 핵산 분자를 변형시키는 것이 가능하다. 본 발명은 또한 합성된 단백질이 식물 세포의 원형질막 내에 또는 어떠한 구획 내에 국소화되는 것을 허용한다. 특이적 구획 또는 원형질막 내의 국소화를 달성하기 위하여, 코딩되는 영역은 대응하는 구획 또는 원형질막 내에서 국소화를 달성하는 DNA 서열과 연결될 필요가 있다. 이러한 서열은 공지이다(예를 들어 Braunet al., EMBO J.(1992) 11, 3219-3227; Wolteret al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1988) 85, 846-850;Sonnewaldet al., Plant S.(1991) 1, 95-106 참조).

따라서, 본 발명은 또한 본 발명의 하나 이상의 핵산 분자(들) 또는 본 발명에 따라 사용되는 핵산 분자(들)로 형질전환된 형질전환 식물 세포 뿐 아니라, 이러한 형질전환된 세포로부터 유전된 형질전환 식물 세포와도 관련된다. 이들 세포는 본 발명의 핵산 분자(들) 또는 본 발명에 따라 사용되는 핵산 분자(들)의 하나 이상을 포함하는데, 여기에서 상기 분자(들)은 바람직하게는 식물 세포에서 전사를 생산하는 조절 DNA 요소와, 특히 프로모터와 함께 연결된다. 본 발명은 또한 게놈이 SUT 및/또는 SUC 유전자를 포함하는 군으로부터의 적어도 두 개의 안정적으로 통합된 변형된 유전자를 포함하는 형질전환 식물 세포와도 관련된다. 이들 세포는 상기 세포에 자연적으로 존재하지 않는 본 발명에 따라 사용되는 핵산 분자 또는 본 발명의 핵산 분자의 적어도 하나를 포함한다는 점에서, 또는 상기 분자가, 자연에 정상적으로 존재하는 것과 다른 게놈 환경 또는 다른 복제 수로, 자연에 정상적으로 존재하지 않는 세포의 게놈 내 어떤 위치에서 통합된다는 점에서, 자연적으로 존재하는 식물 세포와 다르다. 형질전환 식물 세포는 본 분야에 숙련된 당업자에게 익숙한 기술을 사용하여 전체 식물을 생산하도록 재생될 수 있다. 본 발명의 형질전환 식물 세포의 재생을 통하여 얻어진 식물은 또한 본 발명의 범위에 포함된다. 본 발명은 또한 본 발명에 따라 사용되는 벡터 시스템 또는 유도체 또는 그의 절편을 포함하는, 적어도 하나의 세포, 그러나 바람직하게는 복수의 세포를 포함하는 식물과도 관련되고, 상기 벡터 시스템의 포함에 근거하여, 벡터 시스템의 일부 또는 유도체는 변형된 사카로스 운반 활성, 특히 SUT4 활성을 야기하는 단백질을 합성할 수 있다. 따라서, 본 발명은 여러 가지 종류(types), 속(genera), 과(families), 목(orders), 및 강(classes)의 식물이 상기 특징을 갖게 생산되도록 허용한다. 형질전환 식물은 이론적으로 어떠한 주어진 식물 종 - 즉, 단자엽 뿐 아니라 쌍자엽 식물, 예를 들어 그라미나에(graminae), 피니다에(pinidae), 마그놀리이다에(magnoliidae), 라눈쿨리다에(ranunculidae), 카리오필리다에 (caryophyllidae), 로지다에(rosidae), 아스테리다에(asteridae), 아리다에 (aridae), 릴리이다에(liliidae), 아레키다에(arecidae) 및 코멜리니다에 (commellinidae)와 나자식물(gymnosperms), 조류(algae), 이끼(mosses), 양치류(ferns), 또는 유합 조직, 식물 세포 배양물 등과 이의 단편, 기관, 조직, 수확 또는 번식 재료일 수 있다. 바람직하게는, 식물은 농업 식물, 특히 밀, 보리, 쌀, 옥수수, 구근(topinambur), 사탕수수, 사탕무우, 또는 감자와 같은 전분-합성 또는 전분-저장 식물이다. 그러나, 본 발명은 또한 토마토, 아라비돕시스 (arabidopsis), 완두콩, 평지(rapeseed), 해바라기, 담배, 호밀, 귀리, 카사아버 (manioc), 양상추(lettuce), 시금치, 포도, 사과, 커피, 차, 바나나, 코코넛, 야자, 콩, 소나무, 포플라, 유칼립투스 등과 같은 다른 식물과도 관련된다. 본 발명은 또한 본 발명의 식물로부터의 번식 물질 및 수확 산물, 특히 꽃, 열매, 종자, 구근, 뿌리, 잎, 주근(taproots), 눈(sprouts), 지맥(shoots) 등과도 관련된다.

본 발명의 핵산 분자 또는 본 발명에 따라 사용되는 핵산 분자를, 예를 들어 식물에서 센스 또는 안티센스 방향에서 발현시키기 위하여, 상기 분자는 식물에서 전사를 달성하는 조절 DNA 요소와 연결된다. 이들 요소는 특히 프로모터를 포함한다. 일반적으로, 예를 들어 구조적으로 발현시키거나, 또는 식물의 발생에서 어떤 시기에, 또는 외부 인자에 의하여 결정된 시기에 어떤 조직에서만 발현시키는 프로모터와 같이, 식물에서 활성인 어떠한 프로모터라도 SUT1-, SUT2-, 및/또는 SUT4-코딩 염기서열을 발현시키는데 사용될 수 있다. 식물과 관련하여, 프로모터는 상동성(homologous) 또는 이형성(heterologous)일 수 있다. 사용될 수 있는 프로모터 중에서는, 예를 들어 컬리플라워 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus; CaMV)의 35S RNA의 프로모터 및 옥수수로부터의 우비퀴틴 프로모터가 구조적 발현을 위하여 존재하고; 특히 바람직한 것은 파타틴 유전자 프로모터 B33(Rocha-Sosaet al., op. cit.)이 감자에서 근경-특이적 발현을 위하여, 또는 광합성에서 활성이 있는 조직에서만 발현이 일어남을 확인하는 프로모터, 예를 들어 ST-LS1-프로모터(Stockhauset al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1987) 84, 7943-7947; Stockhauset al., EMBO J.(1989) 8, 2445-2451) 또는 배유-특이적 발현을 위한 것으로, 밀로부터의 HMG 프로모터, USP 프로모터, 파세올린(phaseolin) 프로모터, 또는 옥수수로부터의 제인 유전자 프로모터가 존재한다. 종결 서열 또한 벡터에 존재할 수 있다. 이 서열은 전사를 정확하게 종결시키기 위하여 사용된다. 폴리-A 꼬리가 그것을 안정화시키기 위하여 전사에 추가될 수 있다. 이러한 요소는 문헌(Gielenet al., EMBO J.(1989) 8, 23-29)에 기술되어 있고 완전히 상호교환 가능하다. 추가의 프로모터는 위에 기술되어 있다.

외원성 유전자를 더 높은 레벨의 식물로 삽입하기 위하여 많은 수의 클로닝 벡터가 사용된다. 이들 벡터는 대장균(E. coli)를 위한 복제 신호 및 형질전환된박테리아 세포를 선택하기 위한 표지 유전자를 포함한다. 이러한 벡터의 예로는 pBR322, pUC 시리즈, M13mp 시리즈, pACYC181 등이 있다. 요망되는 서열은 벡터 내 적절한 제한 절단 위치에 도입될 수 있다. 생성된 플라스미드는 예를 들어 E. coli 세포의 형질전환을 위하여 사용된다. 형질전환된 E. coli 세포는 적절한 매질 내에서 배양되고, 다음에 수확 및 용해된다. 플라스미드가 회수된다. 얻어지는 플라스미드 DNA를 특성화하기 위하여 일반적으로 사용되는 분석 방법은 제한절단 분석, 겔 전기영동, 및 다른 생화학적/분자-생물학적 방법이 있다. 각 조작 후에, 플라스미드 DNA는 용해될 수 있고 생성된 DNA 절편은 다른 DNA 서열과 조합될 수 있다. 각 플라스미드 DNA 서열은 동일 또는 다른 플라스미드로 클로닝될 수 있다. 이 DNA를 식물 숙주 세포로 도입하기 위하여 다양한 기술이 사용된다. 이들 기술은 형질전환 벡터로서 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 또는 아그로박테리움 리조게네스(Agrobacterium rhizogenes)를 사용하여 T-DNA를 식물 세포로 형질전환, 프로토플라스트의 융합, DNA의 주입 및 일렉트로포레이션, 그리고 추가적 방법 및 생물학적 방법을 사용하여 DNA를 도입하는 것을 포함한다. 식물 세포에 DNA를 주입 및 일렉트로포레이션하는 경우, 기본적으로는 사용된 플라스미드에 어떠한 특정 요구사항도 적용되지 않는다. pUC 유도체와 같은 간단한 플라스미드가 사용될 수 있다. 그러나, 전체 식물이 이와 같은 방식으로 형질전환된 세포로부터 재생되려면, 선택적 표지가 존재하여야 한다.

