CN116157019A - 鳞翅目害虫的基于rna的控制 - Google Patents

鳞翅目害虫的基于rna的控制 Download PDF

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Abstract

本文公开了控制害虫的组合物和方法，其涉及施用RNA干扰剂。特别例证的是对鳞翅目物种如小菜蛾和草地粘虫的控制。还公开了双链RNA分子靶向鳞翅目物种中的某些基因的用途。

Description

鳞翅目害虫的基于RNA的控制
相关申请
本申请根据35U.S.C.(s)119(e)要求美国临时申请第63/024,133号和美国临时申请第63/106,614号的权益，它们通过引用以其整体并入本文。
背景技术
作物经常是昆虫攻击的目标。根据联合国粮食及农业组织的数据，在全球范围内，农民由于病虫害损失了30％至40％的作物。作物维护和作物健康对产品的产量和质量至关重要，这最终需要长期战略来最大限度地减少病虫害的发生。估计控制作物害虫(例如鳞翅目(Lepidoptera)、双翅目(Diptera，)、鞘翅目(Coleoptera)、半翅目(Hemiptera)等)的年度成本为数千万美元，如果不加以控制，预计每年的作物损失成本将达到数十亿美元。
虽然化学农药一直是用于根除害虫侵染的一种解决方案，但是需要可替代的、对环境更安全的解决方案。化学农药对环境有害，并且可能缺乏特异性或选择性，最终导致非靶标效应。此外，鉴于化学农药缓慢的新陈代谢以及化学农药积累的可能性，很可能会产生耐药性。因此，长期以来一直需要对环境更友好的方法来控制或根除虫害，该方法更具选择性、对环境更安全且可生物降解。
发明内容
本发明的实施例涉及鳞翅目害虫的控制，尤其是那些在经济上或农业上重要的害虫的控制。在各种实施例中，鳞翅目害虫是选自由以下组成的组中的至少一种：夜蛾(Spodoptera spp)(如草地贪夜蛾(S.frugiperda)，又名草地粘虫(fall armyworm))和小菜蛾(Plutella spp)(如小菜蛾(P.xylostella)，又名小菜蛾(diamondback moth))。
本文所述的组合物和方法包含重组多核苷酸分子，如用于使转基因植物抵抗鳞翅目害虫侵染的重组DNA构建体，以及单链或双链DNA或RNA分子，在本文中被称为“触发物”，其可用于控制或预防鳞翅目害虫对植物的侵染。在一些实施例中，提供多核苷酸触发物作为局部施用的药剂，用于控制或预防鳞翅目害虫对植物的侵染。在一些实施例中，提供了对鳞翅目害虫的侵染具有改善的抗性的作物植物，如表达多核苷酸触发物的转基因作物植物(包含种子或可繁殖部分，如块茎)。在一些实施例中，提供了已经用包括多核苷酸触发物的组合物局部处理的作物植物(包含种子或可繁殖部分，如块茎)(例如，已经用dsRNA分子的溶液喷雾的作物植物)。还提供了含有多核苷酸的组合物，该组合物被局部施用于鳞翅目害虫或被保护免受鳞翅目害虫侵染的植物、植物部分或种子。
几个实施例涉及通过多核苷酸触发物抑制鳞翅目害虫中的靶基因。一些实施例涉及用于选择鳞翅目靶基因的方法，所述靶基因可以是RNAi介导的对鳞翅目害虫的控制的有效靶标。在一些实施例中，选择用于RNAi介导的抑制的靶基因是这样的基因，其在鳞翅目害虫基因组中是非重复和非冗余的，或者具有低核苷酸多样性，或者在进化上或功能上被限制为具有比非同义(Ka)核苷酸变化更多的同义(Ks)。本文提供了在本文中被称为“靶基因序列组”的核苷酸序列，其由SEQ ID NOs：1-114、229-361、495-511；530-535、542-822、1104-1333和1564-1623组成。还提供了在本文中被称为“触发物序列组”的核苷酸序列，其由SEQID NOs：115-228、362-494、512-529、536-541、823-1103、1334-1563和1624-1683组成。SEQIDs与本文提供的SEQ ID列表中提供的序列相关。
在一个方面，一种用于控制植物的鳞翅目害虫侵染的方法，其包括使鳞翅目害虫与多核苷酸接触，所述多核苷酸包括18个或更多个连续核苷酸的至少一个区段，所述连续核苷酸具有与具有选自靶基因序列组或触发物序列组的序列的DNA或其DNA互补序列的相应片段具有约95％至约100％的同一性的序列(例如，将包含具有100％同一性的序列的21个连续核苷酸的区段)。在实施例中，用于控制植物的鳞翅目害虫侵染的方法包括使鳞翅目害虫与多核苷酸接触，所述多核苷酸包括与具有选自由以下组成的组的核苷酸序列的靶基因或从靶基因转录的RNA的至少18个连续核苷酸互补的核苷酸序列：SEQ ID NOs：2、5、7、9、13、21、26、27、29、36、37、39、44、47、87、95、99、103、301、309、318、319、320、321、323、324、328、341、343、346、356、358、359、503、504、505、506、509、510、530、532、533、542、545、546、547、549、551、552、553、559、560、561、563、564、570、572、573、581、593、596、602、611、612、620、665、666、672、717、730、731、736、737、738、740、741、742、743、749、757、760、761、763、766、808、809、810、814、815、817、818、821、822、1104、1105、1106、1111、1113、1116、1121、1123、1124、1132、1133、1147、1156、1157、1163、1166、1187、1190、1192、1195、1196、1216、1217、1240、1243、1251、1263、1264、1265、1270、1275、1279、1283、1290、1308、1310、1316、1318、1320、1564、1565、1569、1622和1623。在一些实施例中，多核苷酸是双链RNA。在一些实施例中，多核苷酸包括选自触发物序列组的一个或多个核苷酸序列。在一些实施例中，与多核苷酸的接触通过将多核苷酸或含有多核苷酸的组合物或溶液直接局部施用(例如，通过喷雾或撒粉或浸泡)到鳞翅目害虫或鳞翅目害虫接触的表面或基质(例如，植物或土壤)来实现。在一些实施例中，与多核苷酸的接触通过提供被鳞翅目害虫摄取的多核苷酸来实现。在一些实施例中，与多核苷酸的接触通过提供表达鳞翅目害虫的转基因植物来实现。
几个实施例涉及一种通过在鳞翅目害虫的食物中提供包括多核苷酸的药剂来控制植物的鳞翅目害虫侵染的方法，所述多核苷酸具有18个或更多个连续核苷酸的至少一个区段，其具有与具有选自靶基因序列组、触发物序列组或其任一种的DNA互补序列的序列的DNA的相应片段具有约95％至约100％的同一性的序列((例如，具有与其具有100％同一性的序列的21个连续核苷酸的区段))，并且其中所述药剂在被鳞翅目害虫摄取时起作用以抑制鳞翅目害虫内的生物学功能，从而控制鳞翅目害虫的侵染。在实施例中，用于控制植物的鳞翅目害虫侵染的方法包括在鳞翅目害虫的食物中提供多核苷酸，所述多核苷酸包括与具有选自由以下组成的组的核苷酸序列的靶基因或从靶基因转录的RNA的至少18个连续核苷酸互补的核苷酸序列：SEQ ID NOs：2、5、7、9、13、21、26、27、29、36、37、39、44、47、87、95、99、103、301、309、318、319、320、321、323、324、328、341、343、346、356、358、359、503、504、505、506、509、510、530、532、533、542、545、546、547、549、551、552、553、559、560、561、563、564、570、572、573、581、593、596、602、611、612、620、665、666、672、717、730、731、736、737、738、740、741、742、743、749、757、760、761、763、766、808、809、810、814、815、817、818、821、822、1104、1105、1106、1111、1113、1116、1121、1123、1124、1132、1133、1147、1156、1157、1163、1166、1187、1190、1192、1195、1196、1216、1217、1240、1243、1251、1263、1264、1265、1270、1275、1279、1283、1290、1308、1310、1316、1318、1320、1564、1565、1569、1622和1623。在一些实施例中，多核苷酸包括选自触发物序列组的一个或多个核苷酸序列。在一些实施例中，多核苷酸是双链RNA。在一些实施例中，将含有多核苷酸的药剂配制成用于施用到作物植物的领域，例如在可喷雾的溶液或乳液、罐混合物或粉末中。在一些实施例中，药剂是生物学产生的，例如，以微生物发酵产物的形式或在转基因植物细胞中表达。
另一方面，提供了一种导致鳞翅目害虫幼虫的死亡或发育迟缓(stunting)的方法。在一些实施例中，在鳞翅目害虫幼虫的食物中提供包括至少一种沉默元件的至少一种RNA，其中RNA被鳞翅目害虫幼虫摄取导致鳞翅目害虫幼虫的死亡或发育迟缓。在一些实施例中，沉默元件与鳞翅目害虫幼虫的靶基因序列的片段基本上相同或基本上互补，其中靶基因选自由靶基因序列组中的基因组成的组。在实施例中，导致鳞翅目害虫的幼虫死亡或发育迟缓的方法包括在幼虫的食物中提供至少一种多核苷酸，所述多核苷酸包括至少一种沉默元件，所述沉默元件包括与具有选自由靶基因序列组组成的组的核苷酸序列的靶基因互补的至少18、19、20或21个连续核苷酸。在特定的实施例中，靶基因选自由以下组成的组：SEQ ID NOs：2、5、7、9、13、21、26、27、29、36、37、39、44、47、87、95、99、103、301、309、318、319、320、321、323、324、328、341、343、346、356、358、359、503、504、505、506、509、510、530、532、533、542、545、546、547、549、551、552、553、559、560、561、563、564、570、572、573、581、593、596、602、611、612、620、665、666、672、717、730、731、736、737、738、740、741、742、743、749、757、760、761、763、766、808、809、810、814、815、817、818、821、822、1104、1105、1106、1111、1113、1116、1121、1123、1124、1132、1133、1147、1156、1157、1163、1166、1187、1190、1192、1195、1196、1216、1217、1240、1243、1251、1263、1264、1265、1270、1275、1279、1283、1290、1308、1310、1316、1318、1320、1564、1565、1569、1622和1623。在一些实施例中，沉默元件包括选自触发物序列组的一个或多个核苷酸序列。在一些实施例中，多核苷酸是双链RNA。一些实施例涉及一种导致鳞翅目害虫的死亡或较低的繁殖力的方法，所述方法包括在鳞翅目害虫的食物中提供至少一种RNA，所述RNA包括至少一种与鳞翅目害虫幼虫的靶基因序列的片段基本上相同或基本上互补的沉默元件，其中通过鳞翅目害虫摄取该RNA导致鳞翅目害虫死亡或较低的繁殖力。在一些实施例中，靶基因选自由靶基因序列组中的基因组成的组。在一些实施例中，该方法导致变态率降低或摄食活性减少。在一些实施例中，该方法可用于提供对鳞翅目害虫侵染具有增加的抗性的植物。
几个实施例涉及一种提供对鳞翅目害虫侵染具有改善的抗性的植物的方法，其包括向植物局部施用包括至少一种多核苷酸的组合物，所述多核苷酸具有18个或更多个连续核苷酸的至少一个区段，其具有与具有选自靶基因序列组、触发物序列组或其任何一种的DNA互补序列的序列的相应DNA片段具有约95％至约100％同一性的序列(例如，与该相应DNA片段具有100％同一性的序列的21个连续核苷酸的区段)。在实施例中，提供对鳞翅目害虫侵染具有改善的抗性的植物的方法包括向植物局部施用包括至少一种多核苷酸的组合物，所述多核苷酸包括与具有选自由以下组成的组的核苷酸序列的靶基因或从靶基因转录的RNA的至少18个连续核苷酸互补的核苷酸序列：SEQ ID NOs：2、5、7、9、13、21、26、27、29、36、37、39、44、47、87、95、99、103、301、309、318、319、320、321、323、324、328、341、343、346、356、358、359、503、504、505、506、509、510、530、532、533、542、545、546、547、549、551、552、553、559、560、561、563、564、570、572、573、581、593、596、602、611、612、620、665、666、672、717、730、731、736、737、738、740、741、742、743、749、757、760、761、763、766、808、809、810、814、815、817、818、821、822、1104、1105、1106、1111、1113、1116、1121、1123、1124、1132、1133、1147、1156、1157、1163、1166、1187、1190、1192、1195、1196、1216、1217、1240、1243、1251、1263、1264、1265、1270、1275、1279、1283、1290、1308、1310、1316、1318、1320、1564、1565、1569、1622和1623。在实施例中，提供对鳞翅目害虫侵染具有改善的抗性的植物的方法包括以以下方式将包括至少一种多核苷酸的组合物局部施用至所述植物，所述方式使得有效量的多核苷酸被以所述植物为食的鳞翅目害虫摄取，所述多核苷酸包括与具有选自由以下组成的组的核苷酸序列的靶基因或从靶基因转录的RNA互补的至少18个连续核苷酸：SEQ ID NOs：2、5、7、9、13、21、26、27、29、36、37、39、44、47、87、95、99、103、301、309、318、319、320、321、323、324、328、341、343、346、356、358、359、503、504、505、506、509、510、530、532、533、542、545、546、547、549、551、552、553、559、560、561、563、564、570、572、573、581、593、596、602、611、612、620、665、666、672、717、730、731、736、737、738、740、741、742、743、749、757、760、761、763、766、808、809、810、814、815、817、818、821、822、1104、1105、1106、1111、1113、1116、1121、1123、1124、1132、1133、1147、1156、1157、1163、1166、1187、1190、1192、1195、1196、1216、1217、1240、1243、1251、1263、1264、1265、1270、1275、1279、1283、1290、1308、1310、1316、1318、1320、1564、1565、1569、1622和1623。在一些实施例中，多核苷酸包括选自触发物序列组的一个或多个核苷酸序列。在一些实施例中，多核苷酸是双链RNA。几个实施例涉及包括多核苷酸的组合物，所述组合物被配制成用于施用到作物植物的领域，例如，在可喷雾溶液或乳液、罐混合物或粉末中。
几个实施例涉及一种用于控制鳞翅目害虫的杀虫组合物，其包括杀虫有效量的至少一种多核苷酸分子，所述多核苷酸分子包括18个或更多个连续核苷酸的至少一个区段，所述连续核苷酸与具有选自靶基因序列组、触发物序列组或其任何一种的DNA互补序列的序列的相应DNA片段基本上相同或互补(例如，与该相应DNA片段具有100％同一性或互补性的序列的21个连续核苷酸的区段)。在一些实施例中，多核苷酸分子包括与具有选自由以下组成的组的核苷酸序列的靶基因或从靶基因转录的RNA互补的至少18个连续核苷酸：SEQID NOs：2、5、7、9、13、21、26、27、29、36、37、39、44、47、87、95、99、103、301、309、318、319、320、321、323、324、328、341、343、346、356、358、359、503、504、505、506、509、510、530、532、533、542、545、546、547、549、551、552、553、559、560、561、563、564、570、572、573、581、593、596、602、611、612、620、665、666、672、717、730、731、736、737、738、740、741、742、743、749、757、760、761、763、766、808、809、810、814、815、817、818、821、822、1104、1105、1106、1111、1113、1116、1121、1123、1124、1132、1133、1147、1156、1157、1163、1166、1187、1190、1192、1195、1196、1216、1217、1240、1243、1251、1263、1264、1265、1270、1275、1279、1283、1290、1308、1310、1316、1318、1320、1564、1565、1569、1622和1623。在一些实施例中，多核苷酸包括选自触发物序列组的一个或多个核苷酸序列。在一些实施例中，多核苷酸分子是重组多核苷酸。在一些实施例中，多核苷酸分子是RNA。在一些实施例中，多核苷酸分子是双链RNA。相关的实施例包含杀虫组合物，所述杀虫组合物包括配制用于施用到农作植物领域的多核苷酸分子，例如以可喷雾的溶液或乳液、罐混合物或粉末形式，并且任选地包括一种或多种额外组分，如载剂药剂、表面活性剂、阳离子脂质、有机硅氧烷、有机硅氧烷表面活性剂、多核苷酸除草分子、非多核苷酸除草分子、非多核苷酸杀虫剂、安全剂(safener)和昆虫生长调节剂。
几个实施例涉及一种提供对鳞翅目害虫侵染具有改善的抗性的植物的方法，所述方法包括在所述植物中表达至少一种多核苷酸，所述多核苷酸包括18个或更多个连续核苷酸的至少一个区段，所述连续核苷酸与具有选自靶基因序列组、触发物序列组或其任何一种的DNA互补序列的序列的相应DNA片段基本上相同或互补(例如，与该相应DNA片段具有100％同一性或互补性的序列的21个连续核苷酸的区段)。在一些实施例中，多核苷酸包括选自触发物序列组的一个或多个核苷酸序列。在一些实施例中，多核苷酸是双链RNA。
几个实施例涉及一种重组DNA构建体，其包括与DNA元件可操作地连接的异源启动子，所述DNA元件包括18个或更多个连续核苷酸的至少一个区段，其具有与具有选自靶基因序列组、触发物序列组或其任何一种的DNA互补序列的序列的相应DNA片段具有约95％至约100％的同一性的序列(例如，与该相应DNA片段具有100％同一性的序列的21个连续核苷酸的区段)。在一些实施例中，DNA元件编码双链RNA。在一些实施例中，双链RNA包括选自触发物序列组的一个或多个核苷酸序列。相关的实施例包含植物染色体或质体或重组植物病毒载体或重组杆状病毒载体，其包括重组DNA构建体，或包括不含异源启动子的DNA元件。
几个实施例涉及一种转基因作物植物细胞，在该转基因作物植物细胞的基因组中具有编码RNA的重组DNA，所述RNA在接触或摄取RNA的鳞翅目害虫中抑制靶基因的表达，其中所述RNA包括至少一种沉默元件，所述沉默元件具有与靶基因的片段互补的18个或更多个连续核苷酸的至少一个区段。在一些实施例中，靶基因选自靶基因序列组。特定的实施例是一种转基因作物植物细胞，在该转基因作物植物细胞的基因组中具有编码用于沉默一个或多个选自靶基因序列组的靶基因的RNA的重组DNA。在一些实施例中，RNA包括选自触发物序列组的一个或多个核苷酸序列。
几个实施例涉及一种分离的重组RNA分子，该重组RNA分子当被鳞翅目害虫摄入或接触时导致鳞翅目害虫的死亡或生长发育迟缓，其中该重组RNA分子包括18个或更多个连续核苷酸的至少一个区段，所述连续核苷酸与具有选自靶基因序列组、触发物序列组或其任何一种的DNA互补序列的序列的相应DNA片段基本上互补(例如，具有与该相应DNA片段具有100％互补性的序列的21个连续核苷酸的区段)。在一些实施例中，重组RNA分子是双链RNA。特定的实施例包括一种分离的重组双链RNA分子，其具有具有选自由以下组成的组的序列的链：SEQ ID NOs：115、116、119、121、123、127、135、140、141、143、150、151、153、158、161、201、209、213、217、434、442、451、452、453、454、456、457、461、474、476、479、489、491、492、521、522、523、524、527、528、536、538、539、823、826、827、828、830、832、833、834、840、841、842、844、845、851、853、854、862、874、877、883、892、893、901、946、947、953、998、1011、1012、1017、1018、1019、1021、1022、1023、1024、1030、1038、1041、1042、1044、1047、1089、1090、1091、1095、1096、1098、1099、1102、1103、1334、1335、1336、1341、1343、1346、1351、1353、1354、1362、1363、1377、1386、1387、1393、1396、1417、1420、1422、1425、1426、1446、1447、1470、1473、1481、1493、1494、1495、1500、1505、1509、1513、1520、1538、1540、1546、1548、1550、1624、1625、1629、1682或1683或其组合。另一实施例涉及一种分离的重组双链RNA分子，其具有具有选自由以下组成的组的序列的链：SEQ ID NOs：434、442、451、452、453、454、456、457、461、474、476、479、489、491、492、521、522、523、524、527、528、536、538和539或其组合。
几个实施例涉及一种提供对鳞翅目害虫侵染具有改善的抗性的植物的方法，其包括向植物提供至少一种多核苷酸，该多核苷酸包括与选自靶基因序列组的靶基因的相应片段基本上相同或互补的18个或更多个连续核苷酸的至少一个区段(例如，具有与所述相应片段具有100％同一性或互补性的序列的21个连续核苷酸的区段)。在实施例中，提供对鳞翅目害虫侵染具有改善的抗性的植物的方法包括向植物提供至少一种多核苷酸，该多核苷酸包括与靶基因或从靶基因转录的RNA的至少18个连续核苷酸相同或互补的至少一个区段，其中靶基因选自由在靶基因序列组中鉴定的基因组成的组。在一些实施例中，多核苷酸包括选自触发物序列组的一个或多个核苷酸序列。在一些实施例中，多核苷酸是双链RNA。
几个实施例涉及一种用于控制植物的鳞翅目害虫侵染的方法，其包括使鳞翅目害虫与多核苷酸接触，所述多核苷酸包括18个或更多个连续核苷酸的至少一个区段，所述连续核苷酸与选自靶基因序列组的靶基因的DNA的等效长度的相应片段基本上相同或互补(例如，具有与所述相应片段具有100％同一性或互补性的序列的21个连续核苷酸的区段)。在一些实施例中，多核苷酸是双链RNA。
几个实施例涉及一种从植物基因组或动物基因组(例如，昆虫和节肢动物)中选择用于RNAi介导的沉默的靶基因的方法。在各种实施例中，该方法提供了靶基因的子集，所述靶基因以单拷贝数或低拷贝数(非重复和非冗余)存在于特定基因组，或具有低核苷酸多样性，或具有同义(Ks)与非同义(Ka)核苷酸变化比率的，其中Ks＞＞Ka。
几个实施例涉及包括至少一种如本文所述的多核苷酸的人造组合物。在一些实施例中，提供了可用于局部施用至需要保护免受鳞翅目害虫侵染的植物或物质的配方。在一些实施例中，提供了可用于制备转基因作物植物细胞和转基因作物植物的重组构建体和载体。在一些实施例中，提供了可用于处理作物植物、作物植物种子或可繁殖部分如块茎的配方和涂层。在一些实施例中，提供了由用如本文所述的多核苷酸处理或含有如本文所述的多核苷酸的此类作物植物、种子或可繁殖部分生产的商品产品和食品(特别是具有可检测量的如本文所述的多核苷酸的商品产品和食品)。几个实施例涉及多克隆抗体或单克隆抗体，其结合由选自靶基因序列组的序列或序列片段编码的蛋白质。另一方面涉及多克隆抗体或单克隆抗体，其结合由选自触发物序列组或其互补序列的序列或序列片段编码的蛋白质。此类抗体通过如本领域普通技术人员已知的常规方法制备。
在本文描述的各种实施例中，植物可以是经受鳞翅目害虫侵染的任何植物。特别感兴趣的是其中植物是[植物名称科]的实施例。实例包括选自由[特定作物植物名称]组成的组的植物。实施例包含其中植物是未发芽的作物植物种子、营养阶段的作物植物或生殖阶段的作物植物的那些实施例。
本发明的其他方面和特定实施例在下面的具体实施方式中公开。
具体实施方式
I.定义
除非另外定义，否则所使用的所有技术术语和科学术语均具有与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。在以单数形式提供术语的情况下，发明人还考虑了由该术语的复数形式描述的本发明的方面。在通过引用并入的参考文献中使用的术语和定义存在差异的情况下，本申请中使用的术语应具有本文给出的定义。所使用的其他技术术语在它们所使用的领域中具有它们的普通含义，如通过各种领域专用词典，例如，“美国
Figure BDA0004022386480000091
科学词典”(美国传统词典的编辑(Editors ofthe American HeritageDictionaries)，2011，霍顿·米夫林出版公司(HoughtonMifflinHarcourt)，波士顿和纽约)，“麦格劳-希尔科学和技术术语词典(McGraw-Hill Dictionary of Scientific andTechnical Terms)”(第6版，2002，麦格劳-希尔，纽约)，或“牛津生物学词典(OxfordDictionary ofBiology)”(第6版，2008，牛津大学出版社(Oxford University Press)，牛津和纽约)所举例说明的。发明人不意图局限于作用的机制或模式。对其的引用仅出于说明的目的提供。
除非另有说明，否则本说明书的正文中的核酸序列在从左至右阅读时，按5′至3′方向给出。本领域的技术人员将会意识到，给定的DNA序列被理解为定义了相应的RNA序列，除了用尿嘧啶(U)核苷酸替换DNA的胸腺嘧啶(T)核苷酸之外，该RNA序列与DNA序列相同。因此，提供特定的DNA序列被理解为定义了精确的RNA等价物，并且关于DNA序列的术语“同一性”或“基本上相同”包含符合这些标准的RNA序列，除了胸腺嘧啶核苷酸被尿嘧啶核苷酸代替。给定的第一多核苷酸序列，无论是DNA还是RNA，进一步定义了其精确互补序列(其可以是DNA或RNA)，即通过形成沃森-克里克碱基对与第一多核苷酸完美杂交的第二多核苷酸的序列。对于DNA：DNA双链体(杂交链)，碱基对是腺嘌呤：胸腺嘧啶或鸟嘌呤：胞嘧啶；对于DNA：RNA双链体，碱基对是腺嘌呤：尿嘧啶或鸟嘌呤：胞嘧啶。因此，完全杂交的钝端双链多核苷酸的核苷酸序列(其中在链之间存在“100％互补性”或者其中链是“互补的”)通过提供一条链的核苷酸序列(无论是以DNA还是RNA给出)来明确定义。与靶基因或靶基因的片段“基本上相同”或“基本上互补”意指多核苷酸链(或双链多核苷酸的至少一条链)被设计成与靶基因或靶基因的片段或靶基因或靶基因的片段的转录物杂交(通常在生理条件下，如在活的植物或动物细胞中发现的生理条件下)；本领域技术人员将理解，此类杂交不一定需要100％的序列同一性或互补性。当第一核酸序列与第二核酸序列处于功能关系时，第一核酸序列与第二核酸序列“可操作地”连接(connected)或“连接(linked)”。例如，如果启动子提供DNA的转录或表达，则启动子序列与DNA“可操作地连接”。通常，可操作地连接的DNA序列是连续的。
术语“多核苷酸”通常是指含有多个核苷酸的DNA或RNA分子，并且通常是指“寡核苷酸”(长度为18-25个核苷酸的多核苷酸分子)和26个或更多个核苷酸的更长的多核苷酸。多核苷酸还包含含有多个核苷酸的分子，所述多个核苷酸包含如本领域通常实践的非规范核苷酸或化学修饰的核苷酸；参见，例如，在技术手册“RNA干扰(RNAi)和DsiRNA”，2011(整合DNA技术公司(Integrated DNA Technologies)，爱荷华州科拉尔维尔(Coralville、Iowa))中公开的化学修饰。通常，如本文所述的多核苷酸，无论是DNA或RNA或两者，并且无论是单链还是双链，包含18个或更多个连续核苷酸的至少一个区段(或者，在双链多核苷酸的情况下，至少18个连续碱基对)，所述连续核苷酸与靶基因的DNA或靶基因的RNA转录物的同等大小的片段基本上相同或互补。在整个本公开中，“至少18个连续的”意指“约18至约10,000，包含其间的每个整数点”。因此，本发明的实施例包含长度为18-25个核苷酸的寡核苷酸(18-mers、19-mers、20-mers、21-mers、22-mers、23-mers、24-mers或25-mers)，或长度为26个或更多个核苷酸的中等长度多核苷酸(26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、约65、约70、约75、约80、约85、约90、约95、约100、约110、约120、约130、约140、约150、约160、约170、约180、约190、约200、约210、约220、约230、约240、约250、约260、约270、约280、约290或约300个核苷酸的多核苷酸)或长度大于约300个核苷酸的长多核苷酸(例如，长度为约300至约400个核苷酸、约400至约500个核苷酸、约500至约600个核苷酸、约600至约700个核苷酸、约700至约800个核苷酸、约800至约900个核苷酸、约900至约1000个核苷酸、约300至约500个核苷酸、约300至约600个核苷酸、约300至约700个核苷酸、约300至约800个核苷酸、约300至约900个核苷酸，或约1000个核苷酸，或甚至长度大于约1000个核苷酸，例如高达靶基因的全长(包含靶基因的编码部分或非编码部分或编码部分和非编码部分两者)的多核苷酸)。在多核苷酸是双链的情况下，其长度可以类似地用碱基对来描述。
本文描述的多核苷酸可以是单链(ss)或双链(ds)。“双链”是指通常在生理学相关条件下，在充分互补的反平行核酸链之间发生的碱基配对，以形成双链核酸结构。实施例包括其中多核苷酸选自由有义单链DNA(ssDNA)、有义单链RNA(ssRNA)、双链RNA(dsRNA)、双链DNA(dsDNA)、双链DNA/RNA杂交体、反义ssDNA或反义ssRNA组成的组的那些；可以使用这些类型中的任何一种的多核苷酸的混合物。在一些实施例中，多核苷酸是双链RNA，其长度大于天然存在的调节性小RNA(如内源性产生的siRNA和成熟miRNA)的典型长度。在一些实施例中，多核苷酸是长度至少约30个连续碱基对的双链RNA。在一些实施例中，多核苷酸是长度在约50至约500个碱基对之间的双链RNA。在一些实施例中，多核苷酸可以包含除了标准核糖核苷酸以外的组分，例如，实施例是一种包括末端脱氧核糖核苷酸的RNA。
实施例为作物植物提供了针对鳞翅目害虫的保护。作物植物包含但不限于：谷类作物植物(如小麦、燕麦、大麦、玉米、黑麦、黑小麦、水稻、小米、高粱、藜麦、苋菜和荞麦)；饲料作物植物(如饲料草和饲料双子叶植物，包含苜蓿、野豌豆、三叶草等)；油料作物植物(如棉花、红花、向日葵、大豆、油菜、油菜籽、亚麻、花生和油棕)；树坚果(如核桃、腰果、榛子、山核桃、杏仁等)；甘蔗、椰子、椰枣、橄榄、甜菜、茶叶、咖啡；产木材或纸浆的树木；蔬菜作物植物，如豆类(例如，豆类、豌豆、扁豆、苜蓿、花生)、莴苣、芦笋、朝鲜蓟、芹菜、胡萝卜、萝卜、芸苔(例如，卷心菜、羽衣甘蓝、芥菜、芥菜以及其他多叶芸苔、花椰菜、球芽甘蓝、芜菁、大头菜)、可食用的瓜类(例如，黄瓜、甜瓜、夏季南瓜、冬季南瓜)、可食用的蒜类(例如，洋葱、大蒜、韭菜、葱、细香葱)、茄科的可食用成员(例如，番茄、茄子、土豆、辣椒、酸樱桃)和藜科的可食用成员(例如，甜菜、甜菜、菠菜、藜麦、苋菜)；水果作物植物如苹果、梨、柑橘类水果(例如，柑橘、酸橙、柠檬、葡萄柚等)、核果类水果(例如，杏、桃、李、油桃)、香蕉、菠萝、葡萄、猕猴桃、木瓜、鳄梨和浆果。
在各种实施例中，本文所述的多核苷酸包括天然存在的核苷酸，如那些存在于DNA和RNA中的核苷酸。在某些实施例中，多核苷酸是核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的组合，例如，主要由核糖核苷酸组成但具有一个或多个末端脱氧核糖核苷酸或一个或多个末端双脱氧核糖核苷酸的合成多核苷酸，或主要由脱氧核糖核苷酸组成但具有一个或多个末端双脱氧核糖核苷酸的合成多核苷酸。在某些实施例中，多核苷酸包括非典型核苷酸，如肌苷、硫尿苷或假尿苷。在某些实施例中，多核苷酸包括化学修饰的核苷酸。化学修饰的寡核苷酸或多核苷酸的实例在本领域是熟知的；参见，例如，美国专利公开2011/0171287、美国专利公开2011/0171176、美国专利公开2011/0152353、美国专利公开2011/0152346和美国专利公开2011/0160082，它们通过引用并入本文。说明性的实例包含但不限于天然存在的寡核苷酸或多核苷酸的磷酸二酯主链，其可以用硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间连接修饰部分地或完全修饰，修饰的核苷碱基或修饰的糖可以用于寡核苷酸或多核苷酸合成，并且寡核苷酸或多核苷酸可以用荧光部分(例如荧光素或罗丹明)或其他标记物(例如生物素)标记。
几个实施例涉及一种多核苷酸，其包括18个或更多个连续核苷酸的至少一个区段，其具有与具有选自靶基因序列组或触发物序列组或其任何一种的RNA转录物，或前述中的任何一种的DNA或RNA互补序列的序列的DNA或靶基因的等效长度的片段具有约95％至约100％同一性的序列。在一些实施例中，连续核苷酸的数目为至少18，例如18-24，或18-28，或20-30，或20-50，或20-100，或50-100，或50-500，或100-250，或100-500，或200-1000，或500-2000，或者甚至更多。在一些实施例中，连续核苷酸的数目大于18，例如19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30，或大于30，例如至少约35、至少约40、至少约45、至少约50、至少约55、至少约60、至少约65、至少约70、至少约75、至少约80、至少约85、至少约90、至少约95、至少约100、至少约110、至少约120、至少约130、至少约140、至少约150、至少约160、至少约170、至少约180、至少约190、至少约200、至少约210、至少约220、至少约230、至少约240、至少约250、至少约260、至少约270、至少约280、至少约290、至少约300、至少约350、至少约400、至少约450、至少约500或大于500个连续核苷酸。在一些实施例中，多核苷酸包括至少18、19、20或21个(如通篇使用的提及至少18、19、20或21旨在意指所述组的这些下限中的任何一个可以是个体化的)连续核苷酸的至少一个区段，所述区段具有与具有选自靶基因序列组或触发物序列组或前述中任何一个的DNA或RNA互补序列的序列的DNA或靶基因的等效长度的片段具有100％同一性的序列。在一些实施例中，多核苷酸是双链核酸(例如，dsRNA)，其中一条链包括至少18、19、20或21个连续核苷酸的至少一个区段，该区段与具有选自靶基因序列组或触发物序列组或前述中任何一个的DNA或RNA互补序列的序列的DNA或靶基因的等效长度的片段具有100％同一性；以碱基对的形式表达，此类双链核酸包括至少18个连续的、完全匹配的碱基对的至少一个区段，其对应于具有选自靶基因序列组或触发物序列组，或前述中任何一个的DNA或RNA互补序列的序列的DNA或靶基因的等效长度的片段。在一些实施例中，多核苷酸中含有的每个区段的长度大于天然存在的调节性小RNA的典型长度，例如，每个区段的长度为至少约30个连续核苷酸(或碱基对)。在一些实施例中，多核苷酸的总长度或多核苷酸中含有的每个区段的长度小于具有选自靶基因序列组或触发物序列组的序列的DNA或靶基因的总长度。在一些实施例中，多核苷酸的总长度为约50至约500个核苷酸(对于单链多核苷酸)或碱基对(对于双链多核苷酸)。在一些实施例中，多核苷酸是约100至约500个碱基对的dsRNA，如表1A、1B和1C中公开的dsRNA触发物中的任何一种的长度的dsRNA。实施例包括其中在植物中表达的多核苷酸是包括具有选自由以下组成的组的序列的区段的RNA的那些实施例：SEQ ID NOs：2、5、7、9、13、21、26、27、29、36、37、39、44、47、87、95、99、103、301、309、318、319、320、321、323、324、328、341、343、346、356、358、359、503、504、505、506、509、510、530、532、533、542、545、546、547、549、551、552、553、559、560、561、563、564、570、572、573、581、593、596、602、611、612、620、665、666、672、717、730、731、736、737、738、740、741、742、743、749、757、760、761、763、766、808、809、810、814、815、817、818、821、822、1104、1105、1106、1111、1113、1116、1121、1123、1124、1132、1133、1147、1156、1157、1163、1166、1187、1190、1192、1195、1196、1216、1217、1240、1243、1251、1263、1264、1265、1270、1275、1279、1283、1290、1308、1310、1316、1318、1320、1564、1565、1569、1622和1623或其互补序列。在一些实施例中，多核苷酸在植物中表达。在一些实施例中，将多核苷酸局部提供至植物或鳞翅目害虫的表面。
几个实施例涉及被设计成通过诱导对鳞翅目害虫靶基因的调节或抑制来调节表达的多核苷酸。在一些实施例中，多核苷酸被设计成具有与鳞翅目害虫靶基因或cDNA(例如，靶基因序列组)的核苷酸序列或从鳞翅目害虫靶基因转录的RNA的序列基本上相同或基本上互补的核苷酸序列，其可以是编码序列或非编码序列。这些调节表达的有效多核苷酸分子在本文中可以被称为“多核苷酸”、“多核苷酸触发物”、“触发物”或“触发物”。