SUT1-, SUT2-, 및/또는 SUT4-코딩 염기서열을 식물 세포로 삽입하는데 사용되는 방법에 따라, 추가의 DNA 서열이 필요할 수도 있다. 예를 들어, 식물 세포의형질전환을 위해 Ti- 또는 Ri-플라스미드가 사용된다면, Ti- 및 Ri-플라스미드-T-DNA의 적어도 우측 경계 서열, 그러나 종종 우측 및 좌측 경계 서열도 도입되는 유전자에 측부 영역으로서 부착되어야 한다. 아그로박테리아가 형질전환에 사용되면, 도입될 DNA는 특정 플라스미드로, 중개(intermediary) 벡터나 또는 바이너리 (binary) 벡터로 클로닝되어야 한다. T-DNA의 서열과 상동성이 있는 서열에 근거하여, 중간 벡터는 상동성 재조합에 의하여 아그로박테리아의 Ti- 또는 Ri-플라스미드로 통합될 수 있다. 이 플라스미드는 또한 T-DNA의 전이를 위해 필요한 vir 영역을 포함한다. 중개 벡터는 아그로박테리아에서 복제될 수 없다. 헬퍼(helper) 플라스미드는 중개 벡터를 Agrobacterium tumefaciens로 전이시키는데 사용될 수 있다. 바이너리 벡터는 E.coli 뿐 아니라 아그로박테리아에서 복제할 수 있다. 이들은 우측 및 좌측 T-DNA 경계 영역에 의해 구조되는 선택 표지 유전자 및 링커 또는 폴리링커를 포함한다. 이들은 아그로박테리아로 직접 형질전환될 수 있다(Holsterset al., Mol. Gen. Genet.(1978) 163, 181-187). 숙주 세포로서 작용하는 아그로박테리움은 vir 영역을 갖는 플라스미드를 포함한다. 추가의 T-DNA도 존재할 수 있다. 이러한 방식으로 형질전환된 아그로박테리움은 식물 세포를 형질전환하는데 사용된다. 식물 세포의 형질전환을 위한 T-DNA의 사용은 EP-A-120 516; Hoekema: The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters. B.V., Alblasserdam (1985), Chapter V, Fraleyet al., Crit. Rev. Plant. Sci., 4, 1-46, 및 Anet al. EMBO J.(1985) 4, 277-287에 기술되어 있다. 식물 엑스플랜트(explants)는 DNA를 식물 세포로 전이하도록 Agrobacterium tumefaciens 또는 Agrobacteriumrhizogenes와 함께 공동-배양될 수 있다. 형질전환된 세포를 선택하기 위해 항생물질 또는 살생물제를 포함하는 적절한 배지에서, 감염된 식물 물질, 예를 들어 잎의 조각, 줄기 단편, 뿌리 및 원형질체나 현탁-배양된 식물 세포로부터 전체 식물이 다시 재생될 수 있다. 이러한 방식으로 얻어진 식물은 다음에 도입되는 DNA의 존재를 위해 분석될 수 있다. 바이올리스틱 방법 또는 원형질체 형질전환을 이용하여 외원성 DNA를 도입하기 위한 다른 방법은 공지이다(Willmitzer, L., 1993 Transgenic plants, In: Biotechnology, A Multi-Volume Comprehensive Treatise(H. J. Rehm, G. Reed, A. Puhler, P. Stadler, eds.), vol. 2, 627-659, VCH Weinheim: New York, Basel, Cambridge). 단자엽 식물을 형질전환하기 위한 다른 시스템으로는 원형질체에서 전기적 또는 화학적으로 도입되는 DNA의 회수, 부분적으로 투과된 세포의 일렉트로포레이션, 개화(inflorescences) 시 DNA의 마크로인젝션, 마이크로스포어 및 프로-엠브리오에서 DNA의 마이크로인젝션, 꽃가루 발아에 의한 DNA의 회수 및 팽윤(swelling)에 의한 배에서의 DNA의 회수가 있다(Potrykus,Physiol. Plant(1990), 269-273). Agrobacterium tumefaciens의 도움으로 Ti-플라스미드 벡터 시스템을 이용한 쌍자엽 식물의 형질전환이 확립된 기술인 반면, 최근의 연구에서는 단자엽 식물도 아그로박테리움-베이스의 벡터를 사용하여 형질전환될 수 있음을 제시하고 있다(Chanet al., Plant Mol. Biol.(1993) 22, 491-506; Hieiet al., Plant J.(1994) 6, 271-282; Bytebieret al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA(1987) 84, 5345-5349; Raineriet al., Bio/Technology(1990) 8, 33-38; Gouldet al.,Plant. Physiol.(1991) 95, 426-434; Mooneyet al., Plant,Cell Tiss. & Org. Cult.(1991) 25, 209-218; Liet al., Plant Mol. Biol.(1992) 20, 1037-1048). 몇 가지 인용된 형질전환 시스템은 여러 가지 곡식에서 확립되었다: 조직의 일렉트로포레이션, 프로토플라스트의 형질전환, 및 입자의 폭격을 통하여 재생가능한 조직 및 세포로 DNA의 전이(Jahneet al., Euphytica85 (1995), 35-44). 밀의 형질전환은 문헌(Maheshwariet al., Critical Reviews in Plant Science(1995) 14(2), 149-178)에 기술되어 있고, 옥수수는 Brettschneideret al.(Theor. Appl. Genet.(1997) 94, 737-748) 및 Ishidaet al.(Nature Biotechnology(1996) 14, 745-750)에 기술되어 있다.

본 발명은 또한 사카로스 대사의 조절기(modulators), 바람직하게는 잠재적 살충제 및 제초제를 위한 확인 및/또는 스크리닝 과정과도 관련되는데, 여기에서 SUT4- 및/또는 SUT2-발현 세포 또는 조직, 특히 본 발명의 숙주 세포 또는 식물, 예를 들어 본 발명의 식물 또는 효모는 시험되는 잠재적 조절기, 예를 들어 살충제 또는 제초제와 접촉하게 되고, SUT1, SUT2, 및/또는 SUT4의 활성에 대한 그 효과, 특히 잠재적 조절기, 예를 들어 살충제 또는 제초제의 저해 효과가 정량적 또는 정성적으로 측정된다. 유사하게, SUT2 및/또는 SUT4는 살충제의 개선된 동원 (mobilization)을 허용하는 시스템을 개발하도록 사용될 수 있다. 저해제는 효모의 성장을 특이적으로 차단, SUT4와 같은 낮은 친화성 사카로스 운반자를 발현, 또는 예를 들어 SUT4 및 SUT2 또는 SUT2 및 SUT1 또는 SUT4 및 SUT1과 같은 다른 사카로스 운반자의 조합을 공동-발현하는 물질을 위한 체계적 스크리닝 화학 라이브러리에 의하여 확인될 수 있다. 이들 저해제는 제초제로서, 또한 새로운 제초제의 전구체로서 사용될 수 있다. 시험에 근거하여, 이들 운반자에 의하여 식물에서 동원될 수 있고 이 방식으로 그들의 표적 위치에 더 효과적으로 도달할 수 있는 잠재적 살충제가 또한 확인될 수 있다.

본 발명은 또한 키메라플라스티(chimeraplasty)에 영향, 즉 혼합된 올리고뉴클레오티드의 사용을 통한 식물에서의 운반자의 활성에 영향을 주는 것과 관련되는데, 이는 사카로스 운반자의 활성을 증가, 저하, 또는 사카로스 운반자의 생화학적 특성을 변형시킨다. 이러한 타입의 방법은 WO99/07865에 기술되어 있는데, 여기에서는 이 공정과 관련하여 본 발명 교시의 개시된 내용에 완전 포함되고 본 발명의 범위 내에서 청구된다.

본 발명은 또한 사카로스 운반의 조절기(modulators), 특히 인덕터 (inductors), 액티베이터(activators), 또는 저해제(inhibitors), 특히 식물에서 사카로스 운반의 감지 및/또는 조절을 확인하기 위한 SUT2-코딩 염기서열 또는 SUT2의 용도와도 관련되는데, 이에 의해 SUT2-코딩 염기서열에 의하여 코딩되는 단백질의 활성이 잠재적 조절기의 존재 및 부재로 검출된다. SUT2에 의하여 조절되는 사카로스 운반자, 예를 들어 SUT1 또는 SUT4의 활성이 SUT2의 활성 대신에 확인될 수 있다.

본 발명은 또한 식물에서 사카로스 운반 활성의 조절, 특히 체관부의 고-용량 사카로스 적하의 저-친화성 저해제의 조절을 확인하기 위한, SUT1-코딩 염기서열, 특히 SEQ ID no. 22 및/또는 SUT4-코딩 염기서열 및/또는 SUT1 및/또는 SUT4의 용도와도 관련되는데, 이에 의해 SUT4-염기서열에 의하여 코딩되는 단백질의 활성은 잠재적 조절기의 존재 및 부재 중에 검출된다.

본 발명은 또한 다른 식물, 예를 들어 cDNA 또는 게놈 뱅크로부터의 식물에서 상동성 유전자를 확인하기 위한, 본 발명의 SUT1, SUT2, 및 SUT4 염기서열의 용도와도 관련된다.

본 발명은 또한 교차 프로그램을 위한 분자 표지로서의 유전자 및 주위 영역의 용도와도 관련된다. 감자 근경에서 더 높은 탄수화물 함량 및 더 높은 수율을 위해, SUT2 및 SUT4 좌위는 QTL 좌위의 영역에 위치한다. 따라서, 양자는 적절한 염색체 단편에서 교차를 위해 야생형 또는 고성능 타입을 포함하고, 이 방법으로 개선된 수율을 생산하는 식물을 얻는 번식 프로그램에 사용하기에 적합한다.

본 발명의 추가적인 바람직한 실시예는 종속항에서 인용된다.

서열번호 1(SEQ ID no. 1)은 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)로부터의 SUT4 유전자의 코딩 DNA 서열.

서열번호 2(SEQ ID no. 2)는 라이코페르시콘 에스쿨렌툼(Lycopersicon esculentum)으로부터의 SUT4 유전자의 코딩 DNA 서열.

서열번호 3(SEQ ID no. 3)은 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)로부터의 SUT2 유전자의 코딩 DNA 서열.

서열번호 4(SEQ ID no. 4)는 라이코페르시콘 에스쿨렌툼(Lycopersicon esculentum)으로부터의 SUT2 유전자의 코딩 DNA 서열.

서열번호 5(SEQ ID no. 5)는 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)로부터의 SUT4의 아미노산 서열.

서열번호 6(SEQ ID no. 6)은 라이코페르시콘 에스쿨렌툼(Lycopersicon esculentum)으로부터의 SUT4의 아미노산 서열.

서열번호 7(SEQ ID no. 7)은 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)로부터의 SUT2의 아미노산 서열.

서열번호 8(SEQ ID no. 8)은 라이코페르시콘 에스쿨렌툼(Lycopersicon esculentum)으로부터의 SUT2의 아미노산 서열.

서열번호 9(SEQ ID no. 9)는 T-DNA-특이적 프라이머.

서열번호 10(SEQ ID no. 10)은 SUT4-특이적 프라이머.

서열번호 11(SEQ ID no. 11)은 SUT4-특이적 프라이머.

서열번호 12 내지 15(SEQ ID no. 12 to 15)는 추가의 SUT4 프라이머를 나타낸다.

서열번호 16 및 17(SEQ ID no. 16 and 17)은 LeSUT4의 구획의 아미노산 서열을 나타낸다.

서열번호 18 내지 21(SEQ ID no. 18 to 21)은 클로닝 프라이머를 나타낸다.

서열번호 22(SEQ ID no. 22)는 솔라눔 투베로숨(Solanum tuberosum)으로부터의 SUT1 유전자의 코딩 DNA 서열.

서열번호 23(SEQ ID no. 23)은 솔라눔 투베로숨(Solanum tuberosum)으로부터의 SUT1의 아미노산 서열.

서열번호 24(SEQ ID no. 24)는 염기 1 내지 239를 갖는, SUT2의 N-말단 영역을 코딩하는 서열번호 3(SEQ ID no. 3)으로부터의 DNA 서열.

서열번호 25(SEQ ID no. 25)는 염기 1 내지 149를 갖는, SUT1의 N-말단 영역을 코딩하는 서열번호 22(SEQ ID no. 22)을 위한 DNA 서열.

서열번호 26(SEQ ID no. 26)은 염기 843 내지 1130을 갖는 중앙 루프를 코딩하는 서열번호 3(SEQ ID no. 3)을 위한 DNA 서열.

서열번호 27(SEQ ID no. 27)은 솔라눔 투베로숨(Solanum tuberosum)으로부터의 SUT4 유전자의 코딩 DNA 서열.

서열번호 28(SEQ ID no. 28)은 솔라눔 투베로숨(Solanum tuberosum)으로부터의 SUT4의 아미노산 서열.

서열번호 29(SEQ ID no. 29)는 솔라눔 투베로숨(Solanum tuberosum)으로부터의 SUT2의 코딩 DNA 서열.

서열번호 30(SEQ ID no. 30)은 솔라눔 투베로숨(Solanum tuberosum)으로부터의 SUT2의 아미노산 서열.

실시예 1

SUT4 cDNA의 분리

데이터베이스(유전자 은행)에서 이전에 확인되지 않고 SUT1과 먼 상동성을 갖는 서열을 확인하였다.

게놈 서열:AtSUT4AC000132

아라비돕시스 묘목 은행으로부터 PCR에 의해 cDNA를 증폭하였다(Minetet al., Plant J.(1992) 2. 417-424). 게놈 서열에 근거한 프라이머(5'-gactctgcagcgagaaatggctacttccg SEQ ID no. 12, 5'-taacctgcaggagaatctcatgggagagg SEQ ID no. 13)를 디자인하였다. 각 프라이머는 하나의 PstI 제한효소 절단 위치(밑줄)를 포함하고, 이들은 AtSUT4의 전체 코딩 서열이 증폭되도록 하는 방식으로 고안되었다. 1566 bp의 예상된 크기를 갖는 산물을 PstI로 절단하고 벡터 pBC SK+(Stratagene)의 PstI 위치로 리게이션하였다. AtSUT4를 pDR196의 PstI 위치로 서브클로닝하였다. pDR196에서 AtSUT4-cDNA를 양 방향으로 시퀀싱하였다. 콜럼비아 (Columbia) 및 랜즈버그 에렉타(Landsberg erecta)에서 SUT4 유전자 간의 에코타입 (ecotype) 차이를 Landsberg erecta로부터의 AtSUT4 시퀀싱에 의하여 확인하였다.

토마토(Lycopersicon esculentum cv. UC82b) cDNA-뱅크(꽃)를 감소된 스트린전시(stringency)로 게놈 토바코 클론 NtSUT3(Lemoineet al., FEBS Lett.(1999) 454, 325-330)의 300 bp eco-RIBgIⅡ 단편과 함께 샘플링하였다.

LeSUT1와 별개로 3 개의 다른 클론을 분리하고 LeSUT4로 명명하였다. 토마토 식물로부터 RT-PCR에 의해 얻은 orthologic 서열을 LeSUT4 서열의 프라이머를 이용하여 분리하고 StSUT4로 명명하였다. StSUT4를 PstI/NotI 단편으로서 pBC SK-(Stratagene)로 클로닝하고 XhoI/SacⅡ 단편으로서, URA3 표지, PMA1 프로모터, 및 ADH1 터미네이터를 갖는 효모 발현 벡터 pDR195로 클로닝하였다(Renschet al., FEBS Lett.(1995) 370, 264-268). 다음은 StSUT4를 증폭하기 위하여 사용되었다(ORF,=cDNA 서열): 5'-SUT4-PstI 5'-GAGACTGCAGATGCCGGAGATAGAAAGGC-3' (SEQ ID no. 14) 5'-SUT4-NotI 5'-TATGACAGCGGCCGCTCATGCAAAGATCTTGGG-3' (SEQ ID no. 15).

실시예 2

SUT2 cDNA의 분리

SUT1과 먼 상동성을 갖고 이전에 기술되지 않은 서열을 데이터베이스(유전자 은행)에서 확인하였다.

게놈 서열:AtSUT2AC004138

서열의 상세한 비교에 근거하여, 잎 mRNA로부터 RT-PCR을 통하여 잠재적 cDNA의 클로닝을 허용할 수 있는 다른 공지의 상동적 프라이머 서열을 확인하였다.