在本文所述的各种方法和组合物中，可以单独或组合使用任何大小的有效多核苷酸。在一些实施例中，单个多核苷酸触发物用于制备组合物(例如，用于局部施用的组合物，或可用于制备转基因植物的重组DNA构建体)。在其他实施例中，使用不同多核苷酸触发物的混合物或池；在此类情况下，多核苷酸触发物可以是针对单个靶基因或针对多个靶基因。
如本文所使用的，术语“分离的”是指将一种分子与其他分子分离，所述其他分子通常以其初始或天然状态与之缔合。因此，术语“分离的”可以指已经从其他DNA分子中分离出来的DNA分子，所述其他DNA分子通常以其初始或天然状态与其缔合。此类DNA分子可以以重组状态存在，如重组DNA分子。因此，与它们通常与其不缔合的调控或编码序列融合的DNA分子，例如作为重组技术的结果，被认为是分离的，即使作为转基因整合到细胞的染色体中或与其他DNA分子一起存在。
如本文所用，术语“靶基因序列组”是指由以下组成的序列的组：SEQ ID NOs：1-114、229-361、495-511；530-535、542-822、1104-1333和1564-1623。如本文所用，术语“触发物序列组”是指由以下组成的序列的组：SEQ ID NOs：115-228、362-494、512-529、536-541、823-1103、1334-1563和1624-1683。
在各种实施例中，鳞翅目害虫是选自由夜蛾和小菜蛾组成的组的至少一种昆虫。夜蛾物种的实例是草地贪夜蛾(草地粘虫)。小菜蛾物种的实例是小菜蛾(小菜蛾)。鳞翅目害虫可以处于发育的任何阶段。
几个实施例涉及一种设计成用于抑制一种或多种基因(“靶基因”)的多核苷酸。术语“基因”是指提供转录物的表达或编码转录物的核酸的任何部分。“基因”可以包含但不限于启动子区、5′非翻译区域、可以包含内含子区的转录物编码区域、3′非翻译区域或这些区域的组合。在一些实施例中，靶基因可以包含编码序列或非编码序列或两者。在其他实施例中，靶基因具有与信使RNA相同或互补的序列，例如，在一些实施例中，靶基因是cDNA。在特定实施例中，多核苷酸被设计成抑制一个或多个靶基因，其中每个靶基因由选自靶基因序列组的DNA序列编码。在各种实施例中，多核苷酸被设计成抑制一个或多个靶基因，其中每个靶基因由选自靶基因序列组的序列编码，并且可以被设计成抑制来自该组的多个靶基因，或者靶向这些靶基因中的一个或多个的不同区域。在一个实施例中，多核苷酸包括21个连续核苷酸的多个区段，其与具有选自靶基因序列组或触发物序列组或其任何一种的RNA转录物，或前述中的任何一种的DNA或RNA互补序列的序列的DNA或靶基因的等效长度的片段具有100％的同一性。在此类情况下，每个区段在大小或序列上可以相同或不同，并且相对于靶基因可以是有义或反义的。例如，在一个实施例中，多核苷酸包括串联或重复排列的多个区段，其中每个区段包括21个连续核苷酸，其具有与具有选自靶基因序列组或触发物序列组或前述中任何一种的DNA或RNA互补序列的序列的DNA或靶基因的等效长度的片段具有100％同一性的序列。在一些实施例中，区段可以来自靶基因的不同区域，例如，区段可以对应于靶基因的不同外显子区域。在一些实施例中，不对应于靶基因的“间隔”核苷酸可以任选地用于区段之间或邻近区段。
其他定义在以下章节中提供。
II.通过与多核苷酸接触来控制鳞翅目害虫
本文提供了通过使鳞翅目害虫与多核苷酸接触来控制植物的鳞翅目害虫侵染的方法，所述多核苷酸包括18个或更多个连续核苷酸的至少一个区段，所述18个或更多个连续核苷酸与选自由以下组成的组的DNA或靶基因的相应片段具有约95％至约100％的同一性或互补性：靶基因序列组或触发物序列组，或其任何一种的RNA转录物，或前述中的任何一种的DNA或RNA互补序列。在实施例中，用于控制植物的鳞翅目害虫侵染的方法包括将鳞翅目害虫与多核苷酸接触，所述多核苷酸包括与靶基因的相应片段具有100％同一性的至少18个连续核苷酸，所述靶基因具有选自由以下组成的组的DNA序列：SEQ ID NOs：2、5、7、9、13、21、26、27、29、36、37、39、44、47、87、95、99、103、301、309、318、319、320、321、323、324、328、341、343、346、356、358、359、503、504、505、506、509、510、530、532、533、542、545、546、547、549、551、552、553、559、560、561、563、564、570、572、573、581、593、596、602、611、612、620、665、666、672、717、730、731、736、737、738、740、741、742、743、749、757、760、761、763、766、808、809、810、814、815、817、818、821、822、1104、1105、1106、1111、1113、1116、1121、1123、1124、1132、1133、1147、1156、1157、1163、1166、1187、1190、1192、1195、1196、1216、1217、1240、1243、1251、1263、1264、1265、1270、1275、1279、1283、1290、1308、1310、1316、1318、1320、1564、1565、1569、1622和1623或其任何一种的RNA转录物，或前述中的任何一种的DNA或RNA互补序列。在一些实施例中，多核苷酸是双链RNA。在一些实施例中，多核苷酸(例如，双链RNA)是化学或酶促合成的，或者通过在微生物中表达或通过在植物细胞中表达而产生的。实施例包含其中多核苷酸是dsRNA的实施例，所述dsRNA包括具有选自触发物序列组的序列的链。在该方法中使用的多核苷酸可以被设计成用于多个靶基因。本发明的相关方面包含用于所述方法的分离的多核苷酸和通过所述方法提供的具有改善的鳞翅目抗性的植物。特定实施例包含其中多核苷酸是dsRNA的那些，所述dsRNA包括选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO：115、116、119、121、123、127、135、140、141、143、150、151、153、158、161、201、209、213、217、434、442、451、452、453、454、456、457、461、474、476、479、489、491、492、521、522、523、524、527、528、536、538、539、823、826、827、828、830、832、833、834、840、841、842、844、845、851、853、854、862、874、877、883、892、893、901、946、947、953、998、1011、1012、1017、1018、1019、1021、1022、1023、1024、1030、1038、1041、1042、1044、1047、1089、1090、1091、1095、1096、1098、1099、1102、1103、1334、1335、1336、1341、1343、1346、1351、1353、1354、1362、1363、1377、1386、1387、1393、1396、1417、1420、1422、1425、1426、1446、1447、1470、1473、1481、1493、1494、1495、1500、1505、1509、1513、1520、1538、1540、1546、1548、1550、1624、1625、1629、1682或1683或其互补序列。其他特定实施例包含其中多核苷酸是dsRNA的那些，所述dsRNA包括选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NOs：434、442、451、452、453、454、456、457、461、474、476、479、489、491、492、521、522、523、524、527、528、536、538和539或其组合。
在一些实施例中，连续核苷酸具有与具有选自靶基因序列组或其任何RNA转录物或前述中的任何一种的DNA或RNA互补序列的序列的DNA或靶基因的等效长度的片段具有约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同一性的序列。在一些实施例中，连续核苷酸与具有选自靶基因序列组或触发物序列组或其任何RNA转录物或前述中的任何一种的DNA或RNA互补序列的序列的DNA或靶基因的等效长度的片段完全(100％)相同。在一些实施例中，多核苷酸具有与具有选自靶基因序列组或触发物序列组，或前述中的任何一种的DNA或RNA互补序列的序列的DNA或靶基因的等效长度的片段具有约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同一性的总体序列。
在实施例中，多核苷酸包括21个连续核苷酸的至少一个区段，所述21个连续核苷酸与靶基因的相应片段具有100％同一性，所述靶基因具有选自由以下组成的组的DNA序列：SEQ ID NOs：2、5、7、9、13、21、26、27、29、36、37、39、44、47、87、95、99、103、301、309、318、31 9、320、321、323、324、328、341、343、346、356、358、359、503、504、505、506、509、510、530、532、533、542、545、546、547、549、551、552、553、559、560、561、563、564、570、572、573、581、593、596、602、611、612、620、665、666、672、717、730、731、736、737、738、740、741、742、743、749、757、760、761、763、766、808、809、810、814、815、817、818、821、822、1104、1105、1106、1111、1113、1116、1121、1123、1124、1132、1133、1147、1156、1157、1163、1166、1187、1190、1192、1195、1196、1216、1217、1240、1243、1251、1263、1264、1265、1270、1275、1279、1283、1290、1308、1310、1316、1318、1320、1564、1565、1569、1622和1623或其任何RNA转录物，或前述中的任何一种的DNA或RNA互补序列。在一些实施例中，除了与靶基因的相应片段具有100％同一性的21个连续核苷酸的一个或多个区段之外，多核苷酸包括“中性”序列(与靶基因没有序列同一性或互补性的序列)，因此多核苷酸作为整体与靶基因具有低得多的总体序列同一性。
在该方法中使用的多核苷酸的总长度可以大于18个连续核苷酸，并且可以包含除了连续核苷酸之外的核苷酸，所述连续核苷酸具有与具有选自由靶基因序列组或触发物序列组，或其任何RNA转录物，或前述中的任何一种的DNA或RNA互补序列的序列的DNA或靶基因的等效长度的片段具有约95％至约100％同一性的序列。换句话说，多核苷酸的总长度可以大于设计成抑制一个或多个靶基因的多核苷酸的部分(section)或区段的长度，其中每个靶基因具有选自由靶基因序列组组成的组的DNA序列。例如，多核苷酸可以具有位于抑制靶基因的18个或更多个连续核苷酸的至少一个区段的“活性”区段侧翼的核苷酸，或者在活性区段之间包含“间隔”核苷酸，或者可以在5′端或在3′端或在5′端和3′端两者处具有额外的核苷酸。在实施例中，多核苷酸可以包含与DNA或靶基因不特异性地相关(具有与DNA或靶基因不互补或不相同的序列)的额外核苷酸(例如，提供稳定二级结构或便于克隆或制造的核苷酸)，所述DNA或靶基因具有选自由靶基因序列组或触发物序列组或其任何RNA转录物或其DNA或RNA互补序列组成的组的序列。在实施例中，多核苷酸可以包含定位成与18个或更多个连续核苷酸的一个或多个区段直接相邻的额外核苷酸，所述连续核苷酸具有与选自由靶基因序列组或触发物序列组或其任何RNA转录物或前述中的任何一种的DNA或RNA互补序列组成的组的序列的等效长度的片段具有约95％至约100％的同一性的序列。在实施例中，多核苷酸包括一个这种区段，在该区段附近具有额外的5′G或额外的3′C或两者。在另一实施例中，多核苷酸是包括额外核苷酸以形成突出端的双链RNA，例如，包括2个脱氧核糖核苷酸以形成3′突出端的dsRNA。因此，在各种实施例中，整个多核苷酸的核苷酸序列与具有选自靶基因序列组、触发物序列组或其任何的DNA互补序列的序列的DNA或靶基因中的连续核苷酸的序列不100％相同或互补。例如，在一些实施例中，多核苷酸包括至少两个区段，每个区段具有21个连续核苷酸，其具有与具有选自靶基因序列组或触发物序列组或前述中的任何一种的DNA互补序列的序列的DNA的片段具有100％同一性的序列，其中(1)所述至少两个区段被一个或多个间隔核苷酸分隔，或(2)所述至少两个区段以不同于其中相应片段在DNA中出现的顺序的顺序布置，所述DNA具有选自由靶基因序列组或触发物序列组或前述中的任何一种的DNA互补序列组成的组的序列。
用于该方法中的多核苷酸通过本领域技术人员已知的合适手段提供。实施例包含其中多核苷酸是化学或酶促合成的(例如，通过体外转录，如使用T7聚合酶或其他聚合酶的转录)、通过在微生物中或在细胞培养物(如在培养物中生长的植物或昆虫细胞)中表达产生、通过在植物细胞中表达产生或者通过微生物发酵产生的那些实施例。
在一些实施例中，用于该方法的多核苷酸作为分离的DNA或RNA片段提供。在一些实施例中，用于该方法的多核苷酸不是表达构建体的一部分，并且缺少额外的元件，如启动子或终止子序列。此类多核苷酸可以相对较短，如约18至约300或约50至约500个核苷酸(对于单链多核苷酸)或约18至约300或约50至约500个碱基对(对于双链多核苷酸)的单链或双链多核苷酸。在一些实施例中，多核苷酸是约100至约500个碱基对的dsRNA，如表1A、1B和1C中公开的dsRNA触发物中的任何一种的长度的dsRNA。可替代地，多核苷酸可以在更复杂的构建体中提供，例如作为重组表达构建体的一部分，或者被包含在重组载体中，例如被包含在重组植物病毒载体或重组杆状病毒载体中。在一些实施例中，此类重组表达构建体或载体被设计成包含额外的元件，如用于表达感兴趣的基因(例如，杀虫蛋白)的表达盒。
几个实施例涉及一种用于控制植物的鳞翅目害虫侵染的方法，其包括使鳞翅目害虫与包括18个或更多个连续核苷酸的至少一个区段的多核苷酸接触，所述区段与选自由在靶基因序列组中鉴定的基因组成的组的靶基因的DNA的等效长度的片段基本上相同或互补。在一些实施例中，多核苷酸包括dsRNA，所述dsRNA带有具有选自由触发物序列组组成的组的序列的链。在一些实施例中，本发明提供了一种用于控制植物的鳞翅目害虫侵染的方法，其包括使鳞翅目害虫与有效量的包括来自触发物序列组的双链RNA的溶液接触，该溶液进一步包括一种或多种选自由有机硅氧烷表面活性剂或阳离子脂质组成的组的组分。
在该方法的各种实施例中，接触包括向鳞翅目害虫的表面施用包括用于该方法的多核苷酸的合适的组合物；这种组合物可以例如作为固体、液体(包含均质混合物如溶液和非均质混合物如悬浮液、胶体、胶束和乳液)、粉末、悬浮液、乳液、喷雾、胶囊化或微囊化配方提供，在微珠或其他载剂颗粒中或在微珠或其他载剂颗粒上，在膜或涂层中，或在基质上或在基质内提供，或作为种子处理剂提供。接触可以是种子处理的形式，或“种薯(seedpotato)”块茎或块茎的块的处理形式(例如，通过浸泡、涂覆或撒粉种薯)。合适的粘合剂、惰性载剂、表面活性剂等可以任选地包含在组合物中，如农药和种子处理剂的配方领域的技术人员已知的。在一些实施例中，接触包括在组合物中提供多核苷酸，该组合物进一步包括一种或多种选自由以下组成的组的组分：载剂药剂、表面活性剂、阳离子脂质(如在通过引用并入本文的美国专利申请公开2011/0296556的实例18中公开的阳离子脂质)、有机硅氧烷、有机硅氧烷表面活性剂、多核苷酸除草分子、非多核苷酸除草分子、非多核苷酸杀虫剂、安全剂和昆虫生长调节剂。在一些实施例中，所述接触包括在组合物中提供所述多核苷酸，所述组合物进一步包括至少一种选自由以下组成的组的杀虫剂：马铃薯糖蛋白(patatin)、植物凝集素、植物蜕皮甾类、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)杀虫蛋白、嗜线虫杆菌(Xenorhabdus)杀虫蛋白、发光杆菌(Photorhabdus)杀虫蛋白、侧孢芽胞杆菌(Bacillus laterosporous)杀虫蛋白和球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)杀虫蛋白。在一个实施例中，接触包括提供在组合物中的多核苷酸，所述组合物可以被鳞翅目害虫摄入或以其他方式内部吸收。
预期当与用单独的多核苷酸或单独的非多核苷酸杀虫剂获得的效果相比时，用于该方法的某些多核苷酸(例如，在工作实例中描述的多核苷酸触发物)与一种或多种非多核苷酸杀虫剂的组合将导致在预防或控制鳞翅目害虫侵染方面的增强的改善。在实施例中，发现含有一种或多种多核苷酸和一种或多种非多核苷酸杀虫剂的组合物以实现对鳞翅目害虫侵染的改善的预防或控制，所述非多核苷酸杀虫剂选自由以下组成的组：马铃薯糖蛋白、植物凝集素、植物蜕皮甾类、苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白、嗜线虫杆菌杀虫蛋白、发光杆菌杀虫蛋白、侧孢芽孢杆菌杀虫蛋白和球形芽孢杆菌杀虫蛋白。
III.通过提供食物多核苷酸控制鳞翅目昆虫侵染
本发明的另一方面提供了一种用于控制植物的鳞翅目害虫侵染的方法，其包括在鳞翅目害虫的食物中提供一种药剂，所述药剂包含多核苷酸，该多核苷酸具有18个或更多个连续核苷酸的至少一个区段，其具有与具有选自由以下组成的组的序列的DNA的等效长度的片段具有约95％至约100％同一性的序列：靶基因序列组、触发物序列组或其DNA互补序列，其中所述药剂在被鳞翅目害虫摄取后起作用以抑制鳞翅目害虫内的生物学功能，从而控制通过鳞翅目害虫的侵染。多核苷酸可以比它含有的一个或多个区段长，但是每个多核苷酸区段和相应的DNA片段具有等效长度。在该方法中使用的多核苷酸可以被设计成用于多个靶基因。实施例包含其中药剂包括dsRNA的那些实施例，所述dsRNA包括具有选自触发物序列组或其互补序列的序列的链，或者其中所述药剂包括多核苷酸或RNA，其由选自由以下组成的组的序列编码：SEQ ID NOs：SEQ ID NO：115、116、119、121、123、127、135、140、141、143、150、151、153、158、161、201、209、213、217、434、442、451、452、453、454、456、457、461、474、476、479、489、491、492、521、522、523、524、527、528、536、538、539、823、826、827、828、830、832、833、834、840、841、842、844、845、851、853、854、862、874、877、883、892、893、901、946、947、953、998、1011、1012、1017、1018、1019、1021、1022、1023、1024、1030、1038、1041、1042、1044、1047、1089、1090、1091、1095、1096、1098、1099、1102、1103、1334、1335、1336、1341、1343、1346、1351、1353、1354、1362、1363、1377、1386、1387、1393、1396、1417、1420、1422、1425、1426、1446、1447、1470、1473、1481、1493、1494、1495、1500、1505、1509、1513、1520、1538、1540、1546、1548、1550、1624、1625、1629、1682或1683。在另一实施例中，药剂包括由选自由以下组成的组的序列编码的多核苷酸或RNA：SEQ ID NOs：434、442、451、452、453、454、456、457、461、474、476、479、489、491、492、521、522、523、524、527、528、536、538和539或其组合。在实施例中，提供了一种用于控制植物的鳞翅目害虫侵染的方法，其包括在鳞翅目害虫的食物中提供多核苷酸，所述多核苷酸包括与具有选自由以下组成的组的核苷酸序列的靶基因或从靶基因转录的RNA的至少18个连续核苷酸互补的核苷酸序列：SEQID NOs：2、5、7、9、13、21、26、27、29、36、37、39、44、47、87、95、99、103、301、309、318、319、320、321、323、324、328、341、343、346、356、358、359、503、504、505、506、509、510、530、532、533、542、545、546、547、549、551、552、553、559、560、561、563、564、570、572、573、581、593、596、602、611、612、620、665、666、672、717、730、731、736、737、738、740、741、742、743、749、757、760、761、763、766、808、809、810、814、815、817、818、821、822、1104、1105、1106、1111、1113、1116、1121、1123、1124、1132、1133、1147、1156、1157、1163、1166、1187、1190、1192、1195、1196、1216、1217、1240、1243、1251、1263、1264、1265、1270、1275、1279、1283、1290、1308、1310、1316、1318、1320、1564、1565、1569、1622和1623。在一些实施例中，多核苷酸是双链RNA。在一些实施例中，多核苷酸(例如，双链RNA)是化学或酶促合成的，或者通过在微生物中表达或通过在植物细胞中表达而产生的。本发明的相关方面包含用于所述方法的分离的多核苷酸和通过所述方法提供的具有改善的鳞翅目抗性的植物。
在各种实施例中，包括多核苷酸的药剂包括微生物细胞或者在微生物中产生。例如，药剂可以包含细菌或酵母细胞或者可以在细菌或酵母细胞中产生。在其他实施例中，包括多核苷酸的药剂包括转基因植物细胞或在植物细胞(例如瞬时表达多核苷酸的植物细胞)中产生；此类植物细胞可以是植物中的细胞或在组织培养物或细胞悬浮液中生长的细胞。
在各种实施例中，包括多核苷酸的药剂以适合于摄入的形式被提供以用于通过鳞翅目害虫的食物摄取，例如，作为固体、液体(包含均质混合物如溶液和非均质混合物如悬浮液、胶体、胶束和乳液)、粉末、悬浮液、乳液、喷雾、胶囊化或微囊化配方提供，在微珠或其他载剂颗粒中或在微珠或其他载剂颗粒上，在膜或涂层中，或在基质上或在基质内提供，或作为种子处理剂提供。包括多核苷酸的药剂可以通过将所述药剂施用于经受鳞翅目害虫侵染的植物，或通过将所述药剂施用于植物的种子，例如通过喷雾、撒粉或涂布植物，或通过施用土壤淋洗液，或通过在人工食物中提供而被提供以用于通过鳞翅目害虫的食物吸收。包括多核苷酸的药剂可以在人工食物中被提供用于通过鳞翅目害虫的食物吸收，所述人工食物被配制以满足用于维持鳞翅目害虫的特定营养需求，其中所述人工食物补充有一些量的多核苷酸，所述多核苷酸从单独的来源获得，如化学合成或从微生物发酵纯化；该实施例可用于例如确定有效多核苷酸治疗方案的定时和量。在一些实施例中，包括多核苷酸的药剂以植物细胞的形式或在植物细胞组分中，或在微生物(如细菌或酵母)或微生物发酵产物中，或在合成或人造的食物中被提供以用于通过鳞翅目害虫的食物吸收。在一个实施例中，包括多核苷酸的药剂以被鳞翅目害虫摄取的诱饵的形式提供。包括多核苷酸的药剂可以以种子处理剂的形式，或以处理“种薯”块茎或块茎的块的形式(例如，通过浸泡、涂覆或撒粉种薯)被提供以用于通过鳞翅目害虫的食物吸收。合适的粘合剂、惰性载剂、表面活性剂等可以任选地包含在药剂中，如农药和种子处理剂的配方领域的技术人员已知的。在一些实施例中，包括多核苷酸的药剂进一步包括一种或多种选自由以下组成的组的组分：载剂药剂、表面活性剂、阳离子脂质(如在通过引用并入本文的美国专利申请公开2011/0296556的实例18中公开的阳离子脂质)、有机硅氧烷、有机硅氧烷表面活性剂、多核苷酸除草分子、非多核苷酸除草分子、非多核苷酸杀虫剂、安全剂和昆虫生长调节剂。在一些实施例中，包括多核苷酸的药剂进一步包括至少一种选自由以下组成的组的杀虫剂：马铃薯糖蛋白、植物凝集素、植物蜕皮甾类、植物蜕皮甾类、苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白、嗜线虫杆菌杀虫蛋白、发光杆菌杀虫蛋白、侧孢芽胞杆菌杀虫蛋白和球形芽孢杆菌杀虫蛋白。其他蛋白质包括毒素(Basel)2019Jul1；11(7)中描述的植物来源的蛋白质。在一些实施例中，包括多核苷酸的药剂包括至少一种选自由植入植物中的颗粒、粒料或胶囊组成的组的可植入配方；在此类实施例中，该方法包括在植物中植入可植入配方。在一些实施例中，包括多核苷酸的药剂包括至少一种沟内配方，所述沟内配方选自由粉末、颗粒、粒料、胶囊、喷雾剂或淋洗液，或任何其他适合施用于沟的形式组成的组；在此类实施例中，该方法包括用沟内配方进行沟内处理。在一些实施例中，所述方法包括用所述药剂处理茄科植物种子、马铃薯块茎或马铃薯块茎的块。
预期当与用单独的多核苷酸或单独的非多核苷酸杀虫剂获得的效果相比时，在用于该方法的试剂中使用的某些多核苷酸(例如，工作实例中描述的多核苷酸触发物)与一种或多种非多核苷酸杀虫剂的组合将在预防或控制鳞翅目害虫侵染方面的增强的改善在实施例中，当在食物中提供给鳞翅目害虫时，发现含有一种或多种多核苷酸和一种或多种非多核苷酸杀虫剂的组合物以实现对鳞翅目害虫侵染的改善的预防或控制，所述非多核苷酸杀虫剂选自由以下组成的组：马铃薯糖蛋白、植物凝集素、植物蜕皮甾类、苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白、嗜线虫杆菌杀虫蛋白、发光杆菌杀虫蛋白、侧孢芽孢杆菌杀虫蛋白和球形芽孢杆菌杀虫蛋白。
在一些实施例中，用于该方法的多核苷酸是dsRNA，所述dsRNA包括具有选自触发物序列组或其互补序列的序列的区段，或者其中多核苷酸由选自由以下组成的组的序列编码：SEQ ID NO：115、116、119、121、123、127、135、140、141、143、150、151、153、158、161、201、209、213、217、434、442、451、452、453、454、456、457、461、474、476、479、489、491、492、521、522、523、524、527、528、536、538、539、823、826、827、828、830、832、833、834、840、841、842、844、845、851、853、854、862、874、877、883、892、893、901、946、947、953、998、1011、1012、1017、1018、1019、1021、1022、1023、1024、1030、1038、1041、1042、1044、1047、1089、1090、1091、1095、1096、1098、1099、1102、1103、1334、1335、1336、1341、1343、1346、1351、1353、1354、1362、1363、1377、1386、1387、1393、1396、1417、1420、1422、1425、1426、1446、1447、1470、1473、1481、1493、1494、1495、1500、1505、1509、1513、1520、1538、1540、1546、1548、1550、1624、1625、1629、1682或1683。在另一实施例中，药剂包括由选自由以下组成的组的序列编码的多核苷酸或RNA：SEQ ID NOs：434、442、451、452、453、454、456、457、461、474、476、479、489、491、492、521、522、523、524、527、528、536、538和539或其组合。
在一些实施例中，连续核苷酸具有与具有选自靶基因序列组或触发物序列组或其任何RNA转录物或前述中的任何一种的DNA或RNA互补序列的序列的DNA或靶基因的等效长度的片段至少约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同一性的序列。在一些实施例中，连续核苷酸与具有选自靶基因序列组或触发物序列组或其任何RNA转录物或前述中的任何一种的DNA或RNA互补序列的序列的DNA或靶基因的等效长度的片段完全(100％)相同。在一些实施例中，所述多核苷酸具有与具有选自靶基因序列组或触发物序列组或其任何RNA转录物或前述中的任何一种的DNA或RNA互补序列的序列的DNA或靶基因的等效长度的片段具有至少约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同一性的总体序列。在实施例中，多核苷酸包括21个连续核苷酸的至少一个区段，所述21个连续核苷酸序列具有与靶基因的相应片段具有100％同一性的序列，所述靶基因具有选自由以下组成的组的DNA序列：SEQ ID NOs：2、5、7、9、13、21、26、27、29、36、37、39、44、47、87、95、99、103、301、309、31 8、31 9、320、321、323、324、328、341、343、346、356、358、359、503、504、505、506、509、510、530、532、533、542、545、546、547、549、551、552、553、559、560、561、563、564、570、572、573、581、593、596、602、611、612、620、665、666、672、717、730、731、736、737、738、740、741、742、743、749、757、760、761、763、766、808、809、810、814、815、817、818、821、822、1104、1105、1106、1111、1113、1116、1121、1123、1124、1132、1133、1147、1156、1157、1163、1166、1187、1190、1192、1195、1196、1216、1217、1240、1243、1251、1263、1264、1265、1270、1275、1279、1283、1290、1308、1310、1316、1318、1320、1564、1565、1569、1622和1623或其DNA互补序列；在一些实施例中，除了与靶基因的相应片段具有100％同一性的21个连续核苷酸的区段之外，多核苷酸还包括“中性”序列(与靶基因没有序列同一性或互补性)，因此多核苷酸作为整体与靶基因具有低得多的总体序列同一性。
用于该方法的多核苷酸通常被设计成抑制一个或多个基因(“靶基因”)。在其他实施例中，靶基因具有与信使RNA相同或互补的序列，例如，在一些实施例中，靶基因是cDNA。在特定的实施例中，多核苷酸被设计成抑制一个或多个靶基因，其中每个靶基因具有选自由靶基因序列组组成的组的DNA序列。在各种实施例中，多核苷酸被设计成抑制一个或多个靶基因，其中每个靶基因具有选自由靶基因序列组组成的组的序列，并且可以被设计成抑制来自该组的多个靶基因，或者靶向这些靶基因中的一个或多个靶基因的不同区域。在实施例中，多核苷酸包括21个连续核苷酸的多个区段，其具有与具有选自靶基因序列组或触发物序列组或其任何RNA转录物，或前述中的任何一种的DNA或RNA互补序列的序列的DNA或靶基因的等效长度的片段具有100％同一性的序列。在此类情况下，每个区段在大小或序列上可以相同或不同，并且相对于靶基因可以是有义或反义的。例如，在一个实施例中，多核苷酸包括串联或重复排列的多个区段，其中每个区段包括21个连续核苷酸，其具有与具有选自靶基因序列组或触发物序列组或其任何RNA转录物或前述中的任何一种的DNA或RNA互补序列的序列的DNA或靶基因的等效长度的片段具有100％同一性的序列；所述区段可以来自靶基因的不同区域，例如，所述区段可以对应于靶基因的不同外显子区域，并且不对应于靶基因的“间隔”核苷酸可以任选地用于区段之间或邻近区段。
用于该方法的多核苷酸的总长度可以大于18个连续核苷酸，并且可以包含除了具有与具有选自靶基因序列组或触发物序列组，或其任何RNA转录物，或前述中的任何一种的DNA或RNA互补序列的序列的DNA或靶基因的等效长度的片段具有约95％至约100％同一性的序列的连续核苷酸之外的核苷酸。换句话说，多核苷酸的总长度可以大于设计成抑制一个或多个靶基因的多核苷酸的部分或区段的长度，其中每个靶基因具有选自由靶基因序列组或触发物序列组组成的组的DNA序列。例如，多核苷酸可以具有位于抑制靶基因的18个或更多个连续核苷酸的至少一个区段的“活性”区段侧翼的核苷酸，或者在活性区段之间包含“间隔”核苷酸，或者可以在5′端或在3′端或在5′端和3′端两者处具有额外的核苷酸。在实施例中，多核苷酸可以包含与DNA或靶基因不特异性地相关(具有与DNA或靶基因不互补或不相同的序列)的额外核苷酸(例如，提供稳定二级结构或便于克隆或制造的核苷酸)，所述DNA或靶基因具有选自由靶基因序列组、触发物序列组或其任何RNA互补序列组成的组的序列。在实施例中，多核苷酸可以包含定位成与18个或更多个连续核苷酸的一个或多个区段直接相邻的额外核苷酸，所述连续核苷酸具有与具有选自靶基因序列组、触发物序列组或其任何一种的DNA互补序列的序列的DNA或靶基因的等效长度的片段具有约95％至约100％同一性的序列。在实施例中，多核苷酸包括一个这种区段，在该区段附近具有额外的5′G或额外的3′C或两者。在另一实施例中，多核苷酸是包括额外核苷酸以形成突出端的双链RNA，例如，包括2个脱氧核糖核苷酸以形成3′突出端的dsRNA。因此，在各种实施例中，整个多核苷酸的核苷酸序列与具有选自靶基因序列组、触发物序列组或其任何的DNA互补序列的序列的DNA或靶基因中的连续核苷酸的序列不100％相同或互补。例如，在一些实施例中，多核苷酸包括21个连续核苷酸的至少两个区段，所述21个连续核苷酸具有与具有选自靶基因序列组、触发物序列组，或其任何的DNA互补序列的序列的DNA的片段具有100％同一性的序列，其中(1)所述至少两个区段被一个或多个间隔核苷酸分隔，或(2)所述至少两个区段以不同于其中相应片段在DNA中出现的顺序的顺序布置，所述DNA具有选自靶基因序列组、触发物序列组，或其任何一种的DNA互补序列的序列。
用于该方法中的多核苷酸通过本领域技术人员已知的合适手段提供。实施例包含其中多核苷酸是化学或酶促合成的(例如，通过体外转录，如使用T7聚合酶或其他聚合酶的转录)、通过在微生物中或在细胞培养物(如在培养物中生长的植物或昆虫细胞)中表达产生、通过在植物细胞中表达产生或者通过微生物发酵产生的那些实施例。
在一些实施例中，用于该方法的多核苷酸作为分离的DNA或RNA片段提供。在一些实施例中，用于该方法的多核苷酸不是表达构建体的一部分，并且缺少额外的元件，如启动子或终止子序列。此类多核苷酸可以相对较短，如约18至约300或约50至约500个核苷酸(对于单链多核苷酸)或约18至约300或约50至约500个碱基对(对于双链多核苷酸)的单链或双链多核苷酸。在一些实施例中，多核苷酸是约100至约500个碱基对的dsRNA，如表1A、1B和1C中公开的dsRNA触发物中的任何一种的长度的dsRNA。可替代地，多核苷酸可以在更复杂的构建体中提供，例如作为重组表达构建体的一部分，或者被包含在重组载体中，例如被包含在重组植物病毒载体或重组杆状病毒载体中。在一些实施例中，此类重组表达构建体或载体被设计成包含额外的元件，如用于表达感兴趣的基因(例如，杀虫蛋白)的表达盒。
IV.通过提供食物RNA控制鳞翅目昆虫侵染
本发明的另一方面提供了一种通过在幼虫的食物中提供至少一种多核苷酸引起鳞翅目害虫的幼虫死亡或发育迟缓的方法，所述多核苷酸包括至少一种沉默元件，该沉默元件包括与具有选自靶基因序列组的核苷酸序列的靶基因或由靶基因转录的RNA互补的至少18、19、20或21个连续核苷酸。在一些实施例中，多核苷酸是双链RNA。在一些实施例中，多核苷酸(例如，双链RNA)是化学或酶促合成的，或者通过在微生物中表达或通过在植物细胞中表达而产生的。在实施例中，提供了一种引起鳞翅目害虫幼虫的死亡或发育迟缓的方法，其包括在鳞翅目害虫幼虫的食物中提供至少一种RNA，所述RNA包括至少一种与鳞翅目害虫幼虫的靶基因序列的片段基本上相同或基本上互补的沉默元件，其中所述靶基因序列选自靶基因序列组，并且其中所述RNA被鳞翅目害虫幼虫摄取导致鳞翅目害虫幼虫的死亡或发育迟缓。本发明的相关方面是包括至少一种沉默元件的RNA，其中所述至少一种沉默元件与鳞翅目害虫幼虫的靶基因的片段基本上相同或基本上互补，其中所述靶基因序列选自靶基因序列组。RNA可以比它含有的一个或多个沉默元件更长，但是每个沉默元件和靶基因序列的相应片段具有等效长度。用于该方法的RNA可以针对多个靶基因进行设计。实施例包括其中RNA包括dsRNA的实施例，该dsRNA带有具有选自触发物序列组的序列的链。在相关的方面，提供了一种引起鳞翅目害虫的死亡或较低的生殖力的方法，其包括在鳞翅目害虫的食物中提供至少一种RNA，所述RNA包括至少一种与鳞翅目害虫幼虫的靶基因序列的片段基本上相同或基本上互补的沉默元件，其中所述靶基因序列选自靶基因序列组、触发物序列组或其任何一种的DNA互补序列，并且其中所述RNA被鳞翅目害虫摄取导致鳞翅目害虫的死亡或较低的生殖力。本发明的相关方面包括用于所述方法的分离的RNA和由所述方法提供的具有改良的鳞翅目抗性的植物。
在各种实施例中，提供RNA的食物包括微生物细胞或者在微生物中产生。例如，提供RNA的食物可以包含细菌或酵母细胞或者可以在细菌或酵母细胞中产生。在类似的实施例中，提供RNA的食物包括转基因植物细胞或者在植物细胞(例如瞬时表达多核苷酸的植物细胞)中产生；此类植物细胞可以是植物中的细胞或在组织培养物或细胞悬浮液中生长的细胞。
在一个实施例中，提供RNA的食物以遭受鳞翅目害虫侵染的任何植物的形式提供，其中在植物中或在植物上含有RNA。此类植物可以是表达RNA的稳定转基因植物，或者是瞬时表达RNA的非转基因植物，或者是已经用RNA处理(例如，通过喷雾或涂覆)的非转基因植物。稳定转基因植物通常含有整合到其基因组中的编码RNA的重组构建体。特别感兴趣的是其中植物是作物植物的实施例。