게놈 서열에 근거한 프라이머(5'-TACGAGAATTCGATCTGTGTGTTGAGGACG, SEQ ID no. 20, 5'-AGAGGCTCGAGTGGTCAAAAAGAATCG, SEQ ID no. 21)를 디자인하였다. 이들 프라이머는 EcoRI 또는 XhoI 제한효소 절단 위치(밑줄)를 포함하고, AtSUT2의 전체 코딩 서열이 증폭되도록 하는 방식으로 고안되었다. 1785 bp의 예상된 크기를 갖는 산물을 EcoRI와 XhoI로 절단하고 벡터 pDR196으로 배향된 위치에 리게이션하였다.

실시예 3

SUT4의 기능적 분석

효모 균주 SUSY7/ura3은 SUSY7의 변형판으로(Reismeieret al., EMBO J.(1992) 11, 4705-4713), URA3 유전자의 일부의 결실을 포함하여, 결과적으로 우라실 옥소트로피(auxotrophy)를 위한 선택을 허용한다. 아미노산 없는 1.7 g/ℓ 효모 질소 베이스(Difco)에 2% 사카로스, 20 ㎎/ℓ 트립토판, 및 1.5% 아가로스를 포함하는 pH 5.0 배지가 사카로스 배지 상에서의 효모 성장을 분석하기 위하여 사용되었다.

사카로스 섭취 시험을 위하여, 글루코스를 포함하고 OD₆₂₃약 0.8까지의 액체 최소 배지에서 효모를 배양하였다. 원심분리에 의해 세포를 수집하고, 25 mM 인산나트륨 완충액(pH 5.5)에 세척하고, 동일한 완충액 중에 약 20의 OD₆₂₃으로 현탁하였다. 섭취 시험은 글루코스를 첨가하는 것에 의하여 개시하여¹⁴C-사카로스 첨가 1 분 전 효모 세포 10 mM의 최종 농도에서 종결되었다. 교반하면서 30 ℃에서 배양한 다음, 세포를 파이버글라스 필터 상에서 진공 여과에 의해 수집하고(1-5 분), 4 ㎖의 10 mM 사카로스로 2 회 세척하고(빙점에서), 액체 신틸레이션 카운터를 사용하여 방사능을 측정하였다. AtSUT4 발현은 효모가 사카로스 상에서 성장하도록 허용하였다. AtSUT4와 StSUT4는 기능적 사카로스 운반자임이 입증되었다. AtSUT4- 또는 StSUT4- 발현 효모의¹⁴C-사카로스 섭취에 대한 시간 경과에 따른 곡선은 도 5a에 나타낸다. 대조 벡터와 비교하여 유의적인 차이가 명백하였다.

SUT4에 대한 동력학적 분석을 위한 데이터는 Michaelis-Menten 방정식을 사용한 섭취 측정의 비선형적 회귀로부터 얻어졌다. K_m은 3 개의 독립적 형질전환체±표준편차를 사용하여 8 개 측정치의 평균으로서 나타내었다. 측정된 사카로스의 K_M값은 아라비돕시스로부터의 SUT4에 대해서는 11.6±0.6 mM(pH 5.5에서) 및 5.9±0.8 mM(pH 4.0에서)였다. 솔라눔 투베로숨으로부터의 SUT4에 대해서, K_M값은 6.0±1.2 mM(pH 4.0에서)였다(도 5b 참조).

글루코스를 통한 SUT4에 의한¹⁴C-사카로스의 섭취의 자극 및 전자 운반 저해제(안티마이신 A 및 프로토노포어 CCCP)를 통한 저해는 도 5c에 나타낸다. 도 6은 SUT4-유도된 사카로스 운반의 pH 최적치를 보여준다.

실시예 4

SUT4-삽입 변이체의 제조(Arabidopsis thaliana)

12,800 T-DNA-변이된 아라비돕시스 식물(19,200 삽입 작업)의 종자를 Dupont Co. 및 Arabidopsis Biological Resource Center(ABRC), Ohio State University로부터 입수하였다. 식물을 멸균 배지에서 성장하도록 하고 게놈 DNA를 분리하였다. 각각 100 식물의 140 그룹으로부터의 DNA를 14 수퍼-그룹(수퍼풀)으로 통합하고, 유전자-특이적 및 T-DNA-특이적 프라이머를 사용한 크리산 등(Krysanet al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1996) 93, 8145-8150)에 의하여 개발된 방법을 사용하여 스크리닝하였다. 수퍼풀 DNA를 주형으로 사용하고 T-DNA-특이적 프라이머(LB, 왼쪽 경계 영역 SEQ ID no. 9) 및 유전자-특이적 프라이머(AtSUT4r2 SEQ ID no. 10)를 가지고 PCR을 수행하였다. PCR 산물을 아가로스 겔 전기영동에 의하여 분리하고 하전된 나일론 멤브레인으로 전이시켰다. 멤브레인을 주형으로서 WS(Wassilewskija) 게놈 DNA 및 프라이머 AtSUT4r2(위 참조)와 AtSUT4f2 (ATGGCTACTTCCGATCAAGATCGCCGTC SEQ ID no. 11)로부터 제조된 2.46 kb 길이의 PCR 산물과 융합시켰다. 이 프로브를³²P-CTP로 표지하였다.

표지된 프로브를 블롯과 융합하는 것에 의하여 수퍼풀을 확인하였다. 수퍼풀을 형성하는 100 식물의 풀로부터의 DNA를 다음에 같은 방법으로 스크리닝하였다: 주형으로서 100의 풀로부터의 DNA와 프라이머로서 AtSUT4r2와 LB 를 가지고 PCR을 수행하였다; AtSUT4 게놈 프로브(2.46 kb)를 가지고 DNA 블롯 하이브리디제이션을 수행하여 증폭된 산물을 검출하였다.

양성 융합이 풀 CS2165에서 관찰되었는데, 이는 100 T-DNA-변이된 라인을 포함하는 것이다. CS2165의 각 식물을 배양하고 게놈 DNA를 제조하였다. 각 식물의 DNA를 기술된 바와 같이 스크리닝하였다. 주형으로서 각 식물로부터의 DNA와 프라이머로서 AtSUT4r2와 LB를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR 산물을 에티디디움 브로마이드로 염색하는 것에 의해 아가로스 겔 상에서 가시화하였다. AtSUT4 유전자와 동일한 서열은 AtSUT4 유전자내 T-DNA 삽입을 나타낸다.

그룹 CS2165(Ohio State University, ABRC)에서, T-DNA-특이적 프라이머(LB 5'-GATGCACTCGAAATCAGCCAATTTTAGAC)(SEQ ID no. 9) 및 SUT4-특이적 프라이머 (AtSUT4r2 5'-TCATGGGAGAGGGATGGGCTTCTGAATC)(SEQ ID no. 10) 양자 모두와 양성적인 결과를 생산하는 식물을 얻었다. 각 식물을 분리하고 T-DNA의 삽입 위치를 시퀀싱하여, T-DNA의 좌측 경계 서열이 SUT4 유전자의 ATG로부터 약 480 염기쌍 상향으로 존재한다는 것을 밝혔다. 변이체를 WS(Wassilewskija)와 2 회 교체(cross back)하였다. 카나마이신 저항이 2.9:1(427:147)의 비율로 분리되는 것을 발견하였는데, 이는 단일 표지된 영역의 존재를 나타낸다. 동형접합체(homozygotes)가 얻어졌다. 이들 식물은 WS 야생형보다 유의적으로 더 많은 전분을 갖는데, 이는 KI(요오드화칼륨) 염색에 의하여 입증될 수 있었다. 또한, 이들 식물은 광 하에서 왕성한 발아 성장을 나타내었다. 양쪽 결과는 AtSUT4가 소스 기관, 즉 잎으로부터 사카로스의 출수에 중요한 역할을 한다는 것을 명백히 나타낸다. RT-PCR은 SUT4의 mRNA가 변이체에 존재하고, 따라서 이 변이체가 "넉아웃(knockout)" 식물이 아님을 보여준다.

실시예 5

분리 및 RNase 보호 분석

슈바케 방법(Schwackeet al., Plant Cell(1999) 11, 377-392)을 사용하여 온실에서 경작된 토마토 식물(L. esculentum, cv. Moneymaker)의 여러 기관으로부터 RNA를 분리하였다. MAXIscript^TMSP6/T7 in vitro Transcription Kit(Ambion)를 사용하여, α-³²P UTP를 가지고 역전사를 수행하였다. 600 bp PCR 산물을 pSport로부터 얻었으며, 이는 340 bp LeSUT4 단편을 포함하였다. 이 단편은 주형으로서 사용되었다. 이 프로브는 더 이상 정제될 수 없었고, 샘플 당 300,000 CPM이 융합되었다. 융합은 45 ℃에서 20 ㎍ RNA와 밤새 수행되었다. RNA의 다이제스트에 이어, 보호된 RNA가 5% 폴리아크릴아미드 겔(13×15 ㎝) 상에서 150 ㎷로 분리되었다. 이겔을 건조하고 X-선 이미징을 받았다.

RNA 블롯 분석 및 RNA 보호 분석에서, SUT4의 가장 강한 발현은 싱크 잎, 줄기, 떡잎에서, 그리고 익지 않은 과실에서 발견되었다. 낮은 발현은 소스 잎에서 발견되었다.

실시예 6

항-SUT4 항혈청의 제조 및 면역국소화(immunolocalization)

LeSUT4의 N-말단(MPEIERHRTRHNRPAIREPVKPR SEQ ID no. 16) 또는 중앙 루프 (GSSHTGEEIDESSHGQEEAFLW SEQ ID no. 17)에 대응하는 KLH와 연결된 합성 펩티드를 사용하여 토끼를 면역시켰다. CNBr-활성화된 세파로스 4B 컬럼(Pharmacia)과 결합된 합성 펩티드를 사용하여 상기 기술된 바(Kuhnet al., (1997)op cit.)와 같이 항혈청의 친화성 정제를 수행하였다. 면역전 혈청을 펩티드 친화성 크로마토그래피 대신 단백질 A 세파로스(BioRad)를 사용하는 것을 제외하고는 동일한 방법을 사용하여 정제하였다.

감자 및 토마토 식물에서 SUT4의 형광 면역검출(fluorescence immunodetection)을, 다음에 기술되는 변형을 사용하여 문헌(Stadleret al., Plant Cell(1995) 7, 1545-1554)에 기술된 바와 같이 수행하였다. 토마토 식물과 감자 식물 줄기의 핸드-컷 섹션(1 ㎜)을 0.1% 글루타르알데히드와 6% 포름알데히드를 포함하는 Mops 완충액(50 mM Mops/NaOH, pH 6.9, 5 mM EGTA, 2 mM MgCl₂)에서 진공 하에 밤새 고정하였다. 얼음 상에서 Mops 완충액으로 3 회 세척한 후, 단편들을에탄올 시리즈에서 인큐베이션한 후 96% 에탄올에서 2 회 인큐베이션하여 탈수하였다. 1:1 에탄올, 메틸아크릴레이트 혼액(75% [vol./vol.] 부틸메틸아크릴레이트, 25% [vol./vol.] 메틸메타크릴레이트, 0.5% 벤조인에틸에테르, 10 mM DTT)에서 밤새 인큐베이션한 후, 재료를 100% 메틸아크릴레이트 혼액 중에 묻었다. 중합은 4 ℃에서 UV 광(365 ㎚) 하에 밤새 수행하였다. 세미-박편(1 ㎛)을 예비-가열된 히스토본드 슬라이드(Camon) 상에 놓고 50 ℃에서 건조하였다.

이 박편으로부터 메틸아크릴레이트를 제거하기 위하여, 슬라이드를 아세톤 중에서 30 초 동안 인큐베이션하고, 에탄올 시리즈에 의하여 재수화하고, PBS(100 mM 인산나트륨, pH 7.5, 100 mM NaCl) 중의 2% BSA를 사용하여 1 시간 동안 차단하였다. 친화성-정제된 LeSUT4에 대한 항체와 함께 밤새 인큐베이션한 후, 슬라이드를 PBS-T(0.1% 트윈을 포함하는 PBS) 중에서 2 회 세척하고 PBS로 1 회 세척한 다음, 항-토끼 conjugate IgG-FITC(fluorescein isothiocyanate)와 1 시간 인큐베이션하였다. PBS-T, PBS 및 증류수로 3 회 세척 단계를 거친 후, 형광-상 현미경(Zeiss, Axiophot)과 450-490 ㎚의 여기광(exciter light)을 사용하여 포토마이크로그래프를 만들었다.

형광 신호는 체 요소에서만 검출되었다(토마토와 감자).

실시예 7

형질전환된 식물의 제조

AtSUT2 과도발현 구조(oAtSUT2_35S)

AtSUT2 cDNA를 PCR에 의하여 증폭하였다 - 산물은 1,785 bp 길이로 본 발명의 코딩 영역에서 ATG(위치 1)로부터 TGA(위치 1785)까지의 코딩 영역에 대응한다. 단편을 35S 프로모터 발현 카세트로 센스 방향으로 클로닝하여(pBinAr35S), 이를 pBinAr의 Eco-RI/HindⅢ 단편으로서 분리하였다(Hofgen and Willmitzer,Plant Sc.(1990) 66, 221-230). 이 구조를 HindⅢ과 EcoRI로 절단하고 HindⅢ/EcoRI-절단 pGTPV-bar로 클로닝하였다(Beckeret al., op. cit., PLant Mol. Biol.(1992) 20, 1195-1197). 식물을 형질전환시켰다.

AtSUT2 안티센스 구조(αAtSUT2_35S)

AtSUT2 cDNA(ATTS5034EST 액세스 번호)를 SacI와 BamHI로 절단하고 pBinAr35S 발현 카세트로 안티센스 방향으로 클로닝하였다. 이 구조를 HindⅢ과 EcoRI로 절단하고 HindⅢ/EcoRI-절단 pGPTV-bar로 클로닝하였다(Beckeret al., op. cit.). 식물을 형질전환시켰다.

AtSUT4 과도발현 구조(oAtSUT4_ATSUC2)

AtSUT4 cDNA를 증폭시켰다. 1,533 bp 단편은 본 발명의 AtSUT4cDNA 서열의 위치 1에서 PCR에 의하여 시작되고 TAG 위치 1533에서 끝난다. SUC2 프로모터는 아라비돕시스(Columbia ecotype) 게놈 DNA로부터 다음 프라이머를 사용하여 분리되었다: (reverse 5'-ATGGCTGACCAGATTTGAC; SEQ ID no. 18 및 forward 5'-GTTTCATATTAATTTCAC; SEQ ID no. 19). 1.533 kb 단편을 AtSUC2 프로모터(X79702) 뒤 센스 방향으로 클로닝하였다. 이 구조를 HindⅢ과 EcoRI로 절단하고HindⅢ/EcoRI-절단 pGPTV-bar로 클로닝하였다(Beckeret al., op. cit.).

LeSUT4 안티센스 구조(αLeSUT4_35S)

LeSUT4 cDNA를 BamHI로 절단하여 1.3 kb 단편을 생산하고, 이를 pBinAR의 SmaI 절단 위치로 평탄화 및 클로닝하였다(Bevan,Nucleic Acids Research(1983) 12, 8711-8721).

도 1 내지 4는 상기 구조를 보여준다.

실시예 8

8.1 AtSUT2와 StSUT1 사이의 키메릭 단백질의 제조

AtSUT2의 오픈 리딩 프레임을 Arabidopsis thaliana(Columbia ecotype) 잎으로부터 RT-PCR에 의하여 분리하고 효모 발현 벡터 pDR196으로 클로닝하였다(Barkeret al., (2000)Plant Cell12: 1153-1164). StSUT1의 오픈 리딩 프레임을 pDR195 내에서 StSUT1 cDNA로부터 증폭하고(Riesmeieret al.,(1993)op. cit.), SmaI와 XhoI를 위한 제한효소 절단 위치를 갖는 프라이머를 사용하였다. 오픈 리딩 프레임을 효모 발현 벡터 pDR196으로 리게이션하였다.

AtSUT2의 N-말단, 즉 본 발명의 SUT2의 N-말단 영역(SEQ ID no. 24에 의하여 코딩되는)이 StSUT1의 대응하는 N-말단 영역(SEQ ID no. 25), 즉 본 발명의 SUT1의 N-말단 영역과 교환되는 곳에서 제조되고, 반대도 마찬가지이며, 여기에서 PCR에 의하여 AtSUT2와 StSUT1의 제 1 트랜스멤브레인 영역의 보존된 영역 내에서 제한효소 절단 위치가 생산되었다. 다음에, 서열의 나머지 및 N-말단 영역의 PCR 단편을효모 발현 벡터 pDR196으로 클로닝하여, 절단 위치 SmaI와 PstI를 N-말단 영역을 위해(SdaI를 AtSUT2를 위해), 그리고 XhoI를 오픈 리딩 프레임의 나머지 영역을 위해 사용하였다. 이들 키메릭 구조는 이하 AtSUT2/StSUT1-N 및 StSUT1/AtSUT2-N으로 언급되고, 이들은 도 7에 나타낸다.