在各种实施例中，提供RNA的食物以适合于被鳞翅目害虫摄取的形式被提供，例如，作为固体、液体(包含均质混合物如溶液和非均质混合物如悬浮液、胶体、胶束和乳液)、粉末、悬浮液、乳液、喷雾、胶囊化或微囊化配方提供，在微珠或其他载剂颗粒中或在微珠或其他载剂颗粒上，在膜或涂层中，或在基质上或在基质内提供，或作为种子处理剂提供。提供RNA的食物可以通过将食物适用于遭受鳞翅目害虫侵染的植物来提供，例如通过对植物进行喷雾、撒粉或涂覆，或通过施用土壤淋洗液，或通过在人工食物中提供。在一个实施例中，提供重组RNA的食物以被鳞翅目害虫摄取的诱饵的形式提供。提供RNA的食物可以是配制成满足用于维持鳞翅目害虫的特定营养需要的人工食物，其中人工食物补充有一定量的RNA，所述RNA从单独的来源获得，如化学合成或从微生物发酵纯化；该实施例可用于例如确定有效多核苷酸治疗方案的定时和量。在一些实施例中，提供RNA的食物以植物细胞或植物细胞组分的形式提供，或在微生物(如细菌或酵母)或微生物发酵产物中，或在合成的食物中提供。在一个实施例中，提供RNA的食物以被鳞翅目害虫摄取的诱饵的形式提供。提供RNA的食物可以以种子处理剂的形式，或以处理“种薯”块茎或块茎的块的形式(例如，通过浸泡、涂覆或撒粉种薯)被提供。合适的粘合剂、惰性载剂、表面活性剂等可以任选地包含在食物中，如农药和种子处理剂的配方领域的技术人员已知的。在一些实施例中，提供RNA的食物进一步包括一种或多种选自由以下组成的组的组分：载剂药剂、表面活性剂、阳离子脂质(如在通过引用并入本文的美国专利申请公开2011/0296556的实例18中公开的阳离子脂质)、有机硅氧烷、有机硅氧烷表面活性剂、多核苷酸除草分子、非多核苷酸除草分子、非多核苷酸杀虫剂、安全剂和昆虫生长调节剂。在一些实施例中，提供RNA的食物进一步包括至少一种选自由以下组成的组的杀虫剂：马铃薯糖蛋白、植物凝集素、植物蜕皮甾类、苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白、嗜线虫杆菌杀虫蛋白、发光杆菌杀虫蛋白、侧孢芽胞杆菌杀虫蛋白和球形芽孢杆菌杀虫蛋白。在一些实施例中，提供RNA的食物包括至少一种选自由植入植物中的颗粒、粒料或胶囊组成的组的可植入配方；在此类实施例中，该方法包括在植物中植入所述可植入配方。在一些实施例中，提供RNA的食物包含至少一种沟内配方，所述沟内配方选自由粉末、颗粒、粒料、胶囊、喷雾剂或淋洗液，或任何其他适合施用于沟的形式组成的组；在此类实施例中，该方法包含用沟内配方进行沟内处理。在一些实施例中，所述方法包括用所述药剂处理茄科植物种子、马铃薯块茎或马铃薯块茎的块。
预期当与用单独的RNA或单独的非多核苷酸杀虫剂获得的效果相比时，用于该方法的某些RNA(例如，工作实例中描述的dsRNA触发物)与一种或多种非多核苷酸杀虫剂的组合将在预防或控制鳞翅目害虫侵染方面的增强的改善。在实施例中，发现含有一种或多种RNA和一种或多种非多核苷酸杀虫剂的组合物以实现对鳞翅目害虫侵染的改善的预防或控制，所述非多核苷酸杀虫剂选自由以下组成的组：马铃薯糖蛋白、植物凝集素、植物蜕皮甾类、苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白、嗜线虫杆菌杀虫蛋白、发光杆菌杀虫蛋白、侧孢芽孢杆菌杀虫蛋白和球形芽孢杆菌杀虫蛋白。
用于该方法的RNA可以是单链(ss)的或双链(ds)的。该方法的实施例包含其中RNA是选自由以下组成的组中的至少一种的实施例：有义单链RNA(ssRNA)、反义单链RNA(ssRNA)或双链RNA(dsRNA)；可以使用这些类型中的任何一种的RNA的混合物。在一个实施例中，使用双链DNA/RNA杂交体。RNA可以包含除了标准核糖核苷酸以外的组分，例如，一个实施例是包括末端脱氧核糖核苷酸的RNA。
该RNA包括至少一个沉默元件，其中该沉默元件与鳞翅目害虫幼虫的靶基因的片段基本上相同(作为RNA等价物)或基本上互补，其中该靶基因序列选自靶基因序列组。在一些实施例中，沉默元件具有与具有选自靶基因序列组的序列的DNA的等效长度的片段至少约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％相同或互补的序列。在一些实施例中，沉默元件与具有选自靶基因序列组、触发物序列组或其任何一种的DNA互补序列的序列的DNA的等效长度的片段完全(100％)相同或完全(100％)互补(作为RNA等价物)。在一些实施例中，含有沉默元件的RNA具有与具有选自靶基因序列组的序列的DNA的片段具有约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同一性或互补性的总体序列。
在一些实施例中，沉默元件包括18个或更多个连续核苷酸的至少一个区段，其具有与靶基因的等效长度的片段具有约95％至约100％的同一性或互补性的序列。在一些实施例中，沉默元件包括18个或更多个连续核苷酸的至少一个区段，其具有与具有选自靶基因序列组或触发物序列组或其任何一种的DNA互补序列的序列的DNA的等效长度的片段具有约95％至约100％同一性或互补性的序列。在一些实施例中，沉默元件包括18个或更多个连续核苷酸的至少一个区段，例如，在18-24之间，或在18-28之间，或在20-30之间，或在20-50之间，或在20-100之间，或在50-100之间，或在50-500之间，或在100-250之间，或在100-500之间，或在200-1000之间，或在500-2000之间，或者甚至更大。在一些实施例中，沉默元件包括多于18个连续核苷酸，例如，19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或大于30，例如，至少约35、至少约40、至少约45、至少约50、至少约55、至少约60、至少约65、至少约70、至少约75、至少约80、至少约85、至少约90、至少约95、至少约100、至少约110、至少约120、至少约130、至少约140、至少约150、至少约160、至少约170、至少约180、至少约190、至少约200、至少约210、至少约220、至少约230、至少约240、至少约250、至少约260、至少约270、至少约280、至少约290、至少约300、至少约350、至少约400、至少约450、至少约500或大于500个连续核苷酸。在特定的实施例中，沉默元件包括至少18、19、20或21个连续核苷酸的至少一个区段，其具有与具有选自靶基因序列组、触发物序列组或其任何一种的DNA互补序列的序列的DNA或靶基因的等效长度的片段具有100％同一性的序列。在特定的实施例中，RNA是双链核酸(例如dsRNA)，其中一条链包括至少18、19、20或21个连续核苷酸的至少一个区段，其具有与具有选自靶基因序列组、触发物序列组或其任何一种的DNA互补序列的序列的DNA或靶基因的等效长度的片段具有100％同一性的序列；以碱基对表示，此类双链核酸包括至少18、19、20或21个连续的、完全匹配的碱基对的至少一个区段，其对应于具有选自靶基因序列组、触发物序列组或其任何一种的DNA互补序列的序列的DNA或靶基因的等效长度的片段。在特定的实施例中，RNA中含有的每个沉默元件的长度大于天然存在的调节性小RNA的典型长度，例如，每个区段的长度为至少约30个连续核苷酸(或碱基对)。在一些实施例中，RNA的总长度或RNA中含有的每个沉默元件的长度小于感兴趣的序列(具有选自靶基因序列组或触发物序列组的序列的DNA或靶基因)的总长度。在一些实施例中，RNA的总长度在约50至约500个核苷酸(对于单链多核苷酸)或碱基对(对于双链多核苷酸)之间。在一些实施例中，RNA是约100至约500个碱基对的dsRNA，如表1A、1B和1C中公开的dsRNA触发物中的任何一种的长度的dsRNA。实施例包含其中RNA是dsRNA的那些实施例，所述dsRNA包括具有选自由以下组成的组的序列的区段：SEQ ID NO：115、116、119、121、123、127、135、140、141、143、150、151、153、158、161、201、209、213、217、434、442、451、452、453、454、456、457、461、474、476、479、489、491、492、521、522、523、524、527、528、536、538、539、823、826、827、828、830、832、833、834、840、841、842、844、845、851、853、854、862、874、877、883、892、893、901、946、947、953、998、1011、1012、1017、1018、1019、1021、1022、1023、1024、1030、1038、1041、1042、1044、1047、1089、1090、1091、1095、1096、1098、1099、1102、1103、1334、1335、1336、1341、1343、1346、1351、1353、1354、1362、1363、1377、1386、1387、1393、1396、1417、1420、1422、1425、1426、1446、1447、1470、1473、1481、1493、1494、1495、1500、1505、1509、1513、1520、1538、1540、1546、1548、1550、1624、1625、1629、1682或1683或其组合。在另一实施例中，药剂包括由选自由以下组成的组的序列编码的多核苷酸或RNA：SEQ ID NOs：434、442、451、452、453、454、456、457、461、474、476、479、489、491、492、521、522、523、524、527、528、536、538和539或其组合。
用于该方法中的RNA通常被设计成抑制一种或多种基因(“靶基因”)。在一些实施例中，靶基因可以包含编码序列或非编码序列或两者。在其他实施例中，靶基因具有与信使RNA相同或互补的序列，例如，在一些实施例中，靶基因是cDNA。在特定的实施例中，RNA被设计成抑制一个或多个靶基因，其中每个靶基因具有选自靶基因序列组或触发物序列组的DNA序列。在各种实施例中，RNA被设计成抑制一个或多个基因，其中每个基因具有选自靶基因序列组或触发物序列组的序列，并且可以被设计成抑制来自该组的多个基因，或者靶向这些基因中的一个或多个的不同区域。在实施例中，RNA包括多个沉默元件，每个沉默元件包括21个连续核苷酸的至少一个区段，其具有与具有选自靶基因序列组、触发物序列组或其任何一种的DNA互补序列的序列的DNA的等效长度的片段具有100％同一性或100％互补性的序列。在此类情况下，每个沉默元件在大小上或在序列上可以相同或不同，并且相对于靶基因可以是有义的或反义的。例如，在一个实施例中，RNA可以包含串联或重复排列的多个沉默元件，其中每个沉默元件包括21个连续核苷酸的至少一个区段，其具有与具有选自靶基因序列组或触发物序列组或其任何一种的DNA互补序列的序列的DNA的等效长度的片段具有100％同一性或100％互补性的序列；区段可以来自靶基因的不同区域，例如，区段可以对应于靶基因的不同外显子区域，并且不对应于靶基因的“间隔”核苷酸可以任选地用于区段之间或邻近区段。
RNA的总长度可以大于18个连续核苷酸，并且可以包含除了沉默元件之外的核苷酸，所述沉默元件具有与具有选自靶基因序列组、触发物序列组或其任何一种的DNA互补序列的序列的DNA或靶基因的等效长度的片段具有约95％至约100％同一性或互补性的序列。换句话说，RNA的总长度可以大于设计成用于抑制一个或多个靶基因的沉默元件的长度，其中每个靶基因具有选自由靶基因序列组组成的组的DNA序列。例如，RNA可以具有位于抑制靶基因的18个或更多个连续核苷酸的至少一个区段的“活性”沉默元件侧翼的核苷酸，或者在活性沉默元件之间包含“间隔”核苷酸，或者可以在5′端处或在3′端处或在5′端和3′端两者处具有额外的核苷酸。在实施例中，RNA包括与DNA或靶基因不特异性地相关(具有与DNA或靶基因不互补或不相同的序列)的额外核苷酸(例如，提供稳定二级结构或便于克隆或制造的核苷酸)，所述DNA或靶基因具有选自靶基因序列组或触发物序列组或其任何一种的RNA互补序列的序列。在实施例中，RNA包括定位成与18个或更多个连续核苷酸的一个或多个沉默元件直接相邻的额外核苷酸，所述沉默元件具有与具有选自靶基因序列组、触发物序列组或其任何一种的DNA互补序列的序列的DNA或靶基因的等效长度的片段具有约95％至约100％同一性或互补性的序列。在实施例中，RNA包括一个这种沉默元件，在该沉默元件附近具有额外的5′G或额外的3′C或两者。在另一实施例中，RNA是包括额外核苷酸以形成突出端的双链RNA，例如，包括2个脱氧核糖核苷酸以形成3′突出端的dsRNA。因此，在各种实施例中，整个RNA的核苷酸序列与具有选自靶基因序列组、触发物序列组或其任何一种的DNA互补序列的序列的DNA或靶基因中的连续核苷酸的片段不是100％相同或互补的。例如，在一些实施例中，RNA包括至少两个沉默元件，每个沉默元件具有21个连续核苷酸，其序列与具有选自靶基因序列组、触发物序列组或其任何一种的DNA互补序列的序列的DNA的片段具有100％同一性，其中(1)至少两个沉默元件被一个或多个间隔核苷酸分开，或者(2)至少两个沉默元件以不同于其中相应片段出现在具有选自靶基因序列组、触发物序列组或其任何一种的DNA互补序列的序列的DNA中的顺序排列。
在一些实施例中，RNA由天然存在的核糖核苷酸组成。在某些实施例中，RNA包括除核糖核苷酸以外的组分，例如，主要由核糖核苷酸组成但具有一个或多个末端脱氧核糖核苷酸或一个或多个末端双脱氧核糖核苷酸的合成RNA。在某些实施例中，RNA包括非典型核苷酸，如肌苷、硫尿苷或假尿苷。在某些实施例中，RNA包括化学修饰的核苷酸。
用于该方法中的RNA通过本领域技术人员已知的合适手段提供实施例包含其中RNA是化学或酶促合成的(例如，通过体外转录，如使用T7聚合酶或其他聚合酶的转录)、通过在微生物中或在细胞培养物(如在培养物中生长的植物或昆虫细胞)中表达产生、通过在植物细胞中表达产生或者通过微生物发酵产生的那些实施例。
在一些实施例中，RNA作为分离的RNA提供，该分离的RNA不是表达构建体的一部分并且缺少额外的元件，如启动子或终止子序列。此类RNA可以相对较短，如约18至约300或约50至约500个核苷酸(对于单链RNA)或约18至约300或约50至约500个碱基对(对于双链RNA)的单链或双链RNA。可替代地，RNA可以在更复杂的构建体中提供，例如作为重组表达构建体的一部分，或者被包含在重组载体中，例如被包含在重组植物病毒载体或重组杆状病毒载体中。在一些实施例中，此类重组表达构建体或载体被设计成包含额外的元件，如包含编码适体或核酶的额外的RNA或用于表达感兴趣的基因(例如，杀虫蛋白)的表达盒。
V.提供对鳞翅目侵染具有改善的抗性的植物的方法，以及由此提供的植物、植物 部分和种子
几个实施例涉及一种提供对鳞翅目害虫侵染具有改善的抗性的植物的方法，所述方法包括向所述植物提供至少一种多核苷酸，所述多核苷酸包括18个或更多个连续核苷酸的至少一个区段，所述区段与选自由在靶基因序列组中鉴定的基因组成的组的靶基因的片段基本上相同或互补。在实施例中，本发明提供了一种提供对鳞翅目害虫侵染具有改善的抗性的植物的方法，该方法包括向所述植物提供至少一种多核苷酸，所述多核苷酸包括与靶基因或从靶基因转录的RNA的至少18个连续核苷酸相同或互补的至少一个区段，其中靶基因选自在靶基因序列组中鉴定的基因或从靶基因转录的RNA。靶向基因的序列的实施例由表1A、1B和1C中的SEQ ID NO鉴定，并且包含靶向具有选自由靶基因序列组组成的组的序列的基因以及相关基因的序列，包含来自相关昆虫害虫的同源物，例如来自其他鳞翅目害虫的相关基因。在一些实施例中，多核苷酸(例如，双链RNA)是化学或酶促合成的，或者通过在微生物中表达或通过在植物细胞中表达而产生的。在一些实施例中，多核苷酸包括18个或更多个连续核苷酸的至少一个区段，其与选自靶基因序列组、触发物序列组或其任何一种的DNA互补序列的序列基本上相同或互补。在一些实施例中，多核苷酸是dsRNA，其带有具有选自触发物序列组或其互补序列的序列的链。在一些实施例中，多核苷酸包括dsRNA，其带有具有选自触发物序列组的序列的链。
在相关的方面，本发明涉及对鳞翅目害虫侵袭具有改善的抗性的植物，其通过在植物中表达至少一种多核苷酸来提供，所述多核苷酸包括18个或更多个连续核苷酸的至少一个区段，所述区段与选自由在靶基因序列组中鉴定的基因组成的组的靶基因的等价长度的片段基本上相同或互补，由此当与其中未表达多核苷酸的对照植物相比时，所得的植物对鳞翅目害虫侵袭具有改善的抗性。在相关的方面，本发明涉及对鳞翅目害虫侵染具有改善的抗性的植物，其通过在植物中表达至少一种多核苷酸来提供，所述多核苷酸包括18个或更多个连续核苷酸的至少一个区段，其具有与选自由在靶基因序列组中鉴定的基因组成的组的靶基因的片段具有约95％至约100％的同一性或互补性的序列，由此当与未表达多核苷酸的对照植物相比时，所得的植物对鳞翅目害虫侵染具有改善的抗性。
在另一方面，本发明涉及由如由该方法提供的对鳞翅目害虫侵染具有改善的抗性的植物产生的种子或可繁殖部分(尤其是转基因后代种子或可繁殖部分)。还考虑了由如由该方法提供的对鳞翅目害虫侵染具有改善的抗性的植物产生的商品产品，以及由这种植物的转基因子代种子或可繁殖部分产生的商品产品。
本发明的另一方面提供了一种提供对鳞翅目害虫侵染具有改善的抗性的植物的方法，其包括以以下方式向植物局部施用包含至少一种多核苷酸的组合物，所述多核苷酸具有18个或更多个连续核苷酸的至少一个区段，其具有与具有选自靶基因序列组、触发物序列组或其任何一种的DNA互补序列的序列的靶基因或DNA的片段具有约95％至约100％同一性的序列，所述方式使得用含多核苷酸的组合物处理的植物相对于未处理的植物表现出对鳞翅目害虫侵袭的改善的抗性。在实施例中，所述至少一种多核苷酸包括18个或更多个连续核苷酸的至少一个区段，所述18个或更多个连续核苷酸与具有选自靶基因序列组、触发物序列组或其任何一种的DNA互补序列的序列的DNA的等效长度的片段基本上相同。多核苷酸可以比它所包含的一个或多个区段长，但是靶基因的每个区段和相应的片段具有等效长度。在实施例中，本发明提供了一种提供对鳞翅目害虫侵染具有改善的抗性的植物的方法，其包括向植物局部施用包括至少一种多核苷酸的组合物，所述多核苷酸包括与具有选自由以下组成的组的核苷酸序列的靶基因或从靶基因转录的RNA的至少18个连续核苷酸互补的核苷酸序列：SEQ ID NOs：2、5、7、9、13、21、26、27、29、36、37、39、44、47、87、95、99、103、301、309、318、319、320、321、323、324、328、341、343、346、356、358、359、503、504、505、506、509、510、530、532、533、542、545、546、547、549、551、552、553、559、560、561、563、564、570、572、573、581、593、596、602、611、612、620、665、666、672、717、730、731、736、737、738、740、741、742、743、749、757、760、761、763、766、808、809、810、814、815、817、818、821、822、1104、1105、1106、1111、1113、1116、1121、1123、1124、1132、1133、1147、1156、1157、1163、1166、1187、1190、1192、1195、1196、1216、1217、1240、1243、1251、1263、1264、1265、1270、1275、1279、1283、1290、1308、1310、1316、1318、1320、1564、1565、1569、1622和1623。在实施例中，本发明提供了一种提供对鳞翅目害虫侵染具有改善的抗性的植物的方法，其包括以以下方式向植物局部施用包含至少一种多核苷酸的组合物，所述方式使得有效量的多核苷酸被以植物为食的鳞翅目害虫摄取，所述多核苷酸包括至少18个连续核苷酸，这些连续核苷酸与具有选自由以下组成的组的核苷酸序列的靶基因或从靶基因转录的RNA互补：SEQ ID NOs：2、5、7、9、13、21、26、27、29、36、37、39、44、47、87、95、99、103、301、309、318、319、320、321、323、324、328、341、343、346、356、358、359、503、504、505、506、509、510、530、532、533、542、545、546、547、549、551、552、553、559、560、561、563、564、570、572、573、581、593、596、602、611、612、620、665、666、672、717、730、731、736、737、738、740、741、742、743、749、757、760、761、763、766、808、809、810、814、815、817、818、821、822、1104、1105、1106、1111、1113、1116、1121、1123、1124、1132、1133、1147、1156、1157、1163、1166、1187、1190、1192、1195、1196、1216、1217、1240、1243、1251、1263、1264、1265、1270、1275、1279、1283、1290、1308、1310、1316、1318、1320、1564、1565、1569、1622和1623。
用于在该方法的多核苷酸可以针对多个靶基因进行设计。实施例包含其中组合物包括dsRNA的那些实施例，所述dsRNA带有具有选自由触发物序列组组成的组的序列的链。本发明的相关方面包含用于局部施用的组合物和用于在该方法的分离的多核苷酸，以及通过该方法提供的具有改善的鳞翅目抗性的植物。
如整个本文中使用的“局部施用”意指施用到物体的表面或外部，如植物的表面或外部，如施用到植物部分如叶、茎、花、果实、芽、根、种子、块茎、花、花药或花粉的表面，或施用到整个植物，或施用到植物的地上部分或地下部分。局部施用可以在非活体表面上进行，如施用到土壤上，或施用到鳞翅目害虫可以通过其与多核苷酸接触的表面或基质上。在该方法的各种实施例中，将包括至少一种多核苷酸的组合物以合适的形式局部施用于植物，例如作为固体、液体(包含均质混合物如溶液和非均质混合物如悬浮液、胶体、胶束和乳液)、粉末、悬浮液、乳液、喷雾、胶囊化或微囊化配方，在微珠或其他载剂颗粒中或在微珠或其他载剂颗粒上，在膜或涂层中，或在基质上或在基质内，或作为种子处理剂。在该方法的一些实施例中，将含多核苷酸的组合物局部施用于植物的地上部分，例如喷雾或撒到植物的叶、茎和开花部分上。
该方法的实施例包含局部施用叶面喷雾(例如，将含多核苷酸的液体组合物喷雾在茄科植物的叶子上)或叶面撒粉(例如，用粉末形式或载剂颗粒形式的含多核苷酸的组合物对作物植物进行撒粉)。在其他实施例中，将含多核苷酸的组合物局部施用于植物的地下部分，如根部，例如通过土壤淋洗液。在其他实施例中，将含多核苷酸的组合物局部施用于生长成植物的种子。局部施用可以是作物植物的果实或来自作物植物的果实的种子的局部处理形式，或者是“种薯”块茎或块茎的块的局部处理形式(例如，通过浸泡、涂覆或撒粉种薯)。合适的粘合剂、惰性载剂、表面活性剂等可以任选地包含在含多核苷酸的组合物中，如农药和种子处理剂的配方领域的技术人员已知的。
在一些实施例中，含多核苷酸的组合物是至少一种局部可植入配方，其选自由局部植入植物中的颗粒、粒料或胶囊组成的组；在此类实施例中，该方法包括在植物中局部植入局部可植入配方。在一些实施例中，含多核苷酸的组合物是至少一种沟内配方，所述沟内配方选自由粉末、颗粒、粒料、胶囊、喷雾剂或淋洗液，或任何其他适于局部施用于沟的形式组成的组；在此类实施例中，该方法包括用沟内配方进行沟内处理。在一个实施例中，含多核苷酸的组合物可以被鳞翅目害虫摄取或以其他方式内部吸收。例如，含多核苷酸的组合物可以是诱饵的形式。在一些实施例中，含多核苷酸的组合物进一步包括一种或多种选自由以下组成的组的组分：载剂药剂、表面活性剂、阳离子脂质(如在通过引用并入本文的美国专利申请公开2011/0296556的实例18中公开的阳离子脂质)、有机硅氧烷、有机硅氧烷表面活性剂、多核苷酸除草分子、非多核苷酸除草分子、非多核苷酸杀虫剂、安全剂和昆虫生长调节剂。在一个实施例中，该组合物进一步包括非离子有机硅氧烷表面活性剂，如
Figure BDA0004022386480000341
牌表面活性剂，例如SILWET/>
Figure BDA0004022386480000342
牌表面活性剂，其具有CAS号27306-78-1和EPA号CAL.REG.NO.5905-50073-AA，目前可从纽约奥尔巴尼(Albany，N.Y.)的迈图高新材料集团(Momentive Performance Materials)获得。在一些实施例中，局部施用的组合物进一步包括选自由以下组成的组的至少一种杀虫剂：马铃薯糖蛋白、植物凝集素、植物蜕皮甾类、苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白、嗜线虫杆菌杀虫蛋白、发光杆菌杀虫蛋白、侧孢芽孢杆菌杀虫蛋白和球形芽孢杆菌杀虫蛋白。可替代地，此类额外的组分或杀虫剂可以单独提供，例如通过单独的局部施用或通过在植物中的转基因表达。可替代地，用含多核苷酸的组合物以及用单独(之前、之后或同时)施用改善含多核苷酸的组合物的功效的物质对植物进行局部处理。例如，可以通过第一次局部施用含有非离子有机硅表面活性剂如/>
Figure BDA0004022386480000343
牌表面活性剂(例如SILWET/>
Figure BDA0004022386480000344
牌表面活性剂)的溶液，然后第二次局部施用含有多核苷酸的组合物来喷雾植物，或者反之亦然。
预期当与用单独的多核苷酸或单独的非多核苷酸杀虫剂获得的效果相比时，可用于含多核苷酸的组合物中的某些多核苷酸(例如，在工作实例中描述的多核苷酸触发物)与一种或多种非多核苷酸杀虫剂的组合将导致在预防或控制鳞翅目害虫侵染方面的增强的改善。在实施例中，含多核苷酸的组合物作为表达一种或多种多核苷酸和一种或多种编码非多核苷酸杀虫剂的基因的转基因植物提供，所述非多核苷酸杀虫剂选自由马铃薯糖蛋白、植物凝集素、植物蜕皮甾类、苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白、嗜线虫杆菌杀虫蛋白、发光杆菌杀虫蛋白、侧孢芽孢杆菌杀虫蛋白和球形芽孢杆菌杀虫蛋白组成的组，其中发现所述转基因植物对鳞翅目害虫侵染表现出改善的抗性。
可用于含多核苷酸的组合物中的多核苷酸通过本领域技术人员已知的合适手段提供。实施例包含其中多核苷酸是化学或酶促合成的(例如，通过体外转录，如使用T7聚合酶或其他聚合酶的转录)、通过在微生物中或在细胞培养物(如在培养物中生长的植物或昆虫细胞)中表达产生、通过在植物细胞中表达产生或者通过微生物发酵产生的那些实施例。
在许多实施例中，可用于含多核苷酸的组合物中的多核苷酸作为分离的DNA或RNA片段提供。在一些实施例中，可用于含多核苷酸的组合物中的多核苷酸不是表达构建体的一部分，并且缺少额外的元件，如启动子或终止子序列)。此类多核苷酸可以相对较短，如约18至约300或约50至约500个核苷酸(对于单链多核苷酸)或约18至约300或约50至约500个碱基对(对于双链多核苷酸)的单链或双链多核苷酸。在一些实施例中，多核苷酸是约100至约500个碱基对的dsRNA，如表1A、1B和1C中公开的dsRNA触发物中的任何一种的长度的dsRNA。可替代地，多核苷酸可以在更复杂的构建体中提供，例如作为重组表达构建体的一部分，或者被包含在重组载体中，例如被包含在重组植物病毒载体或重组杆状病毒载体中。此类重组表达构建体或载体可以被设计成包含额外的元件，如用于表达感兴趣的基因(例如，杀虫蛋白)的表达盒。
可用于含多核苷酸的组合物中的多核苷酸具有18个或更多个连续核苷酸的至少一个区段，所述18个或更多个连续核苷酸具有与具有选自靶基因序列组、触发物序列组，或其任何一种的DNA互补序列的序列的DNA的等效长度的片段具有约95％至约100％同一性的序列。在实施例中，多核苷酸包括18个或更多个连续核苷酸的至少一个区段，其与具有选自靶基因序列组或触发物序列组的序列的DNA的等效长度的片段基本上相同或互补。在一些实施例中，连续核苷酸具有与具有选自靶基因序列组、触发物序列组或其任何一种的DNA互补序列的序列的DNA的片段具有约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同一性的序列。在一些实施例中，连续核苷酸与具有选自靶基因序列组、触发物序列组或其任何一种的DNA互补序列的序列的DNA的等效长度的片段完全(100％)相同。在一些实施例中，多核苷酸具有与具有选自靶基因序列组、触发物序列组或其DNA互补序列的序列的DNA的片段具有约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％的同一性的总体序列。
可用于含多核苷酸的组合物中的多核苷酸包括18个或更多个连续核苷酸的至少一个区段，例如，在18-24之间，或在18-28之间，或在20-30之间，或在20-50之间，或在20-100之间，或在50-100之间，或在50-500之间，或在100-250之间，或在100-500之间，或在200-1000之间，或在500-2000之间在一些实施例中，区段包括多于18个连续核苷酸，例如，19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或大于30，例如，至少约35、至少约40、至少约45、至少约50、至少约55、至少约60、至少约65、至少约70、至少约75、至少约80、至少约85、至少约90、至少约95、至少约100、至少约110、至少约120、至少约130、至少约140、至少约150、至少约160、至少约170、至少约180、至少约190、至少约200、至少约210、至少约220、至少约230、至少约240、至少约250、至少约260、至少约270、至少约280、至少约290、至少约300、至少约350、至少约400、至少约450、至少约500或大于500个连续核苷酸。在特定的实施例中，多核苷酸包括至少18、19、20或21个连续核苷酸的至少一个区段，其具有与具有选自靶基因序列组、触发物序列组或其DNA互补序列的序列的DNA或靶基因的等效长度的片段具有100％同一性的序列。在特定的实施例中，多核苷酸是双链核酸(例如dsRNA)，其中一条链包括至少18、19、20或21个连续核苷酸的至少一个区段，其具有与具有选自靶基因序列组、触发物序列组或其任何一种的DNA互补序列的序列的DNA或靶基因的等效长度的片段具有100％同一性的序列；以碱基对表示，此类双链核酸包括至少18、19、20或21个连续的、完全匹配的碱基对的至少一个区段，其对应于具有选自靶基因序列组、触发物序列组或其任何一种的DNA互补序列的序列的DNA或靶基因的等效长度的片段。在特定的实施例中，多核苷酸中含有的每个区段的长度大于天然存在的调节性小RNA的典型长度，例如，每个区段的长度为至少约30个连续核苷酸(或碱基对)。在一些实施例中，多核苷酸的总长度或多核苷酸中含有的每个区段的长度小于感兴趣的序列(具有选自由靶基因序列组组成的组的序列的DNA或靶基因)的总长度。在一些实施例中，多核苷酸的总长度为约50至约500个核苷酸(对于单链多核苷酸)或碱基对(对于双链多核苷酸)。在一些实施例中，多核苷酸是约100至约500个碱基对的dsRNA，如表1A、1B和1C中公开的dsRNA触发物中的任何一种的长度的dsRNA。在一些实施例中，多核苷酸是由选自由以下组成的组的序列编码的dsRNA：115、116、119、121、123、127、135、140、141、143、150、151、153、158、161、201、209、213、217、434、442、451、452、453、454、456、457、461、474、476、479、489、491、492、521、522、523、524、527、528、536、538、539、823、826、827、828、830、832、833、834、840、841、842、844、845、851、853、854、862、874、877、883、892、893、901、946、947、953、998、1011、1012、1017、1018、1019、1021、1022、1023、1024、1030、1038、1041、1042、1044、1047、1089、1090、1091、1095、1096、1098、1099、1102、1103、1334、1335、1336、1341、1343、1346、1351、1353、1354、1362、1363、1377、1386、1387、1393、1396、1417、1420、1422、1425、1426、1446、1447、1470、1473、1481、1493、1494、1495、1500、1505、1509、1513、1520、1538、1540、1546、1548、1550、1624、1625、1629、1682或1683或其组合。在另一实施例中，药剂包括由选自由以下组成的组的序列编码的多核苷酸或RNA：SEQ ID NOs：434、442、451、452、453、454、456、457、461、474、476、479、489、491、492、521、522、523、524、527、528、536、538和539或其组合。
局部施用的多核苷酸通常被设计成抑制一种或多种基因(“靶基因”)。此类靶基因可以包含编码序列或非编码序列或两者。在特定的实施例中，多核苷酸被设计成抑制一个或多个靶基因，其中每个靶基因具有选自由靶基因序列组组成的组的DNA序列。在各种实施例中，局部施用的多核苷酸被设计成抑制一个或多个基因，其中每个基因具有选自由靶基因序列组组成的组的序列，并且可以被设计成抑制来自该组的多个基因，或者靶向这些基因中的一个或多个的不同区域。在实施例中，局部施用的多核苷酸包括多个部分或区段，每个部分或区段包括21个连续核苷酸的至少一个区段，其具有与具有选自靶基因序列组、触发物序列组或其任何一种的DNA互补序列的序列的DNA的等效长度的片段具有100％同一性的序列。在此类情况下，每个部分在大小或序列上可以相同或不同，并且相对于靶基因可以是有义或反义的。例如，在一个实施例中，局部施用的多核苷酸可以包括串联或重复排列的多个部分，其中每个部分包括21个连续核苷酸的至少一个区段，其具有与具有选自靶基因序列组的序列的DNA的等效长度的片段具有100％同一性的序列。
局部施用的多核苷酸的总长度可以大于18个连续核苷酸，并且可以包含除了具有与具有选自靶基因序列组、触发物序列组或其任何一种的DNA互补序列的序列的DNA的等效长度的片段具有约95％至约100％同一性的序列的连续核苷酸之外的核苷酸。换句话说，局部施用的多核苷酸的总长度可以大于设计成抑制一个或多个靶基因的多核苷酸的部分或区段的长度，其中每个靶基因具有选自由靶基因序列组组成的组的DNA序列。例如，局部施用的多核苷酸可以具有位于抑制靶基因的18个或更多个连续核苷酸的至少一个区段的“活性”区段侧翼的核苷酸，或者在活性区段之间包含“间隔”核苷酸，或者可以在5′端处或在3′端处或在5′端和3′端两者处具有额外的核苷酸。在实施例中，局部施用的多核苷酸包括与DNA或靶基因不特异性地相关(具有与DNA或靶基因不互补或不相同的序列)的额外核苷酸(例如，提供稳定二级结构或便于克隆或制造的核苷酸)，所述DNA或靶基因具有选自靶基因序列组或触发物序列组或其任何一种的DNA互补序列的序列。
在实施例中，局部施用的多核苷酸包括定位成与18个或更多个连续核苷酸的一个或多个区段直接相邻的额外核苷酸，其具有与具有选自由靶基因序列组组成的组的序列的DNA或靶基因的等效长度的片段具有约95％至约100％同一性或互补性的序列。在实施例中，局部施用的多核苷酸包括一个这种区段，在该区段附近具有额外的5′G或额外的3′C或两者。在另一实施例中，局部施用的多核苷酸是包括额外核苷酸以形成突出端的双链RNA，例如，包括2个脱氧核糖核苷酸以形成3′突出端的dsRNA。因此，在各种实施例中，整个局部施用的多核苷酸的核苷酸序列与具有选自靶基因序列组、触发物序列组或其任何一种的DNA互补序列的序列的DNA或靶基因中的连续核苷酸的片段不是100％相同或互补的。例如，在一些实施例中，局部施用的多核苷酸包括至少两个区段，每个区段具有21个连续核苷酸，其序列与具有选自靶基因序列组、触发物序列组或其任何一种的DNA互补序列的序列的DNA的片段具有100％同一性，其中(1)至少两个区段被一个或多个间隔核苷酸分开，或者(2)至少两个区段以不同于其中相应片段出现在具有选自靶基因序列组、触发物序列组或其任何一种的DNA互补序列的序列的DNA中的顺序排列。
在相关的方面，本发明涉及对鳞翅目害虫侵染具有改善的抗性的植物，其通过包括向植物局部施用包括至少一种多核苷酸的组合物的该方法来提供，所述多核苷酸具有18个或更多个连续核苷酸的至少一个区段，其具有与具有选自靶基因序列组、触发物序列组或其任何一种的DNA互补序列的序列的DNA的等效长度的片段具有约95％至约100％同一性的序列，由此相对于未处理的植物，用多核苷酸组合物处理的植物表现出对鳞翅目害虫侵染的改善的抗性。
一个实施例是当与对照植物相比时对鳞翅目害虫侵染具有改善的抗性的作物植物，其通过向所述植物或向生长成所述植物的种子(或，在所述植物是马铃薯植物的情况下，向生长成所述马铃薯植物的种薯)局部施用具有选自触发物序列组或其互补序列的序列的dsRNA触发物，或由选自由以下组成的组的序列编码的dsRNA触发物：SEQ ID NO：115、116、119、121、123、127、135、140、141、143、150、151、153、158、161、201、209、213、217、434、442、451、452、453、454、456、457、461、474、476、479、489、491、492、521、522、523、524、527、528、536、538、539、823、826、827、828、830、832、833、834、840、841、842、844、845、851、853、854、862、874、877、883、892、893、901、946、947、953、998、1011、1012、1017、1018、1019、1021、1022、1023、1024、1030、1038、1041、1042、1044、1047、1089、1090、1091、1095、1096、1098、1099、1102、1103、1334、1335、1336、1341、1343、1346、1351、1353、1354、1362、1363、1377、1386、1387、1393、1396、1417、1420、1422、1425、1426、1446、1447、1470、1473、1481、1493、1494、1495、1500、1505、1509、1513、1520、1538、1540、1546、1548、1550、1624、1625、1629、1682或1683或其组合。在另一实施例中，药剂包括由选自由以下组成的组的序列编码的多核苷酸或RNA：SEQ ID NOs：434、442、451、452、453、454、456、457、461、474、476、479、489、491、492、521、522、523、524、527、528、536、538和539或其组合。在另一方面，本发明涉及由如由该方法提供的对鳞翅目害虫侵染具有改善的抗性的植物产生的种子(尤其是转基因后代种子)。还考虑了由如由该方法提供的对鳞翅目害虫侵染具有改善的抗性的植物产生的商品产品，以及由这种植物的转基因子代种子产生的商品产品。
VI.用于控制鳞翅目害虫的杀虫组合物