구조 StSUT1/AtSUT2-N은, SEQ ID no. 22로 나타낸 StSUT1의 염기 150 내지 1548에 융합된 SEQ ID no. 3의 염기 1 내지 239을 갖는데, 이에 의해 클로닝-관련 인자의 결과로서 구조는 t 내지 c의 염기 치환을 나타낸다. 구조의 융합 영역은 하기 서열로서 나타내는데, 여기에서 소문자는 SUT2의 서열이고 대문자는 SUT1의 서열이다(윗줄: 치환 없음, 아랫줄: 치환 있음):

…tgggcattgca/GCTCTCTT…

…tgggcactgca/GCTCTCTT…

AtSUT2/StSUT1-N은 SEQ ID no. 3으로 나타낸 AtSUT2의 염기 240 내지 1785에 융합된, SEQ ID no. 22로 표시되는 StSUT1의 염기 1 내지 149를 갖는다.

클로닝-관련된 인자 때문에, 구조는 야생형 서열 3에 대하여 염기 치환을 갖는다. 융합 영역은 아래 나타낸다. 여기에서 윗줄은 이론적으로 얻어지는 구조이고 실제로 제조되는 융합 영역은 아랫줄에 나타낸다. 대문자는 SUT1의 서열을 의미하고 소문자는 SUT2의 서열을 의미한다:

…TGGGCTCTTCA/actttct

…TGGGCTCTGCA/ggtttct

추가의 키메릭 구조는 SEQ ID no. 26으로 표시되는 AtSUT2의 중앙 원형질 영역, 특히 루프가 StSUT1의 더 작은 원형질 영역, 특히 루프로 치환되는 곳에서 제조되었고, 반대도 같다. 제한효소 절단 위치는 트랜스멤브레인 영역 Ⅳ와 Ⅷ의 보존된 영역 내에서 PCR 에 의하여 사용되었다. 오픈 리딩 프레임의 N-말단 절반, 원형질 루프, 및 C-말단 절반을 Pfu-폴리머라제(Stratagene)을 사용해서 PCR에 의하여 증폭하고, 세 단편을 AtSUT2를 위해 SacI와 BclI/BglⅡ를 이용하여 StSUT1 루프와, 그리고 StSUT1을 위해 BamHI/BglⅡ를 이용하여 AtSUT2 루프와 리게이션하여 효모 발현 벡터로 클로닝하였다. 다음에 SmaI와 XhoI를 이용하여 키메릭 DNA를 효모 발현 벡터 pDR196으로 리게이션하였다. 이들 키메릭 구조는 이하에서 AtSUT2/StSUT1-루프와 StSUT1/AtSUT2-루프로 언급되고, 이들은 표 7에 나타낸다.

AtSUT2/StSUT1-루프는 AtSUT2(SEQ ID no. 3)의 염기 1 내지 842, StSUT1(SEQ ID no. 22)의 750 내지 893, 및 AtSUT2(SEQ ID no. 3)의 염기 1131 내지 1785를 갖는다. 다음에 사용되는 대소문자들은 위에서 언급한 것과 같은 의미를 갖는다. 마찬가지로, 윗줄은 이론적으로-얻어지는 구조의 서열을 나타내고, 아랫줄은 클로닝 중에 만나는 인자의 효과를 포함하는 구조의 실제 서열을 보여준다.

1. 융합 위치:

…tgctaaagagat/CCCGGAGA…

…tgctaaagagct/CCCGGAGA…

2. 융합 위치:

…GTTTGAACTG/gttatcctgg

…GTTTGAACTT/gatctcctgg

구조 StSUT1/AtSUT2 루프는 StSUT1(SEQ ID no. 22)의 염기 1 내지 749, AtSUT2(SEQ ID no. 3)의 염기 843 내지 1130, 및 StSUT1(SEQ ID no. 22)의 염기 894 내지 1548을 갖는다.

1. 융합 위치:

…AACGAGCT/tcctttta…

…AACGAGCT/ccctttta…

2. 융합 위치:

…ctcttacatg/GATCGCGT…

…ctcttacatg/GATCTCGT…

8.2 AtSUT2와 키메릭 단백질의 기능적 분석

사카로스 섭취 시험을 위해, 발현 벡터 pDR196에서 대응하는 cDNA를 갖는 효모 균주 SEY6210(Banakaitis,Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1986) 83, 9705-9070)를 사용하였다. 14-C 사카로스의 섭취는 문헌(Weiseet al.(2000)Plant Cell12: 1345-1355)에 기술된 바에 따라 일어났다. 효모에서 단백질의 발현 분석은 연구된 모든 단백질에 대하여 상당량인 것으로 밝혀졌다.

AtSUT2를 발현하는 효모 세포에 의한 사카로스 섭취는 시험의 첫번째 5 분에서는 선형적으로 보였다. 이 시기 동안, 0.1 n㏖ 사카로스가 10⁸세포 내에 축적되었다. AtSUT2에 의한 사카로스의 섭취는 빈 벡터 pDR196만을 발현하는 효모 세포에서보다 유의적으로 높았다(p<0.05). 대조에 의해, StSUT1-발현 세포에서의 운반율은 AtSUT2-발현 세포 보다 400 배 컸다. 동력학적 연구는 사카로스에 대한 AtSUT2의 매우 낮은 친화성을 밝혀주었다. Michaelis-Menten 방정식과 비선형 회귀 분석을 사용하여, 11.7±1.2 mM(V_max=1.5 n㏖·min^-110⁸cells^-1)의 K_M값이 pH 4에서 AtSUT2에 대하여 측정되었다. 대조적으로, StSUT1은 1.7 mM에서 사카로스에 대해 10-배 낮은 K_M값을 가졌다(V_max=210.2 n㏖·min^-110⁸cells^-1).

AtSUT2에 의한 사카로스 섭취는 pH-의존적이고, 최고의 섭취율은 pH 4.0에서 측정되었다. 사카로스 섭취는 알칼리 pH 값에서 가파르게 감소하고, pH 6에서는 더 이상의 사카로스 섭취가 측정되지 않았다. AtSUT2의 기질 특이성을 측정하기 위하여, 사카로스 섭취(1 mM 사카로스)를 다른 당 및 당알콜과 경쟁적으로 측정하였다. 시험된 기질(사카로스, 말토스, 이소말토스, 글루코만니톨, 글루코솔비톨, 라피노스, 갈락토스, 락토스, 만니톨, 솔비톨, 글루코스)에서는, 사카로스와, 이보다 낮은 정도로 말토스가¹⁴C-사카로스와 유의적으로 경쟁할 수 있었다. AtSUT2에 의한 사카로스 운반은 CCCP에 의하여, 그리고 미토콘드리아 ATP-형성 저해제, 안티마이신 A에 의하여 저해되었다. 이들 데이터는 AtSUT2에 대한 프로톤-커플링된 운반 메카니즘을 제시한다.

8.5 키메릭 단백질의 사카로스 섭취에서 사카로스 섭취 동력학

AtSUT2, StSUT1, 및 키메릭 단백질에 대한 결과는 다음 표에 나타낸다.

사카로스 운반자 StSUT1 및 AtSUT2 뿐 아니라, N-말단 영역 또는 중앙 원형질 루프가 두 운반자 사이에서 교환되는 키메릭 단백질의 사카로스에 대한 K_M값. 이 값은 적어도 3 개의 다른 측정으로부터의 평균값±표준편차로서 측정된다. 다른 글자는 유의적인 차이를 나타낸다(p<0.05).

운반자	KM(n㏖ℓ-1)	Vmax(n㏖ 사카로스 min-1108cells-1)	N-말단	중앙 루프	멤브레인통로
AtSUT2	11.7±1.2a	1.5±0.1	AtSUT2	AtSUT2	AtSUT2
AtSUT2/StSUT1-루프	6.7±2.0bc	0.4±0.1	AtSUT2	StSUT1	AtSUT2
AtSUT2/StSUT1-N	3.7±1.7c	0.3±0.05	StSUT1	AtSUT2	AtSUT2
StSUT1/AtSUT2-N	8.1±1.4b	72.9±4.9	AtSUT2	StSUT1	StSUT1
StSUT1/AtSUT2-루프	1.4±0.3c	5.5±0.3	StSUT1	AtSUT2	StSUT1
StSUT1	1.7±0.2c	210.2±5.7	StSUT1	StSUT1	StSUT1

키메릭 구조 AtSUT2/StSUT1-N에 의해 코딩되는 키메릭 단백질은 AtSUT2와 비교할 때 사카로스에 대하여 유의적으로 더 낮은 K_M값 - 3.4±1.6 mM(V_max=0.3 n㏖·min^-110⁸cells^-1) - 을 갖는다. 비교하면, 키메릭 구조 StSUT1/AtSUT2-N에 의하여 코딩되는 키메릭 단백질은 StSUT1과 비교할 때 사카로스에 대하여 유의적으로 더 높은 K_M값 - 8.08±1.4 mM(V_max=72.9 n㏖·min^-110⁸cells^-1) - 을 갖는다. AtSUT2/StSUT1-루프는 사카로스에 대하여 더 높은 K_M값(6.75 mM±1.9)(V_max=0.4 n㏖·min^-110⁸cells^-1)을 갖고, 반면에 StSUT1/AtSUT2-루프는 사카로스에 대하여 더 낮은 K_M값(1.4 mM±0.3)(V_max=5.5 n㏖·min^-110⁸cells^-1)을 갖는다.