本发明的另一方面提供了一种用于控制鳞翅目害虫的杀虫组合物，其包括杀虫有效量的至少一种RNA，所述RNA包括18个或更多个连续核苷酸的至少一个区段，其与具有选自靶基因序列组、触发物序列组或其任何一种的DNA互补序列的序列的靶基因或DNA的片段基本上相同或互补。在该上下文中，“控制”包含诱导鳞翅目害虫(成虫或幼虫)的生理或行为改变，如但不限于生长发育迟缓、死亡率增加、生殖能力降低、摄食行为或运动的减少或停止或变态阶段发育的减少或停止。“杀虫有效”意指有效诱导鳞翅目害虫(成虫或幼虫)的生理或行为改变，如但不限于生长发育迟缓、死亡率增加、生殖能力下降或生殖力下降、摄食行为或运动的减少或停止或变态阶段发育的减少或停止；在一些实施例中，向植物施用杀虫有效量的RNA改善了植物对鳞翅目害虫侵染的抗性。RNA可以比它所包含的一个或多个区段更长，但是每个片段和靶基因的相应片段具有等效长度。用于该方法的RNA可以针对多个靶基因进行设计。实施例包含其中杀虫组合物包括杀昆虫有效量的多核苷酸的那些实施例，所述多核苷酸包括与具有选自靶基因序列组的核苷酸序列的靶基因或从靶基因转录的RNA互补的至少18、19、20或21个连续核苷酸；或杀虫有效量的至少一种多核苷酸，其包括与靶基因或从靶基因转录的RNA的至少21个连续核苷酸互补的至少一种沉默元件，其中所述靶基因具有选自靶基因序列组的核苷酸序列；或杀虫有效量的至少一种RNA，其包括与具有选自由以下组成的组的核苷酸序列的靶基因或从靶基因转录的RNA的至少18、19、20或21个连续核苷酸相同或互补的至少一个区段：SEQ ID NOs：2、5、7、9、13、21、26、27、29、36、37、39、44、47、87、95、99、103、301、309、318、319、320、321、323、324、328、341、343、346、356、358、359、503、504、505、506、509、510、530、532、533、542、545、546、547、549、551、552、553、559、560、561、563、564、570、572、573、581、593、596、602、611、612、620、665、666、672、717、730、731、736、737、738、740、741、742、743、749、757、760、761、763、766、808、809、810、814、815、817、818、821、822、1104、1105、1106、1111、1113、1116、1121、1123、1124、1132、1133、1147、1156、1157、1163、1166、1187、1190、1192、1195、1196、1216、1217、1240、1243、1251、1263、1264、1265、1270、1275、1279、1283、1290、1308、1310、1316、1318、1320、1564、1565、1569、1622和1623；或当被鳞翅目害虫摄取或接触时导致鳞翅目害虫的死亡或生长发育迟缓的RNA分子，其中所述RNA分子包括与具有选自由以下组成的组的核苷酸序列的靶基因或从靶基因转录的RNA互补的至少18、19、20或21个连续核苷酸：SEQ ID NOs：2、5、7、9、13、21、26、27、29、36、37、39、44、47、87、95、99、103、301、309、318、319、320、321、323、324、328、341、343、346、356、358、359、503、504、505、506、509、510、530、532、533、542、545、546、547、549、551、552、553、559、560、561、563、564、570、572、573、581、593、596、602、611、612、620、665、666、672、717、730、731、736、737、738、740、741、742、743、749、757、760、761、763、766、808、809、810、814、815、817、818、821、822、1104、1105、1106、1111、1113、1116、1121、1123、1124、1132、1133、1147、1156、1157、1163、1166、1187、1190、1192、1195、1196、1216、1217、1240、1243、1251、1263、1264、1265、1270、1275、1279、1283、1290、1308、1310、1316、1318、1320、1564、1565、1569、1622和1623；或杀虫双链RNA分子，所述杀虫双链RNA分子当被鳞翅目害虫摄取或接触时导致鳞翅目害虫死亡或生长发育迟缓，其中所述杀虫双链RNA分子的至少一条链包括与靶基因或从靶基因转录的RNA互补的21个连续核苷酸，其中所述靶基因具有选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NOs：22、5、7、9、13、21、26、27、29、36、37、39、44、47、87、95、99、103、301、309、31 8、319、320、321、323、324、328、341、343、346、356、358、359、503、504、505、506、509、510、530、532、533、542、545、546、547、549、551、552、553、559、560、561、563、564、570、572、573、581、593、596、602、611、612、620、665、666、672、717、730、731、736、737、738、740、741、742、743、749、757、760、761、763、766、808、809、810、814、815、817、818、821、822、1104、1105、1106、1111、1113、1116、1121、1123、1124、1132、1133、1147、1156、1157、1163、1166、1187、1190、1192、1195、1196、1216、1217、1240、1243、1251、1263、1264、1265、1270、1275、1279、1283、1290、1308、1310、1316、1318、1320、1564、1565、1569、1622和1623；或杀虫有效量的至少一种双链RNA，其包括选自触发物序列组的序列。在一些实施例中，多核苷酸是双链RNA。在一些实施例中，多核苷酸(例如，双链RNA)是化学或酶促合成的，或者通过在微生物中表达或通过在植物细胞中表达而产生的。实施例包含包括dsRNA的杀虫组合物，所述dsRNA具有选自触发物序列组的序列，或者在更具体的实施例中，选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO：115、116、119、121、123、127、135、140、141、143、150、151、153、158、161、201、209、213、217、434、442、451、452、453、454、456、457、461、474、476、479、489、491、492、521、522、523、524、527、528、536、538、539、823、826、827、828、830、832、833、834、840、841、842、844、845、851、853、854、862、874、877、883、892、893、901、946、947、953、998、1011、1012、1017、1018、1019、1021、1022、1023、1024、1030、1038、1041、1042、1044、1047、1089、1090、1091、1095、1096、1098、1099、1102、1103、1334、1335、1336、1341、1343、1346、1351、1353、1354、1362、1363、1377、1386、1387、1393、1396、1417、1420、1422、1425、1426、1446、1447、1470、1473、1481、1493、1494、1495、1500、1505、1509、1513、1520、1538、1540、1546、1548、1550、1624、1625、1629、1682或1683或其组合或其互补序列。
在各种实施例中，用于控制鳞翅目害虫的杀虫组合物为选自由以下组成的组的至少一种形式：固体、液体(包含均质混合物如溶液和非均质混合物如悬浮液、胶体、胶束和乳液)、粉末、悬浮液、乳液、喷雾、胶囊化或微囊化配方，在微珠或其他载剂颗粒中或在微珠或其他载剂颗粒上，在膜或涂层中，或在基质上或在基质内，或作为种子处理剂。合适的粘合剂、惰性载剂、表面活性剂等可以任选地包含在含多核苷酸的组合物中，如杀虫剂和种子处理剂的配方领域的技术人员已知的。待控制的鳞翅目害虫通常是侵染植物的害虫。在一些实施例中，杀虫组合物是至少一种可植入配方，其选自由植入植物中的颗粒、粒料或胶囊组成的组；在此类实施例中，该方法包括在植物中植入所述可植入配方。在一些实施例中，杀虫组合物是至少一种沟内配方，所述沟内配方选自由粉末、颗粒、粒料、胶囊、喷雾剂或淋洗液，或任何其他适于施用于沟的形式组成的组；在此类实施例中，该方法包括用沟内配方进行沟内处理。在一个实施例中，杀虫组合物可以被鳞翅目害虫摄取或以其他方式内部吸收。例如，杀虫组合物可以是诱饵的形式。在一些实施例中，杀虫组合物进一步包括一种或多种选自由以下组成的组的组分：载剂药剂、表面活性剂、阳离子脂质(如在通过引用并入本文的美国专利申请公开2011/0296556的实例18中公开的阳离子脂质)、有机硅氧烷、有机硅氧烷表面活性剂、多核苷酸除草分子、非多核苷酸除草分子、非多核苷酸杀虫剂、安全剂和昆虫生长调节剂。在一个实施例中，杀虫组合物进一步包括非离子有机硅氧烷表面活性剂，如
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牌表面活性剂，例如SILWET/>
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牌表面活性剂，其具有CAS号27306-78-1和EPA号CAL.REG.NO.5905-50073-AA，目前可从纽约奥尔巴尼的迈图高新材料集团(MomentivePerformance Materials)获得。在一些实施例中，杀虫组合物进一步包括选自由以下组成的组的至少一种杀虫剂：马铃薯糖蛋白、植物凝集素、植物蜕皮甾类、苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白、嗜线虫杆菌杀虫蛋白、发光杆菌杀虫蛋白、侧孢芽孢杆菌杀虫蛋白和球形芽孢杆菌杀虫蛋白。可替代地，此类额外的组分或杀虫剂可以单独提供，例如通过单独的局部施用或通过在植物中的转基因表达。可替代地，用杀虫组合物以及用单独(之前、之后或同时)施用改善杀虫组合物的功效的物质对植物进行局部处理。例如，可以通过第一次局部施用含有非离子有机硅表面活性剂如/>
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牌表面活性剂(例如SILWET/>
Figure BDA0004022386480000421
牌表面活性剂)的溶液，然后第二次局部施用杀虫组合物来喷雾植物，或者反之亦然。
预期当与用单独的RNA或单独的非多核苷酸杀虫剂获得的效果相比时，用于该方法的某些RNA(例如，在工作实例中描述的dsRNA触发物)与一种或多种非多核苷酸杀虫剂的组合将导致在预防或控制鳞翅目害虫侵染方面的增强的改善。在实施例中，杀虫组合物含有一种或多种RNA和一种或多种非多核苷酸杀虫剂，所述非多核苷酸杀虫剂选自由马铃薯糖蛋白、植物凝集素、植物蜕皮甾类、苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白、嗜线虫杆菌杀虫蛋白、发光杆菌杀虫蛋白、侧孢芽孢杆菌杀虫蛋白和球形芽孢杆菌杀虫蛋白组成的组，并且发现实现对鳞翅目害虫侵染的改善的预防或控制。
在各种实施例中，杀虫组合物包括微生物细胞或在微生物中产生。例如，杀虫组合物可以包含细菌或酵母细胞或者可以在细菌或酵母细胞中产生。在类似的实施例中，杀虫组合物包括转基因植物细胞或在植物细胞(例如，瞬时表达多核苷酸的植物细胞)中产生；此类植物细胞是植物中的细胞或在组织培养物或细胞悬浮液中生长的细胞。
杀虫组合物可以通过将所述组合物施用于遭受鳞翅目害虫侵染的植物或表面，例如通过对所述植物或所述植物的种子或种薯进行喷雾、撒粉或涂覆，或通过施用土壤淋洗液或沟内处理，或通过以人工食物的形式提供，而被提供以用于通过鳞翅目害虫的食物吸收。杀虫组合物可以在人工食物中被提供用于通过鳞翅目害虫的食物吸收，所述人工食物被配制以满足用于维持鳞翅目害虫的特定营养需求，其中所述人工食物补充有一些量的RNA，所述RNA从单独的来源获得，如化学合成或从微生物发酵纯化；该实施例可用于例如确定有效RNA治疗方案的定时和量。在一些实施例中，杀虫组合物以植物细胞的形式或在植物细胞组分中，或在微生物(如细菌或酵母)或微生物发酵产物中，或在合成食物中被提供以用于通过鳞翅目害虫的食物吸收。在一个实施例中，杀虫组合物以被鳞翅目害虫摄取的诱饵的形式提供。杀虫组合物可以以种子(或种薯)处理剂的形式被提供以用于通过鳞翅目害虫的食物吸收。
在一个实施例中，杀虫组合物以遭受鳞翅目害虫侵染的任何植物的形式提供，其中在所述植物中或在所述植物上含有RNA。此类植物可以是表达RNA的稳定转基因植物，或者是瞬时表达RNA的非转基因植物，或者是已经用RNA处理(例如，通过喷雾或涂覆)的非转基因植物。稳定转基因植物通常含有整合到其基因组中的编码RNA的重组构建体。
用于杀虫组合物的RNA可以是单链(ss)的或双链(ds)的。实施例包含其中RNA是选自由以下组成的组中的至少一种的实施例：有义单链RNA(ssRNA)、反义单链RNA(ssRNA)或双链RNA(dsRNA)；可以使用这些类型中的任何一种的RNA的混合物。在一个实施例中，使用双链DNA/RNA杂交体。RNA可以包含除了标准核糖核苷酸以外的组分，例如，一个实施例是包括末端脱氧核糖核苷酸的RNA。
杀虫组合物中的RNA具有18个或更多个连续核苷酸的至少一个区段，其具有与具有选自靶基因序列组、触发物序列组或其任何一种的DNA互补序列的序列的转基因或DNA的等效长度的片段具有约95％至约100％同一性的序列。在实施例中，RNA包括18个或更多个连续核苷酸的至少一个区段，其与具有选自靶基因序列组、触发物序列组或其任何一种的DNA互补序列的序列的DNA的等效长度的片段基本上相同或互补。在一些实施例中，连续核苷酸具有与具有选自靶基因序列组、触发物序列组或其任何一种的DNA互补序列的序列的DNA的片段具有约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同一性的序列。在一些实施例中，连续核苷酸与具有选自靶基因序列组、触发物序列组或其任何一种的DNA互补序列的序列的DNA的等效长度的片段完全(100％)相同。在一些实施例中，RNA具有与具有选自靶基因序列组、触发物序列组或其任何一种的DNA互补序列的序列的DNA的片段具有约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同一性的总体序列。
杀虫组合物中的RNA包括18个或更多个连续核苷酸的至少一个区段，其具有与具有选自靶基因序列组、触发物序列组或其任何一种的DNA互补序列的序列的DNA的等效长度的片段具有约95％至约100％同一性的序列。在一些实施例中，RNA包括18个或更多个连续核苷酸的至少一个区段，例如，在18-24个之间，或在18-28个之间，或在20-30个之间，或在20-50个之间，或在20-100个之间，或在50-100个之间，或在50-500个之间，或在100-250个之间，或在100-500个之间，或在200-1000个之间，或在500-2000个之间，或者甚至更多。在一些实施例中，区段包括多于18个连续核苷酸，例如，19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或大于30，例如，至少约35、至少约40、至少约45、至少约50、至少约55、至少约60、至少约65、至少约70、至少约75、至少约80、至少约85、至少约90、至少约95、至少约100、至少约110、至少约120、至少约130、至少约140、至少约150、至少约160、至少约170、至少约180、至少约190、至少约200、至少约210、至少约220、至少约230、至少约240、至少约250、至少约260、至少约270、至少约280、至少约290、至少约300、至少约350、至少约400、至少约450、至少约500或大于500个连续核苷酸。在特定的实施例中，RNA包括至少18、19、20或21个连续核苷酸的至少一个区段，其具有与具有选自靶基因序列组、触发物序列组或其任何一种的DNA互补序列的序列的DNA或靶基因的等效长度的片段具有100％同一性的序列。在特定的实施例中，RNA是双链核酸(例如dsRNA)，其中一条链包括至少18、19、20或21个连续核苷酸的至少一个区段，该区段具有与具有选自靶基因序列组、触发物序列组或其任何一种的DNA互补序列的序列的DNA或靶基因的等效长度的片段100％相同的序列；以碱基对表示，此类双链核酸包括至少18、19、20或21个连续的、完全匹配的碱基对的至少一个区段，其对应于具有选自靶基因序列组、触发物序列组或其任何一种的DNA互补序列的序列的DNA或靶基因的等效长度的片段。在特定的实施例中，RNA中含有的每个区段的长度大于天然存在的调节性小RNA的典型长度，例如，每个区段的长度为至少约30个连续核苷酸(或碱基对)。在一些实施例中，RNA的总长度或RNA中含有的每个区段的长度小于感兴趣的序列(具有选自由靶基因序列组组成的组的序列的DNA或靶基因)的总长度。在一些实施例中，RNA的总长度在约50至约500个核苷酸(对于单链多核苷酸)或碱基对(对于双链多核苷酸)之间。在一些实施例中，RNA包括至少一条长度在约50至约500个核苷酸之间的RNA链。
杀虫组合物中的RNA通常被设计成抑制一种或多种基因(“靶基因”)。此类靶基因可以包含编码序列或非编码序列或两者。在特定的实施例中，RNA被设计成抑制一个或多个靶基因，其中每个靶基因具有选自由靶基因序列组组成的组的DNA序列。在各种实施例中，RNA被设计成抑制一个或多个基因，其中每个基因具有选自由靶基因序列组组成的组的序列，并且可以被设计成抑制来自该组的多个基因，或者靶向这些基因中的一个或多个的不同区域。在实施例中，RNA包括多个部分或区段)，每个部分或区段包括21个连续核苷酸的至少一个区段，该区段具有与具有选自靶基因序列组、触发物序列组或其任何一种的DNA互补序列的序列的DNA的等效长度的片段具有100％同一性的序列。在此类情况下，每个部分在大小或序列上可以相同或不同，并且相对于靶基因可以是有义或反义的。例如，在一个实施例中，RNA包括串联或重复排列的多个部分，其中每个部分包括21个连续核苷酸的至少一个区段，其具有与具有选自靶基因序列组、触发物序列组或其任何一种的DNA互补序列的序列的DNA的等效长度的片段具有100％同一性的序列；所述区段可以来自靶基因的不同区域，例如，所述区段可以对应于靶基因的不同外显子区域，并且不对应于靶基因的“间隔”核苷酸可以任选地用于区段之间或邻近区段。
杀虫组合物中RNA的总长度可以大于18个连续核苷酸，并且可以包含除了具有与具有选自靶基因序列组、触发物序列组或其任何一种的DNA互补序列的序列的DNA的等效长度的片段具有约95％至约100％同一性的序列的连续核苷酸之外的核苷酸。换句话说，RNA的总长度可以大于设计成抑制一个或多个靶基因的RNA的部分或片段的长度，其中每个靶基因具有选自由靶基因序列组和触发物序列组组成的组的DNA序列。例如，RNA可以具有位于抑制靶基因的18个或更多连续核苷酸的至少一个区段的“活性”区段侧翼的核苷酸，或者在活性区段之间包含“间隔”核苷酸，或者可以在5′端处或在3′端处或在5′端和3′端两者处具有额外的核苷酸。在实施例中，RNA包括与DNA或靶基因不特异性地相关(具有与DNA或靶基因不互补或不相同的序列)的额外核苷酸(例如，提供稳定二级结构或便于克隆或制造的核苷酸)，所述DNA或靶基因具有选自靶基因序列组、触发物序列组或其任何一种的RNA互补序列的序列。在实施例中，RNA包括定位成与18个或更多个连续核苷酸的一个或多个区段直接相邻的额外核苷酸，其具有与具有选自靶基因序列组、触发物序列组或其任何一种的DNA互补序列的序列的DNA、RNA或靶基因的等效长度的片段具有约95％至约100％同一性或互补性的序列。在实施例中，RNA包括一个这种区段，在该区段附近具有额外的5′G或额外的3′C或两者。在另一实施例中，RNA是包括额外核苷酸以形成突出端的双链RNA，例如，包括2个脱氧核糖核苷酸以形成3′突出端的dsRNA。因此，在各种实施例中，整个RNA的核苷酸序列与具有选自靶基因序列组或触发物序列组的序列的DNA或靶基因中的连续核苷酸的片段不是100％相同或互补的。例如，在一些实施例中，RNA包括至少两个区段，每个区段具有21个连续核苷酸，其序列与具有选自靶基因序列组、触发物序列组或其任何一种的DNA互补序列的序列的DNA的片段具有100％同一性，其中(1)至少两个区段被一个或多个间隔核苷酸分开，或者(2)至少两个区段以不同于其中相应片段出现在具有选自靶基因序列组、触发物序列组或其任何一种的DNA互补序列的序列的DNA中的顺序排列。
在各种实施例中，杀虫组合物中的RNA由天然存在的核糖核苷酸组成。实施例包含，例如，完全由核糖核苷酸组成或主要由核糖核苷酸组成但具有一个或多个末端脱氧核糖核苷酸或一个或多个末端双脱氧核糖核苷酸的合成RNA。在某些实施例中，RNA包括非典型核苷酸，如肌苷、硫尿苷或假尿苷。在某些实施例中，RNA包括化学修饰的核苷酸。(a)杀虫组合物中的RNA由本领域技术人员已知的合适手段提供。实施例包含其中RNA是化学或酶促合成的(例如，通过体外转录，如使用T7聚合酶或其他聚合酶的转录)、通过在微生物中或在细胞培养物(如在培养物中生长的植物或昆虫细胞)中表达产生、通过在植物细胞中表达产生或者通过微生物发酵产生的那些实施例。
在一些实施例中，RNA作为不是表达构建体一部分的分离的RNA提供。在一些实施例中，RNA作为缺乏额外元件如启动子或终止子序列的分离的RNA提供。此类RNA可以相对较短，如约18至约300或约50至约500个核苷酸(对于单链RNA)或约18至约300或约50至约500个碱基对(对于双链RNA)的单链或双链RNA。可替代地，RNA可以在更复杂的构建体中提供，例如作为重组表达构建体的一部分，或者被包含在重组载体中，例如被包含在重组植物病毒载体或重组杆状病毒载体中。在一些实施例中，此类重组表达构建体或载体被设计成包含额外的元件，如包含编码适体或核酶的额外的RNA或用于表达感兴趣的基因(例如，杀虫蛋白)的表达盒。
VII.提供对鳞翅目害虫侵染具有改善的抗性的植物的方法，以及由此提供的植物 和种子
本发明的另一方面涉及一种提供对鳞翅目害虫侵染具有改善的抗性的植物的方法，其包括在植物中表达至少一种多核苷酸，该多核苷酸包括18个或更多个连续核苷酸的至少一个区段，其与具有选自靶基因序列组、触发物序列组或其任何一种的DNA互补序列的序列的靶基因或DNA的片段基本上相同或互补，由此当与其中不表达所述多核苷酸的对照植物相比时，所得的植物具有改善的对鳞翅目害虫的抗性。在实施例中，所述方法包括在植物中表达至少一种多核苷酸，所述多核苷酸包括18个或更多个连续核苷酸的至少一个区段，其具有与具有选自靶基因序列组、触发物序列组或其任何一种的DNA互补序列的序列的靶基因或DNA的等效长度的片段具有约95％至约100％同一性的序列。在实施例中，本发明提供了一种提供对鳞翅目害虫侵染具有改善的抗性的植物的方法，其包括在植物中表达至少一种多核苷酸，该多核苷酸包含至少一个区段，该区段与具有选自由以下组成的组的序列的DNA的至少18、19、20或21个连续核苷酸相同或互补：SEQ ID NOs：2、5、7、9、13、21、26、27、29、36、37、39、44、47、87、95、99、103、301、309、318、319、320、321、323、324、328、341、343、346、356、358、359、503、504、505、506、509、510、530、532、533、542、545、546、547、549、551、552、553、559、560、561、563、564、570、572、573、581、593、596、602、611、612、620、665、666、672、717、730、731、736、737、738、740、741、742、743、749、757、760、761、763、766、808、809、810、814、815、817、818、821、822、1104、1105、1106、1111、1113、1116、1121、1123、1124、1132、1133、1147、1156、1157、1163、1166、1187、1190、1192、1195、1196、1216、1217、1240、1243、1251、1263、1264、1265、1270、1275、1279、1283、1290、1308、1310、1316、1318、1320、1564、1565、1569、1622和1623.“在植物中表达多核苷酸”通常意指“在植物中表达RNA转录物”，例如，在植物中表达包括核糖核苷酸序列的RNA，所述核糖核苷酸序列与具有选自靶基因序列组、触发物序列组或其任何一种的DNA互补序列的序列的靶基因或DNA的至少一个片段是反义的或基本上互补的。实施例包含其中在植物中表达的多核苷酸是包括至少一个具有选自触发物序列组或其互补序列的序列的区段的RNA的实施例。然而，在植物中表达的多核苷酸也可以是DNA(例如，在基因组复制期间在植物中产生的DNA)，或由这种DNA编码的RNA。本发明的相关方面包含用于所述方法的分离的多核苷酸和通过所述方法提供的具有改善的鳞翅目抗性的植物。
该方法包括在植物中表达至少一种多核苷酸，其中该多核苷酸包括18个或更多个连续核苷酸的至少一个区段，该区段与具有选自靶基因序列组、触发物序列组或其任何一种的DNA互补序列的序列的靶基因或DNA的片段基本上相同或互补。在一些实施例中，第一多核苷酸以DNA的形式(例如，以分离的DNA分子的形式，或作为表达构建体，或作为转化载体)提供给植物，并且在植物中表达的多核苷酸是在植物中的第二多核苷酸(例如，第一多核苷酸的RNA转录物)。在实施例中，多核苷酸通过转基因表达在植物中表达，即，通过将多核苷酸稳定整合到植物的基因组中，所述多核苷酸可从所述基因组在植物的一种或多种细胞中表达。在实施例中，将第一多核苷酸(例如，包含启动子的重组DNA构建体，所述启动子可操作地连接到包括18个或更多连续核苷酸的至少一个区段的DNA，所述区段与具有选自靶基因序列组、触发物序列组或其任何一种的DNA互补序列的序列的靶基因或DNA的片段基本上相同或互补)稳定地整合到植物的基因组中，由此在植物的一个或多个细胞中表达次级产生的多核苷酸(例如，包括18个或更多个连续核苷酸的区段的转录物的RNA转录物，所述转录物与具有选自靶基因序列组、触发物序列组或其任何一种的DNA互补序列的序列的靶基因或DNA的片段基本上相同或互补)。在标题为“制备和使用转基因植物细胞和转基因植物”的章节中提供了提供稳定转化的植物的方法。
在另一实施例中，在植物中表达的多核苷酸通过瞬时表达(即不是由序列稳定整合到植物基因组中产生的表达)来表达。在此类实施例中，该方法可以包含通过本领域已知的常规技术将多核苷酸(例如dsRNA或dsDNA)引入到植物中的步骤例如，瞬时表达可以通过使用无针注射器将多核苷酸溶液渗入植物的叶子中来实现。
在其中在植物中表达的多核苷酸通过瞬时表达来表达的一些实施例中，第一多核苷酸以RNA或DNA或RNA和DNA两者的形式提供给植物，并且次级产生的第二多核苷酸在植物中瞬时表达。在一些实施例中，第一多核苷酸是选自以下中的一种或多种：(a)单链RNA分子(ssRNA)，(b)自杂交以形成双链RNA分子的单链RNA分子，(c)双链RNA分子(dsRNA)，(d)单链DNA分子(ssDNA)，(e)自杂交以形成双链DNA分子的单链DNA分子，(f)包括转录成RNA分子的修饰的Pol III基因的单链DNA分子，(g)双链DNA分子(dsDNA)，(h)包括被转录成RNA分子的修饰的Pol III基因的双链DNA分子，和(i)双链的杂交的RNA/DNA分子，或其组合。在特定的实施例中，通过向植物局部施用合适形式的含多核苷酸的组合物将第一多核苷酸引入到植物中，所述组合物例如作为固体、液体(包含均质混合物如溶液和非均质混合物如悬浮液、胶体、胶束和乳液)、粉末、悬浮液、乳液、喷雾、胶囊化或微囊化配方，在微珠或其他载剂颗粒中或在微珠或其他载剂颗粒上，在膜或涂层中，或在基质上或在基质内，或以处理作物植物种子或处理种薯的形式。合适的粘合剂、惰性载剂、表面活性剂等可以任选地包含在组合物中，如农药和种子处理剂的配方领域的技术人员已知的。在一些实施例中，含多核苷酸的组合物可以进一步包含一种或多种选自由以下组成的组的组分：载剂药剂、表面活性剂、阳离子脂质(如在通过引用并入本文的美国专利申请公开2011/0296556的实例18中公开的阳离子脂质)、有机硅氧烷、有机硅氧烷表面活性剂、多核苷酸除草分子、非多核苷酸除草分子、非多核苷酸杀虫剂、安全剂和昆虫生长调节剂；在一个实施例中，该组合物进一步包括非离子有机硅氧烷表面活性剂，如
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牌表面活性剂，例如SILWET/>
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牌表面活性剂，其具有CAS号27306-78-1和EPA号CAL.REG.NO.5905-50073-AA，目前可从纽约奥尔巴尼的迈图高新材料集团获得。在一些实施例中，局部施用的组合物进一步包括选自由以下组成的组的至少一种杀虫剂：马铃薯糖蛋白、植物凝集素、植物蜕皮甾类、苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白、嗜线虫杆菌杀虫蛋白、发光杆菌杀虫蛋白、侧孢芽孢杆菌杀虫蛋白和球形芽孢杆菌杀虫蛋白。可替代地，此类额外的组分或杀虫剂可以单独提供，例如通过单独的局部施用或通过在植物中的转基因表达。可替代地，用含多核苷酸的组合物以及用单独(之前、之后或同时)施用改善含多核苷酸的组合物的功效的物质对植物进行局部处理。例如，可以通过第一次局部施用含有非离子有机硅表面活性剂如/>
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牌表面活性剂(例如SILWET
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牌表面活性剂)的溶液，然后第二次局部施用含有多核苷酸的组合物来喷雾植物，或者反之亦然。
预期当与用单独的多核苷酸或单独的非多核苷酸杀虫剂获得的效果相比时，用于该方法的某些多核苷酸(例如，在工作实例中描述的多核苷酸触发物)与一种或多种非多核苷酸杀虫剂的组合将导致在预防或控制鳞翅目害虫侵染方面的增强的改善。在实施例中，发现表达至少一种多核苷酸(例如，工作实例中描述的多核苷酸触发物)和一种或多种编码非多核苷酸杀虫剂的基因的转基因植物表现出对鳞翅目害虫侵染的改善的抗性，所述多核苷酸包括18个或更多个连续核苷酸的至少一个区段，所述区段与具有选自靶基因序列组、触发物序列组或其任何一种的DNA互补序列的序列的靶基因或DNA的片段基本上相同或互补，所述非多核苷酸杀虫剂选自由以下组成的组：马铃薯糖蛋白、植物凝集素、植物蜕皮甾类、苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白、嗜线虫杆菌杀虫蛋白、发光杆菌杀虫蛋白、侧孢芽孢杆菌杀虫蛋白和球形芽孢杆菌杀虫蛋白。
在其中在植物中表达的多核苷酸通过瞬时表达来表达的一些实施例中，第一多核苷酸以RNA或DNA或RNA和DNA两者的形式提供给植物，并且次级产生的第二多核苷酸在植物中瞬时表达；第一多核苷酸的施用位点不需要与其中第二多核苷酸被瞬时表达的位点相同。例如，第一多核苷酸可以通过局部施用到叶上或通过注射到茎中而提供给植物，并且第二多核苷酸可以在植物的其他地方(例如在根中或在整个植物中)瞬时表达。在该方法的一些实施例中，将包括至少一种多核苷酸的组合物局部施用于植物的地上部分，例如喷雾或撒在植物的叶、茎和开花部分上。在其他实施例中，将包括至少一种多核苷酸的组合物局部施用于植物的地下部分，如根部，例如通过土壤淋洗液。在其他实施例中，将包括至少一种多核苷酸的组合物局部施用于种子(或者，在马铃薯的情况下，局部施用于种薯)，所述种子生长成对鳞翅目害虫侵染具有改善的抗性的植物。在一些实施例中，在植物中表达的多核苷酸是RNA，其可以是单链(ss)或双链(ds)RNA或两者的组合。
在一些实施例中，向植物提供第一多核苷酸(DNA或RNA或两者)，随后在植物中表达具有与第一多核苷酸对应(相同或互补)的序列的第二多核苷酸。在此类实施例中，在植物中表达的多核苷酸是RNA转录物，其可以是ssRNA或dsRNA或两者的组合。在其中多核苷酸通过瞬时表达被表达的一些实施例中，将第一多核苷酸以RNA或DNA或RNA和DNA两者的形式提供给植物，并且在植物中瞬时表达次级产生的第二多核苷酸；在此类实施例中，第一多核苷酸是选自以下中的一种或多种：(a)单链RNA分子(ssRNA)，(b)自杂交以形成双链RNA分子的单链RNA分子，(c)双链RNA分子(dsRNA)，(d)单链DNA分子(ssDNA)，(e)自杂交以形成双链DNA分子的单链DNA分子，(f)包括转录成RNA分子的修饰的Pol III基因的单链DNA分子，(g)双链DNA分子(dsDNA)，(h)包括被转录成RNA分子的修饰的Pol III基因的双链DNA分子，和(i)双链的杂交的RNA/DNA分子，或其组合。在其中通过瞬时表达来表达多核苷酸的实施例中，第一多核苷酸可以由天然存在的核苷酸(如那些存在于DNA和RNA中的核苷酸)组成。在其中多核苷酸通过瞬时表达被表达的实施例中，第一多核苷酸可以是化学修饰的，或包括化学修饰的核苷酸。第一多核苷酸通过本领域技术人员已知的合适手段提供。实施例包含其中第一多核苷酸是化学或酶促合成的(例如，通过体外转录，如使用T7聚合酶或其他聚合酶的转录)、通过在微生物中或在细胞培养物(如在培养物中生长的植物或昆虫细胞)中表达产生、通过在植物细胞中表达产生或者通过微生物发酵产生的那些实施例。第一多核苷酸可以作为RNA或DNA片段提供。可替代地，第一多核苷酸可以在更复杂的构建体中提供，例如作为重组表达构建体的一部分，或者被包含在重组载体中，例如被包含在重组植物病毒载体或重组杆状病毒载体中；此类重组表达构建体或载体可以被设计成包含额外的元件，如用于表达感兴趣的基因(例如，杀虫蛋白)的表达盒。
在一些实施例中，在植物中表达的多核苷酸是RNA分子，并且可以相对较短，如约18至约300或约50至约500个核苷酸(对于单链RNA)或约18至约300或约50至约500个碱基对(对于双链RNA)的单链或双链RNA。可替代地，多核苷酸可以在更复杂的构建体中提供，例如作为重组表达构建体的一部分，或者被包含在重组载体中，例如被包含在重组植物病毒载体或重组杆状病毒载体中。在一些实施例中，此类重组表达构建体或载体被设计成包含额外的元件，如用于表达感兴趣的基因(例如，杀虫蛋白)的表达盒。
在植物中表达的多核苷酸具有18个或更多个连续核苷酸的至少一个区段，其具有与具有选自靶基因序列组或触发物序列组或前述中的任何一种的DNA互补序列的序列的DNA的等效长度的片段具有约95％至约100％同一性的序列。在实施例中，在植物中表达的多核苷酸包括18个或更多个连续核苷酸的至少一个区段，其与具有选自靶基因序列组、触发物序列组或其任何一种的DNA互补序列的序列的DNA的等效长度的片段基本上相同或互补。在一些实施例中，连续核苷酸具有与具有选自靶基因序列组或触发物序列组或其任何一种的DNA互补序列的序列的DNA片段具有约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同一性的序列。在一些实施例中，连续核苷酸与具有选自靶基因序列组或触发物序列组或其任何一种的DNA互补序列的序列的DNA的等效长度的片段完全(100％)相同。在一些实施例中，在植物中表达的多核苷酸具有的总体序列与具有选自靶基因序列组或触发物序列组或其任何一种的DNA互补序列的序列的DNA的片段具有约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％的同一性。
在植物中表达的多核苷酸通常被设计成抑制一种或多种基因(“靶基因”)。此类靶基因可以包含编码序列或非编码序列或两者。在特定的实施例中，在植物中表达的多核苷酸被设计成抑制一个或多个靶基因，其中每个靶基因具有选自由靶基因序列组组成的组的DNA序列。在各种实施例中，在植物中表达的多核苷酸被设计成抑制一个或多个基因，其中每个基因具有选自由靶基因序列组组成的组的序列，并且可以被设计成抑制来自该组的多个基因，或者靶向这些基因中的一个或多个的不同区域。在实施例中，在植物中表达的多核苷酸包括多个部分或区段，每个部分或区段包括具有21个连续核苷酸的至少一个区段，该区段具有与具有选自靶基因序列组或触发物序列组或其任何一种的DNA互补序列的序列的DNA的等效长度的片段具有100％同一性的序列。在此类情况下，每个部分在大小或序列上可以相同或不同，并且相对于靶基因可以是有义或反义的。例如，在一个实施例中，在植物中表达的多核苷酸可以包含串联或重复排列的多个部分，其中每个部分包括21个连续核苷酸的至少一个区段，其具有与具有选自靶基因序列组或其DNA互补序列的序列的DNA的等效长度的片段具有100％同一性的序列。这些区段可以来自靶基因的不同区域，例如，区段可以对应于靶基因的不同外显子区域，并且不对应于靶基因的“间隔”核苷酸可以任选地用于区段之间或邻近区段。
在植物中表达的多核苷酸的总长度可以大于18个连续核苷酸，并且可以包含除了具有与具有选自靶基因序列组或其DNA互补序列的序列的DNA的等效长度的片段具有约95％至约100％同一性的序列的连续核苷酸之外的核苷酸。换句话说，在植物中表达的多核苷酸的总长度可以大于设计成抑制一个或多个靶基因的多核苷酸的部分或区段的长度，其中每个靶基因具有选自由靶基因序列组组成的组的DNA序列。例如，在植物中表达的多核苷酸可以具有位于抑制靶基因的18个或更多个连续核苷酸的至少一个区段的“活性”区段侧翼的核苷酸，或者在活性区段之间包含“间隔”核苷酸，或者可以在5′端处或在3′端处或在5′端和3′端两者处具有额外的核苷酸。在实施例中，在植物中表达的多核苷酸包括与DNA或靶基因不特异性地相关(具有与DNA或靶基因不互补或不相同的序列)的额外核苷酸(例如，提供稳定二级结构或便于克隆或制造的核苷酸)，所述DNA或靶基因具有选自靶基因序列组或其DNA互补序列的序列。在实施例中，在植物中表达的多核苷酸包括定位成与18个或更多个连续核苷酸的一个或多个区段直接相邻的额外核苷酸，其具有与具有选自由靶基因序列组组成的组的序列的DNA或靶基因的等效长度的片段具有约95％至约100％同一性或互补性的序列。在实施例中，在植物中表达的多核苷酸包括一个这种区段，在该区段附近具有额外的5′G或额外的3′C或两者。在另一实施例中，在植物中表达的多核苷酸是包括额外核苷酸以形成突出端的双链RNA，例如，包括2个脱氧核糖核苷酸以形成3′突出端的dsRNA。因此，在各种实施例中，在植物中表达的整个多核苷酸的核苷酸序列与具有选自靶基因序列组、触发物序列组或其任何一种的DNA互补序列的序列的DNA或靶基因中的连续核苷酸的片段不是100％相同或互补的。例如，在一些实施例中，在植物中表达的多核苷酸包括至少两个区段，每个区段具有21个连续核苷酸，其具有与具有选自靶基因序列组、触发物序列组或其任何一种的DNA互补序列的序列的DNA的片段具有100％同一性的序列，其中(1)至少两个区段被一个或多个间隔核苷酸分开，或者(2)至少两个区段以不同于其中相应片段出现在具有选自靶基因序列组、触发物序列组或其任何一种的DNA互补序列的序列的DNA中的顺序排列。
在相关的方面，本发明涉及对鳞翅目害虫侵袭具有改善的抗性的植物，其通过在植物中表达至少一种多核苷酸来提供，所述多核苷酸包括18个或更多个连续核苷酸的至少一个区段，其与具有选自靶基因序列组、触发物序列组或其任何一种的DNA互补序列的序列的DNA的等效长度的片段基本上相同或互补，由此当与其中未表达所述多核苷酸的对照植物相比时，所得的植物具有对鳞翅目害虫侵染的改善的抗性。在相关的方面，本发明涉及对鳞翅目害虫侵染具有改善的抗性的植物，其通过在植物中表达至少一种多核苷酸来提供，所述多核苷酸包括18个或更多个连续核苷酸的至少一个区段，其具有与选自靶基因序列组或触发物序列组或其任何一种的DNA互补序列的序列的DNA的等效长度的片段具有约95％至约100％的同一性的序列，由此当与其中未表达多核苷酸的对照植物相比时，所得的植物对鳞翅目害虫侵染具有改善的抗性。一个实施例是当与对照植物相比时具有改善的对鳞翅目害虫侵染的抗性的作物植物，其通过在植物中表达具有选自触发物序列组或其互补序列的序列的RNA来提供。在另一方面，本发明涉及由如由该方法提供的对鳞翅目害虫侵染具有改善的抗性的植物产生的种子(尤其是转基因后代种子)。还考虑了由如由该方法提供的对鳞翅目害虫侵染具有改善的抗性的植物产生的商品产品，以及由这种植物的转基因子代种子产生的商品产品。
VIII.用于控制鳞翅目害虫的重组DNA构建体
本发明的另一方面提供了一种重组DNA构建体，其包括与DNA元件可操作地连接的异源启动子，所述DNA元件包括18个或更多个连续核苷酸的至少一个区段，其具有与具有选自靶基因序列组、触发物序列组或其任何一种的DNA互补序列的序列的DNA片段具有约95％至约100％同一性的序列。在一些实施例中，重组DNA构建体包括异源启动子，所述异源启动子可操作地连接到：(a)DNA，其包括与具有选自由以下组成的组的序列的靶基因或从靶基因转录的RNA的至少18、19、20或21个连续核苷酸互补的核苷酸序列：SEQ ID NOs：2、5、7、9、13、21、26、27、29、36、37、39、44、47、87、95、99、103、301、309、318、319、320、321、323、324、328、341、343、346、356、358、359、503、504、505、506、509、510、530、532、533、542、545、546、547、549、551、552、553、559、560、561、563、564、570、572、573、581、593、596、602、611、612、620、665、666、672、717、730、731、736、737、738、740、741、742、743、749、757、760、761、763、766、808、809、810、814、815、817、818、821、822、1104、1105、1106、1111、1113、1116、1121、1123、1124、1132、1133、1147、1156、1157、1163、1166、1187、1190、1192、1195、1196、1216、1217、1240、1243、1251、1263、1264、1265、1270、1275、1279、1283、1290、1308、1310、1316、1318、1320、1564、1565、1569、1622和1623；或(b)DNA，其包括与具有选自由以下组成的组的序列的DNA或其DNA互补序列的等效长度的片段具有100同一性的18、19、20或21或更多个连续核苷酸：SEQ ID NOs：2、5、7、9、13、21、26、27、29、36、37、39、44、47、87、95、99、103、301、309、318、319、320、321、323、324、328、341、343、346、356、358、359、503、504、505、506、509、510、530、532、533、542、545、546、547、549、551、552、553、559、560、561、563、564、570、572、573、581、593、596、602、611、612、620、665、666、672、717、730、731、736、737、738、740、741、742、743、749、757、760、761、763、766、808、809、810、814、815、817、818、821、822、1104、1105、1106、1111、1113、1116、1121、1123、1124、1132、1133、1147、1156、1157、1163、1166、1187、1190、1192、1195、1196、1216、1217、1240、1243、1251、1263、1264、1265、1270、1275、1279、1283、1290、1308、1310、1316、1318、1320、1564、1565、1569、1622和1623；或(c)编码至少一种沉默元件的DNA，所述沉默元件与靶基因或从所述靶基因转录的RNA的至少18、19、20或21个连续核苷酸互补，其中所述靶基因具有选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NOs：2、5、7、9、13、21、26、27、29、36、37、39、44、47、87、95、99、103、301、309、318、319、320、321、323、324、328、341、343、346、356、358、359、503、504、505、506、509、510、530、532、533、542、545、546、547、549、551、552、553、559、560、561、563、564、570、572、573、581、593、596、602、611、612、620、665、666、672、717、730、731、736、737、738、740、741、742、743、749、757、760、761、763、766、808、809、810、814、815、817、818、821、822、1104、1105、1106、1111、1113、1116、1121、1123、1124、1132、1133、1147、1156、1157、1163、1166、1187、1190、1192、1195、1196、1216、1217、1240、1243、1251、1263、1264、1265、1270、1275、1279、1283、1290、1308、1310、1316、1318、1320、1564、1565、1569、1622和1623；或(d)编码至少一种沉默元件的DNA，所述沉默元件包含与选自靶基因序列组中的基因的靶基因或从所述靶基因转录的RNA互补的至少18、19、20或21个连续核苷酸；或(e)编码包括至少18、19、20或21个连续核苷酸的RNA的DNA，所述连续核苷酸与选自触发物序列组的核苷酸序列或其互补序列或来自鳞翅目害虫的直向同源核苷酸序列互补，其中所述直向同源核苷酸序列与选自触发物序列组的核苷酸序列具有至少95％的序列同一性，其中序列同一性百分比是在相同长度上计算的；或(f)编码包括至少一个双链RNA区域的RNA的DNA，其中至少一条链包括至少18、19、20或21个连续核苷酸，所述连续核苷酸与选自触发物序列组的核苷酸序列或其互补序列或来自鳞翅目害虫的直向同源核苷酸序列互补，其中所述直向同源核苷酸序列与选自靶基因序列组、触发物序列组或其任何一种的DNA互补序列的核苷酸序列具有至少95％的序列同一性，其中百分比序列同一性是在相同长度上计算的；或(g)编码包括选自触发物序列组的核苷酸序列或其互补序列的RNA的DNA。实施例包含一种重组DNA构建体，其包括与编码RNA的DNA元件可操作连接的异源启动子，所述RNA具有选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO：115、116、119、121、123、127、135、140、141、143、150、151、153、158、161、201、209、213、217、434、442、451、452、453、454、456、457、461、474、476、479、489、491、492、521、522、523、524、527、528、536、538、539、823、826、827、828、830、832、833、834、840、841、842、844、845、851、853、854、862、874、877、883、892、893、901、946、947、953、998、1011、1012、1017、1018、1019、1021、1022、1023、1024、1030、1038、1041、1042、1044、1047、1089、1090、1091、1095、1096、1098、1099、1102、1103、1334、1335、1336、1341、1343、1346、1351、1353、1354、1362、1363、1377、1386、1387、1393、1396、1417、1420、1422、1425、1426、1446、1447、1470、1473、1481、1493、1494、1495、1500、1505、1509、1513、1520、1538、1540、1546、1548、1550、1624、1625、1629、1682或1683或其组合或其互补序列。
实施例包含一种重组DNA构建体，其包括与编码dsRNA的DNA可操作连接的异源启动子，所述dsRNA具有选自触发物序列组或其片段或其互补序列的序列的链。重组DNA构建体可用于提供对鳞翅目害虫侵染具有改善的抗性的植物，例如通过在植物中表达这种重组DNA构建体的转录物。重组DNA构建体还可用于制备多核苷酸，所述多核苷酸可用于制备组合物，所述组合物可施用于需要保护免受鳞翅目害虫侵染的植物、种子、可繁殖植物部分、土壤或田地或表面。本发明的相关方面包括：包括重组DNA构建体的组合物；包括所述重组DNA构建体的植物染色体或质体或重组植物病毒载体或重组杆状病毒载体；一种转基因茄科植物细胞，在其基因组中具有重组DNA构建体，任选地在其基因组中包括编码至少一种选自由以下组成的组的杀虫剂的DNA：马铃薯糖蛋白、植物凝集素、植物蜕皮甾类、苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白、嗜线虫杆菌杀虫蛋白、发光杆菌杀虫蛋白、侧孢芽孢杆菌杀虫蛋白和球形芽孢杆菌杀虫蛋白，和一种转基因茄科植物，其包含此类转基因茄科植物细胞，或转基因茄科植物的果实、种子或可繁殖部分；以及通过用重组DNA构建体或其编码的RNA的表达或处理提供的具有改善的鳞翅目抗性的植物。
重组DNA构建体包括异源启动子，所述异源启动子与包括18个或更多个连续核苷酸的至少一个区段的DNA可操作地连接，所述区段具有与具有选自靶基因序列组或其DNA互补序列的序列的DNA的等效长度的片段具有约95％至约100％同一性的序列。在一些实施例中，18个或更多个连续核苷酸的区段具有与具有选自靶基因序列组或其DNA互补序列的序列的DNA的片段具有约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同一性的序列。在一些实施例中，连续核苷酸与具有选自靶基因序列组或其DNA互补序列的序列的DNA的等效长度的片段完全(100％)相同。在一些实施例中，DNA具有与具有选自靶基因序列组或其DNA互补序列的序列的DNA具有约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同一性的总体序列。
因此，重组DNA构建体包括与DNA可操作连接的异源启动子，所述DNA包括18个或更多个连续核苷酸的至少一个区段，所述区段被设计成抑制具有选自靶基因序列组或其DNA互补序列的序列的靶基因的表达。在一些实施例中，DNA包括18个或更多个连续核苷酸的至少一个区段，例如，在18-24之间，或在18-28之间，或在20-30之间，或在20-50之间，或在20-100之间，或在50-100之间，或在50-500之间，或在100-250之间，或在100-500之间，或在200-1000之间，或在500-2000之间，或者甚至更多。在一些实施例中，区段包括多于18个连续核苷酸，例如，19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或大于30，例如，至少约35、至少约40、至少约45、至少约50、至少约55、至少约60、至少约65、至少约70、至少约75、至少约80、至少约85、至少约90、至少约95、至少约100、至少约110、至少约120、至少约130、至少约140、至少约150、至少约160、至少约170、至少约180、至少约190、至少约200、至少约210、至少约220、至少约230、至少约240、至少约250、至少约260、至少约270、至少约280、至少约290、至少约300、至少约350、至少约400、至少约450、至少约500或大于500个连续核苷酸。在特定的实施例中，DNA编码含有至少18、19、20或21个连续核苷酸的至少一个区段的RNA，该区段具有与具有选自靶基因序列组或其DNA互补序列的序列的DNA或靶基因的等效长度的片段具有100％同一性的序列。在特定的实施例中，DNA编码双链核酸(例如dsRNA)，其中一条链包括至少18、19、20或21个连续核苷酸的至少一个区段，所述区段具有与具有选自靶基因序列组或其DNA互补序列的序列的DNA或靶基因的等效长度的片段100％相同的序列；表达为碱基对，此类双链核酸包括至少18、19、20或21个连续的、完全匹配的碱基对的至少一个区段，该区段对应于具有选自靶基因序列组或其DNA互补序列的序列的DNA或靶基因的等效长度的片段。在特定的实施例中，DNA中含有的每个区段的长度大于天然存在的调节性小RNA的典型长度。在一些实施例中，每个区段的长度为至少约30个连续核苷酸(或碱基对)。在一些实施例中，DNA的总长度或多核苷酸中含有的每个区段的长度小于感兴趣的序列(具有选自由靶基因序列组组成的组的序列的DNA或靶基因)的总长度。在一些实施例中，DNA的总长度在约50到约500之间。在一些实施例中，DNA编码具有选自由以下组成的组的序列的RNA：SEQID NO：115、116、119、121、123、127、135、140、141、143、150、151、153、158、161、201、209、213、217、434、442、451、452、453、454、456、457、461、474、476、479、489、491、492、521、522、523、524、527、528、536、538、539、823、826、827、828、830、832、833、834、840、841、842、844、845、851、853、854、862、874、877、883、892、893、901、946、947、953、998、1011、1012、1017、1018、1019、1021、1022、1023、1024、1030、1038、1041、1042、1044、1047、1089、1090、1091、1095、1096、1098、1099、1102、1103、1334、1335、1336、1341、1343、1346、1351、1353、1354、1362、1363、1377、1386、1387、1393、1396、1417、1420、1422、1425、1426、1446、1447、1470、1473、1481、1493、1494、1495、1500、1505、1509、1513、1520、1538、1540、1546、1548、1550、1624、1625、1629、1682或1683或其组合或其互补序列。
重组DNA构建体包括可操作地连接到DNA的异源启动子，所述DNA通常被设计成抑制一个或多个基因(“靶基因”)。此类靶基因可以包含编码序列或非编码序列或两者。在特定的实施例中，重组DNA构建体被设计成抑制一个或多个靶基因，其中每个靶基因具有选自由靶基因序列组组成的组的DNA序列。在各种实施例中，重组DNA构建体被设计成抑制一个或多个基因，其中每个基因具有选自由靶基因序列组组成的组的序列，并且可以被设计成抑制来自该组的多个基因，或者靶向这些基因中的一个或多个的不同区域。在实施例中，重组DNA构建体包括与多个部分或区段可操作连接的异源启动子，每个部分或区段包括21个连续核苷酸的至少一个区段，该区段具有与具有选自靶基因序列组或其DNA互补序列的序列的DNA的等效长度的片段具有100％同一性的序列。在此类情况下，每个部分在大小或序列上可以相同或不同，并且相对于靶基因可以是有义或反义的。例如，在一个实施例中，重组DNA构建体可以包含与串联或重复排列的多个部分可操作连接的异源启动子，其中每个部分包括21个连续核苷酸的至少一个区段，该区段具有与具有选自靶基因序列组或其DNA互补序列的序列的DNA的等效长度的片段具有100％同一性的序列。这些区段可以来自靶基因的不同区域，例如区段可以对应于靶基因的不同外显子区域，并且不对应于靶基因的“间隔”核苷酸可以任选地用于区段之间或邻近区段。
重组DNA构建体包括可操作地连接到DNA的异源启动子，所述DNA可以具有大于18个连续核苷酸的总长度，并且可以包含除了18个或更多个连续核苷酸的至少一个区段的区段之外的核苷酸，所述区段具有与具有选自靶基因序列组或其DNA互补序列的序列的DNA的等效长度的片段具有约95％至约100％同一性的序列。换言之，DNA的总长度可以大于设计成抑制一个或多个靶基因的DNA的区段的长度，其中每个靶基因具有选自由靶基因序列组组成的组的DNA序列。例如，DNA可以具有位于抑制靶基因的18个或更多个连续核苷酸的至少一个区段的“活性”区段侧翼的核苷酸，或者在活性区段之间包含“间隔”核苷酸，或者可以在5′端处或在3′端处或在5′端和3′端两者处具有额外的核苷酸。在实施例中，异源启动子与DNA可操作地连接，所述DNA包括与DNA或靶基因不特异性地相关(具有与DNA或靶基因不互补或不相同的序列)的额外核苷酸(例如，提供稳定二级结构或便于克隆或制造的核苷酸)，所述DNA或靶基因具有选自靶基因序列组或其RNA互补序列的序列。在实施例中，异源启动子与DNA可操作地连接，所述DNA包括定位成与18个或更多个连续核苷酸的一个或多个区段直接相邻的额外核苷酸，所述区段具有与具有选自靶基因序列组、触发物序列组或其任何DNA互补序列的序列的DNA或靶基因的等效长度的片段具有约95％至约100％同一性或互补性的序列。在实施例中，异源启动子与DNA可操作地连接，所述DNA包括一个这种区段，在该区段附近具有额外的5′G或额外的3′C或两者。在另一个实施例中，异源启动子可操作地连接到编码包括额外核苷酸的双链RNA的DNA上，以形成突出端。因此，在各种实施例中，与异源启动子可操作连接的整个DNA的核苷酸序列与具有选自靶基因序列组、触发物序列组或其任何DNA互补序列的DNA或靶基因中的连续核苷酸的片段不是100％相同或互补的。例如，在一些实施例中，异源启动子可操作地连接到包括至少两个区段的DNA上，每个区段具有21个连续核苷酸，其序列与具有选自靶基因序列组、触发物序列组或其任何一种的DNA互补序列的序列的DNA的片段具有100％同一性，其中(1)至少两个区段被一个或多个间隔核苷酸分开，或者(2)至少两个区段以不同于其中相应片段出现在具有选自靶基因序列组、触发物序列组或其任何一种的DNA互补序列的序列的DNA中的顺序排列。
在重组DNA构建体中，异源启动子可操作地连接到编码转录物的DNA上，该转录物可以是单链(ss)或双链(ds)或两者的组合。该方法的实施例包含其中DNA编码包括有义单链RNA(ssRNA)、反义ssRNA或双链RNA(dsRNA)或这些中的任何一种的组合的转录物的实施例。
重组DNA构建体由本领域技术人员已知的合适手段提供。实施例包含其中重组DNA构建体在体外合成、通过在微生物或细胞培养物(例如在培养物中生长的植物或昆虫细胞)中表达产生、通过在植物细胞中表达产生或通过微生物发酵产生的那些实施例。
用于重组DNA构建体的异源启动子选自由在植物中起作用的启动子、在原核生物中起作用的启动子、在真菌细胞中起作用的启动子和杆状病毒启动子组成的组。启动子的非限制性实例在标题为“启动子”的章节中描述。
在一些实施例中，重组DNA构建体包括也与DNA可操作连接的第二启动子。例如，包括18个或更多个连续核苷酸的至少一个区段的DNA的侧翼可以是两个启动子，这两个启动子被排列成使得启动子以相反的方向并以会聚的方式转录，产生彼此互补并能够彼此杂交以形成双链RNA的DNA的相反链转录物。在一个实施例中，DNA位于两个根特异性启动子之间，这使得DNA能够沿相反方向转录，导致dsRNA的形成。
在一些实施例中，除了异源启动子之外，重组DNA构建体还包含其他DNA元件，所述异源启动子可操作地连接到包括18个或更多个连续核苷酸的至少一个区段的DNA上，所述区段具有与具有选自靶基因序列组或其DNA互补序列的序列的DNA的等效长度的片段具有约95％至约100％同一性的序列。此类DNA元件是本领域已知的，并且包含但不限于内含子、重组酶识别位点、适体或核酶、用于表达编码序列(例如，以表达转基因如杀虫蛋白或选择性标志物)或非编码序列(例如，以表达额外的抑制元件)的额外的和额外的表达盒。包含用于被小RNA(例如，被仅在特定细胞或组织中表达的miRNA或siRNA)结合和切割的一个或多个识别位点允许植物中更精确的表达模式，其中重组DNA构建体的表达在表达小RNA的地方被抑制。
在一些实施例中，重组DNA构建体在重组载体中提供。“重组载体”意指用于将遗传信息从一个细胞转移到另一个细胞的重组多核苷酸分子。适用于本发明的实施例包含但不限于重组质粒、重组粘粒、人工染色体和重组病毒载体，如重组植物病毒载体和重组杆状病毒载体。替代实施例包含重组质粒、重组粘粒、人工染色体和重组病毒载体，如包括DNA元件但不含异源启动子的重组植物病毒载体和重组杆状病毒载体。
在一些实施例中，重组DNA构建体在植物染色体或质体中提供，例如在转基因植物细胞或转基因植物中提供。因此，本发明还涵盖在其基因组中具有重组DNA构建体的转基因植物细胞，以及包含此类转基因植物细胞的转基因植物或部分转基因植物。部分转基因植物包含，例如，嫁接到包含转基因植物细胞的转基因根茎上的非转基因接穗。实施例包含有包含转基因植物细胞的转基因番茄根茎。植物可以是遭受鳞翅目害虫侵染的任何植物。特别感兴趣的是其中植物是作物植物的实施例。实施例包含其中植物是未发芽的作物植物种子、营养阶段的作物植物或生殖阶段的作物植物的那些实施例。实施例包含中植物是“种薯”的那些实施例，种薯意指可以繁殖成新的马铃薯植物的马铃薯块茎或马铃薯块茎的块。在另一方面，本发明涉及由在其基因组中具有如本文所述重组DNA构建体的转基因植物产生的种子(尤其是转基因后代种子)。实施例还涵盖在其基因组中具有如本文所述的重组DNA构建体的转基因种薯。还考虑了由此类转基因植物产生的商品产品，以及由此类转基因植物的转基因后代种子产生的商品产品。
重组DNA构建体可以以组合物的形式提供，用于局部施用于植物或植物种子的表面，或用于局部施用于需要保护免受鳞翅目害虫侵染的任何基底。同样，重组DNA构建体可以以局部施用于鳞翅目害虫的组合物的形式提供，或者以用于被鳞翅目害虫摄取的组合物的形式提供。在各种实施例中，含有重组DNA构建体的此类组合物以选自由以下组成的组的至少一种形式提供：固体、液体(包含均质混合物如溶液和非均质混合物如悬浮液、胶体、胶束和乳液)、粉末、悬浮液、乳液、喷雾、胶囊化或微囊化配方，在微珠或其他载剂颗粒中或在微珠或其他载剂颗粒上，在膜或涂层中，或在基质上或在基质内提供，或作为种子处理剂提供。局部施用可以是茄科植物的果实或茄科植物果实的种子的局部处理的形式，或者是“种薯”块茎或块茎的块的局部处理的形式(例如，通过浸泡、涂覆或撒粉种薯)。合适的粘合剂、惰性载剂、表面活性剂等可以包含在含有重组DNA构建体的组合物中，如农药和种子处理剂的配方领域的技术人员已知的。在一些实施例中，含有重组DNA构建体的用于局部施用的组合物是至少一种局部可植入配方，其选自由局部植入植物中的颗粒、粒料或胶囊组成的组；在此类实施例中，该方法包括在植物中植入局部可植入配方。在一些实施例中，含有重组DNA构建体的用于局部施用的组合物是至少一种沟内配方，所述沟内配方选自由粉末、颗粒、粒料、胶囊、喷雾剂或淋洗液，或任何其他适于局部施用于沟的形式组成的组；在此类实施例中，该方法包含用沟内配方进行沟内处理。在一个实施例中，含有重组DNA构建体的用于局部施用的组合物可以被鳞翅目害虫摄取或以其他方式内部吸收。例如，含有重组DNA构建体的用于局部施用的组合物可以是诱饵的形式。在一些实施例中，含有重组DNA构建体的组合物进一步包括一种或多种选自由以下组成的组的组分：载剂药剂、表面活性剂、阳离子脂质(如在通过引用并入本文的美国专利申请公开2011/0296556的实例18中公开的阳离子脂质)、有机硅氧烷、有机硅氧烷表面活性剂、多核苷酸除草分子、非多核苷酸除草分子、非多核苷酸杀虫剂、安全剂和昆虫生长调节剂。在一个实施例中，含有重组DNA构建体的组合物进一步包括非离子有机硅氧烷表面活性剂，如
Figure BDA0004022386480000591
牌表面活性剂，例如SILWET
Figure BDA0004022386480000592
牌表面活性剂，其具有CAS号27306-78-1和EPA号CAL.REG.NO.5905-50073-AA，目前可从纽约奥尔巴尼的迈图高新材料集团(Momentive Performance Materials)获得。在一些实施例中，含有重组DNA构建体的组合物进一步包括选自由以下组成的组的至少一种杀虫剂：马铃薯糖蛋白、植物凝集素、植物蜕皮甾类、苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白、嗜线虫杆菌杀虫蛋白、发光杆菌杀虫蛋白、侧孢芽孢杆菌杀虫蛋白和球形芽孢杆菌杀虫蛋白。
预期当与用单独的重组DNA构建体或单独的非多核苷酸杀虫剂获得的效果相比时，如本文所述的某些重组DNA构建体(例如，包含工作实例中所述的多核苷酸触发物的重组DNA构建体)(无论是转基因表达的还是局部施用的)与一种或多种非多核苷酸杀虫剂(无论是转基因表达的还是局部施用的)的组合将导致在预防或控制鳞翅目害虫侵染方面的增强的改进。在实施例中，发现用于表达一种或多种多核苷酸以及一种或多种编码非多核苷酸杀虫剂的基因的重组DNA构建体在表达所述重组DNA构建体的植物中提供对鳞翅目害虫侵染的改善的抗性，所述非多核苷酸杀虫剂选自由马铃薯糖蛋白、植物凝集素、植物蜕皮甾类、苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白、嗜线虫杆菌杀虫蛋白、发光杆菌杀虫蛋白、侧孢芽孢杆菌杀虫蛋白和球形芽孢杆菌杀虫蛋白组成的组。一个实施例涉及一种用于表达RNA的重组DNA构建体，其包括具有选自触发物序列组的序列的区段以及编码非多核苷酸杀虫剂的一个或多个基因，所述非多核苷酸杀虫剂选自由马铃薯糖蛋白、植物凝集素、植物蜕皮甾类、苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白、嗜线虫杆菌杀虫蛋白、发光杆菌杀虫蛋白、侧孢芽孢杆菌杀虫蛋白和球形芽孢杆菌杀虫蛋白组成的组。
含有重组DNA构建体的组合物可以通过将所述组合物施用于遭受鳞翅目害虫侵染的植物或表面，例如通过喷雾、撒粉或涂布植物，或通过施用土壤淋洗液，或通过在人工食物中提供而被提供以用于通过鳞翅目害虫的食物吸收。含有重组DNA构建体的组合物可以在人工食物中被提供以用于通过鳞翅目害虫的食物吸收，所述人工食物被配制以满足用于维持鳞翅目害虫的特定营养需求，其中所述人工食物补充有一些量的重组DNA构建体，所述重组DNA构建体从单独的来源获得，如化学合成或从微生物发酵纯化；该实施例可用于例如确定有效治疗方案的定时和量。在一些实施例中，含有重组DNA构建体的组合物以植物细胞的形式或在植物细胞组分中，或在微生物(如细菌或酵母)或微生物发酵产物中，或在合成食物中被提供以用于通过鳞翅目害虫的食物吸收。在一个实施例中，含有重组DNA构建体的组合物以被鳞翅目害虫摄取的诱饵的形式提供。含有重组DNA构建体的组合物可以以种子处理剂的形式被提供以用于通过鳞翅目害虫的食物吸收。
在各种实施例中，含有重组DNA构建体的组合物包括微生物细胞或者在微生物中产生。例如，含有重组DNA构建体的组合物可以包含细菌或酵母细胞或者可以在细菌或酵母细胞中产生。在类似的实施例中，含有重组DNA构建体的组合物包括转基因植物细胞或在植物细胞(例如，瞬时表达重组DNA构建体的植物细胞)中产生；此类植物细胞是植物中的细胞或在组织培养物或细胞悬浮液中生长的细胞。
IX.转基因植物细胞
几个实施例涉及表达多核苷酸的转基因作物植物细胞，所述多核苷酸可用于本文所述的用于抑制鳞翅目害虫中的靶基因表达或用于控制鳞翅目害虫侵染的方法中。在一个方面，本发明提供了一种转基因茄科植物细胞，在转基因茄科植物细胞的基因组中具有编码RNA的重组DNA，所述RNA包括18个或更多个连续核苷酸的至少一个区段，所述区段具有与具有选自靶基因序列组、触发物序列组或其任何一种的DNA互补序列的序列的DNA的片段具有约95％至约100％同一性的序列。在一个方面，本发明提供了一种转基因茄科植物细胞，在转基因茄科植物细胞的基因组中具有编码RNA的重组DNA，所述RNA包括至少一个与鳞翅目害虫幼虫的靶基因序列的片段基本上相同或基本上互补的沉默元件，其中靶基因序列选自靶基因序列组、触发物序列组或其任何一种的DNA互补序列。在一个方面，本发明提供了一种转基因茄科植物细胞，在转基因茄科植物细胞的基因组中具有编码RNA的重组DNA，所述RNA抑制接触或摄取该RNA的鳞翅目害虫中靶基因的表达，其中所述RNA包括至少一个沉默元件，该沉默元件具有至少一个与靶基因的片段互补的18个或更多连续核苷酸的区段，并且其中该靶基因选自由靶基因序列组中的基因组成的组。特定的实施例是一种转基因作物植物细胞，在转基因作物植物细胞的基因组中具有编码RNA的重组DNA，所述RNA抑制接触或摄取RNA的鳞翅目害虫中靶基因的表达，其中所述RNA包括至少一个沉默元件，该沉默元件具有至少一个与一个或多个靶基因序列组的片段互补的18个或更多连续核苷酸的区段。在一个方面，本发明提供了一种转基因作物植物细胞，在转基因作物植物细胞的基因组中具有编码RNA的重组DNA，该RNA具有选自触发物序列组的序列。当与缺乏此类植物细胞的对照植物相比时，此类转基因作物植物细胞可用于提供对鳞翅目害虫侵染具有改善的抗性的转基因作物植物。转基因作物植物细胞可以是分离的转基因茄科植物细胞，或在培养物中生长的转基因茄科植物细胞，或任何遭受鳞翅目害虫侵染的转基因作物植物的转基因细胞。
在实施例中，重组DNA被稳定地整合到转基因作物植物的基因组中，由此它可以在转基因茄科植物的一个或多个细胞中表达。在标题为“制备和使用转基因植物细胞和转基因植物”的章节中提供了提供稳定转化的植物的方法。
几个实施例涉及一种在其基因组中具有编码RNA的重组DNA的转基因茄科植物细胞，所述RNA抑制接触或摄取RNA的鳞翅目害虫中靶基因的表达，其中RNA包括至少一个与靶基因互补的沉默元件，并且其中靶基因序列选自靶基因序列组或其互补序列。在一些实施例中，沉默元件包括至少一个18个或更多个连续核苷酸，其具有与具有选自靶基因序列组、触发物序列组或其任何一种的DNA互补序列的序列的DNA的等效长度片段具有约95％至约100％互补性的序列。在一些实施例中，沉默元件包括至少一个18或更多个连续核苷酸，其能够在体内或在生理条件下(例如，如通常在鳞翅目害虫的细胞中发现的生理条件下)与具有选自靶基因序列组、触发物序列组或其任何一种的DNA互补序列的序列的DNA的等效长度的片段杂交。连续核苷酸的数目为至少18个，例如在18-24之间，或在18-28之间，或在20-30之间，或在20-50之间，或在20-100之间，或在50-100之间，或在50-500之间，或在100-250之间，或在100-500之间，或在200-1000之间，或在500-2000之间，或者甚至更多。在一些实施例中，连续核苷酸的数目大于18，例如，19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或大于30，例如，至少约35、至少约40、至少约45、至少约50、至少约55、至少约60、至少约65、至少约70、至少约75、至少约80、至少约85、至少约90、至少约95、至少约100、至少约110、至少约120、至少约130、至少约140、至少约150、至少约160、至少约170、至少约180、至少约190、至少约200、至少约210、至少约220、至少约230、至少约240、至少约250、至少约260、至少约270、至少约280、至少约290、至少约300、至少约350、至少约400、至少约450、至少约500或大于500个连续核苷酸。在特定的实施例中，沉默元件包括至少18、19、20或21个连续核苷酸的至少一个区段，其具有与具有选自靶基因序列组或触发物序列组或其DNA互补序列的序列的DNA或靶基因的等效长度的片段具有100％同一性的序列。在特定的实施例中，RNA是双链核酸(例如dsRNA)，其中一条链包括至少18、19、20或21个连续核苷酸组成的至少一个区段，该区段具有与具有选自靶基因序列组或触发物序列组或其DNA互补序列的序列的DNA或靶基因的等效长度的片段具有100％同一性的序列；表达为碱基对，此类双链核酸包括至少18、19、20或21个连续的完全匹配的碱基对的至少一个区段，该区段对应于具有选自靶基因序列组或触发物序列组或其DNA互补序列的序列的DNA或靶基因或的等效长度的片段。在特定的实施例中，RNA中含有的每个沉默元件的长度大于天然存在的调节性小RNA的典型长度。在一些实施例中，每个区段的长度为至少约30个连续核苷酸(或碱基对)。在特定的实施例中，RNA的长度在约50至约500个核苷酸之间。在特定的实施例中，RNA具有选自触发物序列组的序列。
在一些实施例中，转基因作物细胞进一步能够表达额外的异源DNA序列。在实施例中，转基因茄科植物细胞具有进一步包括编码至少一种杀虫剂的重组DNA的基因组，所述杀虫剂选自由马铃薯糖蛋白、植物凝集素、植物蜕皮甾类、苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白、嗜线虫杆菌杀虫蛋白、发光杆菌杀虫蛋白、侧孢芽孢杆菌杀虫蛋白和球形芽孢杆菌杀虫蛋白组成的组。在特定的实施例中，转基因作物植物细胞在其基因组中稳定整合了(i)编码至少一种具有选自触发物序列组的序列的RNA的重组DNA和(ii)编码至少一种杀虫剂的DNA，所述杀虫剂选自由马铃薯糖蛋白、植物凝集素、植物蜕皮甾类、苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白、嗜线虫杆菌杀虫蛋白、发光杆菌杀虫蛋白、侧孢芽孢杆菌杀虫蛋白和球形芽孢杆菌杀虫蛋白组成的组。
在相关的方面，本发明涉及一种转基因作物植物，其包含转基因作物植物细胞、由转基因作物植物产生的商品产品和转基因子代茄科植物种子或转基因茄科植物的转基因可繁殖部分。还考虑了由转基因作物植物产生的商品产品，以及由这种转基因作物植物的转基因子代种子产生的商品产品。
X.靶基因的选择方法
本发明的另一方面提供了一种非随机选择用于RNAi介导的沉默的靶基因的方法。在实施例中，该方法提供了在特定基因组中以单拷贝或低拷贝数(非重复和非冗余)存在的靶基因的子集。此类靶基因可以是来自植物基因组的基因或来自动物基因组的基因。在一些实施例中，靶基因是无脊椎害虫的基因，例如植物的无脊椎害虫或脊椎动物的无脊椎害虫。在一些实施例中，靶基因是植物的昆虫害虫或植物的线虫害虫的基因。在一些实施例中，靶基因是鳞翅目害虫的基因。另外的方面包含基于通过本文所述的方法中的任何一种选择的RNAi介导的沉默的靶基因，制造多核苷酸(例如，ssRNA或dsRNA触发物，如工作实例中描述的dsRNA触发物，或可用于制备转基因植物的重组DNA构建体)。
在实施例中，该方法包括在所选的基因组中鉴定单拷贝数或低拷贝数基因的步骤，或者可替代地在来自相关生物体的直向同源数据库中鉴定单拷贝数或低拷贝数基因以预测在所选的生物体中哪些基因将是单拷贝/低拷贝的步骤。选择低拷贝基因，特别是单拷贝基因作为用于RNAi介导的沉默的靶标。在一个实施例中，通过来自第一物种的一组基因和来自第二物种的一组基因之间的序列比较进行单拷贝数或低拷贝数基因的鉴定，其中来自第二物种的该组基因已经在第二物种中被鉴定为单拷贝数或低拷贝数。在一个实施例中，通过将由计算机执行的算法应用于来自第一物种的一组基因以鉴定来自第一物种的该组基因中的单拷贝数或低拷贝数基因的子集，然后将来自第二物种的一组基因与来自第一物种的单拷贝数或低拷贝数基因的子集进行比较以鉴定来自第二物种的相应的单拷贝数或低拷贝数基因，来进行单拷贝数或低拷贝数基因的鉴定。来自第二物种的单拷贝数或低拷贝数基因可用作用于RNAi介导的沉默的靶基因；这些靶基因的序列用于设计多核苷酸(例如，ssRNA或dsRNA触发物，如工作实例中所述的dsRNA触发物，或用于制备转基因植物的重组DNA构建体)及其用于预防或控制第二物种的侵染的使用方法。另一实施例涉及通过搜 索含有与靶生物体直向同源的模型物种的这种信息的数据库来鉴定对生物体的存活至关 重要的基因。
该方法的实施例包含估计所选的生物体的群体中低/单拷贝基因的核苷酸多样性并选择进一步具有最低核苷酸多样性的那些低/单拷贝基因的另外的步骤。选择进一步具有低核苷酸多样性的低拷贝/单拷贝基因作为用于RNAi介导的沉默的靶标。另一实施例涉 及通过搜索含有与靶生物体直向同源的模型物种的这种信息的数据库来鉴定对生物体的 存活至关重要的基因。
该方法的实施例包含比较同义(Ks)与非同义(Ka)核苷酸变化的比率作为功能或进化约束的估计的另外的步骤。在实施例中，该方法包括选择其中Ks至少等于或大于Ka的基因的步骤。在一个实施例中，该方法包括选择基因的步骤，其中Ka＞＞Ka。
本发明的相关方面是通过本文所述的基因选择方法中的任何一种从基因组中鉴定的用于RNAi介导的沉默的一组靶基因。实施例涉及用于RNAi介导的沉默的一组靶基因，所述靶基因通过从来自基因组的更大一组基因中鉴定单拷贝数或低拷贝数的靶基因而从该基因组中选择。一个实施例涉及用于RNAi介导的沉默的一组靶基因，所述靶基因通过从来自无脊椎动物基因组的更大一组的基因中鉴定单拷贝数或低拷贝数的靶基因而从该无脊椎动物基因组中选择。特定的实施例涉及用于鳞翅目害虫中RNAi介导的沉默的一组靶基因，所述靶基因通过从来自鳞翅目昆虫基因组的更大一组的基因中鉴定单拷贝数或低拷贝数的靶基因而从该鳞翅目昆虫基因组中选择。特定的实施例涉及用于鳞翅目害虫中RNAi介导的沉默的一组靶基因，所述靶基因通过从来自鳞翅目昆虫基因组的更大一组的基因中鉴定单拷贝数或低拷贝数的靶基因而从该鳞翅目昆虫基因组中选择。