8.6 사카로스 운반자의 N-말단의 중요성

이상에서 기술된 효모에서 키메릭 단백질에 대한 발현 실험으로부터 다음 결론을 유추할 수 있다. 높은 친화성 운반자 StSUT1의 N-말단을 낮은 친화성 AtSUT2의 것으로 치환하는 것은 K_M값의 1.7 mM로부터 8.1 mM로의 증가(p<0.05)를 야기한다. StSUT1 N-말단은 K_M값이 11.7 mM로부터 3.4 mM로 감소(p<0.05)하는 것에 의해 보여주는 바와 같이 AtSUT2에 대한 높은 친화성을 갖는다. 따라서, StSUT1과 AtSUT2 사이에서 N-말단에 있어서의 구조적 차이는 기질 친화성에서의 차이점 대부분을 야기하는 것으로 보인다. 사카로스 운반자의 N-말단은 다른 세포졸 영역과의 분자내 상호작용의 결과로서 또는 제 1 트랜스멤브레인 통로의 위치를 제어하는 것에 의해 사카로스에 대한 친화성에 영향을 줄 가능성이 있다. 이러한 결론은 이론적으로 구속되지 않는다.

본 발명은 당류(saccharide), 특히 사카로스 운반자(saccharose transporters)를 코딩하는 핵산 분자, 이들 핵산 분자를 포함하는 벡터, 및 숙주 세포 뿐 아니라, 여기에 기술되는 핵산 분자 및 벡터를 사용하여 형질전환된 진균(fungi), 식물 세포, 및 식물에 관련되고, 또한 식물에서의 당류 운반 및 특히 사카로스 운반을 변형시키기 위한 방법과 관련하여 이용될 수 있다.

Claims (58)

1. 식물의 조직에서 당류 유동 및/또는 당류 농도를 변형시키는 방법에 있어서, 당류를 위한 높은 운반 능력 및 당류에 대한 낮은 친화성을 갖는 당류 운반자 (saccharide transporter)의 활성이, 적어도 하나의 벡터를 사용하여 적어도 하나의 식물 세포를 형질전환시키고 재생 및 이로부터 그의 조직에 변형된 당류 유동 및/또는 변형된 당류 농도가 존재하는 식물을 얻는 것에 의하여 변형되며, 이 벡터는 그의 발현이 당류 운반자의 운반 활성의 변형을 야기하는 염기서열을 갖는 방법.
2. 제 1 항에 있어서, 벡터는 SUT4-코딩 염기서열, 이의 일부, 또는 이의 상보적 서열을 포함하는 방법.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 벡터는 SUT2-코딩 염기서열, 이의 일부, 또는 이의 상보적 서열을 포함하는 방법.
4. 제 1 항 내지 제 3 항의 어느 한 항에 있어서, 벡터는 SUT1-코딩 염기서열, 이의 일부, 또는 이의 상보적 서열을 포함하는 방법.
5. 제 1 항 내지 제 4 항의 어느 한 항에 있어서, 코딩 염기서열은 cDNA 또는게놈 DNA 서열인 방법.
6. 제 1 항 내지 제 5 항의 어느 한 항에 있어서, 식물 세포는 코딩 염기서열의 잎-특이적 과도발현을 생산하는 적어도 하나의 벡터에 의하여 형질전환되는 방법.
7. 제 1 항 내지 제 5 항의 어느 한 항에 있어서, 식물 세포는 가드 세포(guard cells)에서 코딩 염기서열의 특이적 과도발현을 생산하는 적어도 하나의 벡터에 의하여 형질전환되는 방법.
8. 제 1 항 내지 제 5 항의 어느 한 항에 있어서, 식물 세포는 가드 세포에서 코딩 염기서열의 특이적 과도발현 또는 돌연변이유발을 생산하고, 공동-억제, 돌연변이유발, RNA-이중 스트랜드 저해, 또는 안티센스 발현에 의하여 적어도 하나의 내생적으로 존재하는 SUT1-, SUT2-, 및/또는 SUT4-코딩 염기서열의 감소된 발현을 달성하는 적어도 하나의 벡터에 의하여 형질전환되는 방법.
9. 제 1 항 내지 제 5 항의 어느 한 항에 있어서, 식물 세포는 싱크 조직(sink tissue) 및/또는 유조직(parenchyma)에서 코딩 염기서열의 특이적 과도발현을 생산하는 적어도 하나의 벡터에 의하여 형질전환되는 방법.
10. 제 1 항 내지 제 5 항의 어느 한 항에 있어서, 식물 세포는 싱크 세포(sinkcells)에서 코딩 염기서열의 특이적 과도발현 또는 돌연변이유발을 생산하고, 공동-억제, 돌연변이유발, RNA-이중 스트랜드 저해, 또는 안티센스 발현에 의하여 적어도 하나의 내생적으로 존재하는 SUT1-, SUT2-, 또는 SUT4-코딩 염기서열의 감소된 발현을 달성하는 적어도 하나의 벡터에 의하여 형질전환되는 방법.
11. 제 1 항 내지 제 5 항의 어느 한 항에 있어서, 식물 세포는 잎에서 코딩 염기서열의 특이적 과도발현 또는 돌연변이유발을 생산하고, 공동-억제, 돌연변이유발, RNA-이중 스트랜드 저해, 또는 안티센스 발현에 의하여 적어도 하나의 내생적으로 존재하는 SUT1-, SUT2-, 또는 SUT4-코딩 염기서열의 감소된 발현을 달성하는 적어도 하나의 벡터에 의하여 형질전환되는 방법.
12. 제 1 항 내지 제 5 항의 어느 한 항에 있어서, 식물 세포는 코딩 염기서열의 종자-특이적 과도발현을 생산하는 적어도 하나의 벡터에 의하여 형질전환되는 방법.
13. 제 1 항 내지 제 5 항의 어느 한 항에 있어서, 식물 세포는 잎 실질조직 (mesophyll) 및/또는 잎 표피(epidermis)에서 코딩 염기서열의 특이적 과도발현을 생산하는 적어도 하나의 벡터에 의하여 형질전환되는 방법.
14. 제 1 항 내지 제 13 항의 어느 한 항에 있어서, 코딩 염기서열은 원핵 및/또는 진핵 세포에서 RNA의 발현을 생산하는 적어도 하나의 조절 요소의 작동적 제어 하에 있는 방법.
15. 제 14 항에 있어서, 센스 또는 안티센스 배향의 코딩 염기서열이 적어도 하나의 조절 요소의 작동적 제어 하에 있는 방법.
16. 제 15 항에 있어서, 적어도 하나의 존재하는 조절 요소는 프로모터인 방법.
17. 제 16 항에 있어서, 프로모터는 GAS, SUC2, SUT1, CaMV35S, rolC, 강화된 PMA4, KAT1, StLS1/L700, PFP, 파타틴(patatin)-B33, AAP1, 또는 비실린(vicilin) 프로모터인 방법.
18. 제 1 항 내지 제 17 항의 어느 한 항에 있어서, 당류는 사카로스인 방법.
19. 다음을 포함하는 그룹으로부터 선택되는, 낮은 당류 친화성 및 당류에 대한 높은 운반 능력을 갖는 당류 운반자를 코딩하는 핵산 분자:

    a) 서열번호 1, 2, 또는 27로 나타내는 염기서열, 이의 일부, 또는 이의 상보적 스트랜드를 포함하는 핵산 분자,

    b) 서열번호 5, 6, 또는 28로 나타내는 아미노산서열을 갖는 단백질을 코딩하는 핵산 분자, 그리고

    c) a) 및 b)에서 인용된 핵산 분자의 하나와 융합하는(hybridize) 핵산 분자.
20. 제 19 항에 있어서, 당류 운반자가 사카로스 운반자, 특히 SUT4인 핵산 분자.
21. 다음을 포함하는 그룹으로부터 선택되는, 식물에서 당류 운반, 특히 사카로스 운반을 위한 센서 및/또는 조절자, 특히 SUT2를 코딩하는 핵산 분자, 또는 이의 일부:

    a) 서열번호 3, 4, 24, 26, 또는 29로 나타내는 염기서열, 이의 일부, 또는 이의 상보적 스트랜드를 포함하는 핵산 분자,

    b) 서열번호 7, 8, 또는 30으로 나타내는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩하는 핵산 분자, 그리고

    c) a) 및 b)에서 열거된 핵산 분자의 하나와 융합하는(hybridize) 핵산 분자.
22. 서열번호 22 및 25로 나타내는, SUT1의 적어도 N-말단 영역을 코딩하는 핵산 분자.
23. 제 18 항 내지 제 22 항의 어느 한 항에 있어서, 분자가 DNA 또는 RNA 분자인 핵산 분자.
24. 제 23 항에 있어서, DNA 분자가 cDNA 또는 게놈 DNA인 핵산 분자.
25. 키메릭 단백질을 코딩하는 핵산 분자에 있어서, 핵산 분자의 코딩 영역의 5'-말단 영역이 SUT2 단백질의 N-말단 영역을 나타내고, 나머지는 사카로스의 대사 및/또는 운반과 관련된 유전자의 코딩 영역을 나타내는 핵산 분자.
26. 키메릭 단백질을 코딩하는 핵산 분자에 있어서, 핵산 분자의 코딩 영역의 5'-말단 영역이 SUT1 유전자의 N-말단 영역을 나타내고, 나머지는 사카로스의 대사 및/또는 운반과 관련된 유전자의 코딩 영역을 나타내는 핵산 분자.
27. 키메릭 핵산 분자를 나타내고, 그의 N-말단 영역이 SUT2의 N-말단 영역이고 그의 나머지가 SUT1의 코딩 서열인 키메릭 단백질을 코딩하는 핵산 분자.
28. 키메릭 핵산 분자를 나타내고, 그의 N-말단 영역이 SUT1의 N-말단 영역이고 그의 나머지가 SUT2의 코딩 서열인 키메릭 단백질을 코딩하는 핵산 분자.
29. 키메릭 핵산 분자를 나타내고, 멤브레인 범위 Ⅵ와 Ⅶ 사이에 위치한 그의 중앙 세포질 영역이 SUT2에 의하여 코딩되고 그의 다른 부위가 다른 사카로스 운반자 유전자, 특히 SUT1 또는 SUT4에 의하여 코딩되는 키메릭 단백질을 코딩하는 핵산 분자.
30. 제 19 항 내지 제 29 항의 어느 한 항의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
31. 제 30 항에 있어서, 당류-운반자-코딩 염기서열, 이의 일부, 또는 이의 상보적 염기서열을 추가로 포함하는 벡터.
32. 제 30 항 또는 제 31 항에 있어서, 핵산 분자가 원핵 및/또는 진핵 세포에서 RNA의 발현을 생산하는 적어도 하나의 조절 요소에 작동적으로 연결된 벡터.
33. 제 32 항에 있어서, 조절 요소가 프로모터인 벡터.
34. 제 33 항에 있어서, 프로모터는 GAS, SUC2, SUT1, CaMV35S, rolC, 강화된 PMA4, KAT1, StLS1/L700, PFP, 파타틴(patatin)-B33, AAP1, 또는 비실린(vicilin) 프로모터인 벡터.
35. 제 30 항 내지 제 34 항의 어느 한 항에 있어서, 제 19 항 내지 제 29 항의 어느 한 항의 핵산 분자 및/또는 당류-운반-코딩 염기서열, 또는 이의 일부가 적어도 하나 존재하는 조절 요소에 대하여 작동적 안티센스 배향으로 배열된 벡터.
36. 제 30 항 내지 제 35 항의 어느 한 항의 벡터의 하나를 포함하는 숙주 세포.
37. 제 36 항에 있어서, 식물 세포, 박테리아 세포, 또는 효모 세포인 숙주 세포.
38. 제 19 항 또는 제 20 항의 어느 한 항의 핵산 분자에 의하여 코딩되는, 낮은 당류 친화성 및 높은 당류 운반율을 갖는 당류 운반자.
39. 제 21 항의 핵산 분자에 의하여 코딩되는, 당류 운반의 조절자 및/또는 센서의 생물학적 활성을 갖는 단백질.
40. 제 25 항 내지 제 29 항의 어느 한 항의 핵산 분자의 하나에 의하여 코딩되는 키메릭 단백질.
41. 제 19 항 내지 제 29 항의 어느 한 항의 핵산 분자 또는 제 29 항 내지 제 34 항의 어느 한 항의 벡터의 하나로 형질전환되거나, 또는 이러한 세포로부터 유전되는 형질전환 식물 세포.
42. 제 41 항에 있어서, SUT/SUC-코딩 염기서열, 바람직하게는 SUT1-코딩 염기서열을 포함하는 벡터로 형질전환되거나, 또는 이러한 세포로부터 유전되는 형질전환 식물 세포.
43. 그의 게놈이 SUT/SUC 유전자 패밀리로부터의 적어도 2 개의 안정적으로 통합된 변형된 유전자를 포함하는 형질전환 식물 세포.
44. 그의 게놈이 SUT1/SUT2, SUT1/SUT4, SUT2/SUT4, 및 SUT1/SUT2/SUT4를 포함하는 그룹으로부터 선택된 적어도 2 개의 안정적으로 통합된 변형된 유전자를 포함하는 형질전환 식물 세포.
45. 제 41, 42, 43, 또는 44 항의 적어도 하나의 식물 세포를 포함하거나, 또는 청구항 1 내지 18 항의 방법의 하나를 사용하여 제조된 형질전환 식물.
46. 제 45 항에 있어서, 식물이 아강(subclass) 그라미나에(graminae), 피니다에(pinidae), 마그놀리이다에(magnoliidae), 라눈쿨리다에(ranunculidae), 카리오필리다에(caryophyllidae), 로지다에(rosidae), 아스테리다에(asteridae), 아리다에(aridae), 릴리이다에(liliidae), 아레키다에(arecidae) 및 코멜리니다에 (commellinidae)로부터 선택되는 형질전환 식물.
47. 제 45 항에 있어서, 식물이 사탕수수, 사탕무우, 구근(topinambur), 아라비돕시스(arabidopsis), 해바라기, 토마토, 담배, 옥수수, 보리, 밀, 호밀, 귀리, 쌀, 감자, 평지(rapeseed), 카사아버(manioc), 양상추(lettuce), 시금치, 포도, 사과, 커피, 차, 바나나, 코코넛, 야자, 완두콩, 콩, 소나무, 포플라, 유칼립투스 등을 포함하는 그룹으로부터 선택되는 형질전환 식물.
48. 제 41, 42, 43, 또는 44 항의 어느 한 항의 적어도 하나의 식물 세포를 포함하는, 제 45, 46, 또는 47 항의 어느 한 항의 식물의 번식 또는 수확 재료.
49. 식물에서 당류 운반의 조절자, 특히 저해자로서, 특히 SUT4를 확인하기 위한, 제 19 항 또는 제 20 항의 하나의 염기서열의 용도.
50. 당류 운반에 차례로 영향을 주기 위하여 사용되는 상호작용자(interactor)를 확인하기 위한, 제 19 항 또는 제 20 항의 어느 한 항의 염기서열의 용도
51. 제 49 항에 있어서, 저해제가 소스 기관(source organs)에서의 체관부 적하(loading) 및/또는 싱크 기관(sink organs)에서의 양육(unloading)을 저해하는 것인 용도.
52. 조절자, 특히 식물에서 당류 운반의 저해제, 특히 SUT2를 확인하기 위한, 제 21 항의 염기서열의 용도.
53. 제 52 항에 있어서, 저해제는 당류 운반 시스템의 조절 또는 감지를 저해하는 것인 용도.
54. 교차 프로그램(crossing programs)을 위한 분자 표지로서의 제 19 항 내지 제 29 항의 어느 한 항의 염기서열의 용도
55. 기질, 특히 사카로스에 대한 어떤 주어진 단백질, 특히 SUT/SUC 단백질의 패밀리로부터의 단백질의 친화성을 변형시키기 위한, SUT/SUC 유전자 패밀리로부터의 유전자의 단백질-코딩 영역의 5'-말단 염기서열의 용도.
56. 제 54 항에 있어서, 유전자가 SUT1, SUT2, 또는 SUT4인 용도.
57. 제 54 항 또는 제 55 항에 있어서, N-말단 염기서열이 서열번호 24 또는 25로 나타낸 염기서열인 용도.
58. 특히 당 대사에서 조절 또는 신호 변환(transduction)을 위한, SUT2의 중앙 세포질 루프의 용도.