另一实施例涉及用于RNAi介导的沉默的一组靶基因，所述靶基因通过估计具有基因组的害虫的个体的群体中给定组的基因的核苷酸多样性，并选择具有最低核苷酸多样性的那些基因而从该基因组中选择。一个实施例涉及用于RNAi介导的沉默的一组靶基因，所述靶基因通过估计具有基因组的无脊椎动物的个体的群体中给定组的基因的核苷酸多样性，并选择具有最低核苷酸多样性的那些基因而从无脊椎动物基因组中选择。另一实施例涉及用于RNAi介导的沉默的一组靶基因，所述靶基因通过估计具有基因组的无脊椎动物的个体的群体中低拷贝/单拷贝基因的核苷酸多样性，并选择进一步具有最低核苷酸多样性的那些低拷贝/单拷贝基因基因而从无脊椎动物基因组中选择。
另一实施例涉及用于RNAi介导的沉默的一组靶基因，所述靶基因通过比较基因组的基因中同义(Ks)与非同义(Ka)核苷酸变化的比率并选择其中Ks至少等于或大于Ka的基因而从该基因组中选择。在实施例中，用于RNAi介导的沉默的该组靶基因是其中Ks至少等于或大于Ka的基因。在实施例中，用于RNAi介导的沉默的该组靶基因是其中Ks＞＞Ka的基因。实施例涉及选自无脊椎动物基因组的用于RNAi介导的沉默的一组靶基因，其中对于所选的基因Ks＞＞Ka。
本发明的另一方面是结合由选自靶基因序列组的序列或序列片段编码的蛋白质的多克隆或单克隆抗体，以及结合由选自触发物序列组的序列或序列片段或其互补序列编码的蛋白质的多克隆或单克隆抗体；这些抗体通过本领域普通技术人员已知的常规方法制备，例如使用“抗体方法和方案”(Proetzel和Ebersbach编辑，2012，Humana出版社，纽约)或“制备和使用抗体”(Howard和Kaser编辑，2006，CRC出版社，博卡拉顿(Boca Raton))中所述的常规方案。
XI.通过“平铺”选择有效的多核苷酸
用于本文所述的实施例的多核苷酸不需要具有靶基因的全长，并且在许多实施例中比靶基因短得多。可用于选择有效的多核苷酸的技术的实例是“平铺”，或评估对应于靶基因的相邻或部分重叠区段的多核苷酸。
在一些实施例中，有效的多核苷酸触发物可以通过将基因靶标“平铺”在选定长度的片段(例如，长度为200-300个核苷酸的片段)中来鉴定，沿着靶基因的长度具有部分重叠的区域，例如约25个核苷酸。在一些实施例中，多核苷酸触发物序列被设计成对应于靶基因特有的区域(具有与靶基因特有的区域具有同一性或互补性的核苷酸)。在一些实施例中，靶基因的选定区域可以包含编码序列或非编码序列(例如，启动子区域、3′非翻译区域、内含子等)或两者的组合。
在感兴趣的是设计有效抑制多个靶基因的靶标的情况下，将多个靶基因序列进行比对，并将多核苷酸触发物设计成对应于多个靶标中共同具有高度序列同源性的区域。相反，在感兴趣的是设计有效地选择性抑制多个靶序列中的一个靶序列的靶标的情况下，将多个靶基因序列进行比对，并将多核苷酸触发物设计成对应于多个靶标中没有或具有共同低序列同源性的区域。
XII.在选择有效多核苷酸中的热力学考虑
在一些实施例中，可以使用热力学考虑来设计多核苷酸触发物或优化其序列。例如，可以基于控制一条核酸链(例如，多核苷酸触发物或单个siRNA)和另一条核酸链(例如，靶基因转录物)之间杂交的热力学来选择多核苷酸触发物。
预测在RNAi介导的靶基因的沉默中可能有效的核苷酸序列的方法和算法是本领域已知的。此类方法和算法的非限制性实例包含“i-score”，其由Ichihara等人，(2007)，《核酸研究(Nucleic Acids Res.)》，35(18)∶123e描述；“Oligowalk”，其可在rna.urmc.rochester.edu/servers/oligowalk公开获得并由Lu等人(2008)，《核酸研究》，36：W104-108描述；和“Reynolds score”，其由Khovorova等人，(2004)，《自然生物技术(Nature Biotechnol.)》，22：326-330，描述，和“si-Fi”，其由Luck等人(2019)《植物科学前 沿(Front.Plant Sci.)》，其可在http：//www.snowformatics.com/si-fi.html公开获得； 和“SnapDragon”，其由Hu等人，(2016)《核酸研究》，45：D672-D678描述，可在https：// www.flyrnai.org/snapdragon公开获得；以及“E-RNAi”，其由Horn等人，(2010)《核酸研 究》，38：W332-W339描述，可在https：//www.dkfz.de/signaling/e-rnai3/公开获得。
XIII.允许的不匹配
如本文所用的“基本上相同”或“基本上互补”意指多核苷酸(或双链多核苷酸的至少一条链)对靶基因或对从靶基因转录的RNA(例如，转录物)具有足够的同一性或互补性，以抑制靶基因的表达(例如，以实现靶基因转录物和/或编码的蛋白的水平或活性的降低)。如本文所述的多核苷酸不需要与靶基因或序列或从靶基因转录的RNA具有100％的同一性或互补性以抑制靶基因的表达(例如，以实现靶基因转录物或编码的蛋白的水平或活性的降低，或以提供对鳞翅目害虫的控制)。在一些实施例中，多核苷酸或其部分被设计成与靶基因或从靶基因转录的RNA中的至少18或19个连续核苷酸的序列基本上相同或基本上互补。在一些实施例中，多核苷酸或其部分被设计成与靶基因或从靶基因转录的RNA中的21个连续核苷酸中的一个或多个序列100％相同或100％互补。在某些实施例中，当与内源性靶基因或从靶基因转录的RNA中的18个或更多个连续核苷酸的序列相比时，“基本上相同”的多核苷酸具有100％的序列同一性或至少约83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在某些实施例中，当与靶基因或从靶基因转录的RNA中的18个或更多连续核苷酸的序列相比时，“基本上互补的”多核苷酸具有100％的序列互补性或至少约83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列互补性。
序列同一性：如本文在两个多核苷酸或多肽的上下文中使用的，术语“序列同一性”或“同一性”是指两种分子的序列中的残基，当在指定的比较窗口内为了最大对应性而进行比对时，所述残基是相同的。
如本文使用的，术语“序列同一性百分比”可以是指通过在比较窗口内比较分子的两个最佳比对序列(例如，核酸序列或多肽序列)而确定的值，其中当为了两个序列的最佳比对与参考序列(其不包括添加或缺失)相比时，比较窗口内的序列部分可以包括添加或缺失(即，缺口)。百分比通过以下计算：确定在两个序列中出现相同核苷酸碱基或氨基酸残基的位置的数量以得到匹配的位置的数量，并将匹配的位置的数量除以比较窗口中的总位置的数量并且将结果乘以100以得到序列同一性百分比。与参考序列相比在每个位置都相同的序列被称为与参考序列100％相同，并且反之亦然。关于序列长度的数值的术语“约”意指+/-变化高达1-5％的所述值。例如，约30个连续核苷酸意指27-33个连续核苷酸的范围，或其间的任何范围。关于序列同一性百分比的数值的术语“约”意指+/-变化高达1-3％的指定百分比值，四舍五入到最接近的整数。例如，约90％的序列同一性意指87-93％的范围。然而，序列同一性的百分比不能超过100％。因此，约98％的序列同一性意指95-100％的范围。
含有与靶基因或转录物错配的多核苷酸可以用于本文所述的组合物和方法的某些实施例中。在一些实施例中，所述多核苷酸包含至少18个或至少19个或至少21个连续核苷酸，所述连续核苷酸与靶基因或靶基因的转录物中的等效长度的区段基本上相同或基本上互补。在某些实施例中，18、19、20或21个或更多个连续核苷酸的多核苷酸(其与靶基因或靶基因的转录物中等效长度的区段基本上相同或基本上互补)可以具有1或2个与靶基因或转录物的错配(即，多核苷酸的21个连续核苷酸与靶基因或靶基因的转录物中等效长度的区段之间的1或2个错配)。在某些实施例中，约50、100、150、200、250、300、350或更多个核苷酸的多核苷酸(其含有与靶基因或靶基因的转录物中等效长度的区段相同或互补的连续18、19、20或21个或更多个核苷酸跨度)可以与靶基因或转录物具有1或2个或更多个错配。
在设计与内源性靶基因或从靶基因转录的RNA错配的多核苷酸时，可以使用某些类型的错配和在更可能被耐受的某些位置的错配。在某些实施例中，使用在腺嘌呤和胞嘧啶或鸟苷和尿嘧啶残基之间形成的错配，如Du等人，(2005)，《核酸研究》，33∶1671-1677所述。在一些实施例中，19个碱基对重叠区域中的错配位于低耐受位置5、7、8或11(来自19-核苷酸靶标的5′端)、位于中耐受位置3、4和12-17(来自19-核苷酸靶标的5′端)，和/或位于互补区域任一端的高耐受位置，即位置1、2、18和19(来自19-核苷酸靶标的5′端)，如Du等人，(2005)，《核酸研究》，33∶1671-1677所述。可耐受的错配可以在常规测定中(例如在鳞翅目害虫幼虫的体外食物测定中)凭经验确定。
XIV.在中性序列中嵌入沉默元件
在一些实施例中，包括对应于靶基因的序列并且负责观察到的靶基因抑制的沉默元件被嵌入“中性”序列中，即被插入到与靶基因没有序列同一性或互补性的额外核苷酸中。中性序列可能是理想的，例如，以增加多核苷酸的总长度。例如，出于稳定性、生产中的成本效益或生物活性的原因，可能希望多核苷酸具有特定的大小。在一些实施例中，中性序列也可用于在发夹触发物中形成环或作为触发物区域之间的间隔。
据报告，在另一种鞘翅目物种玉米根叶甲虫(Diabrotica virgifera)中，对于人工食物生物测定中的生物活性，需要大于或等于约60个碱基对(bp)的dsRNA；参见Bolognesi等人，(2012)PLoS ONE 7(10)：e47534.doi：10.1371/journal.pone.0047534。因此，在一个实施例中，对应于靶基因序列组中的靶基因并被发现提供对鳞翅目昆虫侵染的控制的21个碱基对的dsRNA沉默元件被嵌入额外39个碱基对的中性序列中，从而形成约60个碱基对的多核苷酸。在一些实施例中，dsRNA触发物包含约60至约500，或约100至约450个碱基对的中性序列，其中嵌入了21个连续核苷酸的至少一个区段，该区段具有与具有选自靶基因序列组的序列的靶基因的等效长度的片段具有100％同一性或100％互补性的序列。在另一个实施例中，发现具有与靶基因的等效长度的片段具有100％同一性或100％互补性的序列的单个21个碱基对的沉默元件在嵌入到中性序列的较大部分中时是有效的，例如，其中多核苷酸总长度为约60至约300个碱基对。在其中多核苷酸包含中性序列的区域的实施例中，与靶基因相比，多核苷酸将具有相对较低的总体序列同一性；例如，全长度为210个碱基对的dsRNA，含有嵌入在中性序列的额外的189个碱基对中的单个21个碱基对的触发物(与靶基因的21个核苷酸片段具有100％的同一性或互补性)，与靶基因的总序列同一性将为约10％。
XV.杀虫双链RNA分子
本发明的另一方面提供了一种杀虫双链RNA分子，当被鳞翅目害虫摄取或接触时，该杀虫双链RNA分子导致鳞翅目害虫的死亡或生长发育迟缓，其中该杀虫双链RNA分子包括18个或更多个连续核苷酸的至少一个区段，该片段与具有选自靶基因序列组的序列的靶基因或DNA(cDNA)的等效长度的区段基本上相同或基本上互补。在一些实施例中，杀虫双链RNA分子的长度在约50至约500个碱基对之间。在一些实施例中，杀虫双链RNA分子包括长度为至少30个连续核苷酸的至少一个区段。在一些实施例中，杀虫双链RNA分子包括18个或更多个连续核苷酸的多个区段，所述区段与具有选自靶基因序列组的序列的靶基因或DNA(cDNA)的等效长度的区段基本上相同或基本上互补，其中所述区段来自靶基因的不同区域(例如，所述区段可以对应于靶基因的不同外显子区域，并且不对应于靶基因的“间隔”核苷酸可以任选地用于区段之间或邻近区段)，或者来自不同的靶基因。在一些实施例中，杀虫双链RNA分子包括18个或更多个连续核苷酸的多个区段，这些区段与具有选自靶基因序列组的序列的靶基因或DNA(cDNA)的等效长度的区段基本上相同或基本上互补，其中这些区段来自靶基因的不同区域，并且以与其中所述区段在靶基因中天然存在的顺序不同的顺序排列在所述杀虫双链RNA分子中。在一些实施例中，杀虫双链RNA分子包括21个连续核苷酸的多个区段，这些区段具有与具有选自靶基因序列组的序列的靶基因或DNA(cDNA)的等效长度的区段具有100％同一性或100％互补性的序列，其中这些区段来自靶基因的不同区域，并且以与其中所述区段在靶基因中天然存在的顺序不同的顺序排列在所述杀虫双链RNA分子中。在一些实施例中，杀虫双链RNA分子包括一条链，该链包括选自触发物序列组或其互补序列的序列。杀虫双链RNA分子可以局部施用于植物，以控制或预防鳞翅目害虫的侵染。杀虫双链RNA分子可以以适合于被鳞翅目害虫摄取或直接接触的形式提供，例如以喷雾剂或粉剂或诱饵的形式提供。用于提供杀虫双链RNA分子的其他方法和合适的组合物类似于本发明的其他方面的前述段落中所述的那些。
几个实施例涉及包括一种或多种杀虫多核苷酸和水或其他溶剂的桶混合物，任选地包含阳离子脂质或有机硅氧烷表面活性剂或两者。实施例包含多核苷酸和任选地至少一种杀虫剂的桶混合物配方，所述杀虫剂选自选自由马铃薯糖蛋白、植物凝集素、植物蜕皮甾类、苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白、嗜线虫杆菌杀虫蛋白、发光杆菌杀虫蛋白、侧孢芽孢杆菌杀虫蛋白和球形芽孢杆菌杀虫蛋白组成的组。此类组合物的实施例包含其中一种或多种杀虫多核苷酸在活的或死的微生物如细菌或真菌或酵母细胞中提供，或作为微生物发酵产物提供，或在活的或死的植物细胞中提供，或作为合成的重组多核苷酸提供。在实施例中，所述组合物包含含有如本文所述的多核苷酸的微生物的非致病菌株；微生物的摄取或摄入导致鳞翅目害虫的发育迟缓或死亡；合适的微生物的非限制性实例包含大肠杆菌、苏云金芽孢杆菌、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、发光杆菌属(Photorhabdus sp.)、嗜线虫杆菌属(Xenorhabdus sp.)、嗜虫沙雷氏菌(Serratia entomophila)和相关的沙雷氏菌属(Serratia sp.)、球形芽孢杆菌(B.sphaericus)、蜡状芽孢杆菌(B.cereus)、侧孢短芽孢杆菌(B.laterosporus)、蛴螬乳状菌(B.popilliae)、双酶梭状芽胞杆菌(Clostridiumbifermentans)和其他梭状芽孢杆菌物种，或其他形成孢子的革兰氏阳性细菌。在实施例中，该组合物包含植物病毒载体，所述植物病毒载体包括如本文所述的多核苷酸；鳞翅目害虫对用植物病毒载体处理过的植物的取食导致鳞翅目害虫的发育迟缓或死亡。在实施例中，所述组合物包含杆状病毒载体，所述杆状病毒载体包含如本文所述的多核苷酸；载体的摄取或摄入导致鳞翅目害虫的发育迟缓或死亡。在实施例中，如本文所述的多核苷酸被包封在合成基质如聚合物中或附着于颗粒并局部施用于植物的表面；鳞翅目害虫对局部处理的植物的取食导致鳞翅目害虫的发育迟缓或死亡。在实施例中，如本文所述的多核苷酸以表达所述多核苷酸的植物细胞(例如，本发明的转基因茄科植物细胞)的形式提供；鳞翅目害虫对植物细胞或植物细胞内容物的摄取导致鳞翅目害虫的发育迟缓或死亡。
在一些实施例中，如本文所述的一种或多种多核苷酸被提供有有效叶面覆盖所需的合适的粘着剂和湿润剂，以及保护多核苷酸如dsRNAs免受UV损伤的UV保护剂。此类添加剂通常用于生物杀虫剂工业，并且是本领域技术人员已知的。用于土壤施用的组合物可以包含用作用于鳞翅目害虫幼虫的诱饵的颗粒配方。在一些实施例中，如本文所述的一种或多种多核苷酸进一步被提供有载剂药剂、表面活性剂、阳离子脂质(如在通过引用并入本文的美国专利申请公开2011/0296556的实例18中公开的阳离子脂质)、有机硅氧烷、有机硅氧烷表面活性剂、多核苷酸除草分子、非多核苷酸除草分子、非多核苷酸杀虫剂、安全剂和昆虫生长调节剂。在一些实施例中，组合物进一步包含至少一种选自由以下组成的组的杀虫剂：马铃薯糖蛋白、植物凝集素、植物蜕皮甾类、植物蜕皮甾类、苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白、嗜线虫杆菌杀虫蛋白、发光杆菌杀虫蛋白、侧孢芽胞杆菌杀虫蛋白和球形芽孢杆菌杀虫蛋白。
此类组合物以任何方便的方式施用，例如，通过直接喷雾或撒粉于鳞翅目害虫，或喷雾或撒粉于其中需要预防或控制鳞翅目害虫侵染的植物或环境，或通过将涂层施用于植物的表面，或通过将涂层施用于种子(或种薯)以准备种子的种植，或通过在需要预防或控制鳞翅目害虫侵染的植物的根周围施用土壤淋洗液。
如本文所述的多核苷酸的有效量是足以提供对鳞翅目害虫的控制或防止鳞翅目害虫侵染的量；使用常规测定进行多核苷酸的有效量的确定。虽然对可用于本文提供的方法和组合物中的杀虫多核苷酸的浓度和剂量没有上限，但通常为了效率和经济性而寻求较低的有效浓度和剂量。多核苷酸的有效量的非限制性实施例包含以液体形式喷雾在植物上的每毫升约10纳克至每毫升约100微克的多核苷酸，或施用到植物田地上的每英亩约10毫克至每英亩约100克的多核苷酸，或用于喂养鳞翅目害虫的人工食物中的每毫升约0.001至约0.1微克的多核苷酸。在如本文所述的多核苷酸局部施用于植物的情况下，可以考虑施用于植物叶片或其他植物部分表面如花瓣、茎、块茎、果实、花药、花粉、叶、根或种子的喷雾剂或处理剂的体积来调节浓度。在一个实施例中，使用如本文所述的25-mer多核苷酸对草本植物的有用处理是每株植物约1纳摩尔(nmol)多核苷酸，例如每株植物约0.05至1nmol多核苷酸。草本植物的其他实施例包含每株植物约0.05至约100nmol或约0.1至约20nmol或约1nmol至约10nmol的多核苷酸的有用范围。在某些实施例中，施用约40至约50nmol的ssDNA多核苷酸。在某些实施例中，施用约0.5nmol至约2nmol的dsRNA。在某些实施例中，施用含有约0.5至约2.0毫克/毫升，或约0.14毫克/毫升dsRNA或ssDNA(21-mer)的组合物。在某些实施例中，施用约0.5至约1.5毫克/毫升约50至约200个或更多个核苷酸的本发明dsRNA多核苷酸的组合物。在某些实施例中，将约1nmol至约5nmol的本发明dsRNA施用于植物。在某些实施例中，如局部施用于植物的多核苷酸组合物含有至少一种本发明的多核苷酸，其浓度为约0.01至约10毫克/毫升，或约0.05至约2毫克/毫升，或约0.1至约2毫克/毫升。非常大的植物、树木或藤蔓可能需要相应更大量的多核苷酸。当使用可以加工成多种寡核苷酸的本发明的长dsRNA分子(例如，由本发明的单个重组DNA分子编码的多种触发物)时，可以使用较低的浓度。有效的多核苷酸处理方案的非限制性实例包含每株植物约0.1至约1nmol多核苷酸分子，或每株植物约1nmol至约10nmol多核苷酸分子，或每株植物约10nmol至约100nmol多核苷酸分子的处理。
在一些实施例中，一个或多个多核苷酸被提供有“转移剂”，该转移剂是使局部施用的多核苷酸能够进入生物体的细胞的药剂。此类转移剂可以作为包括如本文所述的多核苷酸的组合物的一部分并入，或者可以在施用多核苷酸之前、同时或之后施用。在一些实施例中，转移剂是改善鳞翅目害虫对本发明的多核苷酸摄取的药剂。在一些实施例中，转移剂是调节植物组织(例如种子、叶、茎、根、花或果实)的表面以使多核苷酸渗透到植物细胞中的药剂。在一些实施例中，转移剂使多核苷酸能够通过角质层蜡屏障、气孔和/或细胞壁或膜屏障进入植物细胞。
合适的转移剂包含增加生物体外部的渗透性或增加生物体的细胞对多核苷酸渗透性的药剂。合适的转移剂包含化学药剂、物理药剂或其组合。用于调节或转移的化学药剂包含(a)表面活性剂，(b)有机溶剂或有机溶剂的水溶液或含水混合物，(c)氧化剂，(d)酸，(e)碱，(f)油，(g)酶或其任何组合。在一些实施例中，多核苷酸和转移剂的施用任选地包含温育步骤、中和步骤(例如，以中和酸、碱或氧化剂，或使酶失活)、漂洗步骤或其组合。合适的转移剂可以是乳液、反相乳液、脂质体或其他胶束状组合物的形式，或者可以使多核苷酸采取乳液、反相乳液、脂质体或其他胶束状组合物的形式。转移剂的实施例包含抗衡离子或已知与核酸分子缔合的其他分子，例如无机铵离子、烷基铵离子、锂离子、多胺如精胺、亚精胺或腐胺，以及其他阳离子。转移剂的实施例包含有机溶剂，如DMSO、DMF、吡啶、N-吡咯烷、六甲基磷酰胺、乙腈、二噁烷、聚丙二醇，或与水混溶的或在非水性系统中溶解磷酸核苷酸的其他溶剂(如用于合成反应中的溶剂)。转移剂的实施例包含含有或不含表面活性剂或乳化剂的天然衍生的或合成的油，例如植物来源的油、农作物油(如在《除草剂助剂(Herbicide Adjuvants)》的第9版目录中列出的那些，可在herbicide.adjuvants.com在线公开获得)、石蜡油、多元醇脂肪酸酯或具有用酰胺或多胺如聚乙烯亚胺或N-吡咯烷改性的短链分子的油。
转移剂的实施例包含有机硅氧烷制剂。例如，合适的转移剂是作为SILWET
Figure BDA0004022386480000721
牌表面活性剂可商购的有机硅氧烷制剂，SILWET/>
Figure BDA0004022386480000722
牌表面活性剂具有CAS号27306-78-1和EPA号CAL.REG.NO.5905-50073-AA，并且目前可从纽约奥尔巴尼的迈图高新材料集团获得。一个实施例包含包括多核苷酸和转移剂的组合物，所述转移剂包含约0.015至约2重量％(wt％)范围的有机硅氧烷制剂如Silwet L-77(例如，约0.01、0.015、0.02、0.025、0.03、0.035、0.04、0.045、0.05、0.055、0.06、0.065、0.07、0.075、0.08、0.085、0.09、0.095、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.5wt％)。一个实施例包含一种组合物，该组合物包括本发明的多核苷酸和转移剂，该转移剂包含约0.3至约1重量％(wt％)或约0.5至约1重量％(wt％)的SILWET
Figure BDA0004022386480000723
牌表面活性剂。
可用作本发明中的转移剂的有机硅氧烷化合物包含但不限于包含以下的化合物：(a)共价连接到的三硅氧烷头基，(b)共价连接的烷基接头，包含但不限于正丙基接头，(c)共价连接的聚乙二醇链，(d)末端基团。此类有机硅氧烷化合物的三硅氧烷头基包含但不限于七甲基三硅氧烷。烷基接头可以包含，但不限于，正丙基接头。聚乙二醇链包含但不限于聚乙二醇或聚丙二醇。聚乙二醇链可以包括提供约“7.5”的平均链长“n”的混合物。在某些实施例中，平均链长“n”可以从约5至约14变化。末端基团可以包含但不限于烷基，如甲基。可用作转移剂的有机硅氧烷化合物包含但不限于三硅氧烷乙氧基化物表面活性剂或聚环氧烷改性的七甲基三硅氧烷。用于本发明的转移剂的实例是化合物I：
Figure BDA0004022386480000731
(化合物I：聚环氧烷七甲基三硅氧烷，平均n＝7.5)。
可用作转移剂的有机硅氧烷化合物被使用，例如，以新鲜制成的在约0.015至约2重量％(wt％)的范围内的浓度使用(例如，约0.01、0.015、0.02、0.025、0.03、0.035、0.04、0.045、0.05、0.055、0.06、0.065、0.07、0.075、0.08、0.085、0.09、0.095、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.5wt％)。
转移剂的实施例包含一种或多种盐，如氯化铵、溴化四丁基鏻和硫酸铵，在包含多核苷酸的组合物中提供或与包含多核苷酸的组合物一起使用。在一些实施例中，氯化铵、溴化四丁基鏻和/或硫酸铵以约0.5％至约5％(w/v)或约1％至约3％(w/v)或约2％(w/v)的浓度使用。在某些实施例中，包含多核苷酸的组合物包含浓度大于或等于300毫摩尔的铵盐。在某些实施例中，包含多核苷酸的组合物包含浓度为约0.015至约2重量％(重量百分比)的有机硅氧烷转移剂以及浓度为约80至约1200mM或约150mM至约600mM的硫酸铵。
转移剂的实施例包含磷酸盐。可用于包含多核苷酸的组合物的磷酸盐包含但不限于钙、镁、钾或钠的磷酸盐。在某些实施例中，包含多核苷酸的组合物包含浓度为至少约5毫摩尔、至少约10毫摩尔或至少约20毫摩尔的磷酸盐。在某些实施例中，包含多核苷酸的组合物，在约1mM至约25mM范围内或在约5mM至约25mM范围内的磷酸盐。在某些实施例中，包含多核苷酸的组合物，浓度为至少约5毫摩尔、至少约10毫摩尔或至少约20毫摩尔的磷酸钠。在某些实施例中，包含多核苷酸的组合物包含浓度为约5毫摩尔、约10毫摩尔或约20毫摩尔的磷酸钠。在某些实施例中，包含多核苷酸的组合物包含在约1mM至约25mM范围内或在约5mM至约25mM范围内的磷酸钠盐。在某些实施例中，包含多核苷酸的组合物包含在约10mM至约160mM范围内或在约20mM至约40mM范围内的磷酸钠盐。在某些实施例中，包含多核苷酸的组合物包含pH为约6.8的磷酸钠缓冲液。
转移剂的实施例包含其中含有的表面活性剂和/或有效分子。其中含有的表面活性剂和/或有效分子包含但不限于脂肪酸(如牛油或牛油脂肪胺或磷脂)的钠盐或锂盐以及有机硅氧烷表面活性剂。在某些实施例中，将包含多核苷酸的组合物与抗衡离子或已知与核酸分子缔合的其他分子一起配制。非限制性实例包含四烷基铵离子、三烷基铵离子、锍离子、锂离子和多胺，如精胺、亚精胺或腐胺。在某些实施例中，将包含多核苷酸的组合物与非多核苷酸除草剂一起配制，所述非多核苷酸除草剂例如草甘膦、生长素样苯甲酸除草剂，包含麦草畏(dicamba)、草灭平(chloramben)和TBA、草铵膦、生长素样除草剂，包含苯氧羧酸除草剂、吡啶羧酸除草剂、喹啉羧酸除草剂、嘧啶羧酸除草剂和苯那唑林-乙基除草剂、磺酰脲、咪唑啉酮、溴苯腈、delapon、环己二酮、原卟啉原氧化酶抑制剂和4-羟苯基丙酮酸双加氧酶抑制除草剂。在某些实施例中，将包含多核苷酸的组合物与非多核苷酸杀虫剂一起配制，所述非多核苷酸杀虫剂例如马铃薯糖蛋白、植物凝集素、植物蜕皮甾类、苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白、嗜线虫杆菌杀虫蛋白、发光杆菌杀虫蛋白、侧孢芽孢杆菌杀虫蛋白和球形芽孢杆菌杀虫蛋白。在一些实施例中，与用单独的多核苷酸或单独的非多核苷酸杀虫剂获得的效果相比，包含多核苷酸和非多核苷酸杀虫剂的组合物在预防或控制鳞翅目害虫侵染方面提供了增强的改善。在一些实施例中，将包括具有选自触发物序列组的序列的链的双链RNA的组合物与非多核苷酸杀虫剂(例如，马铃薯糖蛋白、植物凝集素、植物蜕皮甾类、苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白、嗜线虫杆菌杀虫蛋白、发光杆菌杀虫蛋白、侧孢芽孢杆菌杀虫蛋白和球形芽孢杆菌杀虫蛋白)组合，其中当与用单独的双链RNA或单独的非多核苷酸杀虫剂获得的效果相比时，发现该组合能实现对鳞翅目害虫感染的改善的预防或控制。
XVI.相关的技术
如本文所述的多核苷酸和核酸分子的实施例可以包含额外的元件，如启动子、小RNA识别位点、适体或核酶、用于表达编码序列(例如，以表达转基因，如杀虫蛋白或选择的标志物)或非编码序列(例如，以表达额外的抑制元件)的额外和额外的表达盒。例如，本发明的方面提供了一种重组DNA构建体，其包括异源启动子，所述异源启动子可操作地连接到包括18个或更多个连续核苷酸的至少一个区段的DNA上，所述区段具有与具有选自靶基因序列组或触发物序列组或其DNA互补序列的序列的DNA的等效长度的片段具有约95％至约100％的同一性的序列。本发明的另一方面提供了一种重组DNA构建体，其包括与编码RNA发夹的DNA可操作连接的异源启动子，该RNA发夹具有反义区域，该反义区域具有选自选自触发物序列组的组的序列或序列的片段。在另一实施例中，将包括可操作地连接到DNA的启动子的重组DNA构建体稳定地整合到植物的基因组中，所述DNA编码：(a)用于抑制选自靶基因序列组的靶基因的RNA沉默元件，和(b)适体，其中包含RNA适体和RNA沉默元件的RNA转录物在植物的细胞中表达；适体用于将RNA沉默元件引导到细胞中的期望的位置。在另一实施例中，包含用于被小RNA(例如，被仅在特定的细胞或组织中表达的miRNA或siRNA)结合和切割的一个或多个识别位点允许植物中更精确的表达模式，其中重组DNA构建体的表达在表达小RNA的地方被抑制。这些附加元件描述如下。
XVII.启动子
用于本发明中的启动子在其中构建体旨在被转录的细胞中是有功能的。通常，这些启动子是异源启动子，如在重组构建体中使用的，即，它们在自然界中没有被发现可操作地连接到在本文描述的构建体中使用的其他核酸元件。在各种实施例中，启动子选自由组成型启动子、空间特异性启动子、时间特异性启动子、发育特异性启动子和诱导型启动子组成的组。在许多实施例中，启动子是在植物中有功能的启动子，例如pol II启动子、pol III启动子、pol IV启动子或pol V启动子。
适用于本发明的重组DNA构建体的非组成型启动子包含空间特异性启动子、时间特异性启动子和诱导型启动子。空间特异性启动子可以包含细胞器特异性启动子、细胞特异性启动子、组织特异性启动子或器官特异性启动子(例如，分别用于在质体、根、花粉或种子中表达的质体特异性启动子、根特异性启动子、花粉特异性启动子或种子特异性启动子)。在许多情况下，种子特异性启动子、胚特异性启动子、糊粉特异性启动子或胚乳特异性启动子是特别有用的。时间特异性启动子可以包含倾向于在植物的生长周期中的某些发育阶段期间，或在白天或夜晚的不同时间期间，或在一年中的不同季节促进表达的启动子。诱导型启动子包含由化学品或由环境条件诱导的启动子，所述环境条件如但不限于生物或非生物胁迫(例如，缺水或干旱、热、冷、高或低营养或盐水平、高或低光水平或害虫或病原体感染)。微小RNA启动子是有用的，尤其是那些具有时间特异性、空间特异性或诱导型表达模式的启动子；在美国专利申请公开2006/0200878、2007/0199095和2007/0300329(它们通过引用具体并入本文)中提供了miRNA启动子的实例，以及用于鉴定具有特定表达模式的miRNA启动子的方法。表达特异性启动子还可以包含通常组成型表达但表达的程度或“强度”不同的启动子，包含通常被认为是“强启动子”或“弱启动子”的启动子。
特别感兴趣的启动子包含以下实例：从土壤杆菌的T-DNA分离的蛋白聚糖合成酶启动子；花椰菜花叶病毒35S启动子；增强的启动子元件或嵌合启动子元件，如与增强子元件(来自玉米的热休克蛋白70的内含子)连接的增强的花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子；根特异性启动子，如在美国专利第5,837,848号、第6,437,217号和第6,426,446号中公开的那些根特异性启动子；玉米L3油质蛋白启动子，其公开在美国专利第6,433,252号中；编码质体定位的醛缩酶的植物核基因的启动子，其公开在美国专利申请公开2004/0216189中；冷诱导型启动子，其公开在美国专利第6,084,089号中；盐诱导型启动子，其公开在美国专利第6，140,078号中；光诱导型启动子，其公开在美国专利第6,294,714中；病原体诱导型启动子，其公开在美国专利第6,252,138中；和缺水诱导型启动子，其公开在美国专利申请公开2004/0123347 A1中。公开了启动子及其用途，尤其是在植物中有功能的重组DNA构建体中的用途的所有上述专利和专利出版物通过引用并入本文。
感兴趣的植物维管或韧皮部特异性启动子包含发根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)的rolC或rolA启动子、根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)T-DNA基因5的启动子、水稻蔗糖合成酶RSs1基因启动子、鸭跖草属(Commelina)黄色斑驳杆状DNA病毒启动子、椰子叶腐病毒启动子、水稻东格鲁杆状病毒启动子(rice tungrobacilliformviruspromoter)、豌豆谷氨酰胺合成酶GS3A基因的启动子、马铃薯转化酶基因的invCD111和invCD141启动子、分离自拟南芥的启动子，其显示在烟草中具有韧皮部特异性表达，Kertbundit等人，(1991)，《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.)》，88：5212-5216、VAHOX1启动子区域、豌豆细胞壁转化酶基因启动子、来自胡萝卜的酸性转化酶基因启动子、硫酸盐转运蛋白基因Sultr1；3的启动子；植物蔗糖合成酶基因的启动子和植物蔗糖转运蛋白基因的启动子。
适用于本发明的重组DNA构建体或多核苷酸的启动子包含聚合酶II(“pol II”)启动子和聚合酶III(“pol III”)启动子。RNA聚合酶II转录长度通常短于400个核苷酸的结构或催化RNA，并识别T残基的简单运行作为终止信号；它已经被用来转录siRNA双链体(参见，例如，Lu等人，(2004)，《核酸研究》，32：e171)。因此，在某些实施例中，Pol II启动子是其中从本发明的重组DNA构建体产生短RNA转录物的启动子。在一个实施例中，重组DNA构建体包括pol II启动子以表达侧翼为自切割核酶序列(例如，自切割锤头状核酶)的RNA转录物，导致加工的RNA，如结合至鳞翅目靶基因的转录物的单链RNA，具有确定的5′端和3′端，没有潜在干扰侧翼序列。可替代的方法使用pol III启动子来产生具有相对确定的5′端和3′端的转录物，即转录具有最少5′和3′侧翼序列的RNA。在一些实施例中，Pol III启动子(例如，U6或H1启动子)用于添加短的富含AT的转录终止位点，该位点在转录的RNA中产生2个碱基对突出端(UU)；这对于例如表达siRNA型构建体是有用的。已经报道了使用pol III启动子来驱动siRNA构建体的表达；参见van de Wetering等人，(2003)，《EMBO报告》，4：609-615，和Tuschl(2002)，《自然生物技术》，20：446-448.杆状病毒启动子如杆状病毒多角体蛋白和p10启动子是本领域已知的并且是可商购的；参见，例如，Invitrogen的“杆状病毒表达载体系统(BEVS)和昆虫细胞培养技术指南(Guide to Baculovirus Expression VectorSystems(BEVS)and Insect Cell Culture Techniques)”，2002(生命技术公司(LifeTechnologies)，加利福尼亚州卡尔斯巴德(Carlsbad，Calif.))和F.J.Haines等人，“杆状病毒表达载体(Baculovirus Expression Vectors)”，未注明日期(牛津表达技术公司(Oxford Expression Technologies)，英国牛津)。
启动子元件可以包含不是天然存在的启动子或启动子元件或其同源物但可以调节基因的表达的核酸序列。这此“基因非依赖性的”调节序列的实例包含天然存在或人工设计的RNA序列，其包含配体结合区域或适体(参见下文“适体”)和调节区域(其可以是顺式作用的)。参见，例如Isaacs等人，(2004)，《自然生物技术》，22：841-847，Bayer和Smolke(2005)，《自然生物技术》，23：337-343，Mandal和Breaker(2004)，《自然评论分子细胞生物学(Nature Rev.Mol.Cell Biol.》，5：451-463、Davidson和Ellington(2005)，《生物技术趋势(Trends Biotechnol.》，23：109-112，Winkler等人，(2002)，《自然》，419：952-956，Sudarsan等人，(2003)RNA，9：644-647，以及Mandal和Breaker(2004)，《自然结构与分子生物学(Nature Struct.Mol.Biol.》，11：29-35。可以针对特定的空间或时间特异性来选择或设计此类“核糖调节剂”，例如，以仅在存在(或不存在)给定浓度的适当配体的情况下，调节编码用于抑制鳞翅目靶基因的沉默元件的DNA的翻译。一个实例是核糖调节剂，其当在胁迫(例如，非生物胁迫如水、温度或营养物胁迫，或生物胁迫如由害虫或病原体附着)下时对由植物产生的内源性配体(例如，茉莉酸或水杨酸)有响应；在胁迫下，内源性配体的水平增加到足以使核糖调节剂开始转录编码用于抑制鳞翅目靶基因的沉默元件的DNA的水平。
XVIII.重组酶位点
在一些实施例中，本发明的重组DNA构建体或多核苷酸包括编码一个或多个位点特异性重组酶识别位点的DNA。在一个实施例中，重组DNA构建体包括至少一对loxP位点，其中loxP位点之间的DNA的位点特异性重组由Cre重组酶介导。选择loxP位点的位置和相对方向以实现期望的重组；例如，当loxP序列处于相同方向时，loxP位点之间的DNA以环状形式被切除。在另一实施例中，重组DNA构建体包括编码一个loxP位点的DNA；在存在Cre重组酶和另一种具有loxP位点的DNA的情况下，两种DNA被重组。
XIX.适体
在一些实施例中，本发明的重组DNA构建体或多核苷酸包括被加工成RNA适体的DNA，即通过并非主要基于沃森-克里克碱基配对的结合机制与配体结合的RNA(例如，与互补的、反平行的核酸链之间发生的碱基配对以形成双链核酸结构相反)。参见，例如Ellington和Szostak(1990)，《自然》，346：818-822。适体的实例可以在例如可在aptamer.icmb.utexas.edu(Lee等人，(2004)，《核酸研究》，32(1)：D95-100)在线获得的公共适体数据库中找到。然而，可用于本发明的适体可以是单价的(结合单个配体)或多价的(结合多于一个的单独配体，例如结合两个或更多个不同配体的一个单元)。
可用于本发明的配体包含任何分子(或分子的一部分)，其可以通过并非主要基于沃森-克里克碱基配对的机制被核酸二级结构识别和结合。这样，配体和适体的识别和结合类似于抗原和抗体的识别和结合，或者生物效应子和受体的识别和结合。配体可以包含单个分子(或分子的一部分)，或两个或更多个分子(或分子的一部分)的组合，并且可以包含一个或更多个大分子复合物(例如，聚合物、脂质双层、脂质体、细胞膜或其他细胞结构，或细胞表面)。特定配体的实例包含维生素如辅酶B12和硫胺素焦磷酸、黄素单核苷酸、鸟嘌呤、腺苷、S-腺苷甲硫氨酸、S-腺苷高半胱氨酸、辅酶A、赖氨酸、酪氨酸、多巴胺、葡糖胺-6-磷酸、咖啡因、茶碱、抗生素如氯霉素和新霉素、除草剂如草甘膦和麦草畏、蛋白质(包含病毒或噬菌体衣壳蛋白和无脊椎动物表皮或消化道表面蛋白质)，以及RNA，包含病毒RNA、转移RNA(t-RNA)、核糖体RNA(rRNA)和RNA聚合酶如RNA依赖性RNA聚合酶(RdRP)。可用于本发明的一类RNA适体是“热开关”，其不结合至配体但具有热响应性，也就是说，适体的构象由温度决定；参见，例如，Mandal和Breaker，(2004)，《自然评论分子细胞生物学》，5：451-463中的框3.
XX.转基因转录单位
在一些实施例中，本发明的重组DNA构建体或多核苷酸包括转基因转录单位。转基因转录单位包括编码感兴趣的基因的DNA序列，例如天然蛋白质或异源蛋白质。感兴趣的基因可以是来自任何物种(包含但不限于非真核生物，如细菌和病毒；真菌、原生生物、植物、无脊椎动物和脊椎动物)的任何编码序列或非编码序列。感兴趣的特定基因是编码至少一种杀虫剂的基因，所述杀虫剂选自由马铃薯糖蛋白、植物凝集素、植物蜕皮甾类、苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白、嗜线虫杆菌杀虫蛋白、发光杆菌杀虫蛋白、侧孢芽孢杆菌杀虫蛋白和球形芽孢杆菌杀虫蛋白组成的组。转基因转录单位可以进一步包含转基因转录所需的5′或3′序列或两者。
XXI.内含子
在一些实施例中，本发明的重组DNA构建体或多核苷酸包括编码可剪接内含子的DNA。“内含子”通常意指位于外显子(DNA的蛋白质编码区段或相应的转录的RNA)之间的DNA的区段(或从这种区段转录的RNA)，其中，在信使RNA的成熟期间，存在的内含子被酶促“剪接”出来或通过在真核生物的细胞核中发生的切割/连接过程从RNA链中去除。术语“内含子”也用于非编码DNA序列，其被转录成RNA区段，这些RNA区段可以从成熟的RNA转录物中剪接出来，但不是在蛋白质编码外显子之间发现的内含子。这些中的一个实例是具有增强下游编码序列在植物中(在一些情况下，尤其是在单子叶植物中)表达的能力的可剪接序列；这些可剪接序列天然位于一些植物基因的5′非翻译区域，以及一些病毒基因中(例如，被Gallie和Walbot(1992)，《核酸研究》，20：4631-4638描述为增强植物基因中的表达的烟草花叶病毒5′前导序列或“omega”前导序列)。这些可剪接序列或“表达增强内含子”可以人工插入植物基因的5′非翻译区域，在启动子之间，但在任何蛋白质编码外显子之前。此类表达增强内含子的实例包含但不限于玉米醇脱氢酶(Zm-Adh1)、玉米青铜-1表达增强内含子、水稻肌动蛋白1(Os-Actl)内含子、Shrunken-1(Sh-1)内含子、玉米蔗糖合酶内含子、热休克蛋白18(hsp18)内含子和82千道尔顿热休克蛋白(hsp82)内含子。具体通过引用并入本文的美国专利第5,593,874号和第5,859,347号描述了通过将源自70千道尔顿玉米热休克蛋白(hsp70)的表达增强内含子包含在位于距基因启动子3′和距第一蛋白编码外显子5′的非翻译前导中来改善用于植物的重组DNA构建体的方法。
XXII.核酶
在一些实施例中，本发明的重组DNA构建体或多核苷酸包括编码一种或多种核酶的DNA。特别感兴趣的核酶包含自切割核酶、锤头状核酶或发夹状核酶。在一个实施例中，重组DNA构建体包括编码一种或多种核酶的DNA，所述核酶用于切割转录的RNA以提供RNA的确定区段，诸如用于抑制鳞翅目靶基因的沉默元件。
XXIII.基因抑制元件
在一些实施例中，本发明的重组DNA构建体或多核苷酸包括编码用于抑制除了鳞翅目靶基因以外的靶基因的额外基因抑制元件的DNA。待抑制的靶基因可以包含编码序列或非编码序列或两者。
合适的基因抑制元件在美国专利申请公开2006/0200878(该公开通过引用具体并入本文)中被详细地描述，并且包含以下中的一种或多种：
·
○(a)包括至少一个反义DNA区段的DNA，所述反义DNA区段与待抑制的基因的至少一个区段是反义的；
○(b)包括至少一个反义DNA区段的多个拷贝的DNA，所述反义DNA区段与待抑制的基因的至少一个区段是反义的；
○(c)包括至少一个有义DNA区段的DNA，所述有义DNA区段是待抑制的基因的至少一个区段；
○(d)包括至少一个有义DNA区段的多个拷贝的DNA，所述有义DNA区段是待抑制的基因的至少一个区段；
○(e)DNA，其通过形成双链RNA转录成RNA以用于抑制待抑制的基因，并且包括至少一个与待抑制的基因的至少一个区段反义的反义DNA区段和作为待抑制的基因的至少一个区段的至少一个有义DNA区段；
○(f)DNA，其通过形成单个双链RNA而转录成RNA以用于抑制待抑制的基因，并且包括与待抑制的基因的至少一个区段反义的多个串联的反义DNA区段和作为与待抑制的基因的至少一个区段的多个串联的反义DNA片段；
○(g)DNA，其通过形成多个双链RNA转录成RNA以用于抑制待抑制的基因，并且包括与待抑制的基因的至少一个区段反义的多个反义DNA区段和作为待抑制的基因的至少一个区段的多个有义DNA区段，并且其中多个反义DNA区段和多个有义DNA区段以一系列反向重复序列被排列；
○(h)包括源自植物miRNA的核苷酸的DNA
○(i)包括siRNA的核苷酸的DNA
○(j)转录成能够结合至配体的RNA适体的DNA；和
○(k)转录成能够结合至配体的RNA适体的DNA，和转录成能够调节待抑制的基因的表达的调节性RNA的DNA，其中调节依赖于调节性RNA的构象，并且调节性RNA的构象受到RNA适体的结合状态的变构影响。
在一些实施例中，在没有任何蛋白质编码外显子(编码序列)的情况下，内含子被用于递送基因抑制元件。在一个实例中，通过在内含子内嵌入基因抑制元件来中断内含子，如表达增强内含子，其中在转录时，从内含子中切除基因抑制元件。因此，不需要蛋白质编码外显子来提供本文公开的重组DNA构建体的基因抑制功能。
XXIV.转录调节元件
在一些实施例中，本发明的重组DNA构建体或多核苷酸包括编码转录调节元件的DNA。转录调节元件包含调节本发明的重组DNA构建体的表达水平的元件(相对于其在没有此类调节元件的情况下的表达)。合适的转录调节元件的实例包含核糖开关(顺式或反式作用)、转录稳定序列和miRNA识别位点，如美国专利申请公开2006/0200878(其通过引用具体并入本文)中详细描述的。
XXIV.制备和使用转基因植物细胞和转基因植物
植物的转化可以包含几种熟知的方法和组合物中的任何一种。用于植物转化的合适的方法实际上包含可以将DNA引入到细胞中的任何方法。植物转化的一种方法是微喷射轰击，例如，如在美国专利第5,015,580号(大豆)、美国专利第5,538,880号(玉米)、美国专利第5,550,318号(玉米)、美国专利第5,914,451号(大豆)、美国专利第6,153,812号(小麦)、美国专利第6,160,208号(玉米)、美国专利第6,288,312号(水稻)、美国专利第6,365,807号(水稻)、和美国专利第6,399,861号(玉米)和美国专利第6,403,865号(玉米)，所有这些专利通过引用并入，用于能够实现转基因植物的生产。
另一种有用的植物转化方法是通过含有二元Ti质粒系统的农杆菌(Agrobacterium)进行的农杆菌介导的转化，其中农杆菌携带第一Ti质粒和第二嵌合质粒，所述第二嵌合质粒含有野生型Ti质粒的至少一个T-DNA边界、在转化的植物细胞中有功能并与本发明的多核苷酸或重组DNA构建体可操作连接的启动子。参见，例如，在美国专利第5,159,135号(其通过引用并入)中描述的二元系统。还参见De Framond(1983)，《生物技术(Biotechnology)》，1：262-269；和Hoekema等人，(1983)，《自然》，303：179。在此类二元系统中，含有一个或多个T-DNA边界的较小质粒可以方便地在合适的替代宿主如大肠杆菌中构建和操作，然后转移到农杆菌中。
农杆菌介导的植物(尤其是作物植物)的转化的详细程序包含美国专利第5,004,863号、第5,159,135号和第5,518,908号(棉花)；美国专利第5,416,011号、第5,569,834号、第5,824,877号和第6,384,301号(大豆)；美国专利第5,591,616号和第5,981,840号(玉米)；第5,463,174号(芥属植物(brassicas)，包含油菜)、第7,026,528号(小麦)和第6,329,571号(水稻)，以及在美国专利申请公开2004/0244075(玉米)和2001/0042257A1(甜菜)(所有这些专利都通过引用具体并入本文)中公开的程序，用于能够实现转基因植物的生产。美国专利申请公开2011/0296555在实例5中公开了用于转化玉米、大豆、油菜、棉花和甘蔗的转化载体(包含载体序列)和详细方案，并且通过引用具体并入，用于能够实现转基因植物的生产。类似的方法已经被报道用于许多植物物种(双子叶植物和单子叶植物两者)，其中包含花生(Cheng等人，(1996)，《植物细胞报告(Plant Cell Rep.)》，15：653)；芦笋(Bytebier等人，(1987)，《美国国家科学院院刊》，84：5345)；大麦(Wan和Lemaux(1994)《植物生理学(Plant Physiol.)》，104：37)；水稻(Toriyama等人，(1988)，《生物/技术(Bio/Technology)》，6：10；Zhang等人，(1988)，《植入细胞报告》，7：379；小麦(Vasil等人，(1992)，《生物/技术》，10：667；Becker等人，(1994)，《植物杂志(Plant J.)》，5：299)、苜蓿(Masoud等人，(1996)，《转基因研究(Transgen.Res.)》，5：313)；和番茄(Sun等人，(2006)，《植物和细胞生理学(Plant Cell Physiol.)》，47：426-431)。还参见美国专利申请公开2003/0167537 A1中对载体、转化方法和转化的拟南芥植物的生产的描述，其中转录因子由CaMV35S启动子组成型表达，该文献通过引用并入本文。对茄科植物特别有用的转化方法是本领域众所周知的参见，例如，公开描述的番茄(Sharma等人，(2009)，《生物科学杂志(J.Biosci.)》，34：423-433)，茄子(Arpaia等人，(1997)，《理论和应用遗传学(Theor.Appl.Genet.)》，95：329-334)，马铃薯(Bannerjee等人，(2006)，《植物科学(PlantSci.)》，170：732-738；Chakravarty等人，(2007)，《美国马铃薯研究杂志(Amer.J.PotatoRes.)》，84：301-311；S.Millam“农杆菌介导的马铃薯的转化(Agrobacterium-mediatedtransformation of potato)”，第19章(第257-270页)，“世界转基因作物：基本协议(Transgenic Crops of the World：Essential Protocols)”，Ian S.Curtis(编辑)，Springer，2004)和胡椒粉(Li等人，(2003)，《植物细胞报告》，21：785-788)的转化方法。稳定的转基因马铃薯、番茄和茄子已经在商业上被引入到各个地区；参见，例如，K.Redenbaugh等人，“基因工程改造的水果和蔬菜的安全性评估：FLAVR SAVR番茄的病例研究(Safety Assessment of Genetically Engineered Fruits and Vegetables：A CaseStudy of the FLAVR SAVR Tomato)”，CRC出版社(CRC Press)，博卡拉顿(Boca Raton)，1992，以及GM作物数据库中大量公开的商业基因修饰的作物的文献；参见：CERA.(2012).GM作物数据库。ILSI研究基金会环境风险评估中心(CERA)，华盛顿特区，可在cera-gmc.org/？action＝gm_crop_database电子获得。其他植物物种的各种转化方法在本领域中是熟知的，参见，例如，百科参考，“转基因作物植物简编”，由Chittaranjan Kole和TimothyC.Hall编辑，布莱克威尔出版有限公司(Blackwell Publishing Ltd.)，2008；ISBN 978-1-405-16924-0(可在mrw.interscience.wiley.com/emrw/9781405181099/hpt/toc电子获得)，其描述了谷物和牧草(水稻、玉米、小麦、大麦、燕麦、高粱、珍珠粟、手指粟、冷季型牧草和大麦草)、油籽作物(大豆、油籽芸苔、向日葵、花生、亚麻、芝麻和红花)、豆类谷物和牧草(普通豆、豇豆、豌豆、蚕豆、扁豆、温菜豆、亚洲豆、木豆、紫云英、鹰嘴豆、羽扇豆、苜蓿和丁香)、温带水果和坚果(苹果、梨、桃、李子、浆果作物、樱桃、葡萄、橄榄、杏仁和波斯胡桃)、热带和亚热带水果和坚果(柑橘、柚子、香蕉和大蕉、菠萝、木瓜、芒果、鳄梨、猕猴桃、西番莲和柿子)、蔬菜作物(番茄、茄子、辣椒、甘蓝、萝卜、胡萝卜、葫芦、蒜、芦笋和叶菜)、糖、块茎和纤维作物(甘蔗、甜菜、甜叶菊、马铃薯、甘薯、木薯和棉花)、种植作物、观赏植物和草坪草(烟草、咖啡、可可、茶、橡胶树、药用植物、观赏植物和草坪草)以及森林树物种的转化程序。
提供含有稳定整合的重组DNA的转基因植物细胞和转基因植物的转化方法优选地在培养基上的组织培养中和在受控环境中实施。“培养基”是指用于在体外，即在完整的活生物体之外生长细胞的多种营养混合物。受体细胞靶标包含但不限于分生组织细胞、愈伤组织、未成熟胚或部分胚，以及配子细胞，如小孢子、花粉、精子和卵细胞。可以从中再生可育植物的任何细胞被认为是实施本发明的有用的受体细胞。愈伤组织可以从各种组织来源启动，包含但不限于未成熟胚或部分胚、幼苗顶端分生组织、小孢子等。那些能够作为愈伤组织增殖的细胞可以作为遗传转化的受体细胞。用于制备本发明的转基因植物的实用转化方法和材料(例如，各种培养基和受体靶细胞，未成熟胚的转化，以及随后可育转基因植物的再生)被公开在例如美国专利第6,194,636号和第6,232,526号以及美国专利申请公开2004/0216189中，它们通过引用被具体并入。
在一般的转化实践中，在任何一个转化实验中，DNA仅被引入到一小部分靶细胞中。标志物基因通常用于提供一种有效的系统，用于鉴定那些通过接收转基因DNA构建体并将该转基因DNA构建体整合到它们的基因组中而被稳定转化的细胞。优选的标志物基因提供选择性标志物，其赋予对选择性药剂如抗生素或除草剂的抗性。植物细胞对其有抗性的任何抗生素或除草剂都可能是有用的用于选择的药剂。潜在转化的细胞被暴露于选择性药剂。在存活细胞的群体中，通常是那些整合了抗性赋予基因并以足够水平表达以允许细胞存活的细胞。可以进一步测试细胞以确认重组DNA的稳定整合。常用的选择性标志物基因包含那些赋予对抗生素如卡那霉素或巴龙霉素(nptll)、潮霉素B(aph IV)和庆大霉素(aac3和aacC4)抗性或对除草剂如草铵膦(bar或pat)和草甘膦(EPSPS)抗性的基因。有用的选择性标志物基因和选择药剂的实例在美国专利第5,550,318号、第5,633,435号、第5,780,708号和第6,118,047号中描述，所有这些专利通过引用具体并入。也可以使用可筛选的标志物或报告物，如提供视觉鉴定转化体的能力的标志物。有用的可筛选的标志物的实例包含，例如，表达通过作用于生色底物(例如，β葡糖苷酸酶(GUS)(uidA)或荧光素酶(luc))而产生可检测颜色的蛋白质的基因，或其本身可检测的基因，如绿色荧光蛋白(GFP)(gfp)或免疫原性分子。本领域的技术人员将认识到许多其他有用的标志物或报告物是可用的。
检测或测量转基因植物细胞中重组DNA构建体的转录可以通过任何合适的方法实现，包含蛋白质检测方法(例如，蛋白质印迹、ELISA和其他免疫化学方法)、酶促活性的测量或核酸检测方法(例如，Southern印迹、northern印迹、PCR、RT-PCR、荧光原位杂交)。
用于检测或测量本发明的靶向鳞翅目害虫靶基因的重组多核苷酸在植物细胞中的转录的其他合适方法包含测量作为靶基因在鳞翅目害虫中的表达水平的直接或代理指示的任何其他性状，相对于在不存在重组多核苷酸的情况下观察到的表达水平，例如鳞翅目害虫的生长速率、死亡率或生殖或募集速率，或在被鳞翅目害虫侵染的植物或植物的田地中的损伤(例如根损伤)或产量损失的测量。一般而言，用于检测或测量感兴趣的重组多核苷酸在植物细胞中的转录的合适的方法包含，例如，大体或显微形态性状、生长速率、产量、生殖或募集速率、对害虫或病原体的抗性或对生物或非生物胁迫(例如，水分亏缺胁迫、盐胁迫、营养胁迫、热或冷胁迫)的抗性。此类方法可以使用表型性状的直接测量或替代测定(例如，在植物中，这些测定包含植物部分测定，如叶或根测定，以确定对非生物胁迫的耐受性)。此类方法包含对无脊椎动物害虫或病原体的抗性的直接测量(例如，对植物组织的损害)或替代测定(例如，植物产量测定，或生物测定，如在国际专利申请公开WO2005/110068 A2和美国专利申请公开US 2006/0021087 A1(其通过引用具体并入)中描述的西方玉米根虫(玉米根萤叶甲(Diabrotica virgifera virgifera LeConte))幼虫生物测定，或Steeves等人，(2006)，《功能植物生物学(Funct.Plant Biol.)》，33：991-999描述的大豆胞囊线虫病生物测定(其中测量了每株植物的孢囊、每克根的孢囊、每株植物的卵、每克根的卵和每孢囊的卵)，或者本文工作实例中描述的Colorado马铃薯甲虫(Colorado potatobeetle)(鳞翅目昆虫)生物测定。
本发明的重组DNA构建体可以与其他重组DNA堆叠，用于例如通过表达或抑制其他基因来赋予额外性状(例如，在转化植物的情况下，性状包含除草剂抗性、害虫抗性、冷萌发耐受性、水分亏缺耐受性等)。在美国专利申请公开2004/0126845 A1(其通过引用具体并入)中公开了用于基因表达的协同减少和增加的构建体。
可育转基因植物的种子可以被收获并用于生长本发明的转基因植物的子代，包含杂交后代，所述转基因植物在其基因组中包含重组DNA构建体。因此，除了用本发明的重组DNA构建体直接转化植物之外，本发明的转基因植物可以通过将具有重组DNA的第一种植物与缺乏该构建体的第二种植物杂交来制备。例如，可以将重组DNA引入到适于转化的植物系中以产生转基因植物，该转基因植物可以与第二植物系杂交以将重组DNA渗入所得的后代。本发明的转基因植物可以与具有赋予一个或多个额外性状(如但不限于除草剂抗性、害虫或疾病抗性、环境胁迫抗性、改良的营养物含量和产量提高)的其他重组DNA的植物系杂交，以产生具有赋予期望的靶序列表达行为和额外性状两者的重组DNA的子代植物。
在此类用于组合性状的育种中，提供额外性状的转基因植物可以是雄性系(传粉者)，并且携带基础性状的转基因植物可以是雌性系。这种杂交的后代分离，使得一些植物将携带两个亲本性状的DNA，并且一些将携带一个亲本性状的DNA；此类植物可以通过与亲本DNA相关的标志物来鉴定。携带两种亲本性状的DNA的子代植物可以多次杂交回母本系，例如，通常6至8代，以产生与一个原始转基因亲本系以及另一个转基因亲本系的重组DNA具有基本上相同的基因型的纯合子代植物。
本发明的另一方面是由本发明的转基因种子(或在马铃薯的情况下，转基因种薯)生长的转基因植物。本发明考虑了直接从含有重组DNA的转基因种子生长的转基因植物，以及通过将直接从转基因种子生长的转基因植物与不是从同一转基因种子生长的第二种植物杂交而产生的植物的子代，包含近交系或杂种植物系。杂交可以包含例如以下步骤：
●
○(a)第一亲本植物(例如，非转基因或转基因)和根据本发明转基因的第二亲本植物的植物种子；
○(b)使第一亲本植物和第二亲本植物的种子生长成开花的植物；
○(c)用来自第二亲本的花粉给来自第一亲本的花授粉；和
○(d)收获在带有受精的花的亲本植物上产生的种子。
通常希望将重组DNA渐渗到优良品种中，例如通过回交，将特定的期望的性状从一个来源转移到缺乏该性状的近交或其他植物中。这可以例如通过首先将优良近交系(“A”)(轮回亲本)与供体近交系(“B”)(非轮回亲本)杂交来实现，所述供体近交系携带所述性状的适当基因，例如根据本发明制备的构建体。首先在所得的子代中选择该杂交的子代，用于使期望的性状从非轮回亲本“B”转移，然后将所选的子代交配回到优良的轮回亲本“A”。在对期望的性状进行选择的五个或更多回交世代之后，对于控制所转移的特征的基因座，后代基本上可以是半合子，但对于大多数或几乎所有其他基因，类似于优良亲本。最后的回交世代将被自交，以产生对于被转移的基因(例如，一个或多个转化事件)而言是纯育种的后代。
通过一系列的育种操作，可以将选定的DNA构建体从一个细胞系转移到完全不同的细胞系中，而不需要进一步的重组操作。因此，人们可以产生对一种或多种DNA构建体来说是真正育种的近交系植物。通过杂交不同的近交系植物，可以产生大量具有不同DNA构建体的组合的不同杂种。以这种方式，可以产生具有通常与杂种相关的期望的农艺性状(“杂种优势”)以及由一种或多种DNA构建体赋予的期望的特征的植物。
在本发明的某些转基因植物细胞和转基因植物中，有时希望同时表达感兴趣的基因，同时还调节鳞翅目靶基因的表达。因此，在一些实施例中，转基因植物含有重组DNA，该重组DNA进一步包括用于表达至少一种感兴趣的基因的基因表达元件，并且本发明的重组DNA构建体的转录受基因表达元件的同时转录的影响。
在一些实施例中，本发明的重组DNA构建体可以在任何植物细胞或组织中或在任何发育阶段的完整植物中转录。转基因植物可以来自任何单子叶植物或双子叶植物，如但不限于具有商业或农业意义的植物，如作物植物(尤其是用于人类食物或动物饲料的作物植物)、产木材或纸浆的树、蔬菜植物、水果植物和观赏植物。感兴趣的植物的实例包含谷类作物植物(如小麦、燕麦、大麦、玉米、黑麦、黑小麦、水稻、小米、高粱、藜麦、苋菜和荞麦)；饲料作物植物(例如饲料草和饲料双子叶植物，包含苜蓿、野豌豆、三叶草等)；油料作物植物(如棉花、红花、向日葵、大豆、油菜、油菜籽、亚麻、花生和油棕)；树坚果(如核、腰果、榛子、山核桃、杏仁等)；甘蔗、椰子、椰枣、橄榄、甜菜、茶叶和咖啡；产木材或纸浆的树木；蔬菜作物植物如豆类(例如，豆类、豌豆、扁豆、苜蓿、花生)、莴苣、芦笋、朝鲜蓟、芹菜、胡萝卜、萝卜、芸苔(例如，卷心菜、羽衣甘蓝、芥菜以及其他多叶芸苔、花椰菜、球芽甘蓝、芜菁、大头菜)，可食用的瓜类(例如，黄瓜、甜瓜、夏季南瓜、冬季南瓜)、可食用的蒜类(例如，洋葱、大蒜、韭菜、葱、细香葱)、茄科的可食用成员(例如，番茄、茄子、土豆、辣椒、酸樱桃)和藜科的可食用成员(例如，甜菜、甜菜、菠菜、藜麦、苋菜)；水果作物植物如苹果、梨、柑橘类水果(例如，柑橘、酸橙、柠檬、葡萄柚等)、核果类水果(例如，杏、桃、李、油桃)、香蕉、菠萝、葡萄、猕猴桃、木瓜、鳄梨和浆果；为生物质或生物燃料而种植的植物(例如，芒草、柳枝稷、麻风树、油棕、真核微藻如布朗葡萄藻(Botryococcus braunii)、小球藻(Chlorella spp.)、和杜氏藻(Dunaliella spp.)和真核生物大型藻类如江蓠(Gracilaria spp.)和马尾藻(Sargassum spp.))；和观赏植物，包含观赏开花植物、观赏树木和灌木、观赏地被植物和观赏草。
本发明还提供了由本发明的转基因植物细胞、植物或种子产生的商品产品，包含但不限于收获的叶、根、芽、块茎、茎、果实、种子或植物的其他部分、膳食、油、提取物、发酵或消化产物、植物的压碎的或全谷物或种子，或任何食物或非食物产品，包含由本发明的转基因植物细胞、植物或种子产生的此类商品产品。在本文预期的一种或多种商品或商品产品中检测本发明的重组DNA构建体的一种或多种核酸序列是商品或商品产品含有或衍生自本发明的转基因植物细胞、植物或种子的事实证据。
通常，在其基因组中具有本发明的重组DNA构建体的转基因植物对鳞翅目害虫侵染表现出增强的抗性。在各种实施例中，例如，在转基因植物表达本发明的重组DNA构建体(该构建体与其他重组DNA堆叠以赋予额外的性状)的情况下，相对于缺乏重组DNA构建体的植物，转基因植物具有至少一种额外的改变的性状，该额外的改变的性状选自由以下组成的组：
●
○(a)改善的非生物胁迫耐受性；
○(b)改善的生物胁迫耐受性；
○(c)修饰的初级代谢物组成；
○(d)修饰的次级代谢物组成；
○(e)改变的微量元素、类胡萝卜素或维生素组合物；
○(f)提高的产量；
○(g)改善的使用氮、磷或其他营养物的能力；
○(h)改良的农艺性状；
○(i)改变的生长或生殖特征；和
○(j)提改善的收获、储存或加工质量。
在一些实施例中，转基因植物的特征在于：对非生物胁迫的改善的耐受性(例如，对缺水或干旱、热、冷、非最佳营养或盐水平、非最佳光照水平的耐受性)或对生物胁迫(例如，拥挤、化感作用或伤害)的改善的耐受性；修饰的初级代谢物(例如，脂肪酸、油、氨基酸、蛋白质、糖或碳水化合物)组成；修饰的次级代谢物(例如，生物碱、萜类、聚酮化合物(polyketides)、非核糖体肽和混合的生物合成来源的次级代谢物)组成；修饰的微量元素(例如，铁、锌)、类胡萝卜素(例如，β-胡萝卜素、番茄红素、叶黄素、玉米黄质或其他类胡萝卜素和叶黄素)或维生素(例如，生育酚)组成；提高的产量(例如，在非胁迫条件下提高的产量或在生物或非生物胁迫下提高的产量)；改善的使用氮、磷或其他营养物的能力；改良的农艺性状(例如，延迟成熟；延缓衰老；更早或更晚成熟；改善的耐阴性；改善的对根或茎倒伏的抗性；改善的对茎的“绿色折断”的抗性；修饰的光周期响应)；改变的生长或生殖特征(例如，有意的矮化；有意的雄性不育，可用于例如改进的杂交程序；改善的植物生长速率；改善的发芽；改善的雄性或雌性生育力)；改善的收获、储存或加工质量(例如，改善的储存期间对害虫的抗性、改善的对破损的抗性、改善的对消费者的吸引力)；或这些性状的任何组合。
在另一实施例中，转基因种子或由转基因植物产生的种子具有修饰的初级代谢物(例如，脂肪酸、油、氨基酸、蛋白质、糖或碳水化合物)组成、修饰的次级代谢物组成、修饰的微量元素、类胡萝卜素或维生素组成、改善的收获、储存或加工质量或这些的组合。在另一实施例中，可能需要改变转基因植物或转基因植物的种子的天然组分的水平，例如，降低变应原性蛋白质或糖蛋白或毒性代谢物的水平。
通常，筛选各自从转基因植物细胞再生的转基因植物的群体以鉴定发育成具有期望的性状的转基因植物的转基因植物细胞。测定转基因植物以检测增强的性状，例如增强的水利用效率、增强的耐寒性、增加的产量、增强的氮利用效率、增强的种子蛋白质和增强的种子油。筛选方法包含在温室或田间试验中直接筛选性状，或筛选替代性状。此类分析涉及检测植物的化学组成、生物量、生理性质或形态的变化。通过分析种子组成以及蛋白质、游离氨基酸、油、游离脂肪酸、淀粉、生育酚或其他营养物的含量，可以检测到化学组成如谷物的营养组成的变化。生长或生物量特征的变化通过测量植物高度、茎直径、节间长度、根和地上部干重以及(对于谷物生产植物，如玉米、水稻或小麦)穗或种子头长度和直径来检测。通过评估对胁迫条件的响应来鉴定生理性质的变化，例如，在强加的胁迫条件下的测定，所述胁迫条件如水分亏缺、氮或磷缺乏、冷或热生长条件、病原体或昆虫攻击、光缺乏或植物密度增加。其他选择性质包含开花天数、花粉脱落天数、果实成熟天数、果实或块茎质量或产量、玉米吐丝天数、叶片伸展率、叶绿素含量、叶片温度、林分、幼苗活力、节间长度、植株高度、叶数量、叶面积、分蘖、支撑根、保持绿色、茎倒伏、根倒伏、植物健康、肥力、绿梢和害虫抗性。此外，可以评估收获的果实、种子或块茎的表型特征；例如，在番茄和茄子中，这可以包含收获的果实的总数量或重量，或者这种果实的颜色、酸度、含糖量或风味，并且在马铃薯中，这可以包含收获的块茎的数量或总重量以及此类块茎的质量。
以下实例是为了说明的目的而给出的并且不应被解释为限制。
实例
靶基因的鉴定
通过分析靶标鳞翅目害虫的转录组中与产品相关的标签处以及单拷贝和低拷贝数处具有期望的核苷酸表达谱的基因，使用公开可得的数据来鉴定用于RNAi的靶基因。使用文献搜索和公共数据库(如必需基因数据库(DEG)、iBeetle、Flybase、Lepbase等)对这些靶基因进行二次确认，以评估它们作为RNAi靶标的重要性。这些基因随后被提名以用于设计dsRNA触发物
有效触发物序列的设计
然后通过专有算法将鉴定的靶基因分成所有可能的18-25bp长的区段。然后通过Burrows Wheeler Aligner(BWA)工具将这些区段与从各自的公开可获得的转录组中获得的特定靶基因的RNA序列进行匹配。然后分析这些匹配的区段以鉴定靶基因的一个或多个子序列。然后，通过将这些子序列组合，然后输入到专有算法和各种公共dsRNA设计工具(如Snapdragon、E-RNAi和SiFi21)中，设计了有效的dsRNA触发物。然后使用BLAST和专有代码检查设计的触发物的特异性，以匹配非靶向的物种，并且使用上述方法重新设计来自该分析的任何命中。
表1A
Figure BDA0004022386480000891
/>
Figure BDA0004022386480000901
/>
Figure BDA0004022386480000911
/>
Figure BDA0004022386480000921
表1B
Figure BDA0004022386480000922
/>
Figure BDA0004022386480000931
/>
Figure BDA0004022386480000941
/>
Figure BDA0004022386480000951
/>
Figure BDA0004022386480000961
/>
Figure BDA0004022386480000971
/>
Figure BDA0004022386480000981
表1C
Figure BDA0004022386480000982
/>
Figure BDA0004022386480000991
/>
Figure BDA0004022386480001001
/>
Figure BDA0004022386480001011
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Figure BDA0004022386480001021
/>
Figure BDA0004022386480001031
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Figure BDA0004022386480001041
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Figure BDA0004022386480001051
/>
Figure BDA0004022386480001061
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Figure BDA0004022386480001071
/>
Figure BDA0004022386480001081
/>
Figure BDA0004022386480001091
/>
Figure BDA0004022386480001101
/>
Figure BDA0004022386480001111
/>
Figure BDA0004022386480001121
/>
Figure BDA0004022386480001131
实例1：小菜蛾中的RNAi致死基因的鉴定。
初级筛选生物测定。
在基于人工食物的生物测定中测试dsRNA分子对小菜蛾(P.xyostella)的杀虫活性。简而言之，将含有未配制的(例如裸dsRNA)或配制的(例如参见第VI节，同上))dsRNA的人工食物置于47mm皮氏培养皿中。使用细铅笔刷向每个皮氏培养皿中添加5至7只L1龄晚期DBM幼虫。每个处理含有5个重复。测定开始后2天存活的昆虫被视为测试中的昆虫总数，并且该数字用于计算死亡率。在第7天，将新鲜处理的食物加入到每个皮氏培养皿中，此后根据需要加入未处理的食物。在第9天观察幼虫的死亡率。观察持续14天，直到幼虫发育成蛹。死亡率通过如表2和3中报告的Henderson-Tilton公式进行校正。生物测定被评分如下：
Figure BDA0004022386480001141
评分数据在下表2和3中提供。表2和3中的每种dsRNA分子都通过其GS编号进行鉴定，GS编号与表1A中提供的触发物ID和SEQ ID NOs相关。带下划线/斜体的SEQ ID NOs代表根据表2和3所示的数据得分为++或++的序列。
表2
ID 校正的死亡率D9
GS144 +
GS146 ++
GS148 +
GS150 +
GS152 ++
GS268 +
GS269 +++
GS270 +
GS271 +
GS272 +
GS273 +
GS318 ++
GS319 ++
GS320 +
GS321 +++
GS322 +
GS323 +
GS324 +
GS325 +
GS326 ++
GS327 -
GS328 +
GS329 ++
GS330 +
GS331 +
GS332 +
GS333 +
GS334 +
GS335 +
GS336 +
GS337 +
GS338 +
表3
ID 校正的死亡率D9
GS453 -
GS454 -
GS455 -
GS456 -
GS457 -
GS458 +
GS459 -
GS460 -
GS461 -
GS462 -
GS463 +
GS464 -
GS465 +
GS468 +
GS469 -
GS471 -
GS485 -
GS486 +++
GS487 -
GS488 -
GS489 -
GS490 -
GS491 -
GS492 -
GS493 -
GS494 -
GS495 -
GS496 -
GS497 -
实例2：草地贪夜蛾(S.frugiperda.)中的RNAi致死基因的鉴定。
初级筛选生物测定。
在基于人工食物的生物测定中测试dsRNA分子对草地贪夜蛾的杀虫活性。简而言之，将含有未配制的或配制的dsRNA的人工食物置于24孔板中。使用细铅笔刷将一只秋季粘虫新生儿置于每个孔中。板被覆盖有市售的半透明密封件。每个处理含有在多个24孔板中随机化的16-24个重复。在第5天，用并入了dsRNA的新鲜食物再次处理昆虫。观察昆虫的死亡率和发育迟缓(发育停滞在L3)长达12天。设计用于靶向绿色荧光蛋白和水的dsRNA用作阴性对照。生物测定被评分如下：
Figure BDA0004022386480001151
Figure BDA0004022386480001161
评分数据在下表4和5中提供。表4和5中的每种dsRNA分子都通过GS编号进行鉴定，GS编号与表1A中提供的SEQ ID NO相关。表1A中加粗的SEQ ID NOs代表得分为++或+++的序列。
表4
ID 死亡率
GS262 -
GS263 +++
GS264 -
GS265 ++
GS266 -
GS267 -
GS297 -
GS298 -
GS299 -
GS300 ++
GS301 -
GS302 -
GS303 -
GS304 -
GS305 +++
GS306 ++
GS307 -
GS309 +++
GS311 -
GS313 -
GS314 -
GS315 -
GS316 -
GS317 -
表5
Figure BDA0004022386480001162
Figure BDA0004022386480001171
实例3：小菜蛾中的RNAi致死基因的鉴定。
在基于人工食物的生物测定中测试dsRNA分子对小菜蛾的杀虫活性。简而言之，人造食物栓塞被并入有50uL的1mg/mL的裸dsRNA。将每个栓塞放入47mm的皮氏培养皿中。每个皮氏培养皿中放置5只L1晚期阶段幼虫。在第7天添加新鲜的未处理的食物。在dsRNA暴露3天后存活的昆虫是用于死亡率计算的昆虫的总数。监测昆虫的死亡率和发育长达13天。
评分数据在下表6和7中提供。死亡率通过Henderson Tilton公式进行调整，并且纠正的死亡率如下。表6和7中的每种dsRNA分子都通过其GS编号进行鉴定，GS编号与表1B中提供的SEQ ID NO相关。加粗的SEQ ID NOs代表得分为++或+++的序列。
Figure BDA0004022386480001172
表6
Figure BDA0004022386480001173
Figure BDA0004022386480001181
表7
Figure BDA0004022386480001182
/>
Figure BDA0004022386480001191
实例4：小菜蛾中的RNAi致死基因的鉴定。
在基于人工食物的生物测定中测试dsRNA分子对小菜蛾的杀虫活性。简而言之，人造食物栓塞被并入有50uL的1mg/mL的裸dsRNA。将每个栓塞放入47mm的皮氏培养皿中。每个皮氏培养皿中放置5只L1晚期幼虫。在第7天添加新鲜的未处理的食物。在dsRNA暴露3天后存活的昆虫是用于死亡率计算的昆虫的总数。监测昆虫的死亡率和发育长达14天。评分数据在下表9中提供。死亡率通过Henderson Tilton公式进行调整，并且纠正的死亡率如下。表9中的每种dsRNA分子都通过其GS编号进行鉴定，GS编号与表1C中提供的SEQ ID NO相关。表1C中加粗的SEQ ID NOs代表得分为++或+++的序列，并且此类序列中的每一个可以单独用于要求保护的方法或组合物中。
Figure BDA0004022386480001192
表8
Figure BDA0004022386480001201
/>
Figure BDA0004022386480001211
/>
Figure BDA0004022386480001221
/>
Figure BDA0004022386480001231
/>
Figure BDA0004022386480001241
/>
Figure BDA0004022386480001251
/>
Figure BDA0004022386480001261
/>
Figure BDA0004022386480001271
/>
Figure BDA0004022386480001281
/>
Figure BDA0004022386480001291
/>
Figure BDA0004022386480001301
实例5：小菜蛾中的dsRNA的显微注射研究
DBM注射方案
评分数据在下表9中提供。表1C中的每种dsRNA分子都通过GS编号进行鉴定，GS编号与表1A-1C中提供的SEQ ID NO相关。通过显微注射测试了在上述食物测定中显示死亡率＞30％的某些序列，以用于进一步鉴定有效序列，其结果在下表9中示出。在与Knorr等人所著的(2018)，《科学报告(Scientific Reports)》，8：2061 at 11“赤拟谷盗(Triboliumcastaneum)中的基因沉默作为用于作物害虫中的候选RNAi靶标的靶向鉴定工具(Genesilencing in Tribolium castaneum as a tool for the targeted identification ofcandidate RNAi targets in crop pests)”中描述的相似的注射生物测定中，使用适合物种的饲料，用鉴定的序列的dsRNA注射小菜蛾幼虫。结果在表9中示出，其中++的评分表示死亡率为50％-63％，并且+++的评分表示死亡率＞/＝64％。
表9
Figure BDA0004022386480001311
Figure BDA0004022386480001321
/>

Claims (40)

1.一种用于控制植物的鳞翅目害虫侵染的方法，其包括：
(a)使所述鳞翅目害虫与至少一种多核苷酸接触，所述多核苷酸包括与具有选自由以下组成的组的核苷酸序列的靶基因或从所述靶基因转录的RNA的至少18、19、20、21、25、50、100、150或200个连续核苷酸互补，或与和所述连续核苷酸具有至少90％、95％或98％同一性的核苷酸序列互补的核苷酸序列：SEQ ID NOs1-114、229-361、495-511；530-535、542-822、1104-1333和1564-1623；或
(b)在所述鳞翅目害虫的食物中提供至少一种多核苷酸，所述多核苷酸包括与具有选自由以下组成的组的核苷酸序列的靶基因或从所述靶基因转录的RNA的至少18、19、20、21、25、50、100、150或200个连续核苷酸互补，或与和所述连续核苷酸具有至少90％、95％或98％同一性的核苷酸序列互补的核苷酸序列：SEQ ID NOs：1-114、229-361、495-511；530-535、542-822、1104-1333和1564-1623；或
(c)通过在所述鳞翅目害虫的幼虫的食物中提供至少一种包括至少一种沉默元件的多核苷酸，导致所述鳞翅目害虫的幼虫的死亡或发育迟缓，所述沉默元件包括与具有选自由以下组成的组的核苷酸序列的靶基因或从所述靶基因转录的RNA互补的至少18、19、20、21或25个连续核苷酸：SEQ ID NOs：1-114、229-361、495-511；530-535、542-822、1104-1333和1564-1623；或
(d)向所述植物局部施用包括至少一种多核苷酸的组合物，所述多核苷酸包括与具有选自由以下组成的组的核苷酸序列的靶基因或从所述靶基因转录的RNA的至少18、19、20、21、25、50、100、150或200个连续核苷酸互补，或与和所述连续核苷酸具有至少90％、95％或98％同一性的核苷酸序列互补的核苷酸序列：SEQ ID NOs：1-114、229-361、495-511；530-535、542-822、1104-1333和1564-1623；或
(e)以以下方式向所述植物局部施用包括至少一种多核苷酸的组合物，所述方式使得有效量的所述多核苷酸被以所述植物为食的鳞翅目物种摄取，所述至少一种多核苷酸包括与具有选自由以下组成的组的核苷酸序列的靶基因或从所述靶基因转录的RNA的至少18、19、20、21、25、50、100、150或200个连续核苷酸互补，或与和所述连续核苷酸具有至少90％、95％或98％同一性的核苷酸序列互补的核苷酸序列：SEQ ID NOs：1-114、229-361、495-511；530-535、542-822、1104-1333和1564-1623；或
(f)在所述植物中表达至少一种多核苷酸，所述多核苷酸包括与具有选自由以下组成的组的序列的DNA的至少18、19、20、21、25、50、100、150或200个连续核苷酸基本上相同或互补，或与和所述连续核苷酸具有至少90％、95％或98％同一性的核苷酸序列基本上相同或互补的至少一个区段：SEQ ID NOs：1-114、229-361、495-511；530-535、542-822、1104-1333和1564-1623；或
(g)使所述鳞翅目害虫与有效量的至少一种双链RNA接触，所述双链RNA的一条链与选自由以下组成的组的序列的至少18、19、20、21、25、50、100、150或200个连续核苷酸互补，或与和所述连续核苷酸具有至少90％、95％或98％同一性的核苷酸序列互补：SEQ ID NOs：115-228、362-494、512-529；536-541、823-1103、1334-1563和1624-1683。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种多核苷酸是双链RNA。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述双链RNA是化学或酶促合成的，或者是通过在微生物中表达或通过在植物细胞中表达而产生的。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述双链RNA包括一条链，所述一条链与选自由以下组成的组的序列的至少约50个连续核苷酸、至少约100个核苷酸、至少约150个核苷酸或至少约200个连续核苷酸互补，或与和所述连续核苷酸具有至少90％、95％或98％同一性的核苷酸序列互补：SEQ ID NOs：115、116、119、121、123、127、135、140、141、143、150、151、153、158、161、201、209、213、217、434、442、451、452、453、454、456、457、461、474、476、479、489、491、492、521、522、523、524、527、528、536、538、539、823、826、827、828、830、832、833、834、840、841、842、844、845、851、853、854、862、874、877、883、892、893、901、946、947、953、998、1011、1012、1017、1018、1019、1021、1022、1023、1024、1030、1038、1041、1042、1044、1047、1089、1090、1091、1095、1096、1098、1099、1102、1103、1334、1335、1336、1341、1343、1346、1351、1353、1354、1362、1363、1377、1386、1387、1393、1396、1417、1420、1422、1425、1426、1446、1447、1470、1473、1481、1493、1494、1495、1500、1505、1509、1513、1520、1538、1540、1546、1548、1550、1624、1625、1629、1682或1683。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包括向所述植物局部施用包括至少一种多核苷酸的组合物，所述多核苷酸包括与靶基因或从所述靶基因转录的RNA的至少18、19、20、21、25、50、100、150或200个连续核苷酸互补，或与和所述连续核苷酸具有至少90％、95％或98％同一性的核苷酸序列互补的核苷酸序列，其中所述靶基因具有选自由以下组成的组的核苷酸序列：SEQ ID NOs：2、5、7、9、13、21、26、27、29、36、37、39、44、47、87、95、99、103、301、309、31 8、319、320、321、323、324、328、341、343、346、356、358、359、503、504、505、506、509、510、530、532、533、542、545、546、547、549、551、552、553、559、560、561、563、564、570、572、573、581、593、596、602、611、612、620、665、666、672、717、730、731、736、737、738、740、741、742、743、749、757、760、761、763、766、808、809、810、814、815、817、818、821、822、1104、1105、1106、1111、1113、1116、1121、1123、1124、1132、1133、1147、1156、1157、1163、1166、1187、1190、1192、1195、1196、1216、1217、1240、1243、1251、1263、1264、1265、1270、1275、1279、1283、1290、1308、1310、1316、1318、1320、1564、1565、1569、1622和1623；并且任选地，其中所述组合物进一步包括一种或多种选自由载剂药剂、表面活性剂、阳离子脂质、有机硅氧烷、有机硅氧烷表面活性剂、多核苷酸除草分子、非多核苷酸除草分子、非多核苷酸杀虫剂、安全剂和昆虫生长调节剂组成的组的组分。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包括使所述鳞翅目害虫与有效量的包括双链RNA的溶液接触，其中所述双链RNA的至少一条链与具有选自由以下组成的组的序列的基因的至少18、19、20、21、25、50、100、150或200个连续核苷酸互补，或与和所述连续核苷酸具有至少90％、95％或98％同一性的核苷酸序列互补：SEQ ID NOs：2、5、7、9、13、21、26、27、29、36、37、39、44、47、87、95、99、103、301、309、318、319、320、321、323、324、328、341、343、346、356、358、359、503、504、505、506、509、510、530、532、533、542、545、546、547、549、551、552、553、559、560、561、563、564、570、572、573、581、593、596、602、611、612、620、665、666、672、717、730、731、736、737、738、740、741、742、743、749、757、760、761、763、766、808、809、810、814、815、817、818、821、822、1104、1105、1106、1111、1113、1116、1121、1123、1124、1132、1133、1147、1156、1157、1163、1166、1187、1190、1192、1195、1196、1216、1217、1240、1243、1251、1263、1264、1265、1270、1275、1279、1283、1290、1308、1310、1316、1318、1320、1564、1565、1569、1622和1623，并且其中RNA干扰被诱导并且发生鳞翅目害虫死亡。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述溶液进一步包括一种或多种选自由有机硅氧烷表面活性剂或阳离子脂质组成的组的组分。
8.根据权利要求1所述的方法，其中(a)、(b)、(c)、(d)或(e)的所述靶基因或(f)的所述DNA具有选自由SEQ ID NOs.7、9、21、26、27、29、87、95或99组成的组的序列，或其中(g)的所述双链RNA包括一条链，所述一条链与选自由以下组成的组的序列的至少约50个连续核苷酸、至少约100个核苷酸、至少约150个核苷酸或至少约200个连续核苷酸互补：SEQ ID NOs：121、123、135、140、141、143、201、209和213，或与和所选的序列或其与一条链长度相当的片段具有至少90％、至少95％或98％同一性的序列互补。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述鳞翅目害虫选自由以下组成的组：草地贪夜蛾和小菜蛾。
10.根据权利要求1至4、6或7中任一项所述的方法，其中所述至少一种双链RNA包括一条链，所述一条链与选自由以下组成的组的序列的至少约50个连续核苷酸、至少约100个核苷酸、至少约150个核苷酸或至少约200个连续核苷酸互补：SEQ ID NOs：115-228、362-494、512-529；536-541、823-1103、1334-1563和1624-1683，或与和所选的序列或其与一条链长度相当的片段具有至少90％、至少95％或98％同一性的序列互补。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述一条链包括与选自所述组的序列的至少约100个连续核苷酸互补的序列。
12.根据权利要求1至4、6或7中任一项所述的方法，其中所述双链RNA包括至少一个选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NOs：115-228、362-494、512-529；536-541、823-1103、1334-1563和1624-1683，或其至少约50个连续核苷酸、至少约100个核苷酸、至少约150个核苷酸或至少约200个连续核苷酸的片段，或与所述双链RNA或其片段具有至少90％、至少95％或98％同一性的序列。
13.根据权利要求10或11所述的方法，其中所述至少一个双链RNA包括一条链，所述一条链与选自由以下组成的组的序列的至少约50个连续核苷酸、至少约100个核苷酸、至少约150个核苷酸或至少约200个连续核苷酸互补：SEQ ID NOs：115、116、119、127、150、151、153、158、161、217、434、442、451、452、453、454、456、457、461、474、476、479、489、491、492、521、522、523、524、527、528、536、538和539、823、826、827、828、830、832、833、834、840、841、842、844、845、851、853、854、862、874、877、883、892、893、901、946、947、953、998、1011、1012、1017、1018、1019、1021、1022、1023、1024、1030、1038、1041、1042、1044、1047、1089、1090、1091、1095、1096、1098、1099、1102、1103、1334、1335、1336、1341、1343、1346、1351、1353、1354、1362、1363、1377、1386、1387、1393、1396、1417、1420、1422、1425、1426、1446、1447、1470、1473、1481、1493、1494、1495、1500、1505、1509、1513、1520、1538、1540、1546、1548、1550、1624、1625、1629、1682和1683，或与和所选的序列或其与一条链长度相当的片段具有至少90％、至少95％或98％同一性的序列互补。
14.根据权利要求1所述的方法，其中(a)、(b)、(c)、(d)或(e)的所述靶基因或(f)的所述DNA具有选自由以下组成的组的序列：2、5、13、36、37、39、44、47、103、301、309、318、319、320、321、323、324、328、341、343、346、356、358、359、503、504、505、506、509、510、530、532、533、542、545、546、547、549、551、552、553、559、560、561、563、564、570、572、573、581、593、596、602、611、612、620、665、666、672、717、730、731、736、737、738、740、741、742、743、749、757、760、761、763、766、808、809、810、814、815、817、818、821、822、1104、1105、1106、1111、1113、1116、1121、1123、1124、1132、1133、1147、1156、1157、1163、1166、1187、1190、1192、1195、1196、1216、1217、1240、1243、1251、1263、1264、1265、1270、1275、1279、1283、1290、1308、1310、1316、1318、1320、1564、1565、1569、1622和1623。
15.根据权利要求13或14所述的方法，其中所述鳞翅目害虫是小菜蛾。
16.一种通过根据权利要求1所述的方法提供的对鳞翅目害虫侵染具有改善的抗性的植物，或所述植物的果实、种子或可繁殖部分。
17.根据权利要求16所述的植物，其中所述植物是作物植物。
18.一种用于控制鳞翅目害虫的杀虫组合物，其包括：
(a)杀虫有效量的至少一种多核苷酸，所述多核苷酸包括与具有选自由以下组成的组的核苷酸序列的靶基因或从所述靶基因转录的RNA的至少18、19、20、21、25、50、100、150或200个连续核苷酸互补，或与和所述连续核苷酸具有至少90％、95％或98％同一性的核苷酸序列互补的核苷酸序列：SEQ ID NOs 1-114、229-361、495-511；530-535、542-822、1104-1333和1564-1623；或
(b)杀虫有效量的至少一种多核苷酸，所述多核苷酸包括与靶基因或从所述靶基因转录的RNA的至少18、19、20、21或25个连续核苷酸互补的至少一种沉默元件，其中所述靶基因具有选自由以下组成的组的核苷酸序列：SEQ ID NOs：1-114、229-361、495-511；530-535、542-822、1104-1333和1564-1623；或
(c)杀虫有效量的至少一种RNA，所述RNA包括与具有选自由以下组成的组的核苷酸序列的靶基因或从所述靶基因转录的RNA的至少18个连续核苷酸相同或互补的至少一个区段：SEQ ID NOs：1-114、229-361、495-511；530-535、542-822、1104-1333和1564-1623；或
(d)当被鳞翅目害虫摄取或接触时导致所述鳞翅目害虫的死亡或发育迟缓的RNA分子，其中所述RNA分子包括与具有选自由以下组成的组的核苷酸序列的靶基因或从所述靶基因转录的RNA的至少18、19、20、21、25、50、100、150或200个连续核苷酸互补，或与和所述连续核苷酸具有至少90％、95％或98％同一性的核苷酸序列互补的核苷酸序列：SEQ ID NOs：1-114、229-361、495-511；530-535、542-822、1104-1333和1564-1623；或
(e)杀虫双链RNA分子，所述杀虫双链RNA分子当被鳞翅目害虫摄取或接触时导致所述鳞翅目害虫死亡或生长发育迟缓，其中所述杀虫双链RNA分子的至少一条链与靶基因或从所述靶基因转录的RNA的至少18、19、20、21、25、50、100、150或200个连续核苷酸互补，或与和所述连续核苷酸具有至少90％、95％或98％同一性的核苷酸序列互补，其中所述靶基因具有选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NOs：1-114、229-361、495-511；530-535、542-822、1104-1333和1564-1623；或
(f)杀虫有效量的至少一种双链RNA，其中所述双链RNA的一条链与选自由以下组成的组的序列的至少18、19、20、21、25、50、100、150或200个连续核苷酸互补，或与和所述连续核苷酸具有至少90％、95％或98％同一性的核苷酸序列互补：SEQ ID NOs：115-228、362-494、512-529；536-541、823-1103、1334-1563和1624-1683。
19.根据权利要求18所述的杀虫组合物，其中(e)的所述双链RNA分子或(f)的双链RNA包括一条链，所述一条链与选自由以下组成的组的序列的至少约50个连续核苷酸、至少约100个核苷酸、至少约150个核苷酸或至少约200个连续核苷酸互补：SEQ ID NOs：115-228、362-494、512-529；536-541、823-1103、1334-1563和1624-1683，或与和所选的序列或其与一条链长度相当的片段具有至少90％、至少95％或98％同一性的序列互补。
20.根据权利要求19所述的杀虫组合物，其中所述一条链包括与选自所述组的序列的至少约100个连续核苷酸互补的序列。
21.根据权利要求18所述的杀虫组合物，其中所述双链RNA包括至少一个选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NOs：SEQ ID NOs：115-228、362-494、512-529；536-541、823-1103、1334-1563和1624-1683，或其中至少约50个连续核苷酸、至少约100个核苷酸、至少约150个核苷酸或至少约200个连续核苷酸的片段，或与所述双链RNA或其片段具有至少90％、至少95％或98％同一性的序列。
22.根据权利要求19至21中任一项所述的杀虫组合物，其中所述组是SEQ ID NOs：115、116、119、127、150、151、153、158、161、217、434、442、451、452、453、454、456、457、461、474、476、479、489、491、492、521、522、523、524、527、528、536、538、539、823、826、827、828、830、832、833、834、840、841、842、844、845、851、853、854、862、874、877、883、892、893、901、946、947、953、998、1011、1012、1017、1018、1019、1021、1022、1023、1024、1030、1038、1041、1042、1044、1047、1089、1090、1091、1095、1096、1098、1099、1102、1103、1334、1335、1336、1341、1343、1346、1351、1353、1354、1362、1363、1377、1386、1387、1393、1396、1417、1420、1422、1425、1426、1446、1447、1470、1473、1481、1493、1494、1495、1500、1505、1509、1513、1520、1538、1540、1546、1548、1550、1624、1625、1629、1682和1683。
23.根据权利要求18所述的杀虫组合物，其中(a)、(b)、(c)、(d)和(e)中的所述组是2、5、13、36、37、39、44、47、103、301、309、318、319、320、321、323、324、328、341、343、346、356、358、359、503、504、505、506、509、510、530、532、533、542、545、546、547、549、551、552、553、559、560、561、563、564、570、572、573、581、593、596、602、611、612、620、665、666、672、717、730、731、736、737、738、740、741、742、743、749、757、760、761、763、766、808、809、810、814、815、817、818、821、822、1104、1105、1106、1111、1113、1116、1121、1123、1124、1132、1133、1147、1156、1157、1163、1166、1187、1190、1192、1195、1196、1216、1217、1240、1243、1251、1263、1264、1265、1270、1275、1279、1283、1290、1308、1310、1316、1318、1320、1564、1565、1569、1622和1623。
24.根据权利要求22和23所述的杀虫组合物，其中所述鳞翅目害虫是小菜蛾。
25.根据权利要求18至24中任一项所述的杀虫组合物，其中所述杀虫组合物为选自由固体、液体、粉末、悬浮液、乳液、喷雾、胶囊化、微珠、载剂颗粒、膜、基质、种子处理剂、土壤淋洗液、可植入配方和沟内配方组成的组的至少一种的形式。
26.根据权利要求18至25中任一项所述的杀虫组合物，其进一步包括至少一种选自由以下组成的组的组分：载剂药剂、表面活性剂、阳离子脂质、有机硅氧烷、有机硅氧烷表面活性剂、多核苷酸除草分子、非多核苷酸除草分子、非多核苷酸杀虫剂、安全剂和昆虫生长调节剂。
27.根据权利要求18至26中任一项所述的杀虫组合物，其中所述杀虫组合物包括杀虫双链RNA分子，所述杀虫双链RNA分子当被所述鳞翅目害虫摄取或接触时导致鳞翅目害虫的死亡或发育迟缓，其中所述杀虫双链RNA分子包括至少一个与具有选自由以下组成的组的序列的DNA或从所述DNA转录的RNA的21个连续核苷酸互补的区段：SEQ ID NOs：1-114、229-361、495-511；530-535、542-822、1104-1333和1564-1623，并且其中所述双链RNA分子的长度为至少50个碱基对，或者长度在约100至约500个碱基对之间。
28.一种重组DNA构建体，其包括可操作地连接到以下的异源启动子：
(a)包括核苷酸序列的DNA，所述核苷酸序列与具有选自由以下组成的组的序列的靶基因或从所述靶基因转录的RNA的至少18、19、20、21、25、50、100、150或200个连续核苷酸互补，或与和所述连续核苷酸具有至少90％、95％或98％同一性的核苷酸序列互补：SEQ IDNOs：1-114、229-361、495-511；530-535、542-822、542-822、1104-1333和1564-1623；或
(b)包含18个或更多个连续核苷酸的DNA，其与具有选自由以下组成的组的序列的DNA或其DNA互补序列的等效长度的片段具有100％同一性：SEQ ID NOs：1-114、229-361、495-511；530-535、542-822、542-822、1104-1333和1564-1623；或
(c)编码与靶基因或从所述靶基因转录的RNA的至少18个连续核苷酸互补的至少一种沉默元件的DNA，其中所述靶基因具有选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NOs：1-114、229-361、495-511；530-535、542-822、542-822、1104-1333和1564-1623；或
(d)编码RNA的DNA，所述RNA包括选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NOs：115-228、362-494、512-529；536-541、823-1103、1334-1563和1624-1683。
29.一种植物染色体或质体或重组植物病毒载体或重组杆状病毒载体，其包括根据权利要求16所述的重组DNA构建体。
30.一种转基因作物植物细胞，在所述转基因作物植物细胞的基因组中具有根据权利要求28所述的重组DNA构建体。
31.根据权利要求30所述的转基因作物植物细胞，其中所述转基因作物植物细胞在其基因组DNA中进一步具有编码至少一种杀虫剂的DNA，所述杀虫剂选自由马铃薯糖蛋白、植物凝集素、植物蜕皮甾类、苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白、嗜线虫杆菌杀虫蛋白、发光杆菌杀虫蛋白、侧孢芽孢杆菌杀虫蛋白和球形芽孢杆菌杀虫蛋白组成的组。
32.一种转基因作物植物，其包括根据权利要求30所述的转基因茄科植物细胞，或所述转基因作物植物的果实、种子或可繁殖部分。
33.一种生产用于鳞翅目害虫控制的多核苷酸的方法，所述方法包括：
(a)在反应混合物中温育细胞核糖核酸(RNA)和核糖核酸酶，并产生5′核苷单磷酸(5′NMPs)；
(b)消除核糖核酸酶；和
(c)在所述反应混合物中或在第二反应混合物中温育所述5′NMPs、多磷酸激酶、多磷酸、聚合酶和脱氧核糖核酸(DNA)模板，所述模板与SEQ ID NO：2、5、7、9、13、21、26、27、29、36、37、39、44、47、87、95、99、103、301、309、318、319、320、321、323、324、328、341、343、346、356、358、359、503、504、505、506、509、510、530、532、533、542、545、546、547、549、551、552、553、559、560、561、563、564、570、572、573、581、593、596、602、611、612、620、665、666、672、717、730、731、736、737、738、740、741、742、743、749、757、760、761、763、766、808、809、810、814、815、817、818、821、822、1104、1105、1106、1111、1113、1116、1121、1123、1124、1132、1133、1147、1156、1157、1163、1166、1187、1190、1192、1195、1196、1216、1217、1240、1243、1251、1263、1264、1265、1270、1275、1279、1283、1290、1308、1310、1316、1318、1320、1564、1565、1569、1622和1623具有至少80％同一性，或编码包括有包括至少18个连续核苷酸的区段的RNA序列，其中所述区段与SEQ ID NOs：115、116、119、127、150、151、153、158、161、217、434、442、451、452、453、454、456、457、461、474、476、479、489、491、492、521、522、523、524、527、528、536、538、539、823、826、827、828、830、832、833、834、840、841、842、844、845、851、853、854、862、874、877、883、892、893、901、946、947、953、998、1011、1012、1017、1018、1019、1021、1022、1023、1024、1030、1038、1041、1042、1044、1047、1089、1090、1091、1095、1096、1098、1099、1102、1103、1334、1335、1336、1341、1343、1346、1351、1353、1354、1362、1363、1377、1386、1387、1393、1396、1417、1420、1422、1425、1426、1446、1447、1470、1473、1481、1493、1494、1495、1500、1505、1509、1513、1520、1538、1540、1546、1548、1550、1624、1625、1629、1682或1683的序列的区段具有至少90％同一性，以及产生感兴趣的RNA，任选地，其中步骤(c)的反应混合物进一步包括核苷激酶、NMP激酶和/或NDP激酶。
34.根据权利要求1所述的方法，其中(a)至(g)中所述的至少18个连续核苷酸是至少18、19、20或21个连续核苷酸。
35.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包括以以下方式将包括至少一种多核苷酸的组合物局部施用于所述植物，所述方式使得有效量的所述多核苷酸被以所述植物为食的鳞翅目害虫摄取，所述多核苷酸包括与具有选自由以下组成的组的核苷酸序列的靶基因或从所述靶基因转录的RNA的至少18、19、20或21个连续核苷酸互补的核苷酸序列：SEQ IDNOs：1-114、229-361、495-511、530-535、542-822、1104-1333和1564-1623；其中所述鳞翅目害虫是小菜蛾；并且其中所述靶基因具有以下序列：SEQ ID NO：2、5、13、36、37、39、44、47、103、301、309、318、319、320、321、323、324、328、341、343、346、356、358、359、503、504、505、506、509、510、530、532、533、542、545、546、547、549、551、552、553、559、560、561、563、564、570、572、573、581、593、596、602、611、612、620、665、666、672、717、730、731、736、737、738、740、741、742、743、749、757、760、761、763、766、808、809、810、814、815、817、818、821、822、1104、1105、1106、1111、1113、1116、1121、1123、1124、1132、1133、1147、1156、1157、1163、1166、1187、1190、1192、1195、1196、1216、1217、1240、1243、1251、1263、1264、1265、1270、1275、1279、1283、1290、1308、1310、1316、1318、1320、1564、1565、1569、1622或1623、或者其中所述多核苷酸是双链RNA，双链RNA具有选自由以下组成的组的序列的链：115、116、119、127、150、151、153、158、161、217、434、442、451、452、453、454、456、457、461、474、476、479、489、491、492、521、522、523、524、527、528、536、538、539、823、826、827、828、830、832、833、834、840、841、842、844、845、851、853、854、862、874、877、883、892、893、901、946、947、953、998、1011、1012、1017、1018、1019、1021、1022、1023、1024、1030、1038、1041、1042、1044、1047、1089、1090、1091、1095、1096、1098、1099、1102、1103、1334、1335、1336、1341、1343、1346、1351、1353、1354、1362、1363、1377、1386、1387、1393、1396、1417、1420、1422、1425、1426、1446、1447、1470、1473、1481、1493、1494、1495、1500、1505、1509、1513、1520、1538、1540、1546、1548、1550、1624、1625、1629、1682或1683。
36.一种用于控制鳞翅目害虫的杀虫组合物，其包括杀虫双链RNA分子，所述杀虫双链RNA分子当被鳞翅目害虫摄取或接触时导致所述鳞翅目害虫的死亡或生长发育迟缓，其中所述杀虫双链RNA分子的至少一条链包括至少18、19、20、21、25、50、100、150或200个连续核苷酸，所述连续核苷酸与选自由以下组成的组的序列互补：SEQ ID NOs：115-228、362-494、512-529、536-541、823-1103、1334-1563和1624-1683或与和所选的序列或其与至少一条链长度相当的片段具有至少90％、至少95％或98％同一性的序列互补。
37.根据权利要求35所述的杀虫组合物，其中所述组是SEQ ID NOs：115、116、119、127、150、151、153、158、161、217、434、442、451、452、453、454、456、457、461、474、476、479、489、491、492、521、522、523、524、527、528、536、538、539、823、826、827、828、830、832、833、834、840、841、842、844、845、851、853、854、862、874、877、883、892、893、901、946、947、953、998、1011、1012、1017、1018、1019、1021、1022、1023、1024、1030、1038、1041、1042、1044、1047、1089、1090、1091、1095、1096、1098、1099、1102、1103、1334、1335、1336、1341、1343、1346、1351、1353、1354、1362、1363、1377、1386、1387、1393、1396、1417、1420、1422、1425、1426、1446、1447、1470、1473、1481、1493、1494、1495、1500、1505、1509、1513、1520、1538、1540、1546、1548、1550、1624、1625、1629、1682和1683或与所选的序列或其与至少一条链长度相当的片段具有至少90％、至少95％或98％同一性的序列。
38.根据权利要求35所述的杀虫组合物，其中所述双链RNA包括一条链，所述一条链与选自由以下组成的组的序列的至少约50个连续核苷酸、至少约100个核苷酸、至少约150个核苷酸或至少约200个连续核苷酸互补：SEQ ID NOs：115-228、362-494、512-529；536-541、823-1103、1334-1563和1624-1683，或与和所选的序列或其与一条链长度相当的片段具有至少90％、至少95％或98％同一性的序列互补。
39.根据权利要求18所述的杀虫组合物，其中(a)、(b)、(c)、(d)和(e)中的所述组是SEQID NOs：1、2、13、36、37、39、47、103、302、340、346、349、1121、1157、1178、1179、1185、1310、1313、1318和1322。
40.根据权利要求18所述的杀虫组合物，其中(f)中的所述组是SEQ ID NOs 115、116、127、150、151、153、161、217、435、473、479、482、1351、1387、1408、1409、1415、1540、1543、1548和1552。
